CN111676254A

CN111676254A - 乙酰木聚糖酯酶在聚对苯二甲酸乙二醇酯降解中的应用

Info

Publication number: CN111676254A
Application number: CN202010582493.XA
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 颜正飞; 王蕾; 黄青松
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-06-23
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2020-09-18
Anticipated expiration: 2040-06-23
Also published as: CN111676254B

Abstract

本发明涉及乙酰木聚糖酯酶在聚对苯二甲酸乙二醇酯降解中的应用，属于酶工程技术领域。将乙酰木聚糖酯酶加入至高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的Tris‑HCl缓冲液中，65℃、150rpm恒温水浴摇床中反应6h后，可使高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯塑料部分被降解为羟乙基对苯二甲酸酯(MHET)和可直接回收利用的对苯二甲酸(TPA)，处理后的薄膜表面出现明显的腐蚀现象。因此，本发明的乙酰木聚糖酯酶在降解高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料中具备极高的应用前景。

Description

乙酰木聚糖酯酶在聚对苯二甲酸乙二醇酯降解中的应用

技术领域

本发明涉及乙酰木聚糖酯酶在聚对苯二甲酸乙二醇酯降解中的应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

塑料已广泛应用于家具、汽车零部件、包装、人体植入物、航空和航天领域，已成为日常生活中最常用的商品之一。全球每年的塑料消耗量超3.2亿吨，并且消耗量每年以4～6％的速度增长。其中，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是塑料垃圾的主要来源，加之难以降解。这使得PET塑料垃圾在环境中持续积累，对生态构成了严重的威胁。

目前，降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)依旧停留在使用酸、碱、醇、热等化学物理降解法的阶段。其中，化学降解法会需要大量化学品、高温和高压的设备，且会产生大量有毒有害的物质会对生态环境产生较为严重的影响。因此，生物降解被认为是控制塑料污染最有效的方法。

由于目前使用的化学法降解存在成本高、三废污染严重等问题，很多制造领域已愈来愈趋向使用具有绿色无污染以及成本低的生物法，而该方法逐渐成为塑料降解领域的研究热点。目前已报道的PET降解酶主要有角质酶，酯酶，脂肪酶三大类酶，但是上述PET降解酶能够降解经降结晶处理的低结晶度(无定型)PET薄膜(FEBS Open Bio 2016,6(9):919-927；Biochemistry 2018,57(7):1190-1200)，对高结晶度PET薄膜几乎无显著作用。然而，市面上的PET塑料制品均为高结晶度的，故急需一种能够高效降解高结晶度PET塑料的PET降解酶。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种乙酰木聚糖酯酶的新用途，所述新用途是氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的乙酰木聚糖酯酶在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)降解中的应用。

在本发明的一种实施方式中，编码所述乙酰木聚糖酯酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜或含聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的产品。

本发明还提供了一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的方法，所述方法为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的乙酰木聚糖酯酶添加至含有聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的反应体系中进行降解反应。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中乙酰木聚糖酯酶的添加量为480-960U/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为55-65℃、pH为6.5～7.5。

在本发明的一种实施方式中，所述降解温度为65℃，降解时间为6h。

在本发明的一种实施方式中，所述降解体系为pH 7.0，10mM Tris-HCl缓冲液。

本发明还提供了编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的乙酰木聚糖酯酶的基因、含有编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的乙酰木聚糖酯酶的基因的重组质粒、携带编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的乙酰木聚糖酯酶的基因的宿主细胞以及上述的降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的方法在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET-24a(+)质粒、pET-20b(+)质粒、pET-22b(+)质粒或pET-28a(+)质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli BL21

本发明还提供了一种含有上述的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的乙酰木聚糖酯酶的产品。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的乙酰木聚糖酯酶，将乙酰木聚糖酯酶加入含有聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的pH 7.0，10mM Tris-HCl缓冲液中，其在60℃，pH 7.0，150rpm条件下反应6h，可使聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)部分被降解为羟乙基对苯二甲酸酯(MHET)和可直接回收利用的对苯二甲酸(TPA)，其薄膜表面存在显著的腐蚀。

(2)本发明提供了一种全新的降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的方法，该方法反应条件温和、环境友好，因此，本发明提供的乙酰木聚糖酯酶在降解高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料中具备极高的应用前景。

附图说明

图1：乙酰木聚糖酯酶的SDS-PAGE分析；其中，1：OD₆₀₀＝0.5重组大肠杆菌破壁上清液；2：OD₆₀₀＝1.0重组大肠杆菌破壁上清液。

图2：温度对乙酰木聚糖酯酶的影响。

图3：pH对乙酰木聚糖酯酶的影响。

图4：不同添加量的乙酰木聚糖酯酶对聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜表面微观结构变化。

图5：乙酰木聚糖酯酶对不同表面积聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜表面微观结构变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的羟乙基对苯二甲酸酯(MHET)和对苯二甲酸(TPA)购自Sigma公司；低结晶度(无定型)聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜购自Goodfellow GmbH公司；高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜来自于可口可乐瓶；Thermobifida fusca角质酶(TfC)实验室自制(按专利ZL200910260984.6所述制备)；Candida antarctica脂肪酶(CALB)购自Novozymes公司；Leaf and Branch Compost Cutinase(LCC)实验室自制(按文献Biochemistry 2018,57(7):1190-1200所述制备)。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、氯化钠10、琼脂13，pH 7.0。

LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、氯化钠10，pH 7.0。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

乙酰木聚糖酯酶酶活测定方法：

Tris-HCl缓冲液(10mM pH 7.0)：准确称取Tris 1.210g、NaCl 0.584g、加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解，用HCl调节pH至8.0，定容至1000mL。

底物(50mmol/L的对硝基苯丁酸酯溶液)：准确称取0.1046g对硝基苯丁酸酯，用乙腈定容至10mL，-20℃保存。

对硝基苯酚标准曲线的制作：称取13.9mg对硝基苯酚，用10mM pH 7.0Tris-HCl缓冲液定容至1000mL，配制成100μmol/L的对硝基苯酚母液，再用10mM pH 7.0的Tris-HCl缓冲液稀释至0、20、40、60、80、100μmol/L。用0.5cm玻璃比色皿在分光光度计上测定波长为405nm时的吸光值，以对硝基苯酚浓度C为横坐标，吸光值A为纵坐标，绘制标准曲线A＝a×C+b。

用5mL的移液管准确移取1.5ml Tris-HCl缓冲液(37℃提前温育10min)至0.5cm玻璃比色皿中，在吸收波长405nm处调零。取1.44mL Tris-HCl缓冲液至0.5cm石英比色皿中，取30μL待测稀释酶液加入上述石英比色皿中，取30μL底物溶液，加入上述石英比色皿中，摇匀后立即放入可见分光光度计中，在吸收波长405nm处测A值。每隔5秒钟记录一次A值，反应时间为1分钟。

计算：

式中：K：酶反应所测不同时间A值和时间(min)所成曲线的斜率；

V₁：反应体积(mL)；

V₂：加酶量(mL)；

N：稀释倍数。

聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料薄膜表面微观结构的检测方法：

将经乙酰木聚糖酯酶处理后的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜用去离子水反复清洗3～4次；将清洗完的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜于功率200W、频率58KHz的条件下超声15min；将超声后的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜放入烘箱60℃烘干6h；以未经处理的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜为对照，使用扫描电镜检测未经处理的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜表面以及经乙酰木聚糖酯酶处理后聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜表面微观结构。

降解产物及其含量的检测方法：

标准品处理：分别称取TPA、MHET的标准品溶于二甲亚砜(DMSO)中制成母液，利用无菌水将母液稀释成0.1mg/mL标准品溶液，用0.22μM的滤头过滤，用注射器注入液相瓶进行HPLC检测；

样品处理：将培养液静置10min，取上清5mL，12000rpm离心8min，用0.22μM的滤头过滤，用注射器注入液相瓶，进行HPLC检测。

失重率的检测方法：

PET薄膜的失重率(％)＝[(m₂-m₁)/m₂]×100；

m₁：经处理后的PET薄膜用去离子水反复清洗3～4次，将清洗完的PET薄膜于功率200W、频率58KHz的条件下超声15min，放入烘箱60℃烘干6h后称重；

m₂：经菌株处理前的PET薄膜用去离子水反复清洗3～4次，将清洗完的PET薄膜于功率200W、频率58KHz的条件下超声15min，放入烘箱60℃烘干6h后称重；

实施例1：乙酰木聚糖酯酶的重组表达

具体步骤如下：

(1)重组质粒的构建

利用化学方法将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码乙酰木聚糖酯酶的基因合成到载体pET-24a(+)上，直接获得重组质粒pET-24a(+)-acES，将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有40μg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行测序验证，验证正确即获得重组质粒pET-24a(+)-acES；

(2)重组大肠杆菌的构建

将重组质粒pET-24a(+)-acES转化大肠杆菌Escherichia coli BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-24a(+)-acES；

(3)摇瓶发酵产酶

将摇瓶培养8～12h后获得的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-24a(+)-acES菌液以5％(v/v)的接种量转接至100mL的LB液体培养基中，于37℃、200rpm摇床培养3h至OD600＝0.8后添加IPTG至终浓度为0.4mM，于25℃、200rpm继续摇床培养20h，获得发酵液；

将发酵液于8000rpm的条件下离心15min取沉淀；用pH 7.0 10mMTris-HCl缓冲液悬浮沉淀，获得重悬液；将重悬液用高压匀浆机于压力为800Bar的条件下破壁，得到破壁液；将破壁液于8000rpm的条件下离心15min，将破壁上清、破壁沉淀分离。

分别对发酵上清液、破壁上清液、破壁沉淀三个部分进行酶活测定，发现仅在破壁上清有酶活，其余2个部分未检测到酶活，证明该重组乙酰木聚糖酯酶为胞内酶(如表1所示)。破壁上清液经SDS-PAGE分析显示在25kDa条带出存在粗的蛋白带，即为乙酰木聚糖酯酶(如图1所示)，经检测破壁上清液中乙酰木聚糖酯酶的酶活为400U/mL。

表1重组菌不同部分的乙酰木聚糖酯酶酶活

样品	酶活(U/mL)
		发酵上清液	0
破壁上清液	400
		破壁沉淀	0

实施例2：乙酰木聚糖酯酶的酶学性质

具体步骤如下：

1、最适温度

取1.44mL Tris-HCl缓冲液至0.5cm石英比色皿中，取30uL待测稀释样品，将混合液分别置于50、55、60、65、70℃水浴中预热5min后，然后加入30uL底物溶液，摇匀后立即放入可见分光光度计中，在吸收波长405nm处测A值，每隔5秒钟记录一次A值，反应时间为1分钟。

用酶标仪测定反应体系在405nm波长下的吸光值，以酶活最高的为100％，计算各个温度下乙酰木聚糖酯酶的相对酶活(检测结果见图2)，结果显示，乙酰木聚糖酯酶的最适温度是65℃。

2、最适pH

取1.44mL浓度为50mM、pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0的Tris-HCl缓冲液至0.5cm石英比色皿中，取30uL待测稀释样品，将混合液分别置于65℃水浴中预热5min后，然后加入30uL底物溶液，摇匀后立即放入可见分光光度计中，在吸收波长405nm处测A值，每隔5秒钟记录一次A值，反应时间为1分钟。

用酶标仪测定反应体系在405nm波长下的吸光值，以酶活最高的为100％，计算各个pH下乙酰木聚糖酯酶的相对酶活(检测结果见图3)，结果显示，乙酰木聚糖酯酶的最适pH为7.0。

实施例3：乙酰木聚糖酯酶对高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜降解效果

具体步骤如下：

取pH 7.0，10mM Tris-HCl缓冲液10mL，向缓冲液中添加2×2cm²高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜，分别以480U/mL和960U/mL的添加量添加实施例1获得的乙酰木聚糖酯酶液；65℃、150rpm恒温水浴摇床中反应6h后，低速离心将膜与降解液分离；薄膜测定失重率，降解液煮沸15min灭酶，12,000rpm/min离心10min获得上清液进行HPLC分析(检测结果见表2)。

检测经乙酰木聚糖酯酶液处理后高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的表面微观结构可知，结果表明加酶量增加，薄膜表面腐蚀度也会增加(检测结果见图4)；由表2可知，实验结果表明随着加酶量增加，降解产物的量同样也会增加。

表2不同添加量的乙酰木聚糖酯酶降解高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜

实施例4：乙酰木聚糖酯酶降解不同面积的高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜

具体步骤如下：

具体实施方式同实施例3，区别在于，向缓冲液中分别添加面积为4×4cm²和2×2cm²高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜，以960U/mL的添加量添加实施例1获得的乙酰木聚糖酯酶液；

检测经酶液处理后高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的表面微观结构可知，随着表面积的增加，薄膜表面腐蚀度没有显著差异(检测结果见图5)；由表3可知，结果表明2×2cm²和4×4cm²的薄膜降解产物的量基本相同，且薄膜失重率也无明显变化。

表3乙酰木聚糖酯酶降解不同表面积的高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜(PET)薄膜

实施例5：不同的酯酶对高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜降解效果

具体实施方式同实施例3，区别在于，以960U/mL的酶添加量分别添加Thermobifida fusca角质酶(TfC)、Candida antarctica脂肪酶(CALB)、Leaf and BranchCompost Cutinase酶。结果显示(如表4所述)，TfC、CALB、LCC对高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的降解产物生成量、薄膜失重率均低于乙酰木聚糖酯酶处理效果。因此，乙酰木聚糖酯酶比TfC、CALB、LCC更适合降解高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜。

表4不同酶降解高结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜

实施例6：不同的酯酶对低结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜降解效果

具体实施方式同实施例3，区别在于，以960U/mL的添加量分别添加乙酰木聚糖酯酶、Thermobifida fusca角质酶(TfC)、Candida antarctica脂肪酶(CALB)、Leaf andBranch Compost Cutinase酶处理2×2cm²低结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜。

结果显示(如表5所述)，TfC、CALB、LCC对低结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的降解产物生成量、薄膜失重率与乙酰木聚糖酯酶处理效果类似。故乙酰木聚糖酯酶和TfC、CALB、LCC降解低结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜的效果是相似的。

表5不同酶降解低结晶度聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 乙酰木聚糖酯酶在聚对苯二甲酸乙二醇酯降解中的应用

<130> BAA200441A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 320

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Gln Leu Phe Asp Leu Ser Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Lys Pro

1 5 10 15

Lys Lys Thr Ala Arg Pro Asp Phe Ser Asp Phe Trp Lys Lys Ser Leu

20 25 30

Glu Glu Leu Arg Gln Val Glu Ala Glu Pro Thr Leu Glu Ser Tyr Asp

35 40 45

Tyr Pro Val Lys Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Gln Ser Phe

50 55 60

Gly His Ser Lys Ile Glu Gly Phe Tyr Ala Val Pro Asp Gln Thr Gly

65 70 75 80

Pro His Pro Ala Leu Val Arg Phe His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp

85 90 95

Gly Gly Ile His Asp Ile Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Thr

100 105 110

Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gly Gly Ser Glu Asp Thr Ser Val

115 120 125

Thr Pro Gly Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Ser

130 135 140

Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala

145 150 155 160

Leu Glu Val Ile Gln Ser Phe Pro Glu Val Asp Glu His Arg Ile Gly

165 170 175

Val Ile Gly Gly Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ala

180 185 190

Leu Ser Asp Ile Pro Lys Val Val Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser

195 200 205

Asn Phe Glu Arg Ala Val Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu

210 215 220

Ile Asn Ser Tyr Phe Arg Arg Asn Ser Asp Pro Lys Val Glu Glu Lys

225 230 235 240

Ala Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Leu Ile Asn Leu Ala Gly Trp

245 250 255

Val Lys Gln Pro Thr Leu Met Ala Ile Gly Leu Ile Asp Lys Ile Thr

260 265 270

Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Asp Lys

275 280 285

Asp Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Phe Ile Pro Ala Phe

290 295 300

Gln Thr Glu Lys Leu Ser Phe Leu Gln Lys His Leu Leu Leu Ser Thr

305 310 315 320

<210> 2

<211> 5310

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccgcgaccc atttgctgtc caccagtcat gctagccata 240

tgtatatctc cttcttaaag ttaaacaaaa ttatttctag aggggaattg ttatccgctc 300

acaattcccc tatagtgagt cgtattaatt tcgcgggatc gagatctcga tcctctacgc 360

cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc 420

cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg 480

cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc 540

accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat 600

gcaggagtcg cataagggag agcgtcgaga tcccggacac catcgaatgg cgcaaaacct 660

ttcgcggtat ggcatgatag cgcccggaag agagtcaatt cagggtggtg aatgtgaaac 720

cagtaacgtt atacgatgtc gcagagtatg ccggtgtctc ttatcagacc gtttcccgcg 780

tggtgaacca ggccagccac gtttctgcga aaacgcggga aaaagtggaa gcggcgatgg 840

cggagctgaa ttacattccc aaccgcgtgg cacaacaact ggcgggcaaa cagtcgttgc 900

tgattggcgt tgccacctcc agtctggccc tgcacgcgcc gtcgcaaatt gtcgcggcga 960

ttaaatctcg cgccgatcaa ctgggtgcca gcgtggtggt gtcgatggta gaacgaagcg 1020

gcgtcgaagc ctgtaaagcg gcggtgcaca atcttctcgc gcaacgcgtc agtgggctga 1080

tcattaacta tccgctggat gaccaggatg ccattgctgt ggaagctgcc tgcactaatg 1140

ttccggcgtt atttcttgat gtctctgacc agacacccat caacagtatt attttctccc 1200

atgaagacgg tacgcgactg ggcgtggagc atctggtcgc attgggtcac cagcaaatcg 1260

cgctgttagc gggcccatta agttctgtct cggcgcgtct gcgtctggct ggctggcata 1320

aatatctcac tcgcaatcaa attcagccga tagcggaacg ggaaggcgac tggagtgcca 1380

tgtccggttt tcaacaaacc atgcaaatgc tgaatgaggg catcgttccc actgcgatgc 1440

tggttgccaa cgatcagatg gcgctgggcg caatgcgcgc cattaccgag tccgggctgc 1500

gcgttggtgc ggatatctcg gtagtgggat acgacgatac cgaagacagc tcatgttata 1560

tcccgccgtt aaccaccatc aaacaggatt ttcgcctgct ggggcaaacc agcgtggacc 1620

gcttgctgca actctctcag ggccaggcgg tgaagggcaa tcagctgttg cccgtctcac 1680

tggtgaaaag aaaaaccacc ctggcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg 1740

ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc 1800

aacgcaatta atgtaagtta gctcactcat taggcaccgg gatctcgacc gatgcccttg 1860

agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat cgtcgccgca 1920

cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc gctctgggtc 1980

attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc gcttgcggta 2040

ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac caaacgtttc 2100

ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccccac gggtgcgcat gatcgtgctc 2160

ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca 2220

ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca 2280

acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc 2340

tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct 2400

acatctgtat taacgaagcg ctggcattga ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc 2460

atccataccg ccagttgttt accctcacaa cgttccagta accgggcatg ttcatcatca 2520

gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt ttcatcggta tcattacccc catgaacaga 2580

aatccccctt acacggaggc atcagtgacc aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc 2640

cgctttatca gaagccagac attaacgctt ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat 2700

gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc 2760

ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 2820

acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 2880

gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact 2940

ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatata tgcggtgtga 3000

aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct 3060

cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 3120

ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 3180

ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 3240

cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 3300

actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 3360

cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 3420

tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 3480

gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 3540

caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 3600

agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 3660

tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 3720

tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 3780

gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 3840

gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga acaataaaac 3900

tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa cgggaaacgt 3960

cttgctctag gccgcgatta aattccaaca tggatgctga tttatatggg tataaatggg 4020

ctcgcgataa tgtcgggcaa tcaggtgcga caatctatcg attgtatggg aagcccgatg 4080

cgccagagtt gtttctgaaa catggcaaag gtagcgttgc caatgatgtt acagatgaga 4140

tggtcagact aaactggctg acggaattta tgcctcttcc gaccatcaag cattttatcc 4200

gtactcctga tgatgcatgg ttactcacca ctgcgatccc cgggaaaaca gcattccagg 4260

tattagaaga atatcctgat tcaggtgaaa atattgttga tgcgctggca gtgttcctgc 4320

gccggttgca ttcgattcct gtttgtaatt gtccttttaa cagcgatcgc gtatttcgtc 4380

tcgctcaggc gcaatcacga atgaataacg gtttggttga tgcgagtgat tttgatgacg 4440

agcgtaatgg ctggcctgtt gaacaagtct ggaaagaaat gcataaactt ttgccattct 4500

caccggattc agtcgtcact catggtgatt tctcacttga taaccttatt tttgacgagg 4560

ggaaattaat aggttgtatt gatgttggac gagtcggaat cgcagaccga taccaggatc 4620

ttgccatcct atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc attacagaaa cggctttttc 4680

aaaaatatgg tattgataat cctgatatga ataaattgca gtttcatttg atgctcgatg 4740

agtttttcta agaattaatt catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 4800

caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgaaattgt aaacgttaat 4860

attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc 4920

gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt 4980

ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa 5040

accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg 5100

tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga 5160

cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct 5220

agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat 5280

gcgccgctac agggcgcgtc ccattcgcca 5310

Claims

1.乙酰木聚糖酯酶在聚对苯二甲酸乙二醇酯降解中的应用，其特征在于，所述乙酰木聚糖酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的乙酰木聚糖酯酶在聚对苯二甲酸乙二醇酯降解中的应用，其特征在于，编码所述乙酰木聚糖酯酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1或2所述的乙酰木聚糖酯酶在聚对苯二甲酸乙二醇酯降解中的应用，其特征在于，所述应用包括在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜或含聚对苯二甲酸乙二醇酯的产品中的应用。

4.一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的方法，其特征在于，所述方法为将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的乙酰木聚糖酯酶添加至含有聚对苯二甲酸乙二醇酯的反应体系中进行降解反应。

5.如权利要求4所述的一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的方法，其特征在于，所述反应体系中，乙酰木聚糖酯酶的添加量为480-960U/mL。

6.如权利要求4或5所述的一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的方法，其特征在于，所述反应的温度为55-65℃、pH为6.5～7.5。

7.编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的乙酰木聚糖酯酶的基因、含有编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的乙酰木聚糖酯酶的基因的重组质粒、携带编码核苷酸序列如SEQID NO.2所示的乙酰木聚糖酯酶的基因的宿主细胞以及权利要求4-6任一所述的降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的方法在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET载体。

9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

10.一种降解聚对苯二甲酸乙二醇酯的产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的乙酰木聚糖酯酶。