CN111728223A - 一种发酵生产复合细胞因子元素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产复合细胞因子元素的方法,所述的方法包括下述步骤(1)复合植物粉体的制备;(2)复合植物粕的制备;(3)好氧、厌氧共生发酵菌液的制备;(4)接种发酵;(5)制备成品。本发明利用乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和红曲菌组成的好氧、厌氧混合菌种与复合植物粕进行共生发酵制备复合细胞因子元素,该方法安全性高,附加价值高,生产的复合细胞因子元素具有明显的医药、食用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药保健技术领域,尤其是一种发酵生产复合细胞因子元素的方法。
背景技术
复合细胞因子元素是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质,不是单一的某种成分。实际细胞因子是多种复合细胞因子元素的简称,具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、APSC多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。复合细胞因子元素可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。
复合细胞因子元素表现出多种生理学活性,复合细胞因子元素的生理活性包括,例如,干扰素(IFN)的抗病毒活性或抗肿瘤活性,通过粒细胞集落刺激因子(G-CSF)形成粒细胞集落,由促红细胞生成素(EPO)产生红细胞,和由血小板生成素(TPO)增殖巨核细胞。利用其生理学活性,复合细胞因子元素能介导细胞间的相互作用,具有多种生物学功能,如调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等。
国内现有的复合细胞因子元素大多使用人血白蛋白作为保护剂,存在着如下的缺点:1.人血白蛋白为人血液制品,因此存在着传播血液传染病的潜在风险;2.目前市场上人血白蛋白极度紧缺,很多病人使用已产生困难;3.在市场短缺的情况下,人血白蛋白价格飞涨,使使用人血白蛋白为保护剂的药品生产企业成本大幅度增加。
由于复合细胞因子元素是低分子量可溶蛋白,所以通过培养大量的产生复合细胞因子元素的细胞或培养大量的为了产生复合细胞因子元素进行了基因重组的微生物,来制备这些复合细胞因子元素。为了进一步获得单一分子类型的复合细胞因子元素,需要进行复杂的操作,但是从细胞培养上清液或含有破碎的细胞溶液中纯化目标复合细胞因子元素,这样获得的纯化的复合细胞因子元素是高分子量蛋白,而且其稳定性不高。
如何避免使用人血红蛋白作为保护剂导致的血液制品带入的潜在危害,细胞培养和基因重组微生物产生和纯化复合细胞因子元素的步骤太复杂或目标物质缺乏稳定性的缺陷成为本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷,提供一种发酵生产复合细胞因子元素的方法。
本发明通过下述方案实现:
一种发酵生产复合细胞因子元素的方法,所述的方法包括下述步骤:
(1)复合植物粉体的制备
以质量份数计,称取苍耳子5-20份,显齿蛇葡萄叶5-20份,白芷10-20份,黄芪5-20份,滨蒿1-20份,夏枯草5-10份,野菊花10-20份,即得所述复合植物,将所述复合植物用水清洗干净后加水浸泡,水漫过所述复合植物10-15cm高,浸泡时间为6-12h,浸泡完成后滤出所述复合植物在20-30℃下晾干0.5-1h,将晾干后的所述复合植物依次粉碎5-10h、球磨5-10h,得到复合植物粉体;
(2)复合植物粕的制备
以质量份数计,称取所述复合植物粉体10-65份,次粉3-65份,糖蜜1-15份,硫酸锰0.1-1份,食盐0.2-1.3份,纯净水40-72份,混合搅拌均匀即得复合植物粕,将所述复合植物粕装入容器中密闭并进行灭菌、冷却;
(3)好氧、厌氧共生发酵菌液的制备
将乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和红曲菌均接种到液态培养基上,在36-38℃培养2-6d,即得好氧、厌氧共生发酵菌液;
(4)接种发酵
将好氧、厌氧共生发酵菌液与复合植物粕混合搅拌均匀后,在温度为25-35℃下进行有氧、厌氧共生发酵,共发酵5-20d,得到发酵复合物;
(5)制备成品
将所述发酵复合物经过烘干、粉碎、分装后得到所述复合细胞因子元素的成品。
所述灭菌的过程具体为将所述复合植物粕进行高压灭菌或高温灭菌。
所述高压灭菌为将所述复合植物粕在0.05-0.6Mpa下灭菌20-40min。
所述高温灭菌为将所述复合植物粕在110-150℃下灭菌30-60min。
所述冷却的过程具体为:所述复合植物粕灭菌后,经过冷水喷淋装置至所述复合植物粕温度达到25-37℃。
所述好氧、厌氧共生发酵菌液的质量为复合植物粕质量的1-25%。
本发明的有益效果为:
1.本发明一种发酵生产复合细胞因子元素的方法利用复合植物粕经过好氧、厌氧共生发酵复合复合细胞因子元素,安全性高,避免了避免了血液制品的潜在危害。
2.本发明一种发酵生产复合细胞因子元素的方法可用于多种复合植物制备不同需求的复合细胞因子元素,适应性广,减低医学以及科研成本。
3.本发明一种发酵生产复合细胞因子元素的方法直接从复合植物粕中经过好氧、厌氧共生发酵生产的复合细胞因子元素稳定性高的、分子量小,安全性高,可直接用于医药、保健食品、食品领域。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明:
一种发酵生产复合细胞因子元素的方法,所述的方法包括下述步骤:
(1)复合植物粉体的制备
以质量份数计,称取苍耳子5-20份,显齿蛇葡萄叶5-20份,白芷10-20份,黄芪5-20份,滨蒿1-20份,夏枯草5-10份,野菊花10-20份,即得所述复合植物,所述复合植物是一种鼻炎食疗验方组成,可根据具体实际需要调整复合植物的种类和配比,也可根据不同的方向准备复合植物,可以是传统食疗验方,中医药方,或者是既有名方等复合植物组成。将所述复合植物用水清洗干净后加水浸泡,水漫过所述复合植物10-15cm高,浸泡时间为6-12h,浸泡完成后滤出所述复合植物在20-30℃下晾干0.5-1h,将晾干后的所述复合植物依次粉碎5-10h、球磨5-10h,得到复合植物粉体;
(2)复合植物粕的制备
以质量份数计,称取所述复合植物粉体10-65份,次粉3-65份,糖蜜1-15份,硫酸锰0.1-1份,食盐0.2-1.3份,纯净水40-72份,混合搅拌均匀即得复合植物粕,将所述复合植物粕装入容器中密闭并进行灭菌、冷却;
(3)好氧、厌氧共生发酵菌液的制备
将乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和红曲菌均接种到液态培养基上,液态培养基可采用液态查氏—PDA—番茄培养基,在36-38℃培养2-6d,即得好氧、厌氧共生发酵菌液;所述乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和红曲菌可在国家菌种保藏中心获得,在具体实验过程中,4种菌的最适合生长的温度条件均符合本发明设计的试验温度,即复合植物粕温度为25-37℃。乳酸菌发酵的适宜温度是30-40℃,发酵过程中产生大量乳酸。酵母菌属于兼性厌氧菌,发酵最适宜的生长繁殖温度为26~30℃,生长过程中偏酸环境更有利于其繁殖。酵母菌生长过程中代谢的菌体蛋白含量为50%-60%,并且还可以产生多种水解酶等生物活性物质。芽孢杆菌在发酵过程中生长性能稳定,生长的适宜温度范围较宽。在发酵过程中芽孢杆菌可以产生大量的维生素等营养物质,并且可以分泌活性强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶,用来降解大分子营养物质供其他3种菌发酵。红曲菌是腐生真菌,对培养基材料的要求很广泛,嗜酸喜醇,好氧,特别喜欢乳酸和乙醇。红曲菌的适应温度为15-42℃,生长温度范围广,能耐酸(pH=2.0的条件也能生长),红曲菌大都能在有氧的环境中生产,且嗜高渗透压。本发明中采用好氧与厌氧2种不同方式发酵,厌氧发酵更适合乳酸菌的发酵,而乳酸菌的发酵又为酵母菌、红曲菌的发酵提供偏酸性的环境,经过4种菌的混合培养以及相互协同,菌种的活力更高,适应性更强。
(4)接种发酵
将好氧、厌氧共生发酵菌液与复合植物粕混合搅拌均匀后,在温度为25-35℃下进行有氧、厌氧共生发酵,共发酵5-20d,得到发酵复合物;
(5)制备成品
将所述发酵复合物经过烘干、粉碎、分装后得到所述复合细胞因子元素的成品。
所述灭菌的过程具体为将所述复合植物粕进行高压灭菌或高温灭菌。
所述高压灭菌为将所述复合植物粕在0.05-0.6Mpa下灭菌20-40min。
所述高温灭菌为将所述复合植物粕在110-150℃下灭菌30-60min。
所述冷却的过程具体为:所述复合植物粕灭菌后,经过冷水喷淋装置至所述复合植物粕温度达到25-37℃。
所述好氧、厌氧共生发酵菌液的质量为复合植物粕质量的1-25%。
测试方法通过过敏型鼻炎模型制备及分组对比:
选取6只大鼠作为空白对照组即未添加任何处理,其余24只大鼠均给予OVA经全身致敏。空白对照组每日腹腔注射等量生理盐水,模型组以0.5mgOVA溶于1ml生理盐水中,并于大鼠背部皮下10处注射,OVA经全身强化致敏后第7天起每天一次用1mg/ml OVA滴鼻(含有OVA溶液均以生理盐水配制),每次20ul,每日1次,共10次。模型建立成功后备用。模型制备成功大鼠随机分为模型组、阳性对照组、低剂量组(复合细胞因子元素50mg/kg)和高剂量组(复合细胞因子元素200mg/kg),每组6只。
干预方法:空白对照组和模型均以等体积的蒸馏水代替药物;阳性对照组采用氯雷他定85mg/kg灌胃给药;低剂量以50mg/kg灌胃给药;高剂量组以200mg/kg灌胃给药。5组均在10%OVA生理盐水滴鼻之前30min给药,每天1次,共10次。
复合细胞因子元素水平检测:取5组大鼠血清用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中复合细胞因子元素:IgE、IL-4、IL-8水平。
血清IgE、IL-4、IL-8水平:模型组血清IgE、IL-4、IL-8水平明显高于空白对照组(P<0.01);阳性对照组、低剂量组和高剂量组血清IgE、IL4、IL-8水平均较模型组降低,且阳性对照组低于低剂量组和高剂量组(P<0.05)。见表1
表1 5组治疗前后IgE、IL4、IL-8水平比较(x±s)
组别 | 大鼠数量 | IgE(IU/ml) | IL-4(pg/ml) | IL-8(pg/ml) |
空白对照组 | 6 | 1076.2±221.2 | 47.4±4.2 | 97.6±2.4 |
模型组 | 6 | 1678.3±217.4 | 97.6±8.6 | 267.8±21.5 |
低剂量组 | 6 | 1325.5±199.3 | 75.8±5.6 | 189.7±24.6 |
高剂量组 | 6 | 1198.6±108.4 | 60.6±4.6 | 145.8±19.3 |
阳性对照组 | 6 | 1308.3±167.3 | 85.7±2.3 | 210.6±22.3 |
空白对照组为正常大鼠,模型组、阳性对照组、低剂量组、高剂量组均为变应性鼻炎动物模型,阳性对照组给予氯雷他定,低剂量组、高剂量组灌胃剂量分别为50mg/kg、200mg/kg;与空白对照组比较,p<0.01;与模型组比较p<0.05,p<0.01;与低剂量组比较p<0.05;与高剂量组比较p<0.05;本实验具有显著性。结果表明补充外原摄入的复合细胞因子元素能显著减少机体自我分泌的复合细胞因子元素,外源摄入的复合细胞因子元素的稳定性也比较好。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步解释。
实施例1
(1)复合植物粉体的制备
以质量份数计,称取苍耳子15份,显齿蛇葡萄叶15份,白芷15份,黄芪10份,滨蒿20份,夏枯草10份,野菊花15份,即得所述复合植物,将所述复合植物用水清洗干净后加水浸泡,水漫过所述复合植物12cm高,浸泡时间为12h,浸泡完成后滤出所述复合植物在25℃下晾干0.5h,将晾干后的所述复合植物依次粉碎5h、球磨5h,得到复合植物粉体;
(2)复合植物粕的制备
以质量份数计,称取所述复合植物粉体35份,次粉11份,糖蜜13份,硫酸锰0.5份,食盐0.5份,纯净水40份,混合搅拌均匀即得复合植物粕,将所述复合植物粕装入容器中密闭并进行灭菌、冷却;所述灭菌为高压灭菌,将所述复合植物粕在0.15Mpa下灭菌30min;所述冷却的过程具体为:所述复合植物粕灭菌后,经过冷水喷淋装置至所述复合植物粕温度达到35℃;
(3)好氧、厌氧共生发酵菌液的制备
将乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和红曲菌均接种到液态培养基上,在37℃培养3d,即得好氧、厌氧共生发酵菌液;
(4)接种发酵
将好氧、厌氧共生发酵菌液与复合植物粕混合搅拌均匀后,所述好氧、厌氧共生发酵菌液的质量为复合植物粕质量的12%,在温度为35℃下进行有氧、厌氧共生发酵,共发酵10d,得到发酵复合物;
(5)制备成品
将所述发酵复合物经过烘干、粉碎、分装后得到所述复合细胞因子元素的成品1。
实施例2
(1)复合植物粉体的制备
以质量份数计,称取苍耳子15份,显齿蛇葡萄叶15份,白芷15份,黄芪10份,滨蒿20份,夏枯草10份,野菊花15份,即得所述复合植物,将所述复合植物用水清洗干净后加水浸泡,水漫过所述复合植物12cm高,浸泡时间为12h,浸泡完成后滤出所述复合植物在25℃下晾干0.5h,将晾干后的所述复合植物依次粉碎5h、球磨5h,得到复合植物粉体;
(2)复合植物粕的制备
以质量份数计,称取所述复合植物粉体38份,次粉14份,糖蜜7份,硫酸锰0.5份,食盐0.5份,纯净水40份,混合搅拌均匀即得复合植物粕,将所述复合植物粕装入容器中密闭并进行灭菌、冷却;所述灭菌为高压灭菌,将所述复合植物粕在0.15Mpa下灭菌30min;所述冷却的过程具体为:所述复合植物粕灭菌后,经过冷水喷淋装置至所述复合植物粕温度达到35℃;
(3)好氧、厌氧共生发酵菌液的制备
将乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和红曲菌均接种到液态培养基上,在37℃培养3d,即得好氧、厌氧共生发酵菌液;
(4)接种发酵
将好氧、厌氧共生发酵菌液与复合植物粕混合搅拌均匀后,所述好氧、厌氧共生发酵菌液的质量为复合植物粕质量的12%,在温度为35℃下进行有氧、厌氧共生发酵,共发酵10d,得到发酵复合物;
(5)制备成品
将所述发酵复合物经过烘干、粉碎、分装后得到所述复合细胞因子元素的成品2。
准确监测鼻黏膜炎症控制情况对评估鼻炎治疗效果有重要意义。鼻腔黏膜炎症及过敏反应对鼻腔一氧化氮的水平影响较大。炎症状态下一氧化氮合成增强,体内一氧化碳合酶催化产生大量的过氧化硝酸盐衍生物促进嗜酸性粒细胞聚集,通过加快炎症反应损伤鼻腔黏膜组织,不同炎症状态下鼻腔一氧化氮发挥着保护、防御或破坏的作用。鼻腔呼出一氧化氮可以有效评估鼻腔炎症情况,可作为评测鼻腔炎症的潜在标志物。
随机挑选过敏性鼻炎患者50例,分为实验1组、实验2组、实验3组,实验4组和实验5组,每组10人,实验1组、实验2组、实验3组,实验4组服用实施例1所得的复合细胞因子元素成品1,实验5组服用实施例2所得的复合细胞因子元素成品2。
服用方法为:每天2次,早晚服用,一次一包,一包4g。并对50名过敏性鼻炎患者进行跟踪调查,采用瑞典台式NIOX设备检测一氧化氮水平,在上午或下午待患者洗漱口腔后将鼻橄榄接头置入鼻孔头端,采用固定流速和0.25-3.00L/min恒定流速吸气泵从另一个鼻孔进入空气,于NIOX设备一个端口采集呼出气检测一氧化氮,双侧鼻孔测量3次取均值。结果见表2。
表2鼻腔一氧化氮水平比较(x±s,μg/L)
由上可知,服用30天后,可以明显的降低高一氧化氮,服用60天后,一氧化氮的降低更为明显,服用90天后,一氧化氮基本维持在一个数值,基本表明患者可能已经痊愈。其中,有20例患者在服用60天后,一氧化氮即可达到正常水平附近,服用90天后均达到正常水平,显有效率为100%,证明具有明显的修复鼻腔受损细胞的效果。并且复合植物粕中所含的复合植物质量分数越高,产生的复合细胞因子元素含量越多,对修复鼻腔受损细胞的效果更好。
尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举,应当理解,对于本领域技术人员来说,对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案,这对本领域的技术人员而言是显而易见,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种发酵生产复合细胞因子元素的方法,其特征在于所述的方法包括下述步骤:
(1)复合植物粉体的制备
以质量份数计,称取苍耳子5-20份,显齿蛇葡萄叶5-20份,白芷10-20份,黄芪5-20份,滨蒿1-20份,夏枯草5-10份,野菊花10-20份,即得所述复合植物,将所述复合植物用水清洗干净后加水浸泡,水漫过所述复合植物10-15cm高,浸泡时间为6-12h,浸泡完成后滤出所述复合植物在20-30℃下晾干0.5-1h,将晾干后的所述复合植物依次粉碎5-10h、球磨5-10h,得到复合植物粉体;
(2)复合植物粕的制备
以质量份数计,称取所述复合植物粉体10-65份,次粉3-65份,糖蜜1-15份,硫酸锰0.1-1份,食盐0.2-1.3份,纯净水40-72份,混合搅拌均匀即得复合植物粕,将所述复合植物粕装入容器中密闭并进行灭菌、冷却;
(3)好氧、厌氧共生发酵菌液的制备
将乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和红曲菌均接种到液态培养基上,在36-38℃培养2-6d,即得好氧、厌氧共生发酵菌液;
(4)接种发酵
将好氧、厌氧共生发酵菌液与复合植物粕混合搅拌均匀后,在温度为25-35℃下进行有氧、厌氧共生发酵,共发酵5-20d,得到发酵复合物;
(5)制备成品
将所述发酵复合物经过烘干、粉碎、分装后得到所述复合细胞因子元素的成品。
2.根据权利要求1所述的一种发酵生产复合细胞因子元素的方法,其特征在于:所述灭菌的过程具体为将所述复合植物粕进行高压灭菌或高温灭菌。
3.根据权利要求2所述的一种发酵生产复合细胞因子元素的方法,其特征在于:所述高压灭菌为将所述复合植物粕在0.05-0.6Mpa下灭菌20-40min。
4.根据权利要求2所述的一种发酵生产复合细胞因子元素的方法,其特征在于:所述高温灭菌为将所述复合植物粕在110-150℃下灭菌30-60min。
5.根据权利要求1所述的一种发酵生产复合细胞因子元素的方法,其特征在于,所述冷却的过程具体为:
所述复合植物粕灭菌后,经过冷水喷淋装置至所述复合植物粕温度达到25-37℃。
6.根据权利要求1所述的一种发酵生产复合细胞因子元素的方法,其特征在于:所述好氧、厌氧共生发酵菌液的质量为复合植物粕质量的1-25%。
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