CN116617258A - 一种治疗溃疡性结肠炎药菌组合物的制备方法及应用 - Google Patents

一种治疗溃疡性结肠炎药菌组合物的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种治疗溃疡性结肠炎药菌组合物的制备方法及应用，属于生物技术领域。本发明首先将食醋进行陈化浓缩得到醋膏，醋膏联合活的Akkermansia Muciniphila益生菌，并加入适量果浆调配，最后进行灭菌灌装得到治疗溃疡性结肠炎的药菌组合物。本发明不仅利用了保护肠道的传统食物醋膏，而且利用了益生菌Akkermansia Muciniphila对醋膏进行发酵，同时还加入了富含果胶、低聚糖、维C有助于排毒延缓衰老的果浆，增加口感的同时也增强了组合物的功能性。本发明药菌组合物中含有益生菌以及丰富的有机酸、黄酮、氨基酸、维生素C等功能成分，同时作为一种食品或者药物对治疗溃疡性结肠炎具有良好的作用，具有重要的社会前景和经济效益。

Description

一种治疗溃疡性结肠炎药菌组合物的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种治疗溃疡性结肠炎药菌组合物的制备方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
近20年来城市化、工业化不断发展，炎症性肠病发生率逐年增高。同时，随着生活节奏加快以及快餐文化的普及，饮食、压力、昼夜节律以及药物的使用成为影响人们肠道微生物的主要原因，这在一定程度上影响了我们的免疫系统，参与到了炎症性肠病的发生和发展。此外，肠道微生物作为“人体代谢系统的连接者”，可以使原本仅存在肠道的炎症转移到身体其他部位，导致其他部位的炎症，甚至是癌变。
其实受人们广泛使用的食醋药用价值在我国古代已经被发现了。《注解伤寒论》记载醋可以“敛咽疮”，《纲目》中记载醋具有“散瘀血，治黄疸、黄汗”的功效；醋膏的抗炎作用也在现代被证明。而醋膏作为食醋的浓缩物，富集了食醋的活性物质，从而提高食醋浓缩物的功能和品质，被证明具有抗氧化、抗炎、降血脂及保护肝脏等功能。除了药食同源的醋膏之外，益生菌在各种疾病中也发挥着重要的作用。Akkermansia Muciniphila是2004年Derrien在人类粪便中发现的一种新的粘蛋白降解菌，属于疣菌门。AkkermansiaMuciniphila定植在肠道的外黏液层，以肠道的黏蛋白作为自身生长的碳和氮来源，其消耗黏蛋白与杯状细胞再生黏蛋白能够达到动态平衡，从而维持黏液层稳定。AkkermansiaMuciniphila表现出促进肠道屏障完整性、调节免疫反应、抑制炎症、降低某些心脏病风险，如胰岛素抵抗、总血胆固醇和脂肪组织储存等生物学功能。
溃疡性结肠炎是一种以炎症反应、氧化应激和肠上皮细胞凋亡增加为特征的免疫介导的慢性肠道疾病。肠道中的粘液层的破坏造成上皮的通透性增加导致肠道易被抗原攻击，因此，促炎细胞因子TNF-α，IL-12，IL-23，IL-6和白介素1β增加以及炎症性趋化因子如CXCL1、CXCL3和CXCL8的上调导致白细胞不断募集，从而使炎症持续发展。溃疡性结肠炎的传统治疗药物包括氨基水杨酸类、糖皮质激素类和免疫抑制剂等。其中，美沙拉嗪是轻度至中度活动性溃疡性溃疡性结肠炎的一线治疗药物。尽管这些药物能够起到一定疗效，但这些它们需要长期使用，患者依从性不高，并具有多种的不良反应，存在安全风险，如代谢紊乱、头晕、呕吐、血糖升高，肾上腺素抑制等。因此寻找更加安全有效的溃疡性结肠炎辅助治疗手段是十分必要的。
发明内容
为解决上述问题，本发明在醋膏中加入了肠道益生菌Akkermansia Muciniphila进行发酵，相比传统复配的药菌组合物，可以有效提高药材的有效利用率，对溃疡性结肠炎的治疗效果更佳，且克服了传统药物治疗溃疡性结肠炎时对机体造成的不良反应。除此之外，在发酵产物中加入了水果果浆，增强口感的同时增强了组合物的功能性，进一步提高了治疗效果。
本发明的第一个目的是提供一种治疗溃疡性结肠炎的药菌组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、通过蒸馏浓缩方法制备醋膏；
S2、将嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia Muciniphila)在35～38℃下厌氧发酵35～45h，得到活菌；
S3、将S1的醋膏加入S2的活菌中，在35～38℃下厌氧发酵15～35h，得到药菌混合物；
S4、向S3的药菌混合物中加入果浆进行调配，灭菌后得到所述治疗溃疡性结肠炎的药菌组合物。
进一步地，在步骤S1中，所述醋膏的制备方法为，将食醋在60℃～80℃进行加热蒸馏浓缩20～30h，收集浓缩醋液，向其中加入酵母抽提物，混匀后分层，取下层液得到醋膏。
进一步地，浓缩醋液与酵母抽提物的质量比为300-400：1-1.5。
进一步地，在步骤S1中还包括对醋膏进行过滤除杂、均质、灭菌处理的步骤。
进一步地，均质包括但不限于高压均质使醋膏颗粒均一，如在20℃～30℃、压力15～25MPa条件下经均质机处理。
进一步地，灭菌包括但不限于高温灭菌，如在130-170℃下进行灭菌。
进一步地，在步骤S2或S3中，使用食品级培养基对嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia Muciniphila)进行培养。
进一步地，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia Muciniphila)为AkkermansiaMuciniphila ATCC BAA-835。
进一步地，在步骤S3中，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia Muciniphila)的添加量为6×1010～6×1011个/100mL醋膏。
进一步地，在步骤S4中，果浆添加量为调配后的药菌混合物质量的30％～40％。
进一步地，在步骤S4中，所述果浆通过水果果肉打浆、酶解得到。
进一步地，所述酶解过程为，分别向经打浆的果肉中加入纤维素酶和果胶酶进行酶解，酶解温度为50～55℃，酶解时间2～3h。
进一步地，添加果肉总质量0.3％～0.5％的纤维素酶和0.3％～0.4％果胶酶进行酶解。
进一步地，所述水果选自苹果、火龙果、香蕉、葡萄、菠萝和猕猴桃中的至少两种，优选地，果肉原料为苹果、香蕉和火龙果按照质量比4～5：5～6：2～3混合。
进一步地，在步骤S4中，以140～160MPa，40～50℃对调配后的药菌混合物进行高压均质杀菌。
本发明的第二个目的是提供上述制备方法得到的药菌组合物。
本发明的第三个目的是提供上述药菌组合物在制备溃疡性结肠炎治疗药物中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明中的药菌组合物中联合了活的Akkermansia Muciniphila菌和醋膏，在临床检测数据分析基础上，通过大量的动物实验筛选，深入研究，提供药菌组合物在治疗溃疡性结肠炎的新用途。实验结果表明，相对于复配或不含菌剂的组合物，给小鼠灌胃药菌组合物后可显著增加结肠肠道并降低机体炎症水平，对溃疡性结肠炎模型小鼠起到更显著的治疗作用。此外，实验结果表明该药菌组合物的疗效可靠，使用安全，无毒副作用，可以用于制备治疗溃疡性结肠炎的食品或者药物。
2、本发明中的醋膏是传统药食同源中药材，富含有机酸、多糖、蛋白质、黄酮、多酚、川芎嗪等活性物质，有通过饮食干预减少炎症标志物并改变肠道菌群的调节免疫作用。醋膏能抑制结肠炎小鼠血清中炎症因子IL-2、IL-6、IL-13、G-CSF、GMCSF、IFN-γ和RANTES的分泌，促进相关肠道组织抗菌肽的表达；不仅如此，醋膏也能通过增加肠道潜在有益菌Akkermansia等来影响肠道及机体健康。除此之外，本发明利用冷冻浓缩以及蒸馏浓缩技术制备醋膏，提升醋膏的陈化速率，加速活性成分富集，提高醋膏功能及品质。
3、本发明中新鲜果浆是苹果、火龙果、香蕉、葡萄、菠萝和猕猴桃的混合果浆。果浆富含果胶、黄酮、多酚、维生素等，其具有增强和调节人体免疫力，抗氧化，抗炎，利于肠道内有益菌群的生长等功能。同时，水果果浆也可以改善药菌组合物的口感。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中涉及的材料及方法如下：
酵母抽提物：安琪酵母。
Akkermansia Muciniphila菌：Cat.No.BAA-835，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
Akkermansia Muciniphila菌培养基：标准脑心浸液液体培养基(BHI)基础成分中添加以下成分：黏蛋白(0.25％)，L-半胱氨酸(每10mL培养基加入0.1mL 3％的储备液)。
实施例1
(1)醋膏的制备：将食醋进行加热浓缩，加热温度为80℃，时间为20h，收集蒸馏醋液和浓缩醋液。向浓缩醋液中以1：300比例加入酵母抽提物，混匀静置取下层液得到调配醋膏。将调配的醋膏原料过滤除杂再经过均质机处理，使其颗粒均一。均质温度20℃、压力20MPa；最后在150℃、时间15s条件下对醋膏进行灭菌处理。经灭菌处理后，冷却至室温，至此醋膏制备完成。
(2)制备Akkermansia Muciniphila菌：根据HACCP质量体系，使用食品级培养基对细菌进行培养，在37℃的厌氧条件下发酵38h，获得活的Akkermansia Muciniphila菌备用；
(3)水果原料预处理：将水果原料取果肉，苹果、香蕉和火龙果按照质量比4：5：3混合进行打浆，向经打浆的果肉中添加果肉总质量0.3％的纤维素酶和0.35％果胶酶，酶解温度为50-55℃，酶解时间2-2.5h。胶体磨磨浆后，得到新鲜果浆，取所述新鲜果浆备用；
(4)药菌混合物的制备：将所述步骤(1)得到的醋膏中加入步骤(2)所得活的Akkermansia Muciniphila菌，在37℃的厌氧条件下发酵15h，获得药菌混合物；
其中活的Akkermansia Muciniphila菌的添加量为6×1010个/100mL醋膏。
(5)调配：向所述步骤(4)所得复配混合物中加入步骤(3)所得果浆进行调配；
其中新鲜果浆添加量为复配混合物质量的35％。
(6)高压均质灭菌：以150MPa，45℃对药菌组合物进行均质杀菌处理，最终得到治疗溃疡性结肠炎的药菌组合物。
实施例2
(1)醋膏的制备：将食醋进行加热浓缩，加热温度为60℃，时间为28h，收集蒸馏醋液和浓缩醋液。向浓缩醋液中以1：400比例加入酵母抽提物，混匀静置取下层液得到调配醋膏。将调配的醋膏原料过滤除杂再经过均质机处理，使其颗粒均一。均质温度25℃、压力20MPa；最后在150℃、时间15s条件下对醋膏进行灭菌处理。经灭菌处理后，冷却至室温，至此醋膏制备完成。
(2)制备Akkermansia Muciniphila菌：根据HACCP质量体系，使用食品级培养基对细菌进行培养，在35℃的厌氧条件下发酵45h，获得活的Akkermansia Muciniphila菌备用；
(3)水果原料预处理：将水果原料取果肉，苹果、香蕉和火龙果按照质量比5：6：3混合进行打浆，向经打浆的果肉中添加果肉总质量0.3％的纤维素酶和0.35％果胶酶，酶解温度为50-55℃，酶解时间2-2.5h。胶体磨磨浆后，得到新鲜果浆，取所述新鲜果浆备用；
(4)药菌混合物的制备：将所述步骤(1)得到的醋膏中加入步骤(2)所得活的Akkermansia Muciniphila菌，在37℃的厌氧条件下发酵30h，获得药菌混合物；
其中活的Akkermansia Muciniphila菌的添加量为6×1010个/100mL醋膏。
(5)调配：向所述步骤(4)所得复配混合物中加入步骤(3)所得新鲜果浆进行调配；
其中新鲜果浆添加量为复配混合物质量的35％。
(6)高压均质灭菌：以150MPa，45℃对药菌组合物进行均质杀菌处理，最终得到治疗溃疡性结肠炎的药菌组合物。
实施例3
(1)醋膏的制备：将食醋进行加热浓缩，加热温度为70℃，时间为24h，收集蒸馏醋液和浓缩醋液。向浓缩醋液中以1.5：300比例加入酵母抽提物，混匀静置取下层液得到调配醋膏。将调配的醋膏原料过滤除杂再经过均质机处理，使其颗粒均一。均质温度25℃、压力20MPa；最后在150℃、时间15s条件下对醋膏进行灭菌处理。经灭菌处理后，冷却至室温，至此醋膏制备完成。
(2)制备Akkermansia Muciniphila菌：根据HACCP质量体系，使用食品级培养基对细菌进行培养，在37℃的厌氧条件下发酵40h，获得活的Akkermansia Muciniphila菌备用；
(3)水果原料预处理：将水果原料取果肉，苹果、香蕉和火龙果按照质量比5：6：3混合进行打浆，向经打浆的果肉中添加果肉总质量0.3％的纤维素酶和0.35％果胶酶，酶解温度为50-55℃，酶解时间2-2.5h。胶体磨磨浆后，得到新鲜果浆，取所述新鲜果浆备用；
(4)药菌混合物的制备：将所述步骤(1)得到的醋膏中加入步骤(2)所得活的Akkermansia Muciniphila菌，在37℃的厌氧条件下发酵20h，获得药菌混合物；
其中活的Akkermansia Muciniphila菌的添加量为6×1011个/100mL醋膏。
(5)调配：向所述步骤(4)所得复配混合物中加入步骤(3)所得新鲜果浆进行调配；
其中新鲜果浆添加量为复配混合物质量的35％。
(6)高压均质灭菌：以150MPa，45℃对药菌组合物进行均质杀菌处理，最终得到治疗溃疡性结肠炎的药菌组合物。
对比例1
(1)醋膏的制备：将食醋进行加热浓缩，加热温度为70℃，时间为24h，收集蒸馏醋液和浓缩醋液。向浓缩醋液中以1.5：300比例加入酵母抽提物，混匀静置取下层液得到调配醋膏。将调配的醋膏原料过滤除杂再经过均质机处理，使其颗粒均一。均质温度25℃、压力20MPa；最后在150℃、时间15s条件下对醋膏进行灭菌处理。经灭菌处理后，冷却至室温，至此醋膏制备完成。
(2)制备Akkermansia Muciniphila菌：根据HACCP质量体系，使用食品级培养基对细菌进行培养，在37℃的厌氧条件下发酵40h，获得活的Akkermansia Muciniphila菌备用；
(3)水果原料预处理：将水果原料取果肉，苹果、香蕉和火龙果按照质量比5：6：3混合进行打浆，向经打浆的果肉中添加果肉总质量0.3％的纤维素酶和0.35％果胶酶，酶解温度为50-55℃，酶解时间2-2.5h。胶体磨磨浆后，得到新鲜果浆，取所述新鲜果浆备用；
(4)复配：将所述步骤(1)得到的醋膏中加入步骤(2)所得活的AkkermansiaMuciniphila菌，获得复配混合物；
其中活的Akkermansia Muciniphila菌的添加量为6×1011个/100mL醋膏。
(5)调配：向所述步骤(4)所得复配混合物中加入步骤(3)所得新鲜果浆进行调配；
其中新鲜果浆添加量为复配混合物质量的35％。
(6)高压均质灭菌：以150MPa，45℃对药菌组合物进行均质杀菌处理，最终得到治疗溃疡性结肠炎的药菌组合物。
对比例2
(1)醋膏的制备：将食醋进行加热浓缩，加热温度为70℃，时间为24h，收集蒸馏醋液和浓缩醋液。向浓缩醋液中以1.5：300比例加入酵母抽提物，混匀静置取下层液得到调配醋膏。将调配的醋膏原料过滤除杂再经过均质机处理，使其颗粒均一。均质温度25℃、压力20MPa；最后在150℃、时间15s条件下对醋膏进行灭菌处理。经灭菌处理后，冷却至室温，至此醋膏制备完成。
(2)水果原料预处理：将水果原料取果肉，苹果、香蕉和火龙果按照质量比5：6：3混合进行打浆，向经打浆的果肉中添加果肉总质量0.3％的纤维素酶和0.35％果胶酶，酶解温度为50-55℃，酶解时间2-2.5h。胶体磨磨浆后，得到新鲜果浆，取所述新鲜果浆备用；
(3)调配：向所述步骤(1)所得复配混合物中加入步骤(2)所得新鲜果浆进行调配；
其中新鲜果浆添加量为复配混合物质量的35％。
(6)高压均质灭菌：以150MPa，45℃对调配混合物进行均质杀菌处理，得到治疗溃疡性结肠炎的组合物。
对比例3
(1)制备Akkermansia Muciniphila菌：根据HACCP质量体系，使用食品级培养基对细菌进行培养，在37℃的厌氧条件下发酵40h，获得活的Akkermansia Muciniphila菌备用；
(2)水果原料预处理：将水果原料取果肉，苹果、香蕉和火龙果按照质量比5：6：3混合进行打浆，向经打浆的果肉中添加果肉总质量0.3％的纤维素酶和0.35％果胶酶，酶解温度为50-55℃，酶解时间2-2.5h。胶体磨磨浆后，得到新鲜果浆，取所述新鲜果浆备用；
(3)调配：向所述步骤(2)所得新鲜果浆中加入步骤(1)所得活的AkkermansiaMuciniphila菌，获得复配混合物；
其中6×1011的Akkermansia Muciniphila菌中添加100mL水果果浆。
(4)高压均质灭菌：以150MPa，45℃对复配混合物进行均质杀菌处理，得到治疗溃疡性结肠炎的组合物。
测试例治疗溃疡性结肠炎的药菌组合物的应用性能
(1)实验动物
C57BL/6小鼠，5～6周雄性，90只。
(2)实验试剂
实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3的组合物、含2.5％ DSS水溶液小鼠饲料、美沙拉嗪片
(3)实验方法
将小鼠随机分成9组，每组10只，分为正常组、模型组、阳性对照组、给药组1、给药组2、给药组3、给药组4、给药组5和给药组6。分组及给药关系如表1所示。
表1分组及给药情况
正常组正常饮食饮水；模型组进行含2.5％ DSS水溶液小鼠饲料饮食15天；实验组进行含2.5％ DSS水溶液小鼠饲料饮食9天，第10天至第15天每天灌胃组合物或美沙拉嗪片，剂量分别为5mL/kg和0.15g/kg。记录小鼠体重变化(表2)。第16天，断颈法处死。收集小鼠的结肠，测量小鼠的结肠长度，结肠细胞中的炎症因子，以及MPO、MDA(表3)。
表2各组小鼠体重变化的统计结果
表3各组小鼠肠道中相关指标的统计结果
注：###与空白组比较P＜0.001；***与模型组相比较，P＜0.001；**与模型组相比较，P＜0.01；*与模型组比较，P＜0.05。
(4)本发明所得的药菌组合物含量指标如下：
水含量≦40-45％，总酸含量≧8.0g/100g，总多糖含量≧3.50g/100g，总酚含量≧5.00mg/g，总黄酮含量≧4.50mg/g。
综上可知，本发明产品能够显著增加溃疡性结肠炎小鼠体重以及结肠长度，减少小鼠结肠细胞上的炎症因子，降低小鼠结肠组织中MPO的活性和MDA的含量。说明本发明产品可以显著发挥抗炎作用抑制了小鼠体内的氧化应激和炎症反应。以上结果说明本发明产品具有显著治疗溃疡性结肠炎的效果，可以作为一种具有良好治疗溃疡性结肠炎效果的药物。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种治疗溃疡性结肠炎的药菌组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备醋膏；
S2、将嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia Muciniphila)在35～38℃下厌氧发酵35～45h，得到活菌；
S3、将S1的醋膏加入S2的活菌中，在35～38℃下厌氧发酵15～35h，得到药菌混合物；
S4、向S3的药菌混合物中加入果浆进行调配，灭菌后得到所述治疗溃疡性结肠炎的药菌组合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤S1中，所述醋膏的制备方法为，将食醋在60℃～80℃进行加热蒸馏浓缩20～30h，收集浓缩醋液，向其中加入酵母抽提物，混匀后分层，取下层液得到醋膏。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia Muciniphila)为Akkermansia Muciniphila ATCC BAA-835。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia Muciniphila)的添加量为6×1010～6×1011个/100mL醋膏。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤S4中，果浆添加量为调配后的药菌混合物质量的30％～40％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤S4中，所述果浆通过水果果肉打浆、酶解得到。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述酶解过程为，分别向经打浆的果肉中加入纤维素酶和果胶酶进行酶解，酶解温度为50～55℃，酶解时间2～3h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述水果选自苹果、火龙果、香蕉、葡萄、菠萝和猕猴桃中的至少两种。
9.权利要求1-8任一项所述的制备方法得到的药菌组合物。
10.权利要求9所述的得到的药菌组合物在制备溃疡性结肠炎治疗药物中的应用。
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