DK169234B1 - Farmaceutisk præparat til prophylaxe og behandling af retrovirusinfektioner - Google Patents

Description

i DK 169234 B1

Denne opfindelse angår et farmaceutisk præparat til behandling af dyr, som er blevet inficeret med retrovirus, eller som risikerer udsættelse for retrovirusinfektion. Opfindelsen går især ud på i pattedyrceller at inducere 5 en tilstand af resistens overfor retrovirusinfektion og at behandle retrovirus-inficerede mennesker.

Opfindelsens baggrund 10 Opfindelsen beskæftiger sig især med terapien af retro-virus-infektioner, som fører til immunologiske defekter, mere specifikt de infektioner, som menes at være ansvarlige for erhvervet immundefektsyndrom (AIDS).

15 AIDS er en overførbar defekt ved cellulær immunitet, som er karakteriseret ved opportunistiske infektioner og visse ondartede lidelser, navnlig Pneumocystis carinii lungebetændelse og Kaposi's sarcoma, hos patienter uden anden erkendt årsag til at få disse sjældne sygdomme (1-3).

20 AIDS manifesteres ved en lymphopenia, en generaliseret cutan anergi og et tydeligt reduceret proliferativt respons på mitogener, antigener og allogeniske celler, der synes at stamme fra udtynding af 0KT4+ T-lymphocyt-under-mængden (4). Selvom humoral immunitet er relativt upåvir- 25 ket, er der stadig flere vidnesbyrd om et hyperaktivt B-celle-proliferativt respons, som kan relateres årsagsmæssigt til den høje forekomst af B-lymphoma hos AIDS-pati-enter (5,6). Foruden det fuldt udviklede syndrom er der forekommet en epidemi af en beslægtet sygdom, AIDS-rela- 30 teret kompleks (ARC), som er karakteriseret ved generaliseret kronisk lymphadenopathia. Dette syndrom har mange af de epidemiologiske træk og immun-abnormaliteter fælles med AIDS og kommer ofte før de kliniske manifestationer af AIDS.

35

Nylige vidnesbyrd har stærkt impliceret et lymphocyto-tropt retrovirus som det primære ætiologiske agens for DK 169234 B1 2 AIDS og det AIDS-relaterede kompleks. Lymphadenopathia-forbundet virus (LAV) blev først isoleret fra dyrkede lympheknude-T-celler hos patienter med lymphadenopathia og AIDS såvel som en AIDS-patient og en asymptomatisk 5 søster eller bror, begge med haemophilia B (7-9). Et lignende virus betegnet humant T-lymphotropt virus type III (HTLV-III), er blevet isoleret fra et stort antal AIDS-og ARC-patient-blodprøver ved dyrkning sammen med den permissive T-celle-linie H9 (10,11). LAV og HTLV-III, så-10 vel som beslægtede retrovirus, der fornylig er isoleret fra AIDS-patienter (12,13), har flere vigtige egenskaber fælles. Viral replikation sker i 0KT4+ T-lymphocyt-popu-lationen in vivo og in vitro og er forbundet med skadet celleformering og forekomsten af cytopatiske virkninger 2+ 15 (8,10,14). Viruset har en Mg -afhængig revers trans- kriptase, udviser en tæt cylindrisk kernemorphologi, der minder om type D retrovirus (8,13,15) og genkendes af antistoffer fundet i seraene hos praktisk taget alle AIDS-og ARC-patienter (8,13,16-21). HTLV-III og LAV antages nu 20 at være stammer af det samme virus, som er blevet givet navnet human-immundefekt-virus (HIV).

Immunfunktionen hos AIDS- eller ARC-ramte patienter er alvorligt kompromitteret. Imidlertid er den præcise art 25 af de abnormaliteter, som induceres af HIV, stadig under undersøgelse. Af særlig interesse var virkningen af HIV-infektion på immuncellernes produktion af lymphokiner hos sådanne patienter såvel som deres responser på exogent indgivne lymphokiner.

30

Af 16 AIDS-patienter prøvet for T-lymphocyt-kapacitet til at secernere makrofag-aktiverende produkter, herunder r-interferon, var der 14, som ikke frembragte aktive lymphokiner, og 13-14, som slet ikke kunne secernere r-in-35 terferon. Endvidere viste makrofager fra patienter med AIDS forhøjet antimikrobiel aktivitet, når de blev inkuberet in vitro med r-interferon, hvilket hæver sandsyn- DK 169234 B1 3 ligheden for, at sådanne celler kan respondere in vivo på exogent indgivet *-interferon (22,24).

Lymphocyter fra AIDS-patienter er også blevet rapporteret 5 at være deficiente med hensyn til deres evne til at producere interleukin-2, et lymphokin, som spiller en rolle i formeringen og differentieringen af T-lymphocyter, og som stimulerer a-interferon-produktion (23).

10 Endelig var r-interferon kendt for at udøve en direkte antiviral virkning på celler inficeret med vesiculær-sto-matitis-virus (VSV) og at forstærke virkningen af et cytokin på VSV-inficerede celler (25). Dette cytokin blev foreløbigt indenficeret af disse forfattere som det poly-15 peptid, der i denne beskrivelse betegnes som tumornecro-sefaktor-α; se også Eifel et al., "Cell. Immun." 47: 197-203 (1979). Immunsuppleringsterapi for AIDS forekom derfor at være en lovende mulighed, og kliniske undersøgelser med patienter blev igangsat.

20

Trods forventningerne til lymphokin-terapi af AIDS-pati-enter har in vivo resultaterne været skuffende. I modsætning til de resultater, som blev mødt ved in vitro forsøg, viste et langvarigt forløb af intravenøs behandling 25 med rekombinant r-interferon sig at inhibere snarere end at forhøje respiratorisk monocytbristningsfunktion (26), og intravenøs behandling af AIDS-patienter med varierende doser af interleukin-2 eller r-interferon førte til den konklusion, at in vivo lymphokin-terapi ikke var af væ-30 sentlig værdi ved behandling af patienter med AIDS (27). Faktisk havde der ved tidspunktet for den foreliggende opfindelse udviklet sig en tankeretning, som sagde at immunstimulerings- eller rekonstruktionsvejen til AIDS-terapi faktisk var "farlig", fordi lymphokiners celleak-35 tivering mentes at medvirke til virusspredning og T4-cel-le-udtynding og således ville fremskynde sygdommens gang (28). I juni 1986 angav Yamamoto et al. (29), at humane DK 169234 Bl 4 α- og &- (men ikke r-) interferoner undertrykte in vivo replikationen af HIV-stammer, men når udsættelsen for interferoner ophørte, blev den virale produktion af inficerede celler forhøjet. Dette tydede yderligere på, at 5 immunterapi af AIDS ville give det modsatte resultat.

Endelig er det blevet foreslået, at lymphotoxin produceres af HIV-inficerede T-celler ved viralt induceret transaktivering af T-cellens endogene lymphotoxin-gen, 10 hvilket fører til sekretion af autotoxiske mængder af lymphotoxin (35).

Interferoner er blevet anvendt med varierende virkning til prophylaxe eller behandling af kroniske, akute og/el-15 ler eksperimentelle infektioner af virus, såsom vaccinia, rubella, herpes simplex, varicella-zoster, skoldkopper, cytomegalovirus, adenovirus, ebolavirus, rabies og hepatitis B. Kroniske cytomegalovirus-infektioner har vist sig vanskelige at behandle med interferoner, selv under 20 anvendelse af meget højere doser end det var nødvendigt til forhindring af CMV-infektioner; disse doser kan involvere uønskede bireaktioner, såsom neutropenia og undertrykkelse af tilvækst. I overensstemmelse hermed ville det være ønskeligt hos patienter med persistente eller 25 kroniske virusinfektioner at tilvejebringe et interferonpræparat, som er mere effektivt uden at inducere interferonbivirkninger .

Interferoner er også blevet bredt prøvet for deres evne 30 til at forhindre eller behandle den almindelige forkølelse (primært rhinovirus-infektioner). De fleste undersøgelser har anvendt intranasalt indgivne daglige doser i området fra 0,8 x 106 til 42,8 x 106 enheder (Finter et al., 1985, Interferon Vol. 4, side 186-187). Imidlertid 35 bør det forstås, at forholdet mellem de specifikke aktiviteter, som er rapporteret af tidlige forskere, og de internationale standarder, som nu er i anvendelse, er DK 169234 Bl 5 uklar; de anvendte doseringer kunne, udtrykt i internationale enheder, have været større eller mindre. Intrana-sal indgivning var almindeligvis som aerosol, selvom ind-givningen ved hjælp af gennemvædet tampon er blev rappor-5 teret som mere effektiv. Typisk opdeles den daglige dosering i aliquoter og indgives 1-3 gange pr. dag. Erfaring med rekombinante interferoner har vist, at sprøjtninger, som afleverer omkring 1 x 106 enheder/dosis (ved 0,1 ml/næsebor) var effektive med hensyn til at tilføre be-10 skyttelse, medens doser på 1/10 eller 1/100 af dette ikke havde nogen detekterbar virkning (Finter et al., op. cit., side 188). Imidlertid er doser på omkring 1 x 106 enheder af interferon blevet forbundet med generende, mild næseirritation, og større doser er udpræget irrite-15 rende (Finter et al., Id.).

Interferoner er opså blevet indgivet i form af øjendråber for at behandle herpes simplex-virus-konjunktivitis og intravenøst og intraperitonealt som injektioner eller in-20 fusioner til behandling af forskellige virus-infektioner. Øjendråber indeholdt typisk mere end ca. 1 x 106 enheder interferon/ml (et præparat indeholdende 60000 enh./ml blev rapporteret ikke at tilføre nogen klinisk nytte; Sundmacher et al., 1976, "J. Infect. Dis." 133:A160-A164.

25 Intravenøse doser overskred almindeligvis også 1 x 10* enh./patient, selvom tidligere forskere tvunget af de rå interferonpræparater, som den gang var til rådighed, nødvendigvis anvendte lavere doser. Som resultat af disse undersøgelser menes interferoner almindeligvis ikke at 30 være så effektive til behandling af etablerede virus-in fektioner, som de er til forhindring af dem. Der er behov for interferonpræparater, som udviser forhøjet aktivitet over for aktive infektioner, og som udviser højere beskyttende styrke, for at der kan anvendes lavere interfe-35 rondoser.

DK 169234 B1 6

Tumornecrosefaktor (Pennica et al., 20/27. Dec. 1984, "Nature" 312:724) og lymphotoxin (Gray et al., 20.27.

Dec. 1984, "Nature" 312:721) er proteiner, som produceres af aktiverede makrofager og lymphocyter og i denne be-5 skrivelse med krav betegnes henholdsvis "TNF" (eller "TNF-α") og "LT" ("eller TNF-Æ"). Begge er direkte cyto-toxiske overfor tumorceller in vitro og in vivo og udviser synergi med interferoner i denne henseende (Lee et al., 1984, "J. Immun." 133-1083). Imidlertid var hverken 10 TNF eller LT i sig selv kendte for at have nogen direkte antiviral beskyttende aktivitet. TNF-α er blevet foreslået at være ansvarlig for afmagring og cachexia hos patienter med cancer af alvorlige infektioner (34), og passiv immunisering overfor TNF-α blev rapporteret at beskytte 15 mus overfor den dødelige virkning af endotoxin (30). TNF-a's antitumorvirkning vides at forstærkes synergistisk af interferoner, og TNF-s antitumorvirkning forstærkes på lignende måde af interferon- r. Antitumor-virkningerne af TNF-α og TNF-/5 i blanding er imidlertid kun additiv lige-20 som de antivirale virkninger af interferon-a og -0.

Det er opfindelsens formål at forhøje interferoners antivirale aktivitet uden at forøge forekomsten af interferonbivirkninger. Et yderligere formål er at forhøje in-25 terferoners antivirale specificitet. Endnu et formål er at anvende interferoner ved prophylaxen af individer overfor retrovirus-infektion. Det er også et formål for denne opfindelse at anvende immunterapi til heldig behandling af personer inficeret med retrovirus, især lym-30 phocytotrope virus, såsom HIV. Et yderligere formål er at behandle dem, der har risiko for aktiv retrovirusinfek-tion, f.eks. personer, som huser latent retrovirus. Endnu et formål er at tilvejebringe immunterapeutisk prophylaxe overfor retrovirusinfektioner.

35 DK 169234 B1 7

Sammenfatning af opfindelsen

Opfindelsens formål opnås med et farmaceutisk præparat til prophylaxe og behandling af retrovirusinfektioner, 5 især infektioner af humant immundefekt-virus (HIV), som er særegent ved, at det omfatter en interferon og en tu-mornecrosefaktor (TNF) samt et oxygen-friradikal-fjernende stof.

10 Uanset fraværet af nogen kendt antiviral beskyttende aktivitet hos TNF alene, forhøjer TNF synergistisk den an-tivirale aktivitet af interferoner. Typisk og helt uventet forøges aktiviteten af interferon med fra omkring 2 til over 100 gange ved inkludering af TNF i interferon-15 præparatet. Den største virkning iagttages med r-interferon.

Der tilvejebringes interferonpræparater, som ved tidspunktet for denne opfindelse ville være blevet troet at 20 indeholde utilstrækkeligt interferon til terapeutisk anvendelse, inklusive enten antivirale eller antitumor-anvendelser. Disse interferondoser er mindre end ca. 500000 internationale enheder, almindeligvis mindre end 25000 enheder. De gøres effektive ved inklusionen deri af TNF i 25 en mængde, som i sig selv er utilstrækkelig til at vise TNF-toxicitet, men tilstrækkelig til at forhøje den antivirale aktivitet af interferon.

Uventet har det vist sig, at indgivning af en terapeutisk 30 effektiv mængde af en tumornecrosefaktor i kombination med en interferon og et oxygen-friradikal-fjernende stof tilfører beskyttelse hos personer med risiko for retrovi-rusinfektion og dræber retrovirus-inficerede celler. Selvom r-interferon alene kun udøver lidt eller ingen be-35 skyttende aktivitet overfor retrovirusinfektion og heller ikke er væsentligt cytotoxisk overfor retrovirus-inficerede celler, og TNF alene kun er moderat aktiv i høje DK 169234 B1 8 koncentrationer, er kombinationen af disse to midler og et oxygen-friradikal-fjernende stof dramatisk kraftig. Dette fænomen iagttages in vivo trods immunsystemernes derangerede tilstand hos retrovirus-inficerede patienter.

5 Dette resultat var særligt overraskende, fordi TNF ikke var kendt for at være deficient hos sådanne patienter.

Kort beskrivelse af figurerne 10 Fig. 1 og 2 belyser den dramatiske forøgelse i interferon-r-antiviral aktivitet, når interferon-r anvendes i kombination med LT eller TNF.

Fig. 3 afbilder en cellekultur, som er blevet beskyttet 15 mod virusinfektion med varierende koncentrationer af TNF og interferon-r.

Fig. 4a og 4b viser, at den antivirale aktivitet af interferon-a, -ΰ eller -r forhøjes af TNF eller LT.

20

Fig. 5a-5d belyser, at inhibering af viral replikation med interferon-r forstærkes af TNF eller LT.

Fig. 6 er en Northern-gel, som viser den dramatiske re-25 duktion i HIV-mRNA i HIV-inficerede HuT78-celler efter forbehandling med TNF-α og IFN-r sammenlignet med kontrolceller, som ikke var forbehandlet.

Fig. 7 påviser den antiviralt beskyttende virkning af 30 katalase i kombination med TNF-α og/eller IFN-r.

Detailbeskrivelse

Fremgangsmåden og præparaterne ifølge opfindelsen er nyt-35 tige til forhindring eller behandling af aktive eller latente infektioner med DNA-virus, enkeltstrengs-RNA- eller dobbeltstrengs-RNA-virus, herunder uden begrænsning DK 169234 B1 9 adenovirus, herpesvirus, papovavirus (inklusive abevirus 40, papilloma- og polyoma-virus), poxvirus, såsom variola minor og vaccinia, arbovirus, adenovirus, coronavirus, myxovirus (pseudohønsepest, fåresyge, mæslinger og 5 respiratorisk syncytialvirus), rhinovirus, paramyxovirus, såsom influenzavirus A, B eller C, parvovirus, picorna-virus, togavirus, retrovirus (inklusive HTLV-I, II og III), reovirus og rotavirus. Andre specifikke virus inkluderer rubella, herpes simplex, varicella-zoster, 10 skoldkopper, cytomegalovirus, ebolavirus, rabies og hepatitis B.

Retrovirus defineres som virus indeholdende enkelt- eller dobbeltstrenget RNA. Disse virus repliceres ved at tøjle 15 cellemetabolismen hos permissive værter til at revers-transkribere virusets RNA-genetiske materiale. De store mængder således produceret DNA translateres til HIV-pro-tein og -RNA til samling af afkoms-virioner. Eksempler på sådanne virus inkluderer de såkaldte "langsomme" eller 20 lentivirus og T-celle-leukæmi-virus, såsom HTLV-I og HTLV-II, men er først og fremmest HIV-(tidligere kendt som HTLV-III)-stammerne forbundet med AIDS.

Interferoner er velkendte. I naturen omfatter de 0- og r-25 interferon og de omkring 20 forskellige interferon-α-undertyper. Deres mest relevante egenskab til opfindelsens formål er, at de er i stand til at beskytte celler in vitro og in vivo mod virusinfektion. De interferoner, der anvendes i præparatet ifølge opfindelsen, er typisk in-30 terferon-β, -0 eller -r, hvor interferon-r foretrækkes. Interferoner produceret i rekombinant cellekultur ud fra naturlige isolater eller af stabile utransformerede cellelinier er tilfredsstillende til anvendelse i forbindelse med opfindelsen ligesom varianter med hensyn til in-35 terferon-aminosyresekvens eller glycosylering (inklusive uglycosylerede former), sålænge de udviser antiviral aktivitet. Interferon-t bør være fra den samme dyreart, for DK 169234 Bl 10 hvilken terapien er beregnet, fordi interferon-r vides at være artsspecifik. Den foretrukne interferon er human interferon- τ. Interferonerne er ønskeligt i det væsentlige homogene og vil have en specifik aktivitet på over ca.

5 1 x 106 internationale enheder/mg.

TNF inkluderer produkterne af rekombinant eller utrans-formeret cellekultur, inklusive varianter med hensyn til aminosyresekvens. Da TNF ikke er artsspecifik i dens evne 10 til at give synergi med interferoner, er TNF fra én art nyttig ved terapien af en anden. Fortrinsvis anvendes i denne beskrivelse med krav human moden TNF.

TNF-α eller TNF-/5 anvendes alene eller i blanding med 15 hinanden i mængder, som empirisk bestemmes at frembringe det mest effektive kliniske respons. TNF er ikke artsspecifik, så TNF'er fra andre dyrearter, f.eks. svin eller okse, er nyttige til opfindelsens formål. Den foretrukne TNF er moden human TNF-α fra rekombinant mikrobiel celle-20 kultur. TNF'en vil almindeligvis have en cytolytisk aktivitet på modtagelige L-929-museceller på over ca. 1 x 106 enh./mg, hvor en enhed er defineret som anført i de ovenfor angivne patentansøgninger, hvis indhold betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved henvisning.

25

Præparaterne ifølge opfindelsen inkluderer et farmaceutisk acceptabelt medium, såsom dem, der tidligere er anvendt ved terapeutisk indgivning af interferoner eller TNF, f.eks. fysiologisk saltopløsning eller 5% dextrose-30 opløsning, sammen med konventionelle stabilisatorer og/eller excipienter, såsom humant serumalbumin eller mannitol. Præparaterne tilvejebringes lyophiliseret eller som sterile vandige opløsninger.

35 Flere variable vil blive taget i betragtning af den almindelige fagmand ved bestemmelse af mængderne af interferon-a, -0 eller -r og af TNF-α eller TNF-5, nettofor- DK 169234 B1 11 holdet mellem interferon og TNF, koncentrationen af interferon og TNF i de terapeutiske præparater og de doseringer, som skal indgives på kg-basis. Terapeutiske variable inkluderer også de dyrearter, som skal behandles, 5 indgivningsvejen og patientens kliniske tilstand (her under stadiet og graden af retrovirusinfektion og/eller eventuelt infektion med anden organisme ved behandlingens begyndelse). Doser af interferon i området fra omkring 1 til omkring 50 ug/m2 er egnede startdoseringsniveauer.

10 Den tolererede dosis vil eventuelt ikke overskride ca. 25 ug/m2.

Egnede doser af interferon i området fra omkring 50% til omkring 0,1% af dem, der hidtil er antaget at være de mi-15 nimale effektive doser, er nyttige i kombination med TNF til at tilføre resistens over for virus-infektion og til dræbning af viralt inficerede celler. Disse doser vil være i området op til ca. 500000 internationale enheder/70 kg patient, men er typisk mindre end ca. 100000 enh./70 20 kg. Det relative vægtforhold mellem interferon og TNF ligger almindeligvis i området fra ca. 1000:1 til 1:1, hvor ca. 100:1 foretrækkes. Terapeutiske præparater er typisk vandige opløsninger indeholdende fra omkring 1 x 103 til omkring 1 x 10B int. enh. interferon/ml og fra 25 omkring 1 ng til omkring 5 ug TNF/ml. Disse præparater indgives intranasalt, intraperitonealt eller intravenøst, afhængigt af den virusinfektion, som skal forebygges eller behandles. Intranasale doser er almindeligvis mindre end ca. 25000 internationale enheder (i 0,1 ml volumen), 30 medens intravenøse doser er mindre end ca. 500000, almindeligvis mindre end 100000 internationale enheder.

Den synergistiske antivirale beskyttende virkning af interferoner sammen med TNF er bredt anvendelig på alle 35 pattedyr. De cellelinier, der er anført i den følgende tabel 1, blev podet i 24 hullers vævskulturplader og præinkuberet med TNF plus interferon- r. Alle blev beskyttet DK 169234 B1 12 (bestemt ved cytopatisk virkning) i det mindste i nogen grad mod infektion med EMC, VSV og HSV-2 ved multipla af infektivitet på henholdsvis 1, 1 og 100.

5 TABEL 1 A) Humane cellelinier B) Ikke-humane celler 1. A549 (lungecarcinoma) 1. 3T3 (musefibroblast) 10 2. HT-1080 (lungefibro- 2. C127 (museepithel- sarcoma) celler) 3. Hela (cervical carci- 3. Raw-264 (musemakro- 15 noma) fag) 4. T24 (blæretumor) 4. Rat-1 (rottefibroblast) 5. HT29 (colontumor) 5. NRK (normal rottenyre) 20 6. 7860 (renal tumor) 6. PK15 (svineceller) 7. ST486 (lymphoide cel- 7. MDBK (okseceller) ler) 25 8. R8226 (lymphoide cel ler) 30 35 DK 169234 B1 13 I overensstemmelse hermed er præparatet ifølge opfindelsen nyttigt med hensyn til at tilføre beskyttelse overfor virusinfektioner på pattedyr, herunder mennesket, kvæg, svin, fjerkræ og heste. Patienter kan eventuelt vides at 5 huse tumorer eller ondartede sygdomme.

Præparatet ifølge opfindelsen er særlig nyttigt til pro-phylaxe af højsmitsomme virusinfektioner, som kan forekomme i tætte populationer af landbrugsdyr, først og 10 fremmest pseudohønsepest hos høns og "shipping fever" hos kvæg. I modsætning til vacciner er de her omhandlede præparater effektive overfor alle virus, uanset mutationer der måtte forekomme i den virale population, og som kunne gøre en vaccine ineffektiv, og de kan indgives med 15 hurtig beskyttende virkning efter det første tegn på et epidemisk udbrud, hvorved man undgør behovet for at vaccinere en hel population af dyr.

Præparatet er også nyttigt til prophylaxe af luftvejsin-20 fektioner. De, som har risiko for udsættelse, f.eks. de, der har et familiemedlem, som har fået en almindelig forkølelse, vil indtage interferon og TNF til beskyttelse mod infektion. Den mest hensigtsmæssige indgivningsvej for virus overført i dyr eller mennesker via luftvejene 25 er ved intranasal sprøjtning eller tampon. Denne behandling vil anvende de kendte præparater og fremgangsmåder, undtagen at der kun behøver at anvendes en brøkdel af den mængde interferon, som tidligere er anvendt, og behandlingsforskriften inkluderer indgivningen af TNF. Intrana-30 sale præparater inkluderer eventuelt permeationsforhøjere, såsom galdesyresalte eller ikke-ioniske polyoxyethy-lenethere. Sammensætningerne vil indeholde de angivne doser af interferoner og TNF, mannitol eller andre stabilisatorer eller excipienter og 1 vægt-% permeationsforhø-35 jer i pH 7,4 phosphatpuffer. Andre egnede intranasale grundsammensætninger er beskrevet i US patentskrift nr.

4 476 116 og EP offentliggørelsesskrifterne nr. 127 535 DK 169234 B1 14 A, nr. 122 036 A, nr. Ill 841 A og nr. 128 831 A.

TNF- og interferon-doserne indgives sammen eller separat. Hvis det sidstnævnte er tilfældet, bør interferonen ind-5 gives først og TNF'en derefter inden for 24 timer. Det er indenfor opfindelsens omfang at indgive TNF'en og interferonen i flere ganges cyklus, afhængigt af patientens kliniske respons. Denne behandlingsmåde vil være effektiv med hensyn til at angribe latent inficerede celler, som 10 træder ind i den aktive infektionsfase, hvad enten det skyldes enogent indgivne T-celle-mitogener eller ekstra infektioner, som fører til T-celle-aktivering.

Da behandlingen med TNF og interferon vil lysere viralt 15 inficerede celler og kan resultere i frigørelsen af in-fektivt virus, er det fordelagtigt under terapiens forløb at indgive stoffer, som er i stand til at neutralisere yderligere viral infektivitet. Dette kan gennemføres ved flere metoder. Man kan indgive antistoffer, såsom mono-20 klonale eller polyklonale antiretrovirale antistoffer under terapiens forløb, fortrinsvis samtidig med at der indgives TNF. Alternativt kan immunologisk kompetente patienter vaccineres overfor retroviruset for aktivt at inducere neutraliserende antistof. En egnet vaccine til 25 dette formål indeholder HIV gpl20 hylsterpolypeptid. Denne vaccine angives at inducere HIV-neutraliserende antistoffer, som igen kan anvendes ved den ovenfor beskrevne strategi med passiv immunisering. Andre midler, som modvirker den potentielle infektivitet af frigjort virus, 30 kan også indgives sammen med TNF’en, f.eks. gpl20 env. eller fragmenter deraf, som bindes til den celleoverfladereceptor, der almindeligvis genkendes af det pågældende retrovirus (i tilfælde af HIV, 0KT4 celleoverflademarkøren på hjælper-T-celler) og således korapetitivt inhibere 35 viral adhæsion til målcelleoverflader.

DK 169234 B1 15

Den synergistiske antivirale og anti-tumor-aktivitet af TNF og/eller en interferon forstærkes yderligere ved inkludering i behandlingsskemaet og/eller præparaterne af en terapeutisk effektiv mængde oxygen-friradikal-fjerner 5 (herunder oxygenbeskyttende enzymer og peroxidativt aktivt stof). Sådanne stoffer herunder catalase superoxid-dismutase, peroxidase eller chlorperoxidase, forhøjer aktiviteten af TNF og interferon stærkt. Sådanne enzymer er henholdsvis kendt for at katalysere nedbrydningen af H202 10 til vand og oxygen eller at katalysere reaktionen H202 + H0-R-0H -* 2H20 + 0=R=0, selvom de mekanismer, hvorved sådanne midler forstærker TNF og interferon for tiden er ukendte. Catalase er bredt tilgængeligt kommercielt og kan skaffes fra humane væv, såsom røde blodceller. Per-15 oxidase er almindeligt tilgængelig fra peberrod. Mængdeforholdet mellem peroxidativt aktivt stof og TNF og interferon vil eventuelt være fra omkring 1000:1:0,1 til omkring 100:50:25, men doseringerne og forholdene vil nødvendigvis blive indstillet til at afspejle patientens 20 kliniske tilstand og indgivningsvejen, blandt andre variable, som kendes af fagfolk.

TNF'en og interferonerne indgives ad samme eller separate veje, f.eks. ved intravenøs, intranasal eller intramus-25 kulær indgivning. Den ene eller begge komponenter kan indgives fra "sustained release" præparater, f.eks. som polylactid- eller polyhydroxybutyrat-implantater eller -liposomer, som det er beskrevet i EP offentliggørelsesskrift nr. 172 007 A, eller ved kontinuert infusion. For 30 tiden foretrækkes det at infusere TNF'en og interferonen intravenøst i de overfor beskrevne doseringer. For at undgå bivirkninger fra den kombinerede terapi, når der anvendes høje doser, kan TNF'en og interferonen anvendes i et extrakorporalt behandlingsskema som tidligere er 35 blevet betegnet som adoptiv immunoterapi. Ved disse fremgangsmåder separeres patientens perifere mononucleare blodceller eller lymphocytiske celler fra blodet i en DK 169234 B1 16 extrakorporal plasmapheresis-cyklus, behandles med interleukin-2 eller interferon og reinfuseres derpå i patienten. Patientens immunresponser overfor ondartede sygdomme blev stærkt stimuleret ved denne procedure. Til behand-5 ling af retrovirusinfektioner anvendes den samme almene procedure, undtagen at de perifere monocyter og/eller lymphocyter inkuberes i nærvær af TNF eller TNF plus interferon. Viralt inficerede celler dræbes af TNF eller kombinationen af midlerne. De extrakorporale celler kan 10 også inkuberes med et dræbercelleaktiverende middel, såsom et lymphecellemitogen (f.eks. phytohæmagglutinin) og/eller interleukin-2. Cellerne vaskes derpå og resus-penderes i et infusionsmedium til reinfusion i den samme patient, hvorfra cellerne først blev opnået. Reinfusionen 15 kan følges op af indgivning af TNF og interferon, som det i Øvrigt er foreskrevet ifølge denne opfindelse. De optimale mængder af TNF eller TNF + interferon og de optimale betingelser for extrakorporal behandling af patienternes lympheceller bestemmes rutinemæssigt ved prøvning af pa-20 tienternes viraltiter og bedømmelse af forbedringer i patienternes kliniske tilstand.

Personer, som er kandidater til behandling i overensstemmelse med opfindelsen, er sådanne der har risiko for ud-25 sættelse for retrovirusinfektion, eller som udviser tegn på faktisk udsættelse for en sådan infektion. De inkluderer medlemmer af højrisikogrupper, såsom homoseksuelle, brugere af intravenøse lægemidler og dem, som har modtaget transfusioner eller andre produkter fremstillet ud 30 fra blod, der ikke er blevet undersøgt for HIV-antistof-fer. Tegn på udsættelse for retrovirus inkluderer sero-konversion til antistoffer mod HIV, positive serumprøvninger for HIV, symptomer forbundet med AIDS-relateret kompleks (ARC) eller åben AIDS. AIDS-patienter kan even-35 tuelt diagnosticeres for Kaposi's sarcoma eller andre ondartede sygdomme, tilstødende mikroorganismeinfektioner, såsom Pneumocystis carinii eller trøske, neural ska- DK 169234 B1 17 de eller cachexia (afmagring).

Opfindelsen belyses nærmere ved de efterfølgende eksempler. Interferonerne var produkter af rekombinant bakte-5 riecellekultur og blev renset til en specifik aktivitet på omkring 10® enh./mg. TNF og LT var også rekombinante og havde en specifik aktivitet på omkring 5 x 107 enh./mg.

10 Eksempel 1 LT eller TNF forstærker den antivirale aktivitet af humant interferon-r 15 A549-celler blev podet med 2 x 104 pr. hul i 96-hullers fladbundede bakker (Falcon Plastics) i 24 timer før inkubation med rækkedobbeltfortyndede prøver. Prøverne var fortyndinger af interferon-r i de koncentrationer, som er angivet i fig. 1. Prøverne indeholdt i øvrigt 0,1 ug/ml 20 TNF eller LT i Dulbeccomodificeret Eagle's (DME) medium suppleret med 5% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS), glutamin (2 mM), penicillin (100 enh./ml) og streptomycin (100 ug/ml). Kontrolprøver indeholdt a) intet interferon, TNF eller LT, b) TNF alene eller c) LT 25 alene. Efter 18 timers inkubation ved 37 °C blev kultur-supernatanter erstattet med frisk DME-medium indeholdende 2% føtalt kalveserum (men intet interferon, TNF eller LT) og EMC-virus i en multiplicitet af infektion ("MOI", forholdet infektiøst virus/celle) på 1. Den cytopatiske ef-30 fekt (CPE) blev bestemt ved farvning af de levedygtige celler med krystalviolet, og titeren blev kvantitativt kontrolleret under anvendelse af en mikroELISA "auto-reader" (MR580, Dynatech) og yderligere bekræftet visuelt. Den CPE-antivirale titer udtrykkes som den reci-35 prokke værdi af den fortynding, som findes at inhibere 50% af cellecytopatien, og blev standardiseret overfor den internationale referenceprøve af humant interferon-r DK 169234 B1 18 (No. Gg 23-901-530).

Som vist i fig. 1 forhøj er tilstedeværelsen af LT og TNF synergistisk den antivirale virkning af interferon-r i 5 disse interferon-r-koncentrationer. De antivirale titere af interferon-r blev stærkt forøget ved koncentrationer over 1 mg/ml (data ikke vist). Imidlertid var LT eller TNF meget nyttige til at tilføre beskyttelse på målceller, når interferon-r i sig selv var tilstede i lave, 10 stort set ineffektive koncentrationer.

Eksempel 2

Den antivirale aktivitet af okse-interferon-r forhøjes af 15 humant LT eller TNF

Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget, undtagen at TNF- og LT-koncentrationerne var 1 ug/ml i stedet for 0,1 μg/ml, interferonet var fra okse, målcellerne var okse-20 MDBK, og viruset var VSV. Resultaterne af CPE-prøvningen er vist i fig. 2. Igen muliggjordes store forøgelser i beskyttelse af tilstedeværelsen af TNF eller LT. Disse data viser også, at artsoprindelsen af TNF eller LT er uvigtig for den beskyttende virkning, og at den også er 25 anvendelig på andre pattedyr end mennesket.

Eksempel 3

Beskyttelse af A549-celler mod VSV-infektion 30

Fremgangsmåden fra eksempel 1 blev gentaget, undtagen at prøveviruset var VSV, og prøverne var rækkevise 10-dob-belt- og dobbeltfortyndinger af henholdsvis rekombinant interferon-r og TNF, startende med 1 ug/ml TNF og 10 35 ug/ml interferon-r. Resultaterne er vist i fig. 3 som en cellekulturplade, der er blevet farvet med krystalviolet. Koncentrationer af interferon-r i området fra 0,0001 til DK 169234 B1 19 10 ug var ineffektive til beskyttelse af cellerne ligesom koncentrationer af TNF i området nedad fra 1 ug/ml til 1 ng/ml. De viralt inficerede og uinficerede kontroller gav de forventede resultater som vist. Imidlertid beskyttede 5 kombinationen af TNF og interferon-r cellerne imod VSV-infektion selv ved koncentrationer i områderne henholdsvis fra 1 ug til 1 ng/ml og fra 10 ug/ml til 0,1 ng/ml.

Eksempel 4 10

Beskyttelsesforhøjende virkning af TNF eller LT på interferon-a og -0

Fremgangsmåden fra eksempel 1 blev gentaget med EMC/A549 15 såvel som VSV/A549. Interferonkoncentrationerne var 10 ng/ml interferon-α og 10 ng/ml interferon-0. Som vist i fig. 4a viste interferon-a og/i mindre grad interferon-0 antiviral synergi med human TNF eller LT. Lignende resultater blev opnået med MDBK/VSV og okse-interferon-α og -r 20 som vist i fig. 4b.

Eksempel 5

Synergistisk inhibering af viral replikation 25 A549-celler blev podet i 24-hullers vævskulturplader (Costar) i 24 timer og derpå behandlet med forskellige koncentationer af humant LT, TNF eller interferon-r i 18 timer, og mediet blev fjernet før udsættelse for EMC, 30 VSV, Adenovirus-2 (Ad-2) og Herpes Simplex-2 (HSV-2) virus. Infektionsmultipliciteterne af EMC, VSV, Ad-2 og HSV-2 var henholdsvis 1, 1, 100 og 100. Koncentrationen af TNF, LT og interferon-r lå i området fra 0,1 ng/ml til 10 ug/ml. Efter en adsorptionsperiode på 2 timer blev 35 supernatanterne suget fra for at fjerne det uadsorberede virus, og cellerne blev inkuberet ved 37 ’C i medium indeholdende 5% FCS. Efter 24 timer blev kulturerne (celler DK 169234 B1 20 sammen med medium) froset og optøet 2 gange for at lysere cellerne, og derpå blev materialet centrifugeret ved 400 x 6 i 10 minutter, og virusudbyttet blev bestemt ved plakprøvning som beskrevet i Rager-Zisman et al., "Proc.

5 Soc. Exp. Med." 142:1174-1179 (1973). Rækkefortyndninger af lysatet sattes til konfluente A549-celler, og de blev inkuberet i 2 timer ved 37 °C. Supernatanten blev suget fra, og cellerne blev derpå overlejret med medium indeholdende 5% FCS og 0,7% agarose. Efter 24-48 timer blev 10 plakkene visualiseret ved fiksering med formaldehyd og farvning med krystalviolet. Virusudbytterne bestemt som plakdannende enheder/ml (PFU/ml) blev bestemt, og resultaterne vist i fig. 5a/5d. Disse fig. påviser synergis-tisk forhøjelse af antiviral aktivitet, især ved lave in-15 terferon-r-koncentrationer.

Eksempel 6

Synergistisk dræbning af viralt inficerede celler 20

Fremgangsmåden fra eksempel 1 blev gentaget med VSV ved et MOI på 10 og uden forinkubation med interferon, TNF eller LT. VSV blev inkuberet ved 37 °C med cellerae i 4 timer, hvorefter viruset blev vasket fra de inficerede 25 celler. Derpå blev de VSV-inficerede eller uinficerede celler behandlet med 0,1 tig/ml interferon-r, alene eller i kombination som vist i tabel 2. Efter 12 og 18 timer ved 37 °C blev cellernes levedygtighed bestemt ved try-panblåt- eller propidiumiodid-farvning. Resultaterne er 30 vist i tabel 2 nedenfor.

35 DK 169234 B1 21 TABEL 2

Levedygtighedstælling (%) 5 Uinficeret VSV-inficeret

Cellebehandling 12 h 18 h 12 h 18 h

Kontrol ca. 100 92 70 LT ca. 100 41 29 10 TNF ca. 100 38 31 interferon-r ca. 100 91 66 LT + interferon-r ca. 100 14 0 TNF + interferon-r ca. 100 12 0 15 Tabel 2 viser, at virusinficerede celler blev dræbt på synergistisk måde, når der anvendtes kombinationer af interferon-r og TNF eller LT. Taget sammen med resultaterne i forudgående eksempler tyder dette på, at kombinationer af TNF eller LT plus en interferon vil modvirke 20 virusinfektioner ved 2 mekanismer: den ene ved at tilføre beskyttelse på uinficerede celler, og den anden ved at dræbe virusinficerede celler.

Eksempel 7 25

Prophylaxe af HIV-infektion

De 0KT4+-positive humane T-celle-leukæmia-cellelinier H9, HuT78 og U937 blev dyrket i suspension med RPMI-1640 me-30 dium ved 37 °C. Kulturer blev centrifugeret for at separere celler fra mediet, og cellerne blev derpå resuspen-deret i frisk RPMI-1640 i en tæthed på 1 x 106/ml. Der sattes tilstrækkeligt TNF-α og interferon-r til den re-suspenderede kultur til at give en koncentration på 0,1 35 ug/ml TNF-α og 0,1 μg/ml interferon-r. Kombinationen af TNF-α og interferon-r var ikke-toxisk for uinficerede HuT78- og H9-celler. Kulturen blev derpå inkuberet ved 37 DK 169234 B1 22 °C i 24 timer, hvorefter der tilsattes 1 x 10* tællinger/min. enheder af HIV pr. ml. Tællinger/min. enhederne blev bestemt ved revers-transkriptase-aktivitet (31); hver enhed kalibreres til at repræsentere revers tran-5 skriptase-aktiviteten af ét virion. Efter 3 dages yderli gere inkubation ved 37 °C blev cellerne undersøgt for vi-rale antigener ved indirekte immunofluorescens under anvendelse af et monoklonalt muse-antistof over for p24-(kerne-)proteinet i HIV og mærket gede-anti-muse-immuno-10 globulin (32). Resultaterne af gentagne forsøg er vist nedefor som procenten af celler, som indeholder HIV-ker-ne-protein.

tabel 3 15 Middel_% inficerede celler_

HuT78 H9 U937 1 2_1 2_1 2

Kontrol 54 68 48 36 11 14 TNF-a 27 34 32 18 78 20 interferon-r 63 51 42 41 12 11 TNF-a og interferon- r 1 8 4 3 2 1

Disse resultater påviser, at kombinationsterapi med TNF 25 og interferon er højeffektiv til forhindring af HIV-in-fektion af ellers modtagelige T-celler.

30 35 DK 169234 B1 23

Eksempel 8

Behandling af HIV-inficerede celler 5 1 x ΙΟ6 H9 og RPMI-1788 lymphoblastoidceller/ml RPMI-1640 medium blev udsat for 1 x 103 tæll./min. af HIV pr. ml i nærvær af 1 ng/ml polybren for at forhøje procenten af celler inficeret med HIV. Disse celler blev dyrket i omkring 30 dage, hvorunder kulturmediet blev udskiftet hver 10 3.-5. dag, og celler blev overført til subkultur ca. 1 gang om ugen. Tilstrækkeligt TNF-α og interferon-r sattes i det væsentlige samtidigt til kulturer indeholdende 1 x 106 celler/ml for at etablere koncentrationer som vist i tabel 4 nedenfor. Kombinationer af TNF-α og interferon-r 15 i disse koncentrationer var ikke cytotoxiske overfor uin-ficerede H9 og RPMI-1788 celler. Kulturerne blev inkuberet ved 37 °C i 3 dage og derpå prøvet for procenten af levedygtige celler ved trypanblåt-farvning. Resultaterne af gentagne forsøg er vist i tabel 4 (ib = ikke bestemt).

20 25 30 35 DK 169234 B1 24 TABEL 4

Middel_Koncentration_% levedygtige celler H9 1788 5 1 2_1 2

Kontrol — 89 76 95 86 TNF-a 1,0 ng/ml ib ib 90 81 0,1 ag/ml 73 70 81 76 10 inter- 1,0 ng/ml ib ib 83 84 feron-r 0,1 ng/ml 85 74 80 82 TNF-a og 15 inter- 1,0 ng/ml ib ib 68 72 feron-r 0,1 ng/ml 50 42 34 53

Disse resultater påviser koncentrationsafhængig synergis-tisk dræbning af viralt inficerede celler ved hjælp af 20 kombinationer af TNF og interferon og, i mindre grad, TNF-α alene. Dette, kombineret med den beskyttende virkning af TNF eller kombinationerne for uinficerede celler, viser værdien af TNF- eller kombinationsterapi ved behandling af retrovirusinfektioner.

25

Eksempel 9

Reduktion i HIV-replikation ved TNF- og kombinations-terapi 30

HuT78-celler blev behandlet med 0,1 ag/ml hver af TNF-a og interferon-r og derpå inficeret med HIV som beskrevet i eksempel 7. Efter 2 dages inkubation ved 37 °C blev total RNA ekstraheret fra de HIV-inficerede celler som føl-35 ger. Cellerne blev vasket med PBS og resuspenderet i 0,35 ml TSM-puffer (10 mM "Tris" pH 7,5, 0,15 M NaCl, 2mM

MgCl2) indeholdende 0,5% NP-40 og 17 al VRC (BRL) ved DK 169234 B1 25

omkring 0 °C. Efter 3-5 minutter blev kerner centrifugeret fri for de lyserede celler. Supernatanten indeholdende mRNA sattes til 0,35 ml TSE-puffer (10 mM Tris" pH

7,5, 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA) indeholdende 1% SDS og blan-5 dingen blev ekstraheret 3x med 0,7 ml phenol/chloroform/ isoamylalkohol (24:24:1). Phenolet blev ækvilibreret med vand og 0,1% 8-OH-quinolin. RNA blev udfældet fra det vandige lag med ethanol og natriumacetat. Poly(A)-RNA blev fremstillet ved oligo(dT)-cellulose-elektrophorese 10 (36). Northern-hybridisering under anvendelse af 1 ug RNA/bane blev gennemført som beskrevet (37). Resultaterne, vist i fig. 6, påviser, at forbehandling med TNF-a var i stand til at undertrykke forekomsten af HIV-RNA i værtsceller, men at der forekom langt mindre RNA, når TNF 15 og interferon blev anvendt sammen. Disse resultater stemmer overens med de i tabel 3 viste infektivitetsdata. Der blev ikke iagttaget nogen ændring i aktin-mRNA (et strukturprotein) med eller uden TNF- og interferon-behandling, hvilket påviser, at virkningen af TNF-α og interferon var 20 målrettet mod viruset fremfor cellevækst i almindelighed.

Eksempel 10

Protokol for AIDS- eller ARC-patientterapi 25 Mænd, som er seropositive for HIV-antistof og har blod, som er in vitro cellekulturpositivt for påviselig HIV-ti-ter, indrulleres i behandlingen. Disse patienter udviser almindeligvis symptomologi overensstemmende med AIDS el-30 ler ARC og serokonverteres for HIV-antistof. Behandlingsgruppen deles i kohorter baseret på de følgende behandlingsvariable : 1. Samtidig eller sekventiel TNF- og interferonbehand- 35 ling.

2. Intravenøs eller intramuskulær injektion og, i tilfæl- DK 169234 B1 26 de af intravenøs injektion, ved hjælp af bolus eller kontinuert ved infusion (1, 2, 5 og 10 dage).

2 3. Doseringsforskrift over timer, begyndende ved 1 ug/m · 2 5 TNF og 1 ug/m interferon og stigende til 5, 10, 25, 2 50 ... ug/m af hvert middel som tolereret.

4. Mængdeforhold mellem TNF og interferon: 1:100 til 100:1.

10 5. Gentagelsescyklusser af behandlinger: 1-5 med mellemliggende indstillinger af behandling på 1, 2, 5 eller 10 dage.

15 6. Udvælgelse af og mængdeforhold mellem interferontyper: α og r, 1:10 - 10:1; 0 og r, 1:10 - 10:1; r, a eller 0 alene, eller r, α og 0 1:1:1 til 10:1:1 til 1:5:5.

En egnet startforskrift vil omfatte behandling af ARC-20 patienter med en kombination af TNF-α, interferon-r og interferon-α. Kombinationen indgives ved kontinuert infusion under anvendelse af en intravenøs infusionspumpe 2 kalibreret til at levere en dosering på 1 - 10 ug/m /24 2 timer af TNF-α, 1 - 10 ug/m /24 timer af interferon-r og 2 25 1-10 ug/m /24 timer af interferon-α. Patienter kan op trappes til højere doser, alt efter hvad der tolereres. Denne infusion fortsættes i en uge. Patienterne hviler i endnu en uge, og infusionen gentages. Bivirkninger, såsom feber, kulderystninger og lignende, behandles med konven-30 tionelle midler eller ved reducering af doseringen. Når anti-HIV-antistof eller gpl20 env anvendes som antivirale midler i kombination med de ovenstående, er antistoffet eller env-polypeptidet til stede i en dosering udregnet til at være i stand til at udskille virioner frigjort ved 35 den kombinerede terapi. Dette vil afhænge af antistoffets affinitet for virion og dets neutraliserende titer såvel som patientens viraltiter. Bestemmelse af egnede doserin- DK 169234 B1 27 ger vil være indenfor fagmandsrutine.

Patienternes kliniske tilstand og viralinfektivitetsti-tere kontrolleres under og efter behandlingsprotokollen.

5 Overensstemmende med in vitro undersøgelserne i eksempel 7-9 blev immunkompetancen og viraltiteren af en statistisk signifikant del af patienterne forbedret som resultat af behandlingen.

10 Eksempel 11

Catalase forstærker den antivirale aktivitet af interferon- r og/eller TNF-a 15 A549-celler blev podet med 2 x 104/hul i 96-hullers flad bundede bakker (Falcon Plastics) 24 timer før inkubation med prøverne. Prøverne var som vist i fig. 7 ("CAT" er catalase). Prøverne indeholdt i øvrigt Dulbecco-modifice-ret Eagle's (DME) medium suppleret med 5 % varmeinaktive-20 ret føtalt kalveserum (FCS), glutamin (2 mM), penicillin (100 enh./ml) og streptomycin (100 ug/ml). Efter 18 timers inkubation ved 37 °C blev kultursupernatanterne erstattet med frisk DME-medium frit for interferon, TNF eller catalase, men indeholdende 2 % føtalt kalveserum og 25 EMC-virus i en infektionsmultiplicitet ("Μ0Ι", forholdet infektiøst virus/celle) på 1. Den cytopatiske effekt (CPE) blev bestemt ved farvning af de levedygtige celler med krystalviolet, og titeren blev kvantitativt kontrolleret under anvendelse af en mikroELISA "autoreader" 30 (MR580, Dynatech) og yderligere bekræftet visuelt. Den CPE-antivirale titer udtrykkes som den reciprokke værdi af den fortynding, som findes at inhibere 50 % af celle-cytopatien, og blev standardiseret over for den internationale referenceprøve af humant interferon-r (nr. Gg 23-35 901-530).

Som vist i fig. 7 forhøjede catalase dramatisk og syner- DK 169234 B1 28 gistisk den antivirale virkning af interferon-r og TNF-a. Denne virkning er ikke enestående for EMC-virus. Den er blevet iagttaget med en række forskellige permissive celler og virus.

5 10 15 20 25 30 35 DK 169234 B1 29

BIBLIOGRAFI

1. Gottlieb, M. et si-, "New Engl. J. Med." 305:1425- 1431(1981).

2. Masur, H. et al., "New Engl. J. Med." 305:1431-1438(1981).

1Q 3· Siegal, F. et al., "New Engl. J. Med." 305:1439- 1444(1981).

4. Seligman, M. £t al'., "New Engl. J. Med." 311:1286- 1292(1984).

15 5. Lane, H., Masur, H.. ,Edgar, G., Whalen, G. and Fauci, A.

ΰΐ Bi..iU'jts-*.t‘i "New Engl. J. Med." 309:453-458(1983).

6. Ziegler, J. et £l., "New Engl. J. Med." 311:565- 20 570(1984).

7. Barre-Sinoussi, F. et al. "Science" 220:868(1983).

8. Montagnier, L. et al. "Human T-cell Leukemia Viruses" 25 363-379 (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1984).

: V

9. Vilmer, E. et al. "Lancet" I: 753-757(1984).

10. Popovic, M., Sarngadharan, M., Read, E. and Gallo, R., 3Q "Science" 224:497-500(1984).

11. Gallo, R. et al. "Science" 224:500-503(1984).

12. Feorino, P. et al. "Science" 225:69-72(1984).

DK 169234 B1 30 13. Levy, J. et al. "Science" 225:840-842(1984).

14. Klatzmann, D. et al, "Science" 225:59-63(1984).

5 15. Schupbach, J. et al. "Science" 224:503-505ί1984Ί.

16. Samgadharan, M., Popovic, M., Bruch, L., Schupbach, J. and Gallo, R. "Science" 224:505-508(1984).

10 17. Safai, B. et al. "Lancet" 1:1438-1440(1984).

18. Brun-Vezinet, F. et al. "Lancet" 1:1253-1256(1984).

19. Brun-Vezinet, F. e£ al. "Science" 226:453-456(1984).

20. Goedert, J. et al. "Lancet" 11:711-715(1984).

21. Lawrence, J. et al. "New Engl. J. Med." 311:1269- 2o 1273(1984).

22. Murray, H. et al., "New Engl. J. Med." 310:883- 889(1984).

23. Fauci, A. et al. "Ann. Int. Med." 100:92-106(1984).

24. Nathan, C. et al. "J. Exp. Med." 158:670-689(1983).

25. Aderka, et al. "Cell. Immun." 92:218-225(1985).

30 1 .) 26. Pennington, J. et al. "J. Infect. Dis." 153:609-612(March, 1986).

27. Lane, H. et al. "Clinical Research" 32:351A(1984).

n 31 DK 169234 B1 28. Klatzmann, D. et al, "Nature" 319:10-11 (January, 1986).

5 29. Yamamoto, J. et al. "J. Interferon Res. " 6.: 143-152(June, 1986) .

30. Beutler, B. et al. "Science" 229:869 (30 August 1985).

10 31· Hoffman, A. et al. "Virology" 147:326-335(1985).

32. Kaminsky, L. et al. "Proc. Nat. Acad. Sci. USA" 82:5535- 5539(1985).

15 33. Meussing, M. et al. "Nature" 313:450-458 (1985).

34. Anonymous "Science" 229:811 (30 August 1985).

35. Ruddle, N. et al. "Immunology Today" 1:8-9(1986).

2p 36. Aviv, H. et al. "Proc.Nat.Acad.Sci. USA" 69:1408-1412 (1972).

37. Thomas, P. "Proc.Nat.Acad.Sci. USA" 22:5201-5205(1980).

?§ ?e 35

Claims (7)

1. Farmaceutisk præparat til prophylaxe og behandling af 5 retrovirusinfektioner, især infektioner af humant immun- defekt-virus (HIV), kendetegnet ved, at det omfatter en interferon og en tumornecrosefaktor (TNF) samt et oxygen-friradikal-fjernende stof.

2. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er en aerosol.

3. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mængden af TNF er mindre end ca. 10 vægt-% af interferon- 15 mængden.

4. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at interferonen er interferon-r.

5. Præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det oxygen-friradikal-fjernende stof er et peroxidativt aktivt enzym.

6. Præparat ifølge krav 5, kendetegnet ved, at 25. enzymet er human erythrocyt-catalase.

7. Præparat ifølge ethvert af de forudgående krav, kendetegnet ved, at det er i doseringsenhedsform omfattende mindre end 100 000 internationale enheder 30 af interferon. 35