CN116042490B - 一种用于抗疲劳、提高运动能力的复合益生菌及制备方法和应用 - Google Patents

一种用于抗疲劳、提高运动能力的复合益生菌及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于抗疲劳、提高运动能力的复合益生菌及制备方法和应用，属于生物医药技术领域。上述复合益生菌包括植物乳植杆菌、瑞士乳杆菌以及凝结芽孢杆菌，所述植物乳植杆菌的保藏编号为CGMCC No.14491，所述瑞士乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2019013，所述凝结芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2017813。包含该复合益生菌的微生物菌剂，经试验发现，相比单一菌株或者任意两种菌株组合都能明显抗疲劳和提高运动能力的功能，为抗疲劳和提高运动能力的药物或者相关领域的研究提供了新的菌源。

Description

一种用于抗疲劳、提高运动能力的复合益生菌及制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种用于抗疲劳、提高运动能力的复合益生菌及制备方法和应用。
背景技术
疲劳是劳动过程中人体器官或机体发生的自然衰竭状态，是人体能量消耗与恢复相互交替，中枢神经产生“自卫”性抑制的正常生理过程，然而目前对于疲劳现象的解释在学术界并未达成共识，存在多种论点，主要包括疲劳物质积累理论、力源消耗理论、中枢系统变化理论、生化变化理论、局部血流阻断理论等，但是事实上，疲劳产生的机理可能是上述多种理论综合导致，进而导致疲劳的产生。事实上，运动引起的疲劳在运动员、学生、城市健身者和其他不同群体中很常见。运动性疲劳主要是由于维持高强度运动或在身体状态不佳时运动，导致储存的能量储备迅速耗尽，导致能量代谢过渡到无氧代谢，与疲劳相关的代谢产物过度堆积。过度或剧烈运动导致细胞从有氧供能转向无氧供能，导致乳酸大量积累、pH值和渗透压失衡以及活性氧(ROS)水平升高。另外，大病初愈的人和身体状况不佳的人应该经常锻炼，但是由于各方面身体机能处于正在向正常状态转化的过程，存在长期营养不足或者体内消化吸收系统不足，难以储存足够能量，因此很容易产生疲劳。总体上，疲劳是一种主观不适感觉，但客观上会在同等条件下，失去其完成原来所从事的正常活动或工作能力。由于长期的疲劳可能使得某些器官和系统过度紧张，进而造成各种病损，还可能出现消化系统、免疫系统、代谢系统等减退，头晕、乏力、恶心等症状，进而影响人们正常生活和工作效率。因此，减少疲劳也是人们生活和工作中普遍的需求和向往。
随着科学的发展和人们认知的扩展，对于益生菌影响人类消化、免疫、代谢等有了越来越多的理解和关注。研究表明，乳酸菌可以作为益生菌，部分乳酸菌可增强生物活性、解毒和免疫力，作为疾病的辅助治疗，因此可用作微生物药物部分。而目前，有关于单一菌株用于抗疲劳的或者抗氧化方面的应用，或者将单一菌株或者复合菌株与其他中药材或者功能性组分复配，一方面单一菌株的功效有限，另一方面通过菌株和其他中药材或者功能组分复配后，一般都是通过菌株发酵将中药材或者功能组分进行降解成更容易吸收利用的组分，使得中药材和功能组分发挥抗疲劳或者抗氧化的作用，而并非是益生菌本很所起的作用(比如：专利CN114703105A“一种复合益生菌在降血脂或缓解肥胖中的应用”)；另外，由于微生物生存条件的限制，将其与其他成分复配需要特殊工艺的控制，增加了工艺方法的步骤以及存在操作繁琐等问题，而目前还未见通过单纯的菌株复配用于抗疲劳、提高运动能力方面的报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出了一种用于抗疲劳、提高运动能力的复合益生菌及制备方法和应用，本发明通过单纯的将植物乳植杆菌、瑞士乳杆菌和凝结芽孢杆菌组合制备了复合益生菌，包含该复合益生菌的微生物菌剂相比单一菌株或者任意两种菌种的组合，明显提高了抗疲劳、提高运动能力功能。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于抗疲劳、提高运动能力的复合益生菌，包括植物乳植杆菌、瑞士乳杆菌以及凝结芽孢杆菌，所述植物乳植杆菌具体为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)CQPC02，保藏编号为CGMCC No.14491，保藏时间为2017年8月4日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述瑞士乳杆菌具体为植物乳植杆菌(Lactobacillushelveticus)LH08B，保藏编号为CCTCC NO：M2019013，保藏时间为2019年1月4日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学；所述凝结芽孢杆菌具体为：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BC01，保藏编号为CCTCC NO：M2017813，保藏时间为2017年12月21日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
本发明还提供了一种微生物菌剂，包括所述的复合益生菌。
本发明还提供了一种所述的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将植物乳植杆菌、瑞士乳杆菌以及凝结芽孢杆菌分别发酵后，分别得到植物乳植杆菌发酵液、瑞士乳杆菌发酵液以及凝结芽孢杆菌发酵液，之后经离心、冷冻干燥，分别得到植物乳植杆菌冻干粉、瑞士乳杆菌冻干粉以及凝结芽孢杆菌冻干粉；
(2)植物乳植杆菌冻干粉、瑞士乳杆菌冻干粉以及凝结芽孢杆菌冻干粉在无菌条件下混合均匀，即为所述微生物菌剂。
优选的是，步骤(1)中，发酵所述植物乳植杆菌和瑞士乳杆菌的培养基均为改良的MRS培养基，所述改良的MRS培养基包括以下组分：胰蛋白胨15.0g、牛肉膏8.0g、酵母膏3.0g、柠檬酸钠2.0g、葡萄糖20.0g、KH2PO42.0g、乙酸钠5g、吐温-80 1.0mL、七水硫酸镁0.40g、硫酸锰0.20g以及蒸馏水1000mL；
发酵凝结芽孢杆菌的培养基包括以下组分：胰蛋白胨10g、酵母浸粉20g、葡萄糖15g、硫酸铵1g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁1g、硫酸锰0.01g份和蒸馏水1000mL。
优选的是，步骤(2)中，所述植物乳植杆菌冻干粉、所述瑞士乳杆菌冻干粉以及凝结芽孢杆菌冻干粉的质量比为(1-3)：(0.5-2)：(0.5-2)。
本发明还提供了所述的复合益生菌，或所述的微生物菌剂在制备抗疲劳、提高运动能力的药物或者医疗器械方面的应用。
本发明还提供一种用于抗疲劳、提高运动能力的药物，包括所述的复合益生菌，或者所述的微生物菌剂。
优选的是，所述药物还包括药物上可接受的载体。
本发明还提供一种用于抗疲劳、提高运动能力的医疗器械，包括使用所述的复合益生菌或者所述的微生物菌剂用于抗疲劳、提高运动能力的装置。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
本发明公开的包含植物乳植杆菌、瑞士乳杆菌和凝结芽孢杆菌的复合益生菌，利用该复合益生菌构建的微生物菌剂经实验发现，相比单一菌株或者任意两种菌株组合构建的微生物菌剂，表现出明显的抗疲劳、提高运动能力作用。经发明人多年对菌株和研究，并结合前期对上述菌株相关研究，发现凝结芽孢杆菌为兼性厌氧菌，当进入肠道后会消耗游离氧进行肠道繁殖，有利于其他两种乳酸菌的生长，从而调节肠道内微生物菌群的平衡，提高机体免疫力；而在凝结芽孢杆菌在肠道繁殖的过程中还分泌多种酶类，促进机体对营养物质的消化和吸收，进而实现乳酸菌因营养不良或者运动后等产生与疲劳相关的代谢产物进行降解，并调控pH值、渗透压、活性氧的水平，使得机体营养水平、代谢水平等趋于平衡，以减少机体疲劳。因此，本发明通过特定配比的将上述三种菌进行复配，可以提高植物乳植杆菌单一菌种抗疲劳、提高运动能力性能，并且使得原不具备提高运动能力和抗疲劳功能的瑞士乳杆菌和凝结芽孢杆菌得到了更广泛的应用，为抗疲劳、提高运动能力药物以及相关领域的发展提供新的菌源。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1微生物菌剂的制备
(1)发酵培养植物乳植杆菌
先将保存的植物乳植杆菌于36℃厌氧活化培养20h，获取植物乳植杆菌活化菌液；活化用的培养基为：胰蛋白胨18.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏3.0g、柠檬酸钠2.0g、葡萄糖23.0g、KH2PO42.0g、乙酸钠5g、吐温-80 1.0mL、七水硫酸镁0.40g、硫酸锰0.20g以及蒸馏水1000mL。
活化后，将植物乳植杆菌活化菌液按照接种量5.0％接种于发酵培养基中，于36℃，220rpm培养36h，得到植物乳植杆菌发酵液；发酵培养基为：胰蛋白胨15.0g、牛肉膏8.0g、酵母膏3.0g、柠檬酸钠2.0g、葡萄糖20.0g、KH2PO42.0g、乙酸钠5g、吐温-80 1.0mL、七水硫酸镁0.40g、硫酸锰0.20g以及蒸馏水1000mL。
(2)同培养植物乳植杆菌的方法培养瑞士乳杆菌，其中活化和发酵培养温度替换为36℃，发酵转速替换为200rpm，其他步骤、条件均相同。
(3)发酵培养凝结芽孢杆菌
将保存的凝结芽孢杆菌在于38℃厌氧活化培养20h，获取凝结芽孢杆菌活化菌液；活化用的培养基为：胰蛋白胨12g、酵母浸粉20g、葡萄糖20g、硫酸铵1g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁1g、硫酸锰0.01g份和蒸馏水1000mL。
活化后，将凝结芽孢杆菌活化菌液按照接种量5.0％接种于发酵培养基中，于38℃、250rpm发酵培养30h，获取凝结芽孢杆菌发酵液；发酵培养基为胰蛋白胨10g、酵母浸粉20g、葡萄糖15g、硫酸铵1g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁1g、硫酸锰0.01g份和蒸馏水1000mL。
(4)分别按照上述方法步骤得到植物乳植杆菌发酵液、瑞士乳杆菌发酵液、凝结芽孢杆菌发酵液，分别过滤收集菌体，然后再真空条件下冷冻干燥，分别得到植物乳植杆菌冻干粉、瑞士乳杆菌冻干粉以及凝结芽孢杆菌冻干粉。
(5)在无菌条件下，按照植物乳植杆菌冻干粉、瑞士乳杆菌冻干粉以及凝结芽孢杆菌冻干粉按照不同质量比配制，获取微生物菌剂。结果发现，不同质量比组合配制的微生物菌剂所含的植物乳植杆菌、瑞士乳杆菌和凝结芽孢杆菌的活菌量存在差异，见表1。
表1不同质量比配比制备的微生物菌剂
实施例2微生物菌剂在抗疲劳、提高运动能力方面的应用
本实施例主要研究微生物菌剂在抗疲劳、提高运动能力方面的作用。
将135只体重为18g±2g的健康SPF级BALB/c纯系小鼠在试验条件下进行7d适应期后，随机分为：
微生物菌剂低剂量组：按照实施例1的8组标准制备微生物菌剂，按照1×108cfu/kg的剂量灌胃小鼠。
微生物菌剂高剂量组：按照实施例1的8组标准制备微生物菌剂，按照1×1010cfu/kg的剂量灌胃小鼠。
空白对照组：每天每只小鼠灌胃0.2mL生理盐水；
植物乳植杆菌+瑞士乳杆菌组：按照实施例1的8组标准，仅将植入乳杆菌冻干粉和瑞士乳杆菌冻干粉按照质量比2:0.5混合后，按照1×1010cfu/kg的剂量灌胃小鼠。
植物乳植杆菌+凝结芽孢杆菌组：按照实施例1的8组标准，仅将植入乳杆菌冻干粉和凝结芽孢杆菌冻干粉按照质量比2:1混合后，按照1×1010cfu/kg的剂量灌胃小鼠。
瑞士乳杆菌+凝结芽孢杆菌组：按照实施例1的8组标准，仅将瑞士乳杆菌冻干粉和凝结芽孢杆菌冻干粉按照质量比0.5:1混合后，按照1×1010cfu/kg的剂量灌胃小鼠。
植物乳植杆菌组：按照实施例1的8组标准制备植物乳植杆菌冻干粉，按照1×1010cfu/kg的剂量灌胃小鼠。
瑞士乳杆菌组：按照实施例1的8组标准制备瑞士乳杆菌，按照1×1010cfu/kg的剂量灌胃小鼠。
凝结芽孢杆菌组：按照实施例1的8组标准制备凝结芽孢杆菌，按照1×1010cfu/kg的剂量灌胃小鼠。
每组小鼠各15只，每日定时灌胃，连续灌胃28天。按照不同微生物制剂组(微生物菌剂低剂量组、微生物菌剂高剂量组植物乳植杆菌+瑞士乳杆菌组、植物乳植杆菌+凝结芽孢杆菌组、瑞士乳杆菌+凝结芽孢杆菌组、植物乳植杆菌组、瑞士乳杆菌组、凝结芽孢杆菌组，空白对照组)分别对应给予小鼠所制备的微生物制剂后，小鼠在连续28天内的每周进行3次30分钟的游泳运动(KW-小鼠QP强迫游泳系统，南京卡尔文生物科技有限公司，江苏南京)。将小鼠置于强迫游泳系统中并允许其自由游泳。当小鼠无力在水中自由漂浮时，静置15s后，用玻璃棒搅动水面，促使小鼠继续游动30min，直至小鼠体力透支下沉，取出小鼠停止移动。随后，游泳时间减少到10分钟。28天后解剖小鼠取血清和脏器组织，测定如下抗疲劳、提高运动能力指标：
(1)使用标准方法(参考文献：Mojibi N,Rasouli M.Comparison of metheds toassay liver glycogen fractions:the effects of starvation.)测定肝脏肝糖原；使用二乙酰单肟显色法(参考文献：jainu M,Vijaimohan K,Kannan K.Cissus quadrangularisL.extract attenuates chronic ulcer by possible involvement of polyamines andproliferating cell nuclear antigen.)测定血液尿素氮(BUN)含量。结果如表2所示。
表2肝脏肝糖原和骨骼肌糖原含量测定结果
由表2可知，与空白对照组相比，微生物低剂量组和高剂量组中小鼠的肝糖原含量均上升，且明显高于空白对照组。这表明本发明对维持试验小鼠体内肝脏肝糖原的高水平含量具有一定的效果，具有抗疲劳和提高运动能力的潜力。同时可以看出，微生物菌剂低剂量组和高剂量组比单一菌株或者任意两种菌株组合表现出更佳的效果。
(2)测定血清/组织中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。
每只小鼠摘眼球取血液于1.5mL EP管中，经过37℃恒温水浴锅静置30分钟后，2000rpm离心15分钟获得血清，按照相应的试剂盒操作说明分别测定MAD含量以及SOD、GSH-Px活性。
小鼠取血后，迅速断椎处死，及时摘取肝脏，先用4℃预冷的生理盐水清晰肝脏表面血液，再用干净滤纸吸干表面水分，称重，用匀浆器匀浆，再加入生理盐水稀释成10％肝匀浆，以2000rpm离心15分钟，收集上清液，按照相应的试剂盒操作说明分别测定上清液中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。结果如表3所示。
表3血清/组织中不同指标测定结果
上表中，分组编号具体为：1：空白对照组；2：微生物菌剂低剂量组；3：微生物菌剂高剂量组；4：植物乳植杆菌+瑞士乳杆菌组；5：植物乳植杆菌+凝结芽孢杆菌组；6：瑞士乳杆菌+凝结芽孢杆菌组；7：植物乳植杆菌组；8：瑞士乳杆菌组；9：凝结芽孢杆菌组。
从表3的结果看，与空白对照组相比，微生物菌剂低剂量组和高剂量组能明显增强血清和肝组织中SOD和GSH-Px活性，降低血清和肝组织中MAD含量，并呈现剂量依赖性，说明本发明的微生物菌剂具有抗疲劳和提高运动能力的潜力；同时，相比单一菌株或者任意两种菌株构建的微生物菌剂，具有更明显的抗疲劳和提高运动能力的效果。
(3)抗疲劳游泳实验
按照不同微生物制剂组(微生物菌剂低剂量组、微生物菌剂高剂量组植物乳植杆菌+瑞士乳杆菌组、植物乳植杆菌+凝结芽孢杆菌组、瑞士乳杆菌+凝结芽孢杆菌组、植物乳植杆菌组、瑞士乳杆菌组、凝结芽孢杆菌组，空白对照组，每组小鼠15只)分别对应给予小鼠所制备的微生物制剂后，小鼠在第一周进行了三组30分钟的游泳运动(KW-小鼠QP强迫游泳系统，南京卡尔文生物科技有限公司，江苏南京)。将小鼠置于强迫游泳系统中并允许其自由游泳。当小鼠无力在水中自由漂浮时，静置15s后，用玻璃棒搅动水面，促使小鼠继续游动30min，直至小鼠体力透支下沉，取出小鼠停止移动。随后，游泳时间减少到10分钟，每周3次。4周后，在最后一次灌胃微生物制剂后，对小鼠进行游泳力竭实验。首先给每只小鼠称重，然后将一根重量为小鼠体重5％的导线系在它的尾巴上。然后将小鼠放入水箱(水深：30cm；温度：30℃)中并进行游泳力竭实验。当小鼠保持浸没至少10s时，它们被判断为筋疲力尽，并记录到此时的总游泳时间。数据以均数和标准差表示。测试结果见表4。
表4抗疲劳游泳实验结果
分组 总游泳时间(s)
空白对照组 30.21±4.56
微生物菌剂低剂量组 108.45±2.35
微生物菌剂高剂量组 119.78±4.68
植物乳植杆菌+瑞士乳杆菌组 90.23±5.31
植物乳植杆菌+凝结芽孢杆菌组 92.34±6.12
瑞士乳杆菌+凝结芽孢杆菌组 46.96±4.32
植物乳植杆菌组 50.12±3.45
瑞士乳杆菌组 43.56±4.62
凝结芽孢杆菌组 47.31±3.67
从表4中可以看出，相比空白对照组，微生物菌剂低剂量组和高剂量组能够明显增加小鼠总游泳时间；相比单一菌株或者任意两种菌株构建的微生物菌剂，本发明微生物菌剂低剂量组和高剂量组也具有明显增长小鼠总游泳时间，并且成剂量依赖性，具有明显的抗疲劳、提高运动能力的效果。
上述实施例的实验结果说明本发明由植物乳植杆菌、瑞士乳杆菌和凝结芽孢杆菌按照特定配比制备的微生物菌剂具有明显的抗疲劳、提高运动能力的功能，能够应用到制备抗疲劳和提高运动能力的药物，或者辅助治疗抗疲劳、提高运动能力的医疗器械中。
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种用于抗疲劳、提高运动能力的复合益生菌，其特征在于，包括植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）CQPC02、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）LH-08B以及凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）BC01，所述植物乳植杆菌的保藏编号为CGMCCNo.14491，所述瑞士乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2019013，所述凝结芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2017813。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的复合益生菌。
3.一种如权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将植物乳植杆菌、瑞士乳杆菌以及凝结芽孢杆菌分别发酵后，分别得到植物乳植杆菌发酵液、瑞士乳杆菌发酵液以及凝结芽孢杆菌发酵液，之后经离心、冷冻干燥，分别得到植物乳植杆菌冻干粉、瑞士乳杆菌冻干粉以及凝结芽孢杆菌冻干粉；
（2）植物乳植杆菌冻干粉、瑞士乳杆菌冻干粉以及凝结芽孢杆菌冻干粉在无菌条件下混合均匀，即为所述微生物菌剂。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，发酵所述植物乳植杆菌和瑞士乳杆菌的培养基均为改良的MRS培养基，所述改良的MRS培养基包括以下组分：胰蛋白胨15.0g、牛肉膏8.0g、酵母膏3.0g、柠檬酸钠2.0g、葡萄糖20.0g、KH2PO42.0g、乙酸钠5g、吐温-80 1.0mL、七水硫酸镁0.40g、硫酸锰0.20g以及蒸馏水1000mL；
发酵凝结芽孢杆菌的培养基包括以下组分：胰蛋白胨10g、酵母浸粉20g、葡萄糖15g、硫酸铵1g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁1g、硫酸锰0.01g份和蒸馏水1000mL。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述植物乳植杆菌冻干粉、所述瑞士乳杆菌冻干粉以及凝结芽孢杆菌冻干粉的质量比为（1-3）：（0.5-2）：（0.5-2）。
6.如权利要求1所述的复合益生菌，或权利要求2所述的微生物菌剂在制备抗疲劳、提高运动能力的药物方面的应用。
7.一种用于抗疲劳、提高运动能力的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的复合益生菌，或者权利要求2所述的微生物菌剂。
8.如权利要求7所述的用于抗疲劳、提高运动能力的药物，其特征在于，所述药物还包括药物上可接受的载体。
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