CN113684196A

CN113684196A - 一种耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的纯化方法

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Publication number: CN113684196A
Application number: CN202110999081.0A
Authority: CN
Inventors: 陈必强; 张子璇; 陈长京; 邵超锋; 谭天伟
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2021-08-28
Filing date: 2021-08-28
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2041-08-28
Also published as: CN113684196B

Abstract

本发明属于蛋白分离纯化领域，涉及一种耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的纯化方法，其包括：步骤B，对耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的粗酶液进行加热处理，获得热处理后粗酶液；步骤C，将热处理后粗酶液进行离心或静置处理，获得高纯度的聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶。本发明与已有技术相比，成本低廉，操作简便，回收率高，纯化效果好，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的纯化方法

技术领域

本发明属于蛋白分离纯化领域，涉及一种耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的纯化方法。

背景技术

为了应对废弃塑料对环境的挑战，发展循环经济，迫切需要开发可持续的废塑料升级回收技术。与传统的塑料处理方式(如焚烧和填埋)总是会导致二次污染相比，生物法更为环保，可通过催化水解反应，将塑料碎片升级为大宗化学品。与基于酸和碱催化的传统化学催化路线相比，使用耐高温PET水解酶水解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等塑料更具吸引力，因其所需能耗低，且二次污染可忽略不计。

在过去几年中，已经鉴定并表征了多种PET水解酶。其中，本发明人研究发现来自白色高温双歧菌(Thermobifida alba)、解纤维素喜热裂胞菌(Thermobifidacellulosilytica)、褐色喜热裂胞菌(Thermobifida fusca)、耐盐高温双歧菌(Thermobifida halotolerans)、弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、特异腐质霉(Himicolainsolens)、假单胞菌(Pseudomonas)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、绿色糖单胞菌(Saccharomonospora viridis)和产气弧菌(Vibrio gazogenes)等的角质酶及其突变体均具有较高的PET水解效率。

由于PET水解反应所需温度较高，杂蛋白极易受热沉淀。无论采用哪种PET水解酶，在PET生物水解过程中，都必须对异源表达后的PET水解酶进行纯化，以避免杂质的干扰，从而保证催化效率。常见的蛋白纯化方式主要包括硫酸铵沉淀(基于蛋白溶解度差异)、蔗糖密度梯度超离心(基于蛋白质浮游密度的差异)、离子交换层析(静电相互作用)以及亲和层析(亲和作用)等物理分离方法。

这些蛋白纯化技术虽然经典且久经考验，但仍存在很多弊端。例如，使用硫酸铵沉淀时，沉淀出的蛋白难以重新溶解，并且可能发生蛋白质聚集。尽管蔗糖密度梯度离心操作简单，但其对蛋白的解析度很差。

离子交换层析和亲和层析虽然可以获得高纯度的酶，但成本过高以至于无法在大规模操作中实现，此外层析法的酶回收率较低，同时还会产生大量废水、洗脱溶剂和固体废物。例如，采用实验室广泛应用的镍柱分离酶后，还需要妥善处理大量含镍离子的琼脂糖废料和有机溶剂咪唑，以避免重金属污染和人皮肤致敏。与此同时，在洗脱过程中，含有酶的溶液会被稀释，还需要额外的浓缩和过滤步骤以去除残留的咪唑。

因此，建立一种替代的成本低廉且环境友好的PET水解酶纯化方法，对促进解决“白色污染”问题至关重要。幸运的是，PET水解酶总是表现出良好的耐热性，而常用宿主菌(如大肠杆菌)中的内源蛋白耐热性很差。因此，可通过升高温度，使杂蛋白变性并沉淀，从而促进PET水解酶的纯化。在前人的工作中，已初步尝试热处理以半纯化LCC酶及其相关突变体(V.Tournier,C.M.Topham,et al.Nature(2020)1476-4687，DOI号：10.1038/s41586-020-2149-4)。然而，到目前为止，还没有一种完全使用热处理方式纯化PET水解酶的策略。

因此，目前存在的问题是需要研究开发一种用于PET水解酶热纯化的一般适用性方法，并为具有更好热稳定性的酶提供一种新的纯化方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术存在的缺陷提供一种耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的纯化方法。该方法直接利用热处理方式实现聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的纯化，成本低廉，操作简便，回收率高，纯化效果好，具有良好的工业化应用前景。

为此，本发明提供了一种耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的纯化方法，其包括：

步骤B，对耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的粗酶液进行加热处理，获得热处理后粗酶液；

步骤C，将热处理后粗酶液进行离心或静置处理，获得高纯度的聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶。

在本发明的一些实施例中，所述加热处理的温度为55-80℃。

在本发明的一些实施例中，所述加热处理的时间为0.5-48h。

在本发明的一些实施例中，在步骤C中，所述离心处理的转速为3000～15000rpm，所述离心处理的时间为0～30min。

本发明中，所述耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶为角质酶或经基因工程改造后角质酶；编码所述角质酶的基因来源于宏基因组文库或合成角质酶的微生物。

在本发明的一些实施例中，所述合成角质酶的微生物包括白色高温双歧菌(Thermobifida alba)、解纤维素喜热裂胞菌(Thermobifida cellulosilytica)、褐色喜热裂胞菌(Thermobifida fusca)、耐盐高温双歧菌(Thermobifida halotolerans)、弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、特异腐质霉(Himicola insolens)、假单胞菌(Pseudomonas)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、绿色糖单胞菌(Saccharomonospora viridis)和产气弧菌(Vibriogazogenes)中的一种或几种。

在本发明的一些进一步的实施例中，所述耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶为通过大肠杆菌或其他非嗜热基因工程菌对编码所述角质酶的基因进行异源表达获得。

根据本发明方法，所述耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的粗酶液中还任选地加入了添加剂。

本发明中，所述添加剂为酶保护剂和/或絮凝剂。

在本发明的一些实施例中，所述絮凝剂为聚丙烯酰胺；和/或，所述酶保护剂包括多元醇、糖类、嘧啶类、氨基酸及其衍生物、甜菜碱和3-羟基丁酸中的一种或几种。

在本发明的一些实施例中，所述酶保护剂的添加量为粗酶液质量的0％～20％。

在本发明的另一些实施例中，所述酶絮凝剂的用量为0～100ppm。

与现有技术相比，本发明具有如下特性：

(1)仅使用简单的热处理方法，即可实现聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的纯化，纯化效果与实验室最常用的镍柱纯化法相当，但成本低廉，操作简便，回收率高，且无额外废物流产生，具有良好的工业化应用前景。

(2)本发明可利用工厂中废蒸汽对体系进行加热，耗能较少，设备简单，有利于工业化生产。

附图说明

下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：

图1为六种聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶粗酶液在60℃催化PET膜水解的反应进程图，其中，ThcCut1、TfCut2、TfCut2-G62A、TfCut2-G62A/F209A和LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G在96小时内反应速率并未出现下降趋势，证明这五种酶均可在60℃保持长时间稳定活性，而ThcCut2的反应曲线随着时间的延长逐渐变缓，表明其反应速率有所下降，证明该酶无法在60℃保持稳定活性。

图2为聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶纯化前后的蛋白电泳图；其中，图2(a)为ThcCut1、ThcCut2、TfCut2粗酶液经镍柱纯化前后的蛋白电泳图；图2(b)为TfCut2-G62A、TfCut2-G62A/F209A、LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G粗酶液经镍柱纯化前后的蛋白电泳图；图2(c)为ThcCut1和ThcCut2粗酶液在60℃加热24h后的蛋白电泳图，各设置四种体系，从左到右依次为无添加剂体系、含10％甘油(w/v)体系、含1ppm阴离子聚丙烯酰胺(分子量1200-1400万)体系、含1ppm非离子聚丙烯酰胺(分子量1200万)体系；图2(d)为TfCut2和TfCut2-G62A粗酶液在60℃加热24h后的蛋白电泳图，各设置四种体系，从左到右依次为无添加剂体系、含10％甘油(w/v)体系、含1ppm阴离子聚丙烯酰胺(分子量1200-1400万)体系、含1ppm非离子聚丙烯酰胺(分子量1200万)体系；图2(e)为TfCut2-G62A/F209A和LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G粗酶液在60℃加热24h后的蛋白电泳图，各设置四种体系，从左到右依次为无添加剂体系、含10％甘油(w/v)体系、含1ppm阴离子聚丙烯酰胺(分子量1200-1400万)体系、含1ppm非离子聚丙烯酰胺(分子量1200万)体系；图2(f)为ThcCut1和ThcCut2粗酶液在60℃加热48h后的蛋白电泳图，各设置四种体系，从左到右依次为无添加剂体系、含10％甘油(w/v)体系、含1ppm阴离子聚丙烯酰胺(分子量1200-1400万)体系、含1ppm非离子聚丙烯酰胺(分子量1200万)体系；图2(g)为TfCut2和TfCut2-G62A粗酶液在60℃加热48h后的蛋白电泳图，各设置四种体系，从左到右依次为无添加剂体系、含10％甘油(w/v)体系、含1ppm阴离子聚丙烯酰胺(分子量1200-1400万)体系、含1ppm非离子聚丙烯酰胺(分子量1200万)体系；图2(h)为TfCut2-G62A/F209A和LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G粗酶液在60℃加热48h后的蛋白电泳图，各设置四种体系，从左到右依次为无添加剂体系、含10％甘油(w/v)体系、含1ppm阴离子聚丙烯酰胺(分子量1200-1400万)体系、含1ppm非离子聚丙烯酰胺(分子量1200万)体系；图2(i)为ThcCut1和ThcCut2粗酶液在60℃加热72h后的蛋白电泳图，各设置四种体系，从左到右依次为无添加剂体系、含10％甘油(w/v)体系、含1ppm阴离子聚丙烯酰胺(分子量1200-1400万)体系、含1ppm非离子聚丙烯酰胺(分子量1200万)体系；图2(j)为TfCut2和TfCut2-G62A粗酶液在60℃加热72h后的蛋白电泳图，各设置四种体系，从左到右依次为无添加剂体系、含10％甘油(w/v)体系、含1ppm阴离子聚丙烯酰胺(分子量1200-1400万)体系、含1ppm非离子聚丙烯酰胺(分子量1200万)体系；图2(k)为TfCut2-G62A/F209A和LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G粗酶液在60℃加热72h后的蛋白电泳图，各设置四种体系，从左到右依次为无添加剂体系、含10％甘油(w/v)体系、含1ppm阴离子聚丙烯酰胺(分子量1200-1400万)体系、含1ppm非离子聚丙烯酰胺(分子量1200万)体系。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

Ⅰ.术语

本发明所述用语“PET”是指聚对苯二甲酸乙二醇酯，“TPA”是指对苯二甲酸，“MHET”是指对苯二甲酸单(羟乙基)酯，“BHET”是指对苯二甲酸双(羟乙基)酯，“HPLC”是指高效液相色谱法。

本发明中所述用语“蛋白”与“蛋白质”可以互相使用。

本发明中所述用语“嗜热”与“耐高温”、“高温”、“喜热”可以互相使用。

本发明中所述用语“耐高温”是指耐60℃及以上温度，“耐高温”的酶是指可在60℃保持稳定活性的酶。

本发明中所述用语“高纯度”是指纯化后蛋白进行蛋白电泳后，无目的条带以外的杂条带。

本发明中所述用语“比酶活”与“比活力”可以互相使用。

本发明中所述用语“加热”与“热处理”可以互相使用。

Ⅱ.实施方案

如前所述，硫酸铵沉淀法会使沉淀出的蛋白难以重新溶解，并且可能发生蛋白质聚集；蔗糖密度梯度离心法对蛋白的解析度很差；离子交换层析和亲和层析成本过高以至于无法在大规模操作中实现，酶回收率较低，同时还会产生大量废水、洗脱溶剂和固体废物。而现有的热处理纯化方法均为在多步纯化过程中，以热处理手段为第一步预纯化的方式进行，操作更为繁琐。鉴于此，本发明人对单热处理方式纯化聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的工艺进行了大量研究。

本发明人研究发现来自白色高温双歧菌(Thermobifida alba)、解纤维素喜热裂胞菌(Thermobifida cellulosilytica)、褐色喜热裂胞菌(Thermobifida fusca)、耐盐高温双歧菌(Thermobifida halotolerans)、弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、特异腐质霉(Himicola insolens)、假单胞菌(Pseudomonas)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、绿色糖单胞菌(Saccharomonospora viridis)和产气弧菌(Vibrio gazogenes)等的角质酶及其突变体均具有较高的PET水解效率，但所需的反应温度较高，通常在50℃以上进行，而大肠杆菌中内源蛋白的热稳定性较差，在高温条件极易沉淀，会严重影响PET水解酶与底物的结合，使得PET水解酶的催化效率变低，但反应仍可以较低的效率持续进行(参见图1)，证明长时间加热对PET水解酶本身的活性可能并无影响。因此，考虑利用此特点进行PET水解酶的分离纯化，杂蛋白可以非常简单的方式去除，并且不会影响到PET水解酶的活性，且无污染，成本低，操作简便，有利于工业化生产。本发明正是基于上述发现完成的。

因此，本发明所提供的耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的纯化方法包括以下步骤：

(1)对耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的粗酶液进行加热处理，获得热处理后粗酶液；

(2)将热处理后粗酶液进行离心或静置处理，获得高纯度的聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶。

在本发明的一些实施例中，在步骤(1)中，所述加热处理的温度为55-80℃，优选为55-60℃，进一步优选为60℃。

在本发明的另一些实施例中，在步骤(1)中，所述加热处理的时间为0.5-48h，优选为48h。

在本发明的又一些实施例中，在步骤(2)中，所述离心处理的转速为3000～15000rpm，所述离心处理的时间为0～30min。

本发明人研究发现，静置处理也可以较好地实现分离纯化，且能节约成本，本发明本发明中，所谓“离心处理的时间为0”可以理解为静置处理。

在本发明的一些具体优选的实施例中，在步骤(2)中，所述离心处理的转速为12000rpm，所述离心处理的时间为10min。

如前所述，本发明人研究发现可用作PET水解的角质酶均具有良好的耐热性，而大肠杆菌等非嗜热宿主细胞中表达的内源蛋白热稳定性很差，因此，本发明中，直接通过加热后离心的方式实现耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的纯化。

具体地，所述耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶为角质酶或经基因工程改造后角质酶；编码所述角质酶的基因来源于宏基因组文库或合成角质酶的微生物，所述合成角质酶的微生物包括但不限于白色高温双歧菌(Thermobifida alba)、解纤维素喜热裂胞菌(Thermobifida cellulosilytica)、褐色喜热裂胞菌(Thermobifida fusca)、耐盐高温双歧菌(Thermobifida halotolerans)、弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、特异腐质霉(Himicolainsolens)、假单胞菌(Pseudomonas)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、绿色糖单胞菌(Saccharomonospora viridis)、产气弧菌(Vibrio gazogenes)等。

由于本发明中纯化耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的方式是加热法，所以需要杂蛋白是不耐热的，使用非嗜热的基因工程菌进行角质酶的表达，所产生的杂蛋白都是这些工程菌所表达的内源蛋白，它们都不耐高温。而有一些特殊的基因工程菌，本身就是嗜热菌，它们表达出的内源蛋白也会是耐热的，这种就没办法用加热法来纯化。

因此，优选地，所述耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶为通过大肠杆菌或其他非嗜热基因工程菌对编码所述角质酶的基因进行异源表达获得。

本发明中对于在大肠杆菌或其他非嗜热基因工程菌中对编码所述角质酶的基因进行异源表达的方式没有特别的限制，例如，可以采用本领域中常规的方法进行。

本发明人研究发现，在步骤(1)中，不添加任何添加剂对耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的粗酶液进行加热处理，就可以实现对耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的最终分离，甚至高效分离。发明人进一步考察了诸如酶保护剂和/或絮凝剂等添加剂对耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶分离纯化的影响，发现在耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的粗酶液中添加某些添加剂，例如甘油和阴离子聚丙烯酰胺，进行加热处理，对耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的最终分离效果可能会更好。

本发明中，所述添加剂为酶保护剂和/或絮凝剂，其包括但不限于多元醇(例如，甘油、山梨醇、聚乙二醇)、糖类(例如，蔗糖、海藻糖、麦芽糖)、嘧啶类(例如，四氢嘧啶，羟基四氢嘧啶)、氨基酸及其衍生物(例如，甘氨酸)、甜菜碱、3-羟基丁酸和聚丙烯酰胺(例如，阴离子聚丙烯酰胺，阳离子聚丙烯酰胺，非离子聚丙烯酰胺)中的一种或几种；其中，聚丙烯酰胺为絮凝剂，其余均为酶保护剂。

在本发明的一些具体实施例中，以大肠杆菌BL21(DE3)(购于北京全式金生物技术有限公司)为宿主细胞，进行耐高温PET水解酶的表达，以获得PET水解酶粗酶液，包括以下步骤：

(1)接管：向4mL无菌LB培养基中，加入40μL用于表达PET水解酶的甘油菌与4μL对应抗性抗生素，在37℃，180rpm条件下，培养12～16h；

(2)接瓶：向30mL无菌LB培养基中，加入30μL对应抗性抗生素与500μL的(1)中所述菌液，在37℃，180rpm条件下，培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8；

(3)诱导：向摇瓶中加入30μL IPTG溶液，16℃，180rpm，诱导16～22h；

(4)离心，收集菌体；

(5)加入6mL裂解缓冲液(100mM pH＝8.0 K₂HPO₄-KH₂PO₄，300mM NaCl)，重悬菌体；

(6)冰浴超声破碎10min；

(7)离心，收集上清。

在PET酶法水解领域，最常用的酶纯化方法为镍柱纯化法。因此，在本发明的具体实施例中，以镍柱纯化得到的酶液为对照组，进行两种纯化方法的比较，镍柱纯化包括以下步骤：

(1)装柱：向各个12cm重力柱中加入2mL镍柱填料；

(2)加入5mL磷酸缓冲液(100mM pH＝8.0 K₂HPO₄-KH₂PO₄)；

(3)加入5mL洗脱液(100mM pH＝8.0 K₂HPO₄-KH₂PO₄，300mM NaCl，250mM咪唑)；

(4)加入5mL清洗液(100mM pH＝8.0 K₂HPO₄-KH₂PO₄，300mM NaCl，20mM咪唑)；

(5)加入PET水解酶粗酶液，反复穿透3次；

(6)加入5mL清洗液，重复5次；

(7)加入5mL洗脱液，重复4次，收集后3次的流出液；

(8)以5mL洗脱液及清洗液，各洗5次；

(9)以5mL磷酸缓冲液洗去咪唑；

(10)以5mL 20％乙醇预封柱；

(11)堵住下塞头，加入5mL 20％乙醇，封柱，4℃保存。

本发明中所涉及的相关参数检测和计算方法如下：

(1)PET纳米颗粒的水解方法：

将PET水解酶以磷酸缓冲液(100mM，pH＝8.0)稀释到一定蛋白浓度，将PET纳米颗粒与稀释后PET水解酶按1：1体积比加入2mL反应管中，在热振荡器(400rpm)上于60℃孵育2小时，加入等体积包含20％(v/v)DMSO的160mM磷酸盐缓冲液(pH＝2.5)来终止反应，将反应上清液用于产物分析。

(2)PET水解产物的测定方法：

使用赛默飞UltiMate 3000高效液相色谱仪(色谱柱为Acclaim 120-C18)进行HPLC分析，A相：磷酸缓冲液(20mM，pH＝2.5)，B相：色谱纯甲醇，流速：1mL/min，检测波长：240nm，洗脱程序：0至15分钟，25％甲醇；15至25分钟，25％-100％甲醇，25至26分钟，100％甲醇；26至30分钟，25％-100％甲醇。对BHET、MHET、TPA进行定量测定。

(3)蛋白浓度的测定方法：

利用传统的考马斯亮蓝法，使用赛默飞Multiskan Spectrum全波长酶标仪，在596nm处进行蛋白浓度的测定。

(4)PET水解酶的比活力(SA)按照下式进行理论计算：

其中，C_产为实际产物浓度，是试样中测得的BHET、MHET、TPA浓度之和的2倍(因测样前稀释了一倍)，单位为μmol/mL；

V_反为反应总体积，单位为mL；

T为反应时间，单位为h；

V_酶为反应中所使用酶液的体积，单位为mL；

C_酶为酶液中蛋白浓度，单位为mg/mL；

在本发明的具体实施例中，V_反＝0.6mL，T＝2h，因此：

(5)相对酶活回收因子(α)按照下式进行理论计算：

其中，SA_热为热纯化酶液的比活力，单位为U/mg；

C_热为热纯化酶液的蛋白浓度，单位为mg/mL；

V_热为热纯化酶液的体积，单位为mL；

SA_镍为镍柱纯化酶液的比活力，单位为U/mg；

C_镍为镍柱纯化酶液的蛋白浓度，单位为mg/mL；

V_镍为镍柱酶液的体积，单位为mL；

在本发明的具体实施例中，V_热＝V_镍，因此：

研究表明，本发明中的耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的纯化方法并不仅限于耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶，该纯化方法也可以推广至其他嗜热酶。

Ⅲ.实施例

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅作为说明作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明所使用的原料或组分若无特殊说明，均可通过商业途径或常规方法获得。

以下实施例以大肠杆菌BL21(DE3)(购于北京全式金生物技术有限公司)为宿主细胞，通过在大肠杆菌表达质粒的NdeI和XhoI限制酶位点之间插入编码耐高温PET水解酶的基因的核苷酸序列(其中，ThcCut1、TfCut2-G62A、TfCut2-G62A/F209A和LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G使用pET22b(+)质粒表达，TfCut2使用pET20b(+)质粒表达，ThcCut2使用pET26b(+)质粒表达)，表达该相应的编码耐高温PET水解酶的基因，获得相应的PET水解酶的粗酶液。

实施例1：

向ThcCut1粗酶液(经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因ThcCut1，其序列如SEQ No.1所示，基因ThcCut1的序列为GENBANK：ADV92526.1，来源于Thermobifidacellulosilytica DSM44535)[图2(a)中的泳道1]中加入1ppm阴离子聚丙烯酰胺(分子量1200-1400万)，在60℃加热48小时，离心后保留上清液，获得纯化后的ThcCut1酶溶液[图2(f)中的泳道3]。

取等量ThcCut1粗酶液用于镍柱纯化[图2(a)中的泳道2]，超滤浓缩后稀释至加热纯化后酶液等同体积。将二者分别用于PET水解酶的酶活测定及蛋白浓度的测定，测得加热纯化后ThcCut1的比酶活为12.979U/mg，蛋白浓度为0.333mg/mL；镍柱纯化后ThcCut1的比酶活为12.798U/mg，蛋白浓度为0.285mg/mL。PET水解酶经镍柱纯化与加热纯化后的对比分析结果如表1所示，可以看出，二者纯化效果相当，且加热纯化后ThcCut1的相对酶活回收因子为1.185，大于1，证明对ThcCut1而言，加热纯化更优。

实施例2：

将TfCut2粗酶液(经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因TfCut2，其序列如SEQ No.2所示，基因TfCut2的序列为GENBANK：CBY05530.1，来源于Thermobifida fuscaKW3)[图2(a)中的泳道5]在60℃加热48小时，离心后保留上清液，获得纯化后的TfCut2酶溶液[图2(g)中的泳道1]。

取等量TfCut2粗酶液用于镍柱纯化[图2(a)中的泳道6]，超滤浓缩后稀释至加热纯化后酶液等同体积。将二者分别用于PET水解酶的酶活测定及蛋白浓度的测定，测得加热纯化后TfCut2的比酶活为13.066U/mg，蛋白浓度为0.272mg/mL；镍柱纯化后TfCut2的比酶活为12.655U/mg，蛋白浓度为0.254mg/mL。PET水解酶经镍柱纯化与加热纯化后的对比分析结果如表1所示，可以看出，二者纯化效果相当，且加热纯化后TfCut2的相对酶活回收因子为1.106，大于1，证明对TfCut2而言，加热纯化更优。

实施例3：

向TfCut2粗酶液(经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因TfCut2，其序列如SEQ No.2所示，基因TfCut2的序列为GENBANK：CBY05530.1，来源于Thermobifida fuscaKW3)[图2(a)中的泳道5]中加入10％甘油(w/v)，在60℃加热48小时，离心后保留上清液，获得纯化后的TfCut2酶溶液[图2(g)中的泳道2]。

取等量TfCut2粗酶液用于镍柱纯化[图2(a)中的泳道6]，超滤浓缩后稀释至加热纯化后酶液等同体积。将二者分别用于PET水解酶的酶活测定及蛋白浓度的测定，测得加热纯化后TfCut2的比酶活为12.491U/mg，蛋白浓度为0.320mg/mL；镍柱纯化后TfCut2的比酶活为12.655U/mg，蛋白浓度为0.254mg/mL。PET水解酶经镍柱纯化与加热纯化后的对比分析结果如表1所示，可以看出，二者纯化效果相当，且加热纯化后TfCut2的相对酶活回收因子为1.244，大于1，证明对TfCut2而言，加热纯化更优。

实施例4：

将TfCut2-G62A粗酶液(经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因TfCut2-G62A，其序列如SEQ No.3所示，基因TfCut2-G62A的序列为TfCut2的G62A突变体，DOI：10.1002/bit.25941)[图2(b)中的泳道1]在60℃加热48小时，离心后保留上清液，获得纯化后的TfCut2-G62A酶溶液[图2(g)中的泳道5]。

取等量TfCut2-G62A粗酶液用于镍柱纯化[图2(b)中的泳道2]，超滤浓缩后稀释至加热纯化后酶液等同体积。将二者分别用于PET水解酶的酶活测定及蛋白浓度的测定，测得加热纯化后TfCut2-G62A的比酶活为14.418U/mg，蛋白浓度为0.188mg/mL；镍柱纯化后TfCut2-G62A的比酶活为14.245U/mg，蛋白浓度为0.111mg/mL。PET水解酶经镍柱纯化与加热纯化后的对比分析结果如表1所示，可以看出，二者纯化效果相当，且加热纯化后TfCut2-G62A的相对酶活回收因子为1.714，大于1，证明对TfCut2-G62A而言，加热纯化明显更优。

实施例5：

向TfCut2-G62A粗酶液(经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因TfCut2-G62A，其序列如SEQ No.3所示，基因TfCut2-G62A的序列为TfCut2的G62A突变体，DOI：10.1002/bit.25941)[图2(b)中的泳道1]中加入1ppm阴离子聚丙烯酰胺(分子量1200-1400万)，在60℃加热48小时，离心后保留上清液，获得纯化后的TfCut2-G62A酶溶液[图2(g)中的泳道7]。

取等量TfCut2-G62A粗酶液用于镍柱纯化[图2(b)中的泳道2]，超滤浓缩后稀释至加热纯化后酶液等同体积。将二者分别用于PET水解酶的酶活测定及蛋白浓度的测定，测得加热纯化后TfCut2-G62A的比酶活为14.250U/mg，蛋白浓度为0.200mg/mL；镍柱纯化后TfCut2-G62A的比酶活为14.245U/mg，蛋白浓度为0.111mg/mL。PET水解酶经镍柱纯化与加热纯化后的对比分析结果如表1所示，可以看出，二者纯化效果相当，且加热纯化后TfCut2-G62A的相对酶活回收因子为1.802，大于1，证明对TfCut2-G62A而言，加热纯化明显更优。

实施例6：

将TfCut2-G62A/F209A粗酶液(经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因TfCut2-G62A/F209A，其序列如SEQ No.4所示，基因TfCut2-G62A/F209A的序列为TfCut2的G62A/F209A突变体，DOI：10.1038/s41598-019-52379-z)[图2(b)中的泳道3]在60℃加热48小时，离心后保留上清液，获得纯化后的TfCut2-G62A/F209A酶溶液[图2(h)中的泳道1]。

取等量TfCut2-G62A/F209A粗酶液用于镍柱纯化[图2(b)中的泳道4]，超滤浓缩后稀释至加热纯化后酶液等同体积。将二者分别用于PET水解酶的酶活测定及蛋白浓度的测定，测得加热纯化后TfCut2-G62A/F209A的比酶活为13.489U/mg，蛋白浓度为0.160mg/mL；镍柱纯化后TfCut2-G62A/F209A的比酶活为13.812U/mg，蛋白浓度为0.078mg/mL。PET水解酶经镍柱纯化与加热纯化后的对比分析结果如表1所示，可以看出，二者纯化效果相当，且加热纯化后TfCut2-G62A/F209A的相对酶活回收因子为2.003，大于1，证明对TfCut2-G62A/F209A而言，加热纯化明显更优。

实施例7：

向TfCut2-G62A/F209A粗酶液(经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因TfCut2-G62A/F209A，其序列如SEQ No.4所示，基因TfCut2-G62A/F209A的序列为TfCut2的G62A/F209A突变体，DOI：10.1038/s41598-019-52379-z)(图2(b)中的泳道3)中加入10％甘油(w/v)，在60℃加热48小时，离心后保留上清液，获得纯化后的TfCut2-G62A/F209A酶溶液[图2(h)中的泳道2]。

取等量TfCut2-G62A/F209A粗酶液用于镍柱纯化[图2(b)中的泳道4]，超滤浓缩后稀释至加热纯化后酶液等同体积。将二者分别用于PET水解酶的酶活测定及蛋白浓度的测定，测得加热纯化后TfCut2-G62A/F209A的比酶活为12.914U/mg，蛋白浓度为0.190mg/mL；镍柱纯化后TfCut2-G62A/F209A的比酶活为13.812U/mg，蛋白浓度为0.078mg/mL。PET水解酶经镍柱纯化与加热纯化后的对比分析结果如表1所示，可以看出，二者纯化效果相当，且加热纯化后TfCut2-G62A/F209A的相对酶活回收因子为2.278，大于1，证明对TfCut2-G62A/F209A而言，加热纯化明显更优。

实施例8：

将LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G粗酶液(经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G，其序列如SEQ No.5所示，基因LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G的序列为LCC(GENBANK：AEV21261.1)的F243I/D238C/S283C/Y127G突变体，DOI：10.1038/s41586-020-2149-4)[图2(b)中的泳道5]在60℃加热48小时，离心后保留上清液，获得纯化后的LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G酶溶液[图2(h)中的泳道5]。

取等量LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G粗酶液用于镍柱纯化[图2(b)中的泳道6]，超滤浓缩后稀释至加热纯化后酶液等同体积。将二者分别用于PET水解酶的酶活测定及蛋白浓度的测定，测得加热纯化后LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G的比酶活为14.818U/mg，蛋白浓度为0.185mg/mL；镍柱纯化后LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G的比酶活为14.314U/mg，蛋白浓度为0.084mg/mL。PET水解酶经镍柱纯化与加热纯化后的对比分析结果如表1所示，可以看出，二者纯化效果相当，且加热纯化后LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G的相对酶活回收因子为2.280，大于1，证明对LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G而言，加热纯化明显更优。

实施例9：

向LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G粗酶液(经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G，其序列如SEQ No.5所示，基因LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G的序列为LCC(GENBANK：AEV21261.1)的F243I/D238C/S283C/Y127G突变体，DOI：10.1038/s41586-020-2149-4)(图2(b)中的泳道5)中加入1ppm阴离子聚丙烯酰胺(分子量1200-1400万)，在60℃加热48小时，离心后保留上清液，获得纯化后的LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G酶溶液[图2(h)中的泳道7]。

取等量LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G粗酶液用于镍柱纯化[图2(b)中的泳道6]，超滤浓缩后稀释至加热纯化后酶液等同体积。将二者分别用于PET水解酶的酶活测定及蛋白浓度的测定，测得加热纯化后LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G的比酶活为14.416U/mg，蛋白浓度为0.220mg/mL；镍柱纯化后LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G的比酶活为14.314U/mg，蛋白浓度为0.084mg/mL。PET水解酶经镍柱纯化与加热纯化后的对比分析结果如表1所示，可以看出，二者纯化效果相当，且加热纯化后LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G的相对酶活回收因子为2.638，大于1，证明对LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G而言，加热纯化明显更优。

实施例10：

向ThcCut2粗酶液(经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因ThcCut2，其序列如SEQ No.6所示，其原始GENBANK：ADV92527.1，来源于Thermobifida cellulosilyticaDSM44535)[图2(a)中的泳道3]中加入10％甘油(w/v)，在60℃加热48小时，离心后保留上清液，获得纯化后的ThcCut2酶溶液[图2(f)中的泳道6]。

取等量ThcCut2粗酶液用于镍柱纯化[图2(a)中的泳道4]，超滤浓缩后稀释至加热纯化后酶液等同体积。将二者分别用于PET水解酶的酶活测定及蛋白浓度的测定，测得加热纯化后ThcCut2的比酶活为6.552U/mg，蛋白浓度为0.381mg/mL；镍柱纯化后ThcCut2的比酶活为8.389U/mg，蛋白浓度为0.353mg/mL。PET水解酶经镍柱纯化与加热纯化后的对比分析结果如表1所示，可以看出，加热纯化后ThcCut2的比酶活远低于镍柱纯化后比酶活，且相对酶活回收因子为0.843，小于1，证明该纯化方法不适用于ThcCut2。

表1 PET水解酶经镍柱纯化与加热纯化后的对比分析结果

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 一种耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的纯化方法

<130> RB2102821-FF

<160> 6

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 783

<212> DNA

<213> （经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因ThcCut1）

<400> 1

gcgaatccgt atgaacgcgg cccgaatccg accgatgcgc tgttagaagc gagcagcggt 60

ccatttagcg tgagcgaaga aaatgtgagc cgcctgagcg cgagcggctt tggtggtggt 120

accatttatt atccgcgcga aaataatacc tacggcgcgg tggcgattag cccgggttat 180

accggtaccg aagcgagcat tgcgtggctg ggtgaacgca ttgcgagcca tggttttgtg 240

gtgattacca ttgataccat taccaccctg gatcagccgg atagccgcgc ggaacaatta 300

aatgcggcgt taaatcacat gattaaccgc gcgagcagca ccgtgcgcag tagaattgat 360

agcagccgtc tggcggttat gggccatagc atgggcggtg gtggtacctt acgtttggcg 420

agccaacgcc cagatttaaa agcggcgatt ccgttgaccc catggcatct gaataaaaat 480

tggagcagcg tgaccgtgcc gaccctgatt attggcgcgg atctggatac cattgcgccg 540

gtggcgactc atgcgaaacc attttataat agcctgccga gcagcattag caaagcgtat 600

ctggaactgg atggcgcgac ccattttgcg ccgaatattc cgaataaaat tatcggcaaa 660

tacagcgtgg cgtggctgaa acgctttgtg gataatgata cccgctatac ccagtttctg 720

tgcccgggcc cacgtgatgg cttatttggt gaagttgaag aatatcgcag cacctgcccg 780

ttt 783

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> （经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因TfCut2）

<400> 2

gcgaaccctt atgaacgtgg cccgaaccct accgatgcgt tattagaagc gcgcagcggc 60

ccttttagcg tgagcgaaga aaacgtgagc cgtttaagcg cgtcaggctt tggtggtggc 120

accatttatt atccgcgcga gaacaacact tatggcgcgg ttgcgatttc accgggttat 180

accggtaccg aagcgagcat tgcgtggtta ggcgaacgca ttgcgagcca tggctttgtg 240

gtgattacca tcgataccat taccaccctg gatcagcctg atagccgtgc ggaacaatta 300

aacgcggcgc tgaaccacat gattaaccgc gcgagcagca ctgttcgtag ccgcattgat 360

tcaagccgcc tggcggttat gggtcatagc atgggtggtg gtggcagctt acgcttagcg 420

agccaacgtc ctgatctgaa agcggcgatt ccgttaaccc cgtggcatct gaacaaaaac 480

tggagcagcg tgaccgttcc gaccctgatt attggcgcgg atctggatac cattgcgcct 540

gttgcgaccc atgcgaaacc gttttataac agcctgccga gcagcattag caaagcgtat 600

ctggaactgg atggcgcgac ccattttgca ccgaacatcc cgaacaaaat tatcggcaaa 660

tatagcgtgg cgtggctgaa acgctttgtg gataacgata cccgctatac ccagttttta 720

tgcccgggcc ctcgtgatgg tctgtttggc gaagtggaag aatatcgcag cacctgcccg 780

ttt 783

<210> 3

<211> 783

<212> DNA

<213> （经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因TfCut2-G62A）

<400> 3

gcgaatccgt atgaacgcgg tccgaatccg accgatgcgc tgttggaagc gagaagcggt 60

ccatttagcg ttagcgaaga aaatgtgagc cgcctgagcg cgagcggctt tggtggtgga 120

accatttatt atccgcgcga aaataatacc tacggcgcgg tggcgattag cccgggttat 180

accgcgaccg aagcgagcat tgcgtggctg ggtgaacgca ttgcgagcca tggttttgtg 240

gtgattacca ttgataccat taccaccctg gatcagccgg atagccgcgc ggaacaattg 300

aatgcggcgt tgaatcacat gattaaccgc gcgagcagca ccgtgcgcag tcgtattgat 360

agcagccgct tagcggttat gggtcatagc atgggcggcg gtggtagctt acgtttggcg 420

agccaacgtc cagatttaaa agcggcgatt ccgttaaccc cgtggcatct gaataaaaat 480

tggagcagcg tgaccgtgcc gaccctgatt attggcgcgg atctggatac cattgcgccg 540

gtggcgaccc atgcgaaacc attttataat agcctgccga gcagcattag caaagcgtat 600

ctggaactgg atggcgcgac ccattttgcg ccgaatattc cgaataaaat tatcggcaaa 660

tacagcgtgg cgtggctgaa acgctttgtg gataatgata cccgctatac ccagtttctg 720

tgcccgggcc cacgtgatgg tttgtttggt gaagttgaag aatatcgcag cacctgcccg 780

ttt 783

<210> 4

<211> 783

<212> DNA

<213> （经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因TfCut2-G62A/F209A）

<400> 4

gcgaatccgt atgaacgcgg tccgaatccg accgatgcgc tgttggaagc gagaagcggt 60

ccatttagcg ttagcgaaga aaatgtgagc cgcctgagcg cgagcggctt tggtggtgga 120

accatttatt atccgcgcga aaataatacc tacggcgcgg tggcgattag cccgggttat 180

accgcgaccg aagcgagcat tgcgtggctg ggtgaacgca ttgcgagcca tggttttgtg 240

gtgattacca ttgataccat taccaccctg gatcagccgg atagccgcgc ggaacaattg 300

aatgcggcgt tgaatcacat gattaaccgc gcgagcagca ccgtgcgcag tcgtattgat 360

agcagccgct tagcggttat gggtcatagc atgggcggcg gtggtagctt acgtttggcg 420

agccaacgtc cagatttaaa agcggcgatt ccgttaaccc cgtggcatct gaataaaaat 480

tggagcagcg tgaccgtgcc gaccctgatt attggcgcgg atctggatac cattgcgccg 540

gtggcgaccc atgcgaaacc attttataat agcctgccga gcagcattag caaagcgtat 600

ctggaactgg atggcgcgac ccatgcggcg ccgaatattc cgaataaaat tatcggcaaa 660

tacagcgtgg cgtggctgaa acgctttgtg gataatgata cccgctatac ccagtttctg 720

tgcccgggcc cacgtgatgg tttgtttggt gaagttgaag aatatcgcag cacctgcccg 780

ttt 783

<210> 5

<211> 774

<212> DNA

<213> （经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因LCC-F243I/D238C/S283C/Y127G）

<400> 5

agcaatccgt atcagcgcgg cccaaatccg acccgcagtg cgttgaccgc ggatggtcca 60

tttagcgttg cgacctatac cgtgagccgc ctgagcgtta gcggttttgg tggtggtgtt 120

atttattatc cgaccggcac cagcctgacc tttggcggta ttgcgatgag cccgggttat 180

accgcggatg cgagcagctt agcgtggtta ggtcgccgct tagcgagcca tggttttgtg 240

gttttggtga ttaataccaa cagccgcttt gacggcccgg atagccgcgc gagccaactg 300

agcgcggcgt tgaattatct gcgcaccagc agtccaagcg cggttcgtgc acgtttagat 360

gcgaatcgtc tggcggttgc gggccatagt atgggcggtg gtggtaccct gcgtattgcg 420

gaacaaaatc cgagcctgaa agcggcggtg ccgttaaccc catggcatac cgataaaacc 480

tttaatacca gcgtgccggt gctgattgtg ggcgcggaag cggataccgt tgcgccagtt 540

agccaacatg cgattccatt ttatcagaat ctgccgagca ccaccccgaa agtgtatgtg 600

gaactgtgca atgcgagcca tattgcgccg aatagcaata atgcggcgat tagcgtgtat 660

accattagct ggatgaaact gtgggtggat aatgataccc gctatcgcca gtttctgtgc 720

aatgtgaatg atccggcgct gtgcgatttt cgcaccaata atcgccattg ccag 774

<210> 6

<211> 783

<212> DNA

<213> （经密码子优化的编码耐高温PET水解酶的基因ThcCut2）

<400> 6

gcgaacccgt atgaacgtgg tccgaaccct accgatgcgc tgttagaagc gcgtagcggt 60

ccttttagcg tgagcgaaga acgcgcgagc cgttttggtg cggatggttt tggtggcggc 120

accatttatt atccgcgcga gaacaacact tatggcgcgg ttgcgatttc accgggttat 180

accggtaccc aagcgtcagt tgcgtggctg ggtgaacgta ttgcgagcca tggctttgtg 240

gtgattacca ttgataccaa caccaccctg gatcagcctg atagccgtgc gcgtcaatta 300

aatgcggcgc tggactatat gattaacgat gcgagcagcg cagttcgtag ccgcattgat 360

tcaagccgcc tggcggttat gggtcatagc atgggtggtg gcggcacctt acgtttagcg 420

agccagcgcc ctgatctgaa agcggcgatt ccgttaactc cgtggcatct gaacaaaaac 480

tggagcagcg ttcgtgttcc gaccctgatt attggcgcgg atctggatac tattgcgccg 540

gtgttaaccc atgcgcgccc gttttataat agcctgccga ccagcattag caaagcgtat 600

ctggaactgg atggcgcgac tcattttgcg ccgaacattc cgaacaagat catcggcaaa 660

tatagcgtgg cgtggctgaa acgctttgtg gataacgata cccgctatac ccagtttctg 720

tgccctggtc cgcgcgatgg tttatttggc gaggtggaag aatatcgcag cacctgcccg 780

ttt 783

Claims

1.一种耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的纯化方法，其包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述加热处理的温度为55-80℃。

3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于：所述加热处理的时间为0.5-48h。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的纯化方法，其特征在于，在步骤C中，所述离心处理的转速为3000～15000rpm，所述离心处理的时间为0～30min。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的纯化方法，其特征在于，所述耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶为角质酶或经基因工程改造后角质酶；编码所述角质酶的基因来源于宏基因组文库或合成角质酶的微生物。

6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述合成角质酶的微生物包括白色高温双歧菌、解纤维素喜热裂胞菌、褐色喜热裂胞菌、耐盐高温双歧菌、弯曲高温单孢菌、枯草芽孢杆菌、腐皮镰刀菌、特异腐质霉、假单胞菌、米曲霉、绿色糖单胞菌和产气弧菌中的一种或几种。

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶为通过大肠杆菌或其他非嗜热基因工程菌对编码所述角质酶的基因进行异源表达获得。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的纯化方法，其特征在于：所述耐高温聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的粗酶液中还任选地加入了添加剂。

9.根据权利要求8所述的纯化方法，其特征在于：所述添加剂为酶保护剂和/或絮凝剂；优选地，所述絮凝剂为聚丙烯酰胺；和/或，所述酶保护剂包括多元醇、糖类、嘧啶类、氨基酸及其衍生物、甜菜碱和3-羟基丁酸中的一种或几种。

10.根据权利要求9所述的纯化方法，其特征在于：所述酶保护剂的添加量为粗酶液质量的0％～20％；和/或，所述酶絮凝剂的用量为0～100ppm。