CN1023295C - 预防和治疗病毒感染的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供由干扰素、肿瘤坏死因子及药学上可接受的载体组成的药物组合物及其制备方法。该组合物还可含有氧自由基清除物质或针对逆转录病毒外壳多肽的抗体。该组合物用于预防或治疗病毒感染，特别是爱滋病及爱滋相关综合症的治疗。

Description

本发明涉及对于受病毒，特别是受逆转录病毒感染或处于病毒感染威胁下的动物的治疗。进一步说，本发明涉及在哺乳动物细胞内诱发抵抗病毒感染的状态的方法与对受逆转录病毒感染的人的治疗。

本发明特别涉及由逆转录病毒感染导致的免疫缺陷的治疗，进一步说，这些治疗是对于那些被认为与获得性免疫缺陷综合征（AIDS）有关的感染的治疗。

爱滋病是一种可传染的细胞免疫缺陷症，其特征为机会（opportunistic）感染及出现某些恶性变，如，明显的卡氏肺囊虫肺炎及卡波济氏肉瘤，在这些病人中无其它已知的致这些罕见疾病的原因。（1-3）。爱滋病的病症表现似乎是由OKT4⁺T淋巴细胞子亚群（4）的耗尽而引起的极度淋巴细胞减少、全身性的皮肤无反应性及对有丝分裂原、抗原及同种异体细胞的增殖反应的明显降低。而同时体液免疫性却相对地不受影响，日益增多的证据表明存在着超活性B-细胞增殖反应，而其在因果关系上可能与爱滋病人的B-淋巴瘤的高发生率有关（5，6）。除了完全发展为综合征外，一种相关疾病[爱滋相关综合征（ARC）]的流行也显现出来，其特征为全身性的慢性淋巴结病变。这种综合征同时具有许多流行病特性及免疫异常，而往往超出爱滋病的临床表现过程。

最近的证据有力地表明一种嗜淋巴细胞的逆转录病毒是爱滋病及爱滋相关综合症的基本的病原因子。淋巴结病相关病毒（LAV）首先从患淋巴结病及爱滋病的病人的培养的淋巴结T细胞中分离出 来，也同样从一个为爱滋病病人、另一个为无症状者的一对患血友病B的孪生双胞胎的培养淋巴结T细胞中分离出来（7-9）。一种类似的病毒，被称为Ⅲ型人类T嗜淋巴细胞病毒（HTLV-Ⅲ）通过与相容的T细胞系H9进行共培养而从大量爱滋病及爱滋病相关综合症患者的血样中分离出来（10，11）。最近从爱滋病患者身上分离出的LAV及HTLV-Ⅲ和相关的逆转录病毒（12，13），共有几种重要的特征。在体内、外病毒复制发生在OKT4⁺淋巴细胞群中，并与损伤细胞增殖以及致细胞病变作用的出现相关（8，10，14）。该病毒具有一个Mg²⁺依赖性的逆转录酶，显现出与D型逆转录病毒相似的密集的圆柱形核的形态（8，13，15）并且可通过事实上在所有的爱滋病及爱滋病相关综合症患者血清中均可发现的抗体（8，13，16-21）来识别。HTLV-Ⅲ及LAV目前被确信为是同一病毒的不同株，这些株被称为人类免疫缺陷病毒（HIV）。

患爱滋病或爱滋病相关综合症的患者的免疫功能遭到严重的损伤。然而，由HTLV引起的异常的正确性质正有待继续的研究。特别有兴趣的是，HIV感染对由这些患者的免疫细胞产生淋巴因子的影响，及其对外源给与的淋巴因子的反应。对十六位爱滋病患者的T淋巴细胞分泌包括γ干扰素在内的巨噬细胞激活产物的能力进行了测试，结果十四位患者不能产生有活性的淋巴因子而有十三至十四位完全不能分泌γ干扰素。另外，爱滋病患者的巨噬细胞与γ干扰素在体外进行培养时，显示出能增加抗微生物的性能，因而提高了这些细胞对外源给予的γ干扰素在体内发生反应的可能性（22，24）。

爱滋病患者的淋巴细胞据报导缺乏产生白细胞介素-2（inter-leukin-2）的能力，白细胞介素-2（interleukin-2）是一种淋巴因子，在T淋巴细胞增殖与分化过程中具有作用并且刺激γ干扰素的产生（23）。

γ干扰素最终被发现对被水泡性口炎病毒（VSV）感染的细胞发 挥直接的抗病毒作用，并加强一种细胞活素对VSV感染细胞的作用（25）。该细胞活素由这些作者们经实验证实为一种多肽，在此被作为肿瘤坏死因子α。同时参阅Eifel等著《Cell    Immun》47：197-203（1979）。因而，对爱滋病进行的免疫增补疗法显得有机会被采用，并且创立了对病人的临床研究。

尽管对爱滋病人的淋巴因子治疗是有希望的，但是体内的实验结果令人失望。与从体外实验得到的结果相反，长期静脉注射重组γ干扰素的治疗疗程似乎是对单细胞突发性呼吸产生抑制作用而非增强（26），对爱滋病用不同的剂量进行白细胞介素-2（interleukin-2）或γ干扰素的静脉注射而得到的结论是，体内淋巴因子疗法对于爱滋病病人的治疗没有重大的价值（27）。事实上，在本发明以前，一种学派认为，免疫刺激作用或者免疫重建对爱滋病的治疗事实上是“危险的”，因为用淋巴因子对细胞的激活被认为会引起病毒的扩散及T细胞的衰竭，因而加剧了疾病的进程（28）。1986年6月Yamamoto等人（29）揭示了人类α及β（而非γ）干扰素抑制HIV病毒株的体外复制，但当停止暴露于干扰素时，被感染的细胞的病毒产量则增加了。这就进一步说明爱滋病的免疫疗法是事与愿违的。

最后，也意味着淋巴毒素是由HIV病毒感染的T细胞经过病毒诱发的T细胞的内源淋巴毒素基因的转激活作用（transactivation）而产生的，因而导致了对自身有毒性数量的淋巴毒素的分泌（35）。

干扰素用于预防或治疗诸如牛痘、风疹、单纯性疱疹、水痘-带状疱疹、水痘、巨细胞包涵体病毒、腺病毒、未分类的RNA病毒、狂犬病病毒及乙型肝炎病毒的慢性、急性和/或实验感染有不同效果。慢性的巨细胞包涵体病毒感染已证明难以用干扰素治疗，甚至用比预防CMV的感染所需剂量高得多的剂量治疗也无用。这样的剂量可能引起预料不到的副作用如中性白细胞减少症及对体重增加的抑 制。因此希望对持续或慢性病毒感染的病人提供一种更有效而又不会引发干扰素副反应的干扰素制品。

干扰素同样也被广泛地试验其预防或治疗（主要由鼻病毒感染引起）感冒的能力。大多的研究是采用每天0.8×10⁶至42.8×10⁶单位的剂量进行滴鼻（Finter等著，1985，Interferon Vol.4pp.186-187）。然而需要明白的是，由早期研究报导的特异活性（单位）与目前使用的国际标准（单位）之间的关系是模糊的。施用的剂量当用国际单位表达时可能更大些或更小些。尽管据报导用浸药的拭子施药更为有效，但一般是用气雾剂来进行鼻腔施药的。典型的方法是，将每天的剂量分成1至3次施用。采用重组干扰素的实验表明喷雾施与大约1×10⁶单位/剂量（每个鼻孔施用0.1ml）对于提供保护作用是有效的，无论是采用此剂量的十分之一或是百分之一，都没有能检测得出的作用（Finter等，op cit，P188）。然而，大约1×10⁶单位的干扰素的剂量会伴随产生烦躁，对鼻腔有轻微的刺激，更大的剂量则产生显著的刺激（Finter等Id.）。

干扰素同样也可以采用滴眼药的形式治疗单纯性疱疹病毒引起的结膜炎或以静脉或腹腔注射或输注的形式对各种病毒感染进行治疗。典型情况下，每毫升滴眼药中含有超过大约1×10⁶单位的干扰素（一种含有60，000单位/ml干扰素浓度的制剂据报导不产生临床上的作用，Sundmacher等，1976，“J.Infect.Dis.”133：A160-A164）。静脉注射施药的剂量一般也超过1×10⁶单位/患者，尽管早期的研究者限于只有粗制干扰素制剂可用而必须采用较低的剂量。这些研究结果表明，干扰素一般被认为在治疗已存在的病毒感染上不如用于预防上那么有效。因而，需要有一种对于活动性感染表现出有增进的活性并显示更高的保护（预防）能力以便能使用较低的剂量的干扰素。

肿瘤坏死因子（参见Pennica等，20/27    Dec.1984，“Nature” 312：724）及淋巴毒素（参见Gray等，20/27Dec.1984，“Nature”312：721）是由被激活的巨噬细胞及淋巴细胞产生的蛋自质，在此分别称为“TNF”（或“TNF-α”）及“LT”（“或TNF-β”）。两者在体外与体内都直接地对胂瘤细胞产生细胞毒作用，并在这一点上与干扰素产生协同作用（参见Lee等，1984年，“J.Immun.”133：1083）。然而，无论是TNF或LT本身都没有任何直接的抗病毒的保护活性作用。TNF-α被认为与在有严重感染的癌症病人中的消瘦与恶病质有关（34），对TNF-α的被动免疫作用据报导能保护小白鼠以抵抗内源毒素的致死作用（30）。已知TNF-α的抗肿瘤作用可被干扰素类协同地增强，TNF-β的抗肿瘤作用同样可被干扰素γ加强。然而，TNF-α及TNF-β混合物的抗肿瘤作用仅仅是两者的加和，如同干扰素α和β的混合物的抗病毒作用。

本发明的一个目的是增进干扰素的抗病毒活性而不增加干扰素副反应的发生率。

另一个目的是增加干扰素的抗病毒的特异性。

本发明的再有一个目的是采用干扰素在个体中进行病毒感染的预防，包括DNA病毒的感染。

本发明的又一个目的是在被逆转录病毒，特别是嗜淋巴细胞病毒，诸如HIV感染的病人的成功的治疗中使用免疫疗法。

在此还有一个目的是对那些活动性逆转录病毒感染高危人群，例如隐伏有潜隐性逆转录病毒的人进行治疗。

另外一个目的是提供抗逆转录病毒感染的免疫治疗预防。

如果将本发明的说明书作为一个总体来看待，则这些目的以及本发明的其它目的将会更为明显。

本发明的目的是通过对已经受病毒感染或处于受病毒感染威胁之下的哺乳动物施与抗病毒有效量的TNF或LT，或（a）干扰素及（b）TNF或LT而完成的。尽管单独的TNF或LT不存在任何已知 的抗病毒保护活性，但是TNF或LT协同地增强了干扰素的抗病毒活性。非常典型而又十分预料不到的是，当干扰素组合物中含有TNF或LT时干扰素的活性被增加大约从2倍至100多倍。最大作用是用于扰素γ时被观察到的。

对于本发明的情况，认为用于治疗包括抗病毒或抗肿瘤所提供的干抗素组合物中未含有足量的干扰素。这些干扰素剂量少于大约500，000国际单位，一般少于25，000单位。这样剂量的干扰素通过在其中渗和本身不足以显示毒性而又足以增加干扰素抗病毒活性的一定数量的LT或TNF而产生效力。

出乎预料的是，我发现单独施用治疗有效量的肿瘤坏死因子，或者最好是与干扰素合用时，可以对受逆转录病毒威胁的人起到保护作用并杀死已受逆转录病毒感染的细胞。尽管干扰素γ单独施用时产生很少或不产生逆转录病毒感染的保护活性，而且干扰素γ对于受逆转录病毒感染的细胞也没有明显的细胞毒作用，TNF单独施用时在高浓度下也只有中度的活性，但当这两个药剂联用时则产生显著的作用。尽管受逆转录病毒感染的病人的免疫系统处于紊乱状态，在体内还是观察到了这样的现象。这样的结果特别令人鼓舞，因为并不知道在这些病人中缺乏TNF。

附图的简要说明

图1及2表示当干扰素γ与LT或TNF合用时其抗病毒活性的显著增加。

图3描绘了通过改变TNF和干扰素γ的浓度而使之得到保护而不受病毒感染的的细胞培养物。

图4a及4b显示了TNF或LT增加干扰素α、β或γ的抗病毒活性的情况。

图5A至5D描述了被TNF或LT加强的干扰素γ对病毒复制的抑制作用。

图6是一种Northern凝胶显示了与不用TNF-α及干扰素γ（IFN-γ）预处理的对照细胞作比较，当被HIV感染的HuT78细胞用TNF-α及IFN-γ作预处理后HIVmRNA显著地减少。

图7说明了与TNF-α和/或IFN-γ合用时过氧化氢酶的抗病毒保护作用。

本发明的方法及组合物可用于预防或治疗DNA病毒、单股RNA或双股RNA病毒所引起的活动性感染或潜隐性感染，而引起感染的病毒不受限制地包括腺病毒、疱疹病毒、乳头多瘤空病毒（包括猿病毒40、乳头状瘤及多瘤病毒）、痘病毒如天花病毒及牛痘病毒、虫媒病毒、沙粒病毒、冠状病毒、粘病毒（新城鸡瘟病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒及呼吸道合胞病毒）、鼻病毒、副粘病毒如甲、乙或丙型流感病毒、微小病毒、微小核糖核酸病毒、披膜病毒、逆转录病毒（包括HTLV-Ⅰ，Ⅱ及Ⅲ）、呼肠孤病毒及轮状病毒。其它的特异病毒包括风疹、单纯疱疹、水痘-带状疱疹、水痘、巨细胞包涵体、埃博拉病毒、狂犬病及乙型肝炎病毒。

逆转录病毒被定义为含单股或双股RNA的病毒。这类病毒通过利用合适的宿主的细胞代谢以逆转录病毒的RNA遗传物质而进行病毒复制的。如此大量产生的DNA经转译至HIV蛋白及RNA以组装成子代病毒体。这些病毒的例子包括所谓的“慢”或潜隐性病毒及T-细胞白血病病毒如HTLV-Ⅰ及HTLV-Ⅱ，但最优选的是与爱滋病有关的HIV病毒株（以前称为HTLV-Ⅲ）。

干扰素已众所周知。从性质上分别包括β及γ干扰素，以及大约20种不同的α干扰素亚型。它们与本发明目的最为相关的特征为：可以在体内及体外保护细胞免受病毒的感染。本发明方法或组合物中的干扰素典型地为α-干扰素、β或γ干扰素，但γ干扰素被优先采用。在重组体细胞培养产生的、由天然分离物得到的或由稳定的非转化细胞系中获得的干扰素在此均可满意地被使用。干扰素氨 基酸序列或其糖基化的变型（包括非糖基化的形式），只要它们显示出抗病毒的活性，也均可满意地被使用。因为干扰素γ被认为是种特异性的，因而干扰素γ应该用于有治疗打算的同种动物。最适用的干扰素是人干扰素γ。干扰素最好本质上是同源性并且在超过大约1×10⁶国际单位/mg时有特异的活性。

TNF及LT包括重组体或未转化细胞培养物的产物，包括氨基酸顺序或者（对于LT的情况）糖基化的变型（包括非糖基化的LT）。无论是单独的TNF或LN或者它们的混合物都是适用的。因为TNF及LT与干扰素协同作用的能力没有种的特异性，由一个种得到的TNF或LT可以用于其它种的治疗。在此最好采用人类成熟的TNF或人类的非糖基化的成熟的LT。

TNF-α或TNF-β单独使用或者根据经验测得的能发挥最大临床效应的比例混合使用。TNF没有种的特异性，因而从其它的动物种如猪或牛得到的TNF在此也能使用。更合适的TNF是从重组体微生物细胞培养物得到的成熟的人类TNF-α。TNF通常对于敏感的L-929鼠细胞株具有大于1×10⁶单位/毫克的溶细胞活性，此处的单位是由上面描述的那些专利申请所规定的，这些申请揭示的内容加在此处作为参考。

此处组合物的配制包括将抗病毒有效剂量的干扰素、LT或TNF与药物学上可接受的载体（诸如那些在扰素、TNF或LT治疗中使用的载体，如生理盐水或5%葡萄糖及常用的稳定剂和/或赋形剂如人血清白蛋白或甘露糖醇）加以混合。所提供的组合物可以是冻干状态的或是灭菌水溶液状态的。

普通的操作人员可以就干扰素α、β、或γ与TNF-α或TNF-β的比例，干扰素与TNF的净比例，干扰素及TNF在组合物中的浓度以及对每公斤基质施用的剂量等方面考虑作一些改变。在治疗上作的改变也包括被治疗动物的种，施用途径，及患者的临床状况（包 括在治疗的开始时存在的逆转录病毒和/或机会性微生物感染的阶段及程度，如果存在的话）。大约从1至50μg/m²范围的干扰素剂量是合适的起始剂量水平，耐药剂量可能不超过大约25μg/m²。

将迄今被认为是最小有效剂量的约50%至0.1%范围内的干扰素合适剂量与TNF或LT联合使用，在抵抗病毒感染及杀死病毒感染的细胞上是有用的。对70kg的患者，剂量可以达到大约500，000国际单位/70kg，但典型地是低于大约100，000单位/70kg。TNF或LT与干扰素的相对重量比一般在大约1000∶1至1∶1的范围，以大约100∶1为最佳。典型的治疗用组合物为每毫升含有大约从1×10³至1×10⁵国际单位干扰素及每毫升含大约从1ng至5μg的TNF或LT的水溶液。根据所预防或治疗的病毒感染情况，通过鼻腔、腹腔注射或静脉注射施药。鼻腔施药剂量一般少于大约25，000国际单位（于0.1ml体积），而静脉施药的剂量少于500，000国际单位，一般少于100，000单位。

TNF或LT与干扰素合用的协同抗病毒保护作用可以广泛地应用于所有哺乳动物。如下述表1所示的细胞系被接种入24孔的组织培养板并与TNF或LT加干扰素γ一起预培养。（以细胞致病变作用来测定）所有的细胞系在各自以1、1和100感染度相联合的脑心肌类病毒，水泡性口炎病毒和单纯性疱疹病毒2型的感染中至少在某种程度上受到保护。

表1

A）人类细胞系    B）非人类细胞

1.A549（肺癌）    1.3T3（鼠成纤维细胞）

2.HT-1080（肺纤维肉瘤）    2.C127（鼠上皮细胞）

3.Hela（宫颈癌）    3.Raw～264（鼠巨噬细胞）

4.T24（膀胱肿瘤）    4.Rat-1（大鼠成纤维细胞）

5.HT29（结肠肿瘤）    5.NRK（正常大鼠肾细胞）

6.7860（肾肿瘤）    6.PK15（猪细胞）

7.ST486（淋巴细胞）    7.MDBK（牛细胞）

8.R8226（淋巴细胞）

因此，本发明的方法，在哺乳动物包括人、牛、猪、禽类及马提供对病毒感染的保护上是有用的。患者可能已得知或未得知患有潜在的肿瘤或恶性肿瘤。

本发明的方法特别适用于发生在高密度农业动物群体的高度传染性病毒传染的预防，首先为发生在幼鸡中的新城鸡瘟病及牛的败血病。尽管病毒群体中出现的变种可能使疫苗失效，但与许多疫苗不同，本发明的组合物对所有的病毒都有效，在出现流行暴发的第一个信号时紧急施用可得到快速的保护效果，因而避免了对整个动物群体进行接种。

本方法也可用于预防呼吸道感染。那些例如家庭中有人患感冒等而处于接触危险之下的人，可以施用干扰素及TNF或LT以保护防止感染。对于在动物或人中经由呼吸道传播的病毒，给药的最惯用途径是鼻腔内喷雾和鼻拭子。除了以前使用的干扰素的仅有片段必须使用外，本治疗将用已知的组合物与方法，该治疗体系包括TNF或LT的给予。用于鼻腔的制品可选用包括诸如胆汁酸盐或非离子型的聚氧乙烯醚作为渗透增强剂。制定的组合物系在pH7.4的磷酸缓冲液中含有指定剂量的干扰素及TNF或LT，甘露糖醇或其它的稳定剂或者赋形剂以及1%重量比的增强剂。其它合适的鼻腔内施用的基础组合物，美国专利4，476，116号，EP127，535A，EP122，036A，EP111，841A，及EP128，831A中作了描述。

TNF及干扰素的剂量可以一起施用或分别施用。对于后者的情况，干扰素需先施用，然后在24小时内施用TNF。根据病人的临床反应以多周期形式应用TNF及干扰素也包括在本发明范围内。在攻击无论是由于外源性加入T细胞丝裂原或由于机会感染而导致 T细胞激活，从而进入感染活动期的潜状的已感染细胞方面，这个治疗方法是有效的。

由于用TNF及干扰素进行的治疗将使受病毒感染的细胞溶化，并导致感染性病毒的释放，因而在治疗的过程中加入有进一步中和病毒感染能力的物质是有益的。可以通过几种方式来完成这一目的。其中之一，可以在治疗的过程中，最好在施以TNF的同时，施用诸如抗逆转录病毒的单克隆或多克隆抗体样的抗体。另外，对于免疫上有能力的病人可以接种抗逆转录病毒疫苗，以有效地诱发中和抗体的产生。完成这一目的合适的疫苗包括HIVgp120外壳多肽。据报导，该疫苗诱发HIV中和抗体，反过来该抗体能用于上述的被动免疫方法中。其它的用于阻止所释放病毒潜在感染力的药剂也可以与TNF合用，例如gp120外壳或其片段，它们可结合到通常逆转录病毒可识别的细胞表面受体上，但此点尚有争议，（在HIV的例子中，为存在于辅助T细胞上的OKT⁺ ₄细胞表面标记），这样可竞争性的抑制病毒粘附到靶细胞的表面。

TNF和/或干扰素协同抗病毒及抗肿瘤的活性通过在系统的治疗方法和/或组合物中加入治疗有效量的氧自由基清除剂（包括氧保护酶及过氧化活性物质）而被进一步加强。这些物质包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶或氯过氧化物酶（chloroperoxidase），可大大地增强TNF及干扰素的活性。尽管目前这些试剂加强TNF及干扰素的机制还不了解，这些酶分别催化H₂O₂分解成水和氧或催化H₂O₂+HO-R-OH→2H₂O+O＝R＝O的反应这一点是明确的。过氧化氢酶商业上可以大量地获得，并能从人类组织中诸如血红细胞中获得。过氧化酶通常是从辣根中获得。过氧化活性物质与TNF及干扰素的比例，可任意选择，大约从1000∶1∶0.1至100∶50∶25，但是该剂量及比例必须按照病人的临床情况及施药途径以及根据本领域中工作人员熟悉的各种变化情况而作 必要的调整。

TNF及干扰素可以按照同样的途径施用，也可通过不同的途径独立施用，例如通过静脉注射、鼻腔给药或通过肌肉注射施用。两个成份中任一个单独或一起可以通过持续释放的组合物如聚交酯或聚羟基丁酸酯植入物或通过如同EP17，2007A描述的微脂粒而施用，或者通过连续输送而施用。目前最好按如上提及的剂量静脉输注TNF及干扰素。

当采用大剂量时，为了避免复合疗法的副作用，TNF及干扰素可以通过在此称为过继免疫疗法的一种体外治疗关系来使用。在这些方法中，将病人的外周血液单核细胞或淋巴细胞在体外的血浆提出循环中分离出来并用白细胞介素-2（interlenkin-2）或干扰素进行处理然后再输注到病人体内。通过这样的方法大大地刺激了病人对恶性肿瘤的免疫效应。对于逆转录病毒感染的治疗除了将外周单核细胞和/或淋巴细胞在TNF或TNF及干扰素存在下培养之外，也采用相同的一般处理方法。被病毒感染的细胞被TNF或复合药剂杀死。体外细胞同样也可与有杀伤细胞活性的药剂诸如淋巴细胞有丝分裂原（例如：植物血细胞凝集素）及/或白细胞介素-2（interlenkin-2）一起培养。然后洗涤细胞并重新悬浮于输注介质中以便重新输注到原先提供该细胞的病人身上。在（细胞）再输注之后接着可以使用TNF和干扰素，以作额外的补充。施用的TNF或TNF及干扰素的最佳数量，及对病人淋巴细胞进行体外治疗的最佳条件是常规地通过测定病人的病毒滴度，及对病人临床状况的改善的评价而决定的。

按照本发明的治疗方法，是那些处于受逆转录病毒感染威胁的人，或那些显示出确实受到这种病毒感染的体征的人是治疗的候选人。那些有危险的人还包括高危人群，如同性恋者、静脉毒品使用者及那些接受了未进行抗HIV抗体筛选的输血或输入其它的血液制 品的人。受逆转录病毒感染的证据包括抗HIV抗体的血清阳转，对HIV阳性血清试验，与爱滋相关综合征（ARC）有关的症状或者是明显的爱滋病表现。因为卡波济氏肉瘤或其它的恶性肿瘤、机会性微生物感染如卡氏肺囊虫肺炎或真菌性口炎、神经损害或恶病质消耗性可诊断为爱滋病或不诊断爱滋病。

通过下列的例子本发明将更完全地被理解。干扰素是重组体细菌细胞培养物的产物并被提纯至特异性活性达到大约108单位/毫克的程度。TNF及LT也是由重组体获得的，具有大约为5×10⁷单位/毫克的特异性活性。

例1

LT或TNF增强人类干扰素-γ的抗病毒的活性

在96眼的平底盘（Falcon plastics）上以每眼2×10⁴A549细胞的密度接种于平底盘上，24小时后与连续二倍稀释的样品一起培养。样品为如图1中指明浓度的干扰素γ稀释液。该样品另外还含有0.1微克/毫升的TNF或LT，其存在于补充有5%加热去活的胎牛血清（FCS）、谷酰胺（2mM）、青霉素（100μ/ml）、及链霉素（100μg/ml）、Dulbecco改良Eagle（DME）培养基中。对照样品含有a）无干扰素及TNF或LT，b）只有TNF，或c）只有LT。在37℃下培养18小时之后，培养物的上清液用含有2%胎牛血清（但不含干扰素、TNF或LT）及感染多重性为1的EMC病毒的新鲜的DME培养基进行置换。（“MOI”，为感染性病毒/细胞的比例）。细胞致病效果（CPE）用结晶紫（Crystal violet）对生存的细胞进行染色而测定，而滴度用microelisa自动阅读器（MR580，Dynatech）定量并进一步通过肉眼观察以确证。CPE抗病毒的效价是以能抑制50%的细胞的细胞致病性的稀释度的倒数表示。同时用人类干扰素-γ的国际对照样品（NOGg23-901-530）标化。

如图1所示，在这些干扰素-γ浓度之下，LT及TNF的存在协 同地增强了干扰素γ抗病毒作用。在浓度大约为1ng/ml时干扰素γ的抗病毒效价增加很大（数据未标明）。然后当干扰素-γ本身在低而明显无效浓度时，LT或TNF对于提供靶细胞以保护是十分有用的。

例2

牛干扰素γ的抗病毒活性被人类LT或TNF增强

本方法重复例1的方法，只作以下的改动，TNF及LT浓度为1μg/ml而非0.1μg/ml，干扰素为牛的干扰素，靶细胞为牛MD-BK而病毒为VSV。CPE测定的结果列于图2。由于TNF或LT的存在再一次大大地增强了保护活性。该数据表明TNF或LT的种的来源对于提供保护作用是无关紧要的，并能用于除人之外的其它的哺乳动物。

例3

保护A549细胞免受VSV感染

本方法除了作以下的变动之外重复例1的方法，试验病毒为VSV，人类重组体干扰素γ及TNF分别配成一系列的10倍稀释及2倍稀释的溶液，TNF的起始浓度为1μg/ml、干扰素γ的起始浓度为10μg/ml。结果示于图3，为一已经用结晶紫（crystal    violet）染色的细胞培养平板。在0.0001至10μg范围的干扰素γ的浓度对于保护细胞效力是不够的，同样地当TNF的浓度从1μg/ml减少至1ng/ml时也不能显示保护细胞的效力。如图所示，被病毒感染的及未感染的对照产生了预料的结果。然而，甚至当TNF及干扰素γ的浓度分别在大约1μg/ml至1ng/ml以及10μg/ml至0.1ng/ml的范围时，TNF与干扰素γ的联合使用即能保护细胞免受VSV的感染。

例4

TNF或LT对干扰素-α及干扰素β的保护增强作用 用EMC/A549代替VSV/A549，重复例1的方法。干扰素的浓度为，干扰素α    10ng/ml，干扰素β    10ng/ml。如图4a所示干扰素α及干扰素β（在较低程度）显示出与人类TNF或LT的抗病毒协同作用。如图4b所示，用MDBK/VSV及牛的干扰素α及γ得到同样的效果。

例5

对病毒复制的协同抑制

将A549细胞接种于24眼的组织培养平板（costar）24小时后用不同浓度的人类LT、TNF或干扰素γ处理18小时，除去培养基之后加入EMC、VSV、腺病毒-2（Ad-2）及单纯性疱疹病毒-2（HSV-2）。EMC、VSV、Ad-2及HSV-2的感染的多重性分别为1、1、100及100。TNF、LT及干扰素γ的浓度在0.1ng/ml至10μg/ml的范围内。经历2小时的吸附过程之后，将上清液吸出以去除未吸附的病毒，该细胞在37℃下在含有5%FCS的培养基中培养。24小时之后，培养物（细胞及培养基）进行两次冰冻融化以溶解细胞，在400×g下离心10分钟之后用Rager-Zisman等在“Proc.Soc.EXP.Med.”142：1174-1179（1973）中描述的空斑测定法测定病毒产量。胞溶产物的系列稀释液与A549细胞相混合并在37℃下培养2小时。吸出上清液，在上面铺一层含有5%FCS及0.7%琼脂糖的培养基。24-28小时之后，空斑用甲醛固定用结晶紫染色，目测空斑。以形成空斑单位/毫升（PFU/ml）表示病毒产量并将结果列于图5A至5D中。这些数据图表明了对抗病毒活性的协同促进作用，尤其是在低干扰素-γ浓度时。

例6

对受病毒感染的细胞的协同杀伤

采用MOI为10的VSV并且不与干扰素、TNF或LT一起预 培养。将例1的方法重复，VSV与细胞在37℃下培养4小时，然后将病毒从受感染的细胞上洗去。然后，如表2所示，对这些受感染的及未受感染的细胞用0.1μg/ml的LT、干扰素γ单独或联合方式处理。在37℃之下经历了12至18小时后，用台盼蓝或propidium碘化物进行染色以测定细胞存活率。结果列于下面的表2中。

表2

存活数量（%）

细胞处理    未感染    VSV感染

12小时    18小时    12小时    18小时

对照    100    92    70

LT    100    41    29

TNF    100    38    31

干扰素γ    100    91    66

LT+干扰素γ    100    14    0

TNF+干扰素γ    100    12    0

表2显示当干扰素γ与TNF或LT合用时受病毒感染的细胞被协同地杀死。将以上一些例子的结果总和起来考虑，可以认为TNF或LT加上干扰素的联合应用抗病毒感染的机制有两个：其一为未感染的细胞提供保护作用，其二为杀死受病毒感染的细胞。

例7

HIV感染的预防

将OKT4⁺阳性人类T细胞白血病细胞系H9、HuT78及U937悬浮于RPMI-1640培养基中，于37℃下进行培养。将培养物离心以从培养基中分离出细胞，并将细胞以1×10⁶/ml密度重新悬浮于新鲜的RPMI-1640培养基中。将足够量TNF-α及干扰素γ加入再悬浮的培养物以达到0.1μg/mlTNF-α及0.1μg/ml干扰素γ的浓度。TNF-α及干扰素γ的联用对未受感染的HuT78及H9细胞没有 毒性。培养物再在37℃下培养24小时，然后每毫升加入1×10⁶cpm单位的HIV。cpm单位用逆转录酶活性来测定（31）;每一单位校正到表示每一个病毒粒的逆转录酶活性。在37℃下再培养3天之后，将细胞采用鼠抗HIV的P₂₄（核心）蛋白的单克隆抗体及标记的山羊抗鼠免疫球蛋白（32）进行间接的免疫荧光法对病毒的抗原进行筛选。重复实验的结果以含有HIV核心蛋白的细胞的百分数形式列于下面。

表3

试剂    感染细胞的百分数

HuT78    H9    U937

1    2    1    2    1    2

对照    54    68    48    36    11    14

TNF-α    27    34    32    18    7    8

干扰素γ    63    51    42    41    12    11

TNF-α及干扰素γ    1    8    4    3    2    1

这些结果表明了TNF与干扰素的联合治疗对于预防敏感的T细胞免受HIV感染也高度有效。

例8

HIV感染细胞的治疗

将含有1×10⁵H9及RPMI-1788淋巴母细胞（lymphoblastoid）/毫升的RPMI1640培养基在有1μg/ml聚凝胺存在的情况下加入1×10³cpmHIV/ml以提高细胞受HIV感染的百分率。这些细胞培养30天左右的时间，在此期间每隔3至5天换一次培养基，大约每隔一周进行一次细胞亚培养（subculture）。足够的TNF-α及干扰素γ一起同时加到含有1×10⁶细胞/ml的培养物中，以建立下面 的如表4所示的浓度体系。这些浓度的TNF-α及γ干扰素联用对于未受感染的H9及RPMI-1788细胞没有细胞毒作用。培养物在37℃下培养3天，然后用台盼蓝染色测定存活细胞的百分数。重复的实验结果列于表4（ND＝未进行）。

表4

药品（试剂）    浓度    存活细胞百分数

H9    1788

1    2    1    2

对照    /    89    76    95    86

TNF-α    1.0ng/ml    ND    ND    90    81

0.1μg/ml    73    70    81    76

干扰素γ    1.0ng/ml    ND    ND    83    84

0.1μg/ml    85    74    80    82

TNF-α    1.0ng/ml    ND    ND    68    72

+干扰素γ    0.1μg/ml    50    42    34    53

这些结果表明，TNF与干扰素的联用以及在较低程度上单独使用的TNF-α对于病毒感染细胞有浓度依赖性的杀伤作用。这一特性及与TNF或该联合形式对未感染细胞的保护作用一起显示了TNF或联合疗法对于治疗逆转录病毒感染的价值。

例9

TNF及联合疗法使HIV复制减少

HuT78细胞用TNF-α及干扰素γ各0.1μg/ml处理，然后按照例7方法用HIV对其进行感染。在37℃下培养2天之后，按下述方法将HIV感染细胞中的所有的RNA萃取出来。细胞用PBS洗涤 并在0℃左右重新悬浮于含0.5%NP-40及17μlVRC（BRL）的0.35ml TSM缓冲液（10mM Tris pH7.5，0.15M NaCl，2mM MgCl₂）中。3至5分钟后，离心取出溶解细胞的核。将含有mRNA的上清液加入到含有1%SDS的0.35ml的TSE缓冲液中（10mM Tris pH7.5，0.15MNaCl，5mM EDTA）并用0.7ml的苯酚∶氯仿∶异戌醇（24∶24∶1）抽提液抽提三次。苯酚用水及0.1%8-羟基喹啉平衡。RNA从含有乙醇及乙酸钠的水层中沉淀出来。Poly（A）RNA通过oligo（dT）纤维素膜电泳而制备（36）。按照介绍的方法使用1μg RNA/lane进行Northen杂交（37）。图6的结果表明用TNF-α预处理可以抑制宿主细胞中HIV RNA的出现，但是当同时使用TNF及干扰素时出现的RNA就远远地减少了。这些结果与列于表3中的感染力数据是一致的。据观察用或不用TNF及干扰素进行处理时，肌动蛋白（actin）（一种结构蛋白）mRNA都没有变化，表明一般说来TNF-α及干扰素的作用是针对病毒的而不是针对细胞生长。

例10

爱滋病或爱滋相关综合征患者治疗方案

记载的案例为，HIV抗体血清阳性的男性，且其血液作体外细胞培养显示出HIV的效价。这些病人一般都呈现出爱滋或爱滋相关综合症的症状，并且由血清转换产生HIV抗体。这个治疗小组根据下列的治疗变异性分成若干个班：

1.同时或连续的用TNF及干扰素治疗。

2，静脉或肌肉注射，对于静脉注射的情况，采用浓缩剂（bolus）或者持续的输注（1，2，5及10天）。

3，数小时的剂量系统治疗，按以下浓度开始，1μg/m²TNF及1μg/m²干扰素及每一药剂浓度增加至5，10，25，50……μg/m²以至可以耐受的最高浓度。

4，TNF与干扰素的比例为1∶100至100∶1

5，重复的治疗周期：重复1至5次，每次间隔1、2、5或10天。

6，干扰素类型的选择及比例：α及γ，1∶10至10∶1;β及γ，1∶10至10∶1;γ，α或β单独使用1∶1∶1至10∶1∶1至1∶5∶5。

合适的初始疗法包括对于爱滋相关综合征病人施用TNF-α、γ干扰素及α干扰素的联合治疗。联合治疗通过采用一个校正的静脉输注泵进行连续的静脉输注，输注剂量为TNF-α：1-10μg/m²/24小时;γ-干扰素：1-10μg/m²/24小时;α-干扰素1-10μg/m²/24小时。病人施用的剂量可以在能耐受的范围内逐渐上升。输注持续一周。病人休息一周之后进行再次输注。出现的发热、寒战和类似的副作用可以用惯常的方法或减少剂量来处理。在上述的联用时，当抗HIV抗体或g P120env作为抗病毒剂采用的抗体或env多肽的剂量按照能够分离由联合疗法所释放的病毒粒的计算值来确定。这一点将依赖于抗体对病毒粒的亲和性及其中和效价以及病人病毒的效价的确定。确定合适的剂量是专业人员的工作范围。

病人的临床状况及病毒感染性效价在治疗中及治疗后的记录中作了监测。与例7-9中体外研究一致，本治疗方法的结果，病人的免疫力及病毒效价的比例情况获得令人满意、相当的改善。

例11

过氧化氢酶增强干扰素γ和/或TNF-α抗病毒活性

将A549细胞以每眼2×10⁴只的密度载种于96眼的平底盘（falcon plastics），24小时之后与试样一起培养。试样如图7所示（CAT”为过氧化氢酶）。样品还含有Dulbecco改善的Eagle's（DME）培养基并补充有5%加热去活的胎牛血清（FCS）、谷胺酰（2mM）、青霉素（100单位/毫升）及链霉素，（100μg/ml）。在37℃下培养18小时，将培养物上清液换以新鲜的不含干扰素、TNF或过氧化氢酶但含有2%的胎牛血清及感染多重性（“MOI”，为感染性病毒/细胞的比例）为1的EMC病毒的DME培养基。用结晶紫 对存活细胞进行染色以测定致细胞病变的效果（CPE），并用microelisa自动阅读器（MR580，Dynatech）作效价的定量测定并进一步通过用目测来确证。

CPE抗病毒的效价是以能抑制50%细胞的细胞病变的稀释度的倒数表示，同时以人干扰素γ（NO.Gg23-901-530）的国际对照样品标化。

如图7所示，过氧化氢酶显著地并且协同地增强干扰素γ及TNF-α的抗病毒作用。这种作用并非只限于EMC病毒。它可在多种适用的细胞及病毒观察到。

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Claims (10)

1、一种抗病毒组合物的配制方法，其特征在于：将抗病毒有效剂量的干扰素、TNF及药物学上可接受的载体混合，其中TNF与干扰素的重量比为1000∶1至1∶1。

2、按权利要求1所述的方法，其特征在于：所述组合物为一种气雾剂。

3、按权利要求1所述的方法，其特征在于：所述组合物中的所述干扰素为干扰素γ。

4、按权利要求1所述的方法，其特征在于：所述组合物还包括LT。

5、按权利要求1所述的方法，其特征在于：所述组合物中还包括氧自由基清除剂物质。

6、按权利要求5所述的方法，其特征在于：所述氧自由基清除物质为有过氧化活性的物质。

7、按权利要求6所述的方法，其特征在于所述组合物中各组分的重量比为：有过氧化活性的物质∶TNF∶干扰素＝1000∶1∶0.1-100∶50∶25。

8、按权利要求6所述的方法，其特征在于：所述有过氧化活性的物质选自过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶或氯过氧化物酶。

9、按权利要求8所述的方法，其特征在于：所述过氧化氢酶为人红细胞过氧化氢酶。

10、按权利要求1所述的方法，其特征在于：所述组合物还包括一种针对逆转录病毒外壳多肽的抗体。

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