CN111655694B - 吡唑并[1,5-a]嘧啶化合物的盐及其晶体 - Google Patents

吡唑并[1,5-a]嘧啶化合物的盐及其晶体 Download PDF

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Abstract

由式(I)表示的化合物的盐及其晶体具有可用作药物产品的药物物质的潜力。

Description

吡唑并[1,5-a]嘧啶化合物的盐及其晶体
技术领域
本发明涉及具有PAR2抑制作用的吡唑并[1,5-a]嘧啶化合物的盐及其晶体。
背景技术
蛋白酶激活受体(PAR)是三聚体G蛋白偶联的七跨膜受体的类型，并且属于介导丝氨酸蛋白酶细胞作用的受体家族，并且迄今为止已经克隆了四种分子：PAR1、PAR2、PAR3和PAR4。
丝氨酸蛋白酶在特定位点切割PAR分子的细胞外氨基末端肽链，并因此暴露由5个或6个氨基酸残基组成的具有受体激活序列的新的氨基末端肽链。由丝氨酸蛋白酶切割的新暴露的氨基末端肽链作为链状配体键合到细胞外环2，所述细胞外环2是PAR2本身的活性位点，并因此激活PAR2。已知PAR2被胰蛋白酶、类胰蛋白酶、激肽释放酶(主要是激肽释放酶2、4、5、6和14)、凝血因子VIIa、凝血因子Xa等激活，并且当基于受体激活序列合成的由5个或6个氨基酸组成的合成肽外源进入时也被激活(参见非专利文献1至3)。
本文中的PAR2广泛地分布在体内(例如血管、前列腺、小肠、大肠、肝、肾、胰、胃、肺、脑和皮肤)中，并且已知在各种疾病(例如神经性炎症、疼痛、发痒、炎症和过敏)中是恶化因子(参见专利文献1和2、以及非专利文献4至6)。由于这个原因，PAR2抑制剂被期望为用于这些疾病的可能的治疗药物并且被建议为，例如，用于炎性肠病的治疗药物、用于皮炎的治疗药物、用于变应性疾病的治疗药物、或用于皮肤色素形成的预防药物(参见专利文献3至5以及非专利文献3和6至11)。
引用列表
专利文献
[专利文献1]JP-A-2003-286171
[专利文献2]JP-A-2004-170323
[专利文献3]WO 2012/101453
[专利文献4]WO 2015/048245
[专利文献5]WO 2005/030773
非专利文献
[非专利文献1]Dery,O.等人Am.J.Physiol[美国生理学杂志](Cell Physiol.[细胞生理学]).274,C1429-1452,1998
[非专利文献2]Macfarlane,S.R.等人Pharmacol.Rev.[药学评论]53,245-282,2001
[非专利文献3]Yau,M.K.等人Journal of Medicinal Chemistry[药物化学杂志],56,7477-7497,2013
[非专利文献4]Bohm,S.K.等人Biochem.J.[生物化学杂志]15；314,1009-1016,1996
[非专利文献5]D'Andrea,M.R.等人J.Histochem.Cytochem.[组织化学细胞化学杂志]46(2):157-164,1998
[非专利文献6]Rothmeier,A.S.,Ruf,W.Semin.Immunopathol.[免疫病理学研讨会]34(1):133-149,2012
[非专利文献7]Yamaguchi,Y.,Hearing,V.J.Biofactors.[生物因子]35(2):193-199,2009
[非专利文献8]Afkhami-Goli,A.等人The Journal of Immunology.[免疫学杂志]179:5493-5503,2007
[非专利文献9]Dale,C.等人Journal of Receptors and Signal Transduction.[受体和信号转导杂志]28:29-37,2008
[非专利文献10]Hachem,J.P.等人Journal of Investigative Dermatology.[研究型皮肤病学杂志]126:2074-2086,2006
[非专利文献11]Seyfarth,F.等人Clinics in Dermatology.[皮肤病学临床]29:31-36,2011
发明内容
技术问题
由下式(I)表示的化合物(2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸，在下文中也被称为“化合物(I)”)具有PAR2抑制作用，并且具有可用作炎性皮肤病治疗剂或炎性肠病治疗剂的潜力。
Figure GDA0002686189970000031
通常，可用作药物产品的化合物、其盐或所述盐的晶体的特性对药物的生物利用度、药物物质的纯度、制剂的配制等产生显著影响。
问题的解决方案
考虑到以上情况，本发明的诸位发明人对化合物(I)认真进行了研究，并且因此发现了化合物(I)的盐或其晶体，从而完成了本发明。
更具体地，本发明涉及以下[1]至[14]。
[1]一种由式(I)表示的2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐。
Figure GDA0002686189970000041
[2]一种由式(I)表示的2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐的晶体。
Figure GDA0002686189970000042
[3]根据[2]所述的晶体，2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐的晶体在粉末X射线衍射法中在衍射角(2θ±0.2°)为8.3°处具有衍射峰。
[4]根据[2]所述的晶体，2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐的晶体在粉末X射线衍射法中在衍射角(2θ±0.2°)为8.3°和13.1°处具有衍射峰。
[5]根据[2]所述的晶体，2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐的晶体在粉末X射线衍射法中在衍射角(2θ±0.2°)为8.3°、13.1°和15.7°处具有衍射峰。
[6]根据[2]所述的晶体，2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐的晶体在粉末X射线衍射法中在衍射角(2θ±0.2°)为8.3°、11.4°、13.1°、15.7°和17.3°处具有衍射峰。
[7]根据[2]所述的晶体，2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐的晶体在粉末X射线衍射法中在衍射角(2θ±0.2°)为8.3°、11.4°、13.1°、15.2°、15.7°、17.3°、18.8°、19.7°、22.3°和25.0°处具有衍射峰。
[8]根据[2]所述的晶体，2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐的晶体具有与图1示出的粉末X射线衍射图基本相同的粉末X射线衍射图。
[9]根据[2]所述的晶体，2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐的晶体在固态13C NMR谱中在化学位移(δ±0.5ppm)为58.4ppm、77.4ppm和173.5ppm处具有峰。
[10]根据[2]所述的晶体，2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐的晶体在固态13C NMR谱中在化学位移(δ±0.5ppm)为18.5ppm、58.4ppm、77.4ppm、94.4ppm和173.5ppm处具有峰。
[11]根据[2]所述的晶体，2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐的晶体在固态13C NMR谱中在化学位移(δ±0.5ppm)为18.5ppm、19.9ppm、56.6ppm、58.4ppm、76.2ppm、77.4ppm、94.4ppm、95.9ppm、129.3ppm和173.5ppm处具有峰。
[12]根据[2]所述的晶体，2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐的晶体具有与图2示出的固态13C NMR谱基本相同的固态13C NMR谱。
[13]一种药物组合物，所述药物组合物包含根据[1]所述的盐作为活性成分。
[14]一种药物组合物，所述药物组合物包含根据[2]至[12]中任一项所述的晶体作为活性成分。
发明的有利效果
本发明提供的化合物(I)的盐及其晶体具有用作药物产品的药物物质的潜力。
附图说明
[图1]图1是实例1中获得的化合物(I)的盐酸盐的晶体的粉末X射线衍射图。横坐标示出了衍射角(2θ)，并且纵坐标示出了峰强度。
[图2]图2是在实例1中获得的化合物(I)的盐酸盐的晶体的固态13C NMR谱。横坐标示出了化学位移(δ)，并且纵坐标示出了峰强度。
[图3]图3是参考实例4中获得的化合物(I)的晶体的粉末X射线衍射图。横坐标示出了衍射角(2θ)，并且纵坐标示出了峰强度。
[图4]图4是在参考实例4中获得的化合物(I)的晶体的固态13C NMR谱。横坐标示出了化学位移(δ)，并且纵坐标示出了峰强度。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明的化合物(I)的盐及其晶体以及所述盐和晶体的生产方法。
本说明书中的“盐”意指由化合物(I)和与化合物(I)相当的特定数目的酸或碱组成的化学物质。
所述盐只要是药学上可接受的就无特别限制，但是具体的实例包括无机酸盐(例如，盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐)、有机酸盐(例如，乙酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、硬脂酸盐、苯甲酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、对甲苯磺酸盐和苯磺酸盐)、酸性氨基酸盐(例如，天冬氨酸盐和谷氨酸盐)、无机碱性盐(例如，碱金属盐例如钠盐和钾盐、碱土金属盐例如钙盐和镁盐、铝盐和铵盐)、有机碱性盐(例如二乙胺盐、二乙醇胺盐、葡甲胺盐和N,N'-二苄基乙二胺盐)、以及碱性氨基酸盐(例如，精氨酸盐、赖氨酸盐和鸟氨酸盐)。
本发明的盐可以是溶剂化物。本说明书中的化合物(I)的盐的溶剂化物是指由化合物(I)的盐、所述盐的晶体和溶剂分子一起形成的固体。溶剂化物的溶剂的实例包括酮溶剂，例如丙酮、2-丁酮以及环己酮；酯溶剂，例如乙酸甲酯以及乙酸乙酯；醚溶剂，例如1,2-二甲氧基乙烷以及叔丁基甲醚；醇溶剂，例如甲醇、乙醇、1-丙醇、和异丙醇；极性溶剂，例如N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺以及二甲亚砜；以及水。
本说明书中的“晶体”是指化合物(I)或其盐的晶体。因此，例如，化合物(I)的盐酸盐的晶体是由化合物(I)和盐酸形成的盐的晶体，并且意指含有一分子的盐酸比一分子的化合物(I)的盐的晶体。
在本说明书中，化合物(I)的盐的优选的晶体的实例包括
化合物(I)的盐酸盐的晶体，其在粉末X射线衍射法中在衍射角(2θ±0.2°)为8.3°处具有衍射峰；
化合物(I)的盐酸盐的晶体，其在粉末X射线衍射法中在衍射角(2θ±0.2°)为8.3°和13.1°处具有衍射峰；
化合物(I)的盐酸盐的晶体，其在粉末X射线衍射法中在衍射角(2θ±0.2°)为8.3°、13.1°和15.7°处具有衍射峰；
化合物(I)的盐酸盐的晶体，其在粉末X射线衍射法中在衍射角(2θ±0.2°)为8.3°、11.4°、13.1°、15.7°和17.3°处具有衍射峰；
化合物(I)的盐酸盐的晶体，其在粉末X射线衍射法中在衍射角(2θ±0.2°)为8.3°、11.4°、13.1°、15.2°、15.7°、17.3°、18.8°、19.7°、22.3°和25.0°处具有衍射峰；
化合物(I)的盐酸盐的晶体，其在固态13C NMR谱中在化学位移(δ±0.5ppm)为58.4ppm、77.4ppm和173.5ppm处具有峰；
化合物(I)的盐酸盐的晶体，其在固态13C NMR谱中在化学位移(δ±0.5ppm)为18.5ppm、58.4ppm、77.4ppm、94.4ppm和173.5ppm处具有峰；以及
化合物(I)的盐酸盐的晶体，其在固态13C NMR谱中在化学位移(δ±0.5ppm)为18.5ppm、19.9ppm、56.6ppm、58.4ppm、76.2ppm、77.4ppm、94.4ppm、95.9ppm、129.3ppm和173.5ppm处具有峰。
粉末X射线衍射法中的衍射峰和上述固态13C NMR谱中的化学位移各自对化合物(I)的盐酸盐的晶体来说是不同的并且所述峰是此类晶体的特征峰。
通常，由于在粉末X射线衍射法中的衍射角(2θ)可以导致±0.2°的范围内的误差，因此上述衍射角的值需理解为包括在约±0.2°的范围内的数值。因此，在特定的化合物中，不仅粉末X射线衍射法中峰的衍射角完全匹配的晶体，而且峰的衍射角匹配误差为约±0.2°的晶体也相同，并且包括在本发明中。
例如，本说明书中的“在衍射角(2θ±0.2°)为8.3°处具有衍射峰”是指“在衍射角(2θ)为8.1°至8.5°处具有衍射峰”，并且其他衍射角的情况也一样。
另外，通常，即使晶体形式相同，但取决于测量条件的差异以及用作测量样品的粉末晶体的每个颗粒的尺寸和形状的不一致性，粉末X射线衍射法中的衍射角(2θ)的峰强度或半值宽度在每次测量时都不同，并且不一定总是显示恒定的峰强度或半值宽度。由于这个原因，在粉末X射线衍射图的比较中，即使在相同衍射角(2θ)处峰强度或半值宽度存在差异时，此类差异也不意指所测量的晶体形式彼此不同。因此，显示与本发明的特定晶体的特征衍射峰具有此类差异的粉末X射线衍射图的化合物的晶体意指与本发明化合物的晶体相同的晶体形式。另外，在本说明书中“具有与图1中示出的粉末X射线衍射图基本相同的粉末X射线衍射图”意指不仅具有某种特征衍射峰的粉末X射线衍射图与图1中示出的粉末X射线衍射图完全对应的情况，而且峰强度或半值宽度不同或者特征衍射峰的衍射角在±0.2°的误差范围内对应的情况也是与图1中示出的粉末X射线衍射图相同的粉末X射线衍射图。因此，具有这种粉末X射线衍射图的所有晶体都意指与本发明的晶体相同的晶体。
在本说明书中，当在典型测量条件下或在本说明书中描述的条件下进行固态13CNMR谱测量时，“化学位移(δ±0.5ppm)为18.5ppm、19.9ppm、56.6ppm、58.4ppm、76.2ppm、77.4ppm、94.4ppm、95.9ppm、129.3ppm和173.5ppm”意指“分别在化学位移(δ±0.5ppm)为18.5ppm、19.9ppm、56.6ppm、58.4ppm、76.2ppm、77.4ppm、94.4ppm、95.9ppm、129.3ppm和173.5ppm处具有基本相等的峰”。
当确定是否“具有基本相等的峰”时，通常，由于固态13C NMR谱中的化学位移δ可以引起在±0.5ppm范围内的误差，因此以上化学位移的值需理解为包括在约±0.5ppm范围内的数值。因此，本发明中不仅包括在固态13C NMR谱中化学位移完全对应的晶体，而且还包括化学位移以约±0.5ppm的误差对应的晶体。由于这个原因，例如，在本说明书中，“在化学位移(δ±0.5ppm)为173.5ppm处具有峰”意指在范围为从173.0ppm至174.0ppm的化学位移(δ)处具有峰，并且固态13C NMR谱中其他化学位移的情况也是一样。另外，“具有与图2中示出的固态13C NMR谱基本相同的固态13C NMR谱的晶体”意指不仅在某个化学位移处具有峰的固态13C NMR谱与图2中示出的固态13C NMR谱完全对应的情况，而且峰强度不同或特征峰在约化学位移±0.5ppm的范围内对应的情况也是具有与图2中示出的固态13C NMR谱相同的固态13C NMR谱的晶体。因此，具有这种固态13C NMR谱的所有晶体都意指与本发明的晶体相同的晶体。
下文中将描述化合物(I)的盐、其晶体等的生产方法，本发明的实施例。
化合物(I)的生产方法
化合物(I)可以是通过本领域技术人员熟知的方法生产的那些化合物。例如，化合物(I)可以通过稍后将描述的参考实例2中描述的方法合成。
化合物(I)的盐的生产方法
化合物(I)的盐可以通过用于生产盐的典型方法获得。具体地，例如，将化合物(I)悬浮于或溶于溶剂中(根据需要升温)，然后向待获得的悬浮液或溶液中添加选自下组的酸或碱，所述组由以下组成：无机酸盐、有机酸盐、酸性氨基酸盐、无机碱性盐、有机碱性盐、和碱性氨基酸盐，并且在室温或在冰浴中冷却的同时搅拌若干分钟至若干天，或在室温或在冰浴中冷却的同时静置若干分钟至若干天以产生化合物(I)的盐。使用这些生产方法，可以获得化合物(I)的盐，其为结晶或无定形的。本文使用的溶剂的实例包括：醇溶剂，例如乙醇、1-丙醇以及异丙醇；乙腈；酮溶剂，例如丙酮以及2-丁酮；酯溶剂，例如乙酸乙酯；饱和烃溶剂，例如己烷以及庚烷；醚溶剂，例如甲基叔丁基醚；或水。这些溶剂可以单独使用，或者可以两种或更多种混合并且使用。
在化合物(I)以上述化合物(I)的制备方法合成后，通过采用上述方法，也可以连续生产化合物(I)的盐。
化合物(I)或其盐的晶体的生产方法
在下文中将描述化合物(I)或其盐的晶体的生产方法。化合物(I)或其盐的晶体也可以通过将化合物(I)或其盐溶解在溶剂中并伴随在搅拌下加热和冷却以进行结晶来生产。
用于结晶的化合物(I)或其盐可以呈任何形式，可以是溶剂化物、水合物或酸酐，可以是无定形的或结晶的(包括由多个晶体多晶型物组成的那些)，并且可以是其混合物。
用于结晶的溶剂的实例包括：醇溶剂，例如甲醇、乙醇、2-丙醇、1-丁醇以及1-丁醇；乙腈；酰胺溶剂，例如N,N-二甲基甲酰胺；酯溶剂，例如乙酸乙酯；饱和烃溶剂，例如己烷以及庚烷；酮溶剂，例如丙酮以及2-丁酮；醚溶剂，例如甲基叔丁基醚；或水。另外，这些溶剂可以单独使用，或者可以两种或更多种混合并且使用。
使用的溶剂的量可以适当选择，下限为通过加热使化合物(I)或其盐溶解的量或者悬浮液变得可以搅拌的量，以及上限为晶体的产率不显著降低的量。
在结晶中，可以添加所希望的化合物(I)或其盐的晶体作为晶种。添加晶种的溶液的温度不受具体限制，且优选地是0至80℃。
当加热并溶解化合物(I)或其盐时的温度可以是根据化合物(I)或其盐溶解的溶剂适当选择的温度，并且优选范围为从50℃至溶剂开始回流的温度，更优选为55℃-80℃。
考虑到对晶体的质量、晶粒尺寸等的影响，优选通过适当地调节冷却速率来进行结晶期间的冷却，因为快速冷却会得到包含不同状态的晶体(多晶型物)的那些产物。优选的冷却速率是，例如5℃至40℃/小时。
另外，根据晶体的产率、品质等，可以适当选择最终的结晶温度，且优选是-25℃至30℃。
通过典型的过滤操作可以分离结晶的晶体，以获得目的晶体。根据需要，通过过滤分离的晶体可以用溶剂洗涤并可以进一步干燥。用于洗涤晶体的溶剂可与结晶用溶剂相同。优选地，实例包括乙醇、丙酮、2-丁烷、乙酸乙酯、二乙醚、甲基叔丁基醚和己烷。另外，这些溶剂可以单独使用，或者可以两种或更多种混合并且使用。
可以将通过过滤操作分离的晶体适当地置于气氛或氮气流中，或者加热以进行干燥。
干燥时间，即直到残留溶剂小于预定量的时间，可以根据生产量、干燥装置、干燥温度等适当选择。另外，还可以在通风下或在减压下进行干燥。减压度可以根据生产量、干燥装置、干燥温度等适当选择。在干燥之后，根据需要也可以将所得到的晶体留在气氛中。
通过上述生产方法获得的化合物(I)的盐或其晶体具有PAR2抑制作用(如稍后待描述的药理学测试实例中的活性数据所示)，并且例如具有用作药物产品的药物物质的潜力，例如炎性皮肤病治疗剂或炎性肠病治疗剂。
[药物组合物]
本发明的另一个实施例是含有化合物(I)的盐或其晶体和药学上可接受的添加剂的药物组合物。药物组合物可以通过将药学上可接受的添加剂与化合物(I)的盐或其晶体混合来生产。根据本发明的药物组合物可以根据例如The Japanese PharmacopoeiaSixteenth Edition[日本药典第十六版]中的General Rules for Preparations[制剂通则]中描述的已知方法来生产。
根据本实施例的药物组合物可以根据其剂型适当地施用至患者。
根据本发明的化合物(I)的盐或其晶体的剂量取决于症状级别、年龄、性别、体重、施用形式/盐的种类、以及疾病的特定类型而变化，但是典型地以一天约30μg至10g、优选地100μg至5g、进一步优选地100μg至1g通过口服施用至成年人，或者以约30μg至1g、优选地100μg至500mg、进一步优选地100μg至300mg(分别地以一次或以若干次分开的剂量)通过注射施用至成年人。
实例
在下文中，本发明将参考参考实例和实例进行详细描述，但本发明不限于这些参考实例和实例。
在以下参考实例和实例中生产的晶体的粉末X射线晶体衍射法中，将获得的晶体置于粉末X射线衍射仪的样品桌上并在以下条件下分析。
(测量条件)
样品架：铝架
靶标：铜
检测器：闪烁计数器
管电压：50kV
管电流：300mA
狭缝：发散狭缝0.5mm，散射狭缝开放，接收狭缝开放
扫描速度：5°/min或10°/min
加样间隔：0.02°
扫描范围：5°至35°
在以下条件下测量晶体的固态13C NMR谱。
(测量条件)
使用的装置：Avance 400MHz(由布鲁克公司(BRUKER)制造)7mm-CPMAS探头(由布鲁克公司制造)
测量核：13C(100.6130636MHz)
测量温度：室温(25℃)
脉冲模式：CPTOSS测量(旋转边带抑制法)
转速：5000Hz
脉冲重复时间：3sec
接触时间：1msec
累计次数：3072次
参考物质：甘氨酸(外部参考：176.03ppm)
具有文献名称等的化合物表明它们是根据文献等生产的。
另外，本说明书中使用的缩写是本领域技术人员熟知的常用缩写。在本说明书中，使用以下缩写。
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DMSO：二甲基亚砜
DMSO-d6：氘化的二甲基亚砜
HATU：O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HOBT：1-羟基苯并三唑
NMP：1-甲基-2-吡咯烷酮
Pd2DBA3：三(二苯亚甲基丙酮)二钯
t-：叔
THF：四氢呋喃
WSC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸酯
1H-NMR：质子核磁共振光谱法
质子核磁共振谱中的化学位移以相对于四甲基硅烷的δ单位(ppm)记录，并且偶联常数以赫兹(Hz)记录。分裂模式如下。
s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；br，宽峰；m，多重峰；dd，双二重峰；td，三二重峰。
使用Varian MERCURY plus模型核磁共振装置(400MHz)、Varian INOVA UNITY模型核磁共振装置(400MHz)、Varian INOVA UNITY模型核磁共振装置(500MHz)或BrukerAvance模型核磁共振装置(600MHz)测量1H-NMR。
使用JASCO DIP-1000模型旋光计测量旋光度。
对于色谱法，所使用的硅胶是默克公司(Merck)的硅胶60(70-230目ASTM)、富士硅化学有限公司(Fuji Silysia Chemical Ltd.)的PSQ60B、关东化学公司(Kanto Kagaku)的硅胶60(球形的，40-50μM)或YMC YMC*GEL ODS-A(12nM S-50μM)，或者使用预填充柱{柱：YAMAZEN Hi-FlashTM柱(硅胶)，大小；S(16×60mm)、M(20×75mm)、L(26×100mm)、2L(26×150mm)或3L(46×130mm)}。
所使用的NH硅胶是富士硅化学有限公司(Fuji Silysia Chemical Ltd.)的CHROMATOREX NH-DM2035或预填充柱{柱：YAMAZEN Hi-FlashTM柱(Amino)，大小；S(16×60mm)、M(20×75mm)、L(26x×100mm)、2L(26×150mm)或3L(46×130mm)或和光纯化学工业有限公司(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)PresepTM(Luer Lock)NH2(HC)，大小；M型(14g/25mL)、L型(34g/70mL)、2L型(50g/100mL)、3L型(110g/200mL)}。
以下实例和参考实例中的“室温”典型地表示约10℃至约35℃。除非另外说明，“％”表示重量百分比。
以下实例和参考实例中的化合物的化学名称是使用“E-手册”(E-Notebook)第12版(铂金埃尔默有限公司(PerkinElmer Co.,Ltd.))，基于化学结构创建的。然而，构型中的“*”表示相对位置，并且除非另外说明，表示对映异构体之一。而且，在写有“(3R*,4S*)”的情况下，表示每个立构中心的相对关系。更具体地，“(3R*,4S*)”表示特定的对映异构体(3R,4S)或(3S,4R)之一。
在本说明书中的旋转异构体的混合物意指具有由围绕单键(例如，C-C、C-N和C-O)的分子内旋转所引起的不同构象的异构体的混合物。
参考实例1
2-((3R*,4S*)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸乙酯盐酸盐的合成
Figure GDA0002686189970000151
(1a)4-(2-乙氧基-2-氧代亚乙基)-3-甲氧基哌啶-1-甲酸叔丁酯的合成
在室温，在氮气气氛下，将氢化钠(约60％，2.95g)添加至二乙基膦酰基乙酸乙酯(16.56g)在THF(340mL)中的溶液中，搅拌15分钟，随后逐滴添加3-甲氧基-4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(14.11g)(WO 2012/080735)在四氢呋喃(50mL)中的溶液并且将其在室温搅拌16小时。将乙酸乙酯(1000mL)和饱和碳酸氢钠水性溶液(400mL)添加至反应混合物中。将有机层经无水硫酸镁干燥。将干燥剂过滤掉，并且将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(庚烷-乙酸乙酯体系)纯化以获得标题化合物(14.65g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3,E/Z混合物)δ:1.29(t,J＝7.3Hz,3H),1.47(s,4.5H),1.48(s,4.5H),1.98(m,0.5H),2.52-2.83(m,2H),3.2-3.97(m,3H),3.30(s,1.5H),3.37(s,1.5H),3.80-4.58(m,1H),4.18(m,2H),5.21(br.s,0.5H),5.83(s,0.5H),5.94(s,0.5H)。
(1b)2-(3-甲氧基哌啶-4-亚基)乙酸乙酯盐酸盐的合成
将三氟乙酸(4mL)添加至4-(2-乙氧基-2-氧代亚乙基)-3-甲氧基哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.20g)在二氯甲烷(20mL)中的溶液中，并且将所述混合物在室温搅拌5小时。将所述反应混合物在减压下浓缩，向其中添加甲苯(100mL)，并且将其在减压下浓缩。再次添加甲苯(10mL)，将反应混合物在减压下浓缩，随后将乙酸乙酯(10mL)、甲苯(10mL)和4N氯化氢乙酸乙酯溶液(5mL)添加至残余物，并且将其在减压下浓缩以获得标题化合物(0.95g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.29(t,J＝7Hz,1.5H),1.29(t,J＝7Hz,1.5H),2.92-3.20(m,3H),3.33(s,1.5H),3.34(s,1.5H),3.25-3.91(m,4H),4.16-4.24(m,2H),5.98(s,0.5H),6.00(s,0.5H),7.95(br.s,0.5H),8.43(br.s,0.5H),10.11(br.s,1H)。
(1c)2-(3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸乙酯盐酸盐的合成
将钯活性碳(Pd10％)(0.21g)添加至2-(3-甲氧基哌啶-4-亚基)乙酸乙酯盐酸盐(0.95g)、乙醇(10mL)和乙酸乙酯(10mL)的混合物中，并且在氢气气氛下在室温搅拌17小时。将所述气氛返回氮气，将所述混合物通过硅藻土过滤并且将所述硅藻土用乙醇洗涤。将所述滤液和洗涤溶液合并并在减压下浓缩以获得标题化合物(1.02g，主要为顺式异构体)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3,顺式异构体)δ:1.27(t,J＝7Hz,3H),1.71(br.d,J＝14Hz,1H),1.94(br.q,J＝14Hz,1H),2.15(m,1H),2.32(dd,J＝16,6Hz,1H),2.54(dd,J＝16,8Hz,1H),2.94(m,2H),3.41(s,3H),3.44-3.65(m,3H),4.15(q,J＝7Hz,2H),7.84(br.s,1H),9.92(br.s,1H)。
(1d)(±)-2-(顺式-1-二苯甲基-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸乙酯的合成
在氮气气氛下，在-20℃，将溴二苯基甲烷(2.62g)在DMF(5mL)中的溶液添加至2-(3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸乙酯盐酸盐(2.098g)、DMF(80mL)、三乙胺(1.35mL)和碳酸钾(2.44g)的混合物中，并且在室温下搅拌过夜。向其中添加叔丁基甲基醚(400mL)和水(200mL)。随后用水(200mL×2)和饱和氯化钠水性溶液(200mL)洗涤所述有机层，并且经无水硫酸镁干燥。将干燥剂过滤掉，并且将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(庚烷-乙酸乙酯体系)纯化以获得呈无色液体的标题化合物(1.127g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.24(t,J＝7Hz,3H),1.51(m,1H),1.69(m,1H),1.94-2.12(m,3H),2.27(dd,J＝16,7Hz,1H),2.52(dd,J＝16,7Hz,1H),2.72(br.s,1H),2.98(br.s,1H),3.28(s,3H),3.29(br.s,1H),4.11(q,J＝7Hz,2H),4.26(s,1H),7.19(m,2H),7.27(m,4H),7.44(m,4H)。
(1e)2-((3R*,4S*)-1-二苯甲基-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸乙酯的合成
使用CHIRALPAK OJ-H柱，在以下条件下分离(旋光拆分)(±)-2-(顺式-1-二苯甲基-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸乙酯的对映异构体(1.127g)以获得标题化合物(0.411g)作为第一洗脱级分。
HPLC条件
柱：CHIRAL PAK OJ-H(批号；OJH-0CJ-FA001)，20mm×250mm，5μm；
流动相：己烷:乙醇＝98:2；
洗脱速率：20mL/min；
浓度：67mg/mL；
注射量：0.3mL；
HPLC保留时间：10.5min(第一次洗脱级分)
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.24(t,J＝7Hz,3H),1.49(m,1H),1.69(m,1H),1.94-2.12(m,3H),2.27(dd,J＝16,7Hz,1H),2.52(dd,J＝16,7Hz,1H),2.72(br.s,1H),2.98(br.s,1H),3.27(s,3H),3.29(br.s,1H),4.11(q,J＝7Hz,2H),4.26(s,1H),7.19(m,2H),7.27(m,4H),7.44(m,4H)。
(1f)2-((3R*,4S*)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸乙酯盐酸盐的合成
在90℃下搅拌2-((3R*,4S*)-1-二苯甲基-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸乙酯(411mg)、1N盐酸(1.118mL)、钯活性碳(Pd 5％)(0.238g)、环己烯(20mL)和乙醇(80mL)的混合物持续18小时。将所述反应混合物通过硅藻土过滤并且将所述硅藻土用乙醇(50mL x 2)洗涤。将所述滤液和洗涤溶液合并并在减压下浓缩。将庚烷和甲苯(10mL，1:1)以及2N盐酸(20mL)的混合溶剂添加至残余物并且将各层分离。用2N盐酸(20mL)萃取有机层。将5N氢氧化钠水性溶液添加至合并的水层以碱化，并且用二氯甲烷(50mL×2)萃取各层。将合并的有机层经无水硫酸镁干燥。将干燥剂过滤掉，将4N氯化氢乙酸乙酯溶液(2mL)添加至滤液中，并且在减压下浓缩以获得标题化合物(119mg)。
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:1.25(t,J＝7Hz,3H),1.72(m,1H),1.76(m,1H),2.20(m,1H),2.34(dd,J＝17,7Hz,1H),2.52(dd,J＝17,8Hz,1H),3.02(m,2H),3.27(m,1H),3.41(s,3H),3.60(m,2H),4.14(q,J＝7Hz,2H)。
参考实例2
2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡 唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的合成
Figure GDA0002686189970000181
(2a)5-氯-7-((2-氟-6-甲基苯基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-甲酸乙酯的合成
将5,7-二氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-甲酸乙酯(CAS号1232224-62-2)(5g)和2-氟-6-甲基苯胺(CAS号443-89-0)(2.41g)在NMP(3mL)中的溶液在120℃下搅拌4小时。将反应混合物与通过在120℃下搅拌在NMP(0.20mL)中的5,7-二氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-甲酸乙酯(0.50g)和2-氟-6-甲基苯胺(0.27g)持续4小时单独获得的反应溶液合并，用乙酸乙酯稀释，用水和饱和盐水洗涤并经无水硫酸钠干燥。在将干燥剂过滤掉后，将滤液在减压下浓缩，将二氯甲烷添加至残余物并且通过过滤收集不溶解的固体以获得呈淡黄色固体的标题化合物(2.88g)。将滤液在减压下进行浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(己烷-乙酸乙酯体系)纯化以获得标题化合物(2.28g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.46(t,J＝7Hz,3H),2.34(s,3H),4.50(q,J＝7Hz,2H),5.75(s,1H),7.02(s,1H),7.12(t,J＝8Hz,1H),7.18(br.d,J＝8Hz,1H),7.35(td,J＝8,6Hz,1H),7.82(br.s,1H)。
(2b)5-氯-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-甲酸乙酯 的合成
将碳酸铯(7.23g)和碘甲烷(4.61mL)添加至5-氯-7-((2-氟-6-甲基苯基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-甲酸乙酯(5.16g)在DMF(80mL)中的溶液，并且在50℃下搅拌3小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，依次用水和饱和盐水洗涤，并且经无水硫酸钠干燥。将干燥剂过滤掉，并且将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(庚烷-乙酸乙酯体系)纯化以获得呈淡黄色固体的标题化合物(4.64g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.37(t,J＝7Hz,3H),2.26(s,3H),3.83(br.s,3H),4.36(q,J＝7Hz,2H),5.79(br.s,1H),6.88(s,1H),7.04(t,J＝9Hz,1H),7.13(d,J＝8Hz,1H),7.30(td,J＝9,6Hz,1H)。
(2c)5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5- a]嘧啶-2-甲酸乙酯的合成
在氮气气氛下，将水(2mL)、碳酸钠(0.53g)、4-氯-3,5-二氟苯基硼酸(0.44g)和四(三苯基膦)钯(0)(0.12g)添加至5-氯-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-甲酸乙酯(0.73g)和1,4-二噁烷(16mL)的混合物中，并且在100℃下搅拌3小时。在回到室温后，将乙酸乙酯(200mL)和水(50mL)添加至反应混合物中，并且将有机层分离并经无水硫酸镁干燥。将干燥剂过滤掉，并且将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(庚烷-乙酸乙酯体系)纯化以获得呈淡黄色固体的标题化合物(0.96g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.39(t,J＝7Hz,3H),2.28(s,3H),3.88(s,3H),4.38(q,J＝7Hz,2H),6.14(s,1H),7.03(s,1H),7.04(dd,J＝9,8Hz,1H),7.15(d,J＝8Hz,1H),7.32(td,J＝8,6Hz,1H),7.57(d,J＝8Hz,2H)。
(2d)5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5- a]嘧啶-2-甲酸的合成
将水(10mL)和4N氢氧化锂水性溶液(2.47mL)添加至5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-甲酸乙酯(2.35g)和1,4-二噁烷(100mL)的混合物中，并且在室温搅拌17小时。添加5N盐酸(2mL)并且将反应混合物在减压下浓缩至约15mL体积。将所述混合物进行超声处理并且在室温搅拌30分钟，随后将固体通过过滤收集，用水(5mL)洗涤并在减压下干燥以获得呈淡黄色固体的标题化合物(2.24g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:2.30(s,3H),3.71(s,3H),6.47(s,1H),7.03(t,J＝9Hz,1H),7.08(s,1H),7.13-7.18(m,1H),7.34(td,J＝8,5Hz,1H),7.69(d,J＝7Hz,2H)。
(2e)2-((3R*,4S*)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基) 氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸乙酯的合成
依次将HOBT(57mg)、WSC(72mg)、2-((3R*,4S*)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸乙酯盐酸盐(77mg)(参考实例1)和三乙胺(101mg)添加至5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-甲酸(112mg)在DMF(6mL)中的溶液，并且在室温搅拌15小时。将乙酸乙酯(50mL)和水(20mL)添加至反应混合物中，并且将有机层用水(20mL×2)洗涤并经无水硫酸镁干燥。将干燥剂过滤掉，并且将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(庚烷-乙酸乙酯体系)纯化以获得标题化合物(137mg)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,旋转异构体的混合物)δ:1.26(m,3H),1.40-1.74(m,2H),2.12-2.55(m,5H),2.60-3.11(m,4H),3.38-3.75(m,6H),4.14(m,2H),4.10-4.46(m,1H),4.54-4.95(m,1H),6.29-6.53(m,1H),6.90-7.28(m,4H),7.61-7.70(m,2H)。
(2f)2-((3R*,4S*)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基) 氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的合成
将氢氧化锂(10.4mg)的水性溶液(1.5mL)添加至2-((3R*,4S*)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸乙酯(137mg)在1.4-二噁烷(6mL)中的溶液中，并且在室温搅拌20小时。将DMSO(2mL)和乙酸(0.1mL)添加至反应混合物中，将其在减压下浓缩。将残余物通过反相硅胶柱色谱法(乙腈-水、0.1％乙酸体系)纯化以获得呈白色固体的化合物(92mg)。
1H-NMR(600MHz,CDCl3,30℃,旋转异构体的混合物)δ:1.25-1.76(m,2H),2.01-2.41(m,4H),2.47-3.14(m,4H),3.38-3.75(m,7H),4.13-4.46(m,1H),4.54-4.98(m,1H),6.29-6.57(m,1H),6.84-7.30(m,4H),7.56-7.79(m,2H)。
质谱(ESI)m/z：602(M+H)+。
Figure GDA0002686189970000221
(2g)(2S,3S)-3-(氰基甲基)-1-((S)-1-苯基乙基)吡咯烷-2-甲酸乙酯的合成
在氮气气氛下，将(S)-2-(丁烯-3-烯-1-基(1-苯基乙基)氨基)乙酸乙酯(CAS号186586-65-2)(60.29g)在THF(750mL)中的溶液冷却至-75℃，并且使用插管将用乙醇-干冰冷却的二异丙基酰胺锂在正己烷-THF(1.13M，245mL)中的溶液添加至该溶液中。在温度升高至-20℃并搅拌15分钟后，随后使用具有乙醇-干冰作为制冷剂的冷却槽将该反应混合物再次冷却，并且在-72℃或更低下添加溴化锌(156g)在二乙醚(800mL)中的溶液。移除冷却槽以使反应混合物回到室温，并且将所述溶液搅拌1小时。使用具有含盐的冰水作为制冷剂的冷却槽，将反应混合物冷却至0℃或更低，并且添加氰化铜(I)(41.3g)、氯化锂(39.1g)和THF(750mL)的混合物。随后，添加(4-甲基苯基)磺酰氰(CAS号19158-51-1)(50.2g)在THF(200mL)中的溶液，并且在室温搅拌14小时。在搅拌的时候，添加水(1000mL)、氨水(28％，300mL)和乙酸乙酯(1500mL)。将悬浮液通过硅藻土过滤以除去沉淀物。将滤液移至分液漏斗以将有机层从水层分离，并且将所述有机层依次用氨水(10％，750mL)、水(750mL)和饱和氯化钠水性溶液(750mL)洗涤。将硅藻土和沉淀物用乙酸乙酯(500mL)洗涤4次并且合并这些洗涤溶液。使用合并的洗涤溶液，依次萃取以上4种水层(首先分离的水层、用于洗涤的氨水、用于洗涤的水和用于洗涤的饱和氯化钠水性溶液)。将有机层全部合并并且经无水硫酸镁干燥。将干燥剂过滤掉，并且将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(庚烷-乙酸乙酯体系)纯化以获得标题化合物(42.98g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3,主要的异构体)δ:1.24(t,J＝7Hz,3H),1.36(d,J＝7Hz,3H),1.77(m,1H),2.18(m,1H),2.27(dd,J＝17,9Hz,1H),2.35(dd,J＝17,7Hz,1H),2.66(m,1H),2.95(q,J＝8Hz,1H),3.10(td,J＝9,3Hz,1H),3.42(d,J＝8Hz,1H),3.75(q,J＝7Hz,1H),4.09-4.18(m,2H),7.22-7.38(m,5H)。
(2h)2-((2S,3S)-2-羟基甲基-1-((S)-1-苯基乙基)吡咯烷-3-基)乙腈的合成
在冰冷却和氮气气氛下，将四氢硼酸锂(20g)添加至(2S,3S)-3-(氰基甲基)-1-((S)-1-苯基乙基)吡咯烷-2-甲酸乙酯(44.74g)在THF(700mL)中的溶液中，并且加热至回流5小时。将反应混合物冷却至室温并且将其倒入1N盐酸(1000mL)和乙酸乙酯的混合物中。将反应混合物搅拌30分钟，随后添加碳酸氢钠(约100g)，并且用乙酸乙酯萃取3次和用二氯甲烷萃取2次。将有机层合并并干燥，将干燥剂过滤掉，并且随后将滤液在减压下浓缩。将残余物通过NH硅胶柱色谱法(庚烷-乙酸乙酯体系)纯化以获得标题化合物(28.98g)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3,主要的异构体)δ:1.47(d,J＝7Hz,3H),1.59(qd,J＝12,7Hz,1H),1.93(dt,J＝12,6Hz,1H),2.32-2.40(m,1H),2.46-2.63(m,3H),3.01(dd,J＝9,8Hz,1H),3.08-3.10(m,1H),3.27(d,J＝11Hz,1H),3.55(dd,J＝12,2Hz,1H),3.65(dd,J＝12,4Hz,1H),3.87(q,J＝7Hz,1H),7.26-7.36(m,5H)。
(2i)2-((3R,4S)-3-羟基-1-((S)-1-苯基乙基)哌啶-4-基)乙腈的合成
在氮气气氛下，将2-((2S,3S)-2-羟基甲基-1-((S)-1-苯基乙基)吡咯烷-3-基)乙腈(52.44g)在THF(2000mL)中的溶液冷却至-74℃或更低，并且以使内部温度不超过-73℃的方式在搅拌的时候逐滴添加三氟乙酸酐(36.4mL)。在进一步搅拌3小时后，逐滴添加三乙胺(120mL)。在搅拌15分钟后，使内部温度回到室温并且将反应混合物加热至回流15小时。在减压下去除溶剂，将乙酸乙酯(5000mL)和2N氢氧化钠水性溶液(500mL)添加至残余物以分离溶液。将有机层经无水硫酸镁干燥，将干燥剂过滤掉，并且将滤液在减压下浓缩。将残余物通过NH硅胶柱色谱法(庚烷-乙酸乙酯体系)纯化以获得标题化合物(51.25g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3,主要的异构体)δ:1.37(d,J＝7Hz,3H),1.47-1.76(m,3H),1.95(td,J＝12,3Hz,1H),2.15(dd,J＝12,1Hz,1H),2.33(dd,J＝17,8Hz,1H),2.46(dd,J＝17,7Hz,1H),2.82-2.86(m,2H),3.09-3.14(m,1H),3.56(q,J＝7Hz,1H),3.74(d,J＝10Hz,1H),7.24-7.35(m,5H)。
(2j)2-((3R,4S)-3-甲氧基-1-((S)-1-苯基乙基)哌啶-4-基)乙腈的合成
在冰冷却和氮气气氛下，在搅拌的时候经15分钟的时间将氢化钠(60％，9.19g)逐渐添加至2-((3R,4S)-3-羟基-1-((S)-1-苯基乙基)哌啶-4-基)乙腈(51.01g)和THF(750mL)的混合物中。在进一步搅拌10分钟后，逐滴添加硫酸二甲酯(22.94mL)。在搅拌5小时后，依次添加饱和的氯化铵水性溶液(50mL)、氨水(28％，50mL)和乙酸乙酯(1000mL)并且搅拌30分钟。添加1N氢氧化钠水性溶液(500mL)以分离溶液。将有机层用饱和氯化钠水性溶液(250mL)洗涤并且将合并的水层用乙酸乙酯(500mL)萃取。将有机层合并，经无水硫酸镁干燥，将干燥剂过滤掉并且将滤液在减压下浓缩。将残余物通过NH硅胶柱色谱法(庚烷-乙酸乙酯体系)纯化以获得标题化合物(47.9g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3,主要的异构体)δ:1.38(d,J＝7Hz,3H),1.53-1.59(m,1H),1.63-1.72(m,1H),1.85-1.94(m,1H),2.02-2.15(m,2H),2.30(dd,J＝17,7Hz,1H),2.49(dd,J＝17,8Hz,1H),2.74(br.d,J＝11Hz,1H),3.04(br.d,J＝11Hz,1H),3.30(s,3H),3.38(br.s,1H),3.55(q,J＝7Hz,1H),7.23-7.33(m,5H)。
(2k)2-((3R,4S)-3-甲氧基-1-((S)-1-苯基乙基)哌啶-4-基)乙酸甲酯的合成
在氮气气氛下，在冰冷却下将亚硫酰氯(352mL)逐滴添加至甲醇(1500mL)，随后添加2-((3R,4S)-3-甲氧基-1-((S)-1-苯基乙基)哌啶-4-基)乙腈(49.8g)在甲醇(50mL)中的溶液。将混合物加热至回流20小时，随后冰冷却，并且进一步逐滴添加亚硫酰氯(352mL)，并且加热至回流22小时。将反应混合物再次冰冷却，并且进一步逐滴添加亚硫酰氯(50mL)，并且加热至回流62小时。在使其回到室温后，将反应混合物在减压下浓缩。将残余物溶解在水(250mL)和乙酸乙酯(250mL)中，添加氨水(28％，50mL)并且随后添加2N氢氧化钠水性溶液直到pH达到11。分离溶液，将水层用乙酸乙酯萃取(500mL)，将有机层合并并经无水硫酸镁干燥，将干燥剂过滤掉并且将滤液在减压下浓缩以获得残余物A。
其次，将水层在减压下浓缩并且将甲醇(1000mL)和浓缩硫酸(50mL)添加至残余物，并且加热至回流22小时。使反应混合物回到室温并且用碳酸氢钠调节至pH 8。在减压下去除溶剂，将残余物溶解在乙酸乙酯(1000mL)和水(250mL)中，使用2N氢氧化钠水性溶液将pH调节至11并且分离溶液。将水层用乙酸乙酯萃取(500mL)，将有机层合并并经无水硫酸镁干燥，将干燥剂过滤掉并且将滤液在减压下浓缩以获得残余物B。
在氮气气氛下，在冰冷却下将亚硫酰氯(352mL)逐滴添加至甲醇(1500mL)并且随后添加残余物A在甲醇(100mL)中的溶液。将所述混合物加热至回流22小时。使反应混合物回到室温，在减压下去除溶剂，将残余物溶解在乙酸乙酯(1000mL)和水(250mL)中，添加氨水(28％，50mL)，使用2N氢氧化钠水性溶液将pH调节至11并且分离溶液。将水层用乙酸乙酯萃取(500mL)，将有机层合并并经无水硫酸镁干燥，将干燥剂过滤掉并且将滤液在减压下浓缩以获得残余物C。
将在处理后第二个反应中获得的水层在减压下浓缩，添加甲醇(1000mL)和浓缩硫酸(50mL)至残余物，并且加热至回流22小时。使反应混合物回到室温并且用碳酸氢钠调节至pH 8。在减压下去除溶剂，将残余物溶解在乙酸乙酯(1000mL)和水(250mL)中，使用2N氢氧化钠水性溶液将pH调节至11并且分离溶液。将水层用乙酸乙酯萃取(500mL)，将有机层合并并经无水硫酸镁干燥，将干燥剂过滤掉并且将滤液在减压下浓缩以获得残余物D。
将残余物B、残余物C和残余物D合并，通过NH硅胶柱色谱法(庚烷-乙酸乙酯体系)纯化以获得粗的2-((3R,4S)-3-甲氧基-1-((S)-1-苯基乙基)哌啶-4-基)乙酸甲酯(52.35g)。
伴随搅拌将4N氯化氢乙酸乙酯溶液(100mL)添加至乙酸乙酯(400mL)溶液中，其中将通过相同的方法单独获得的粗的2-((3R,4S)-3-甲氧基-1-((S)-1-苯基乙基)哌啶-4-基)乙酸甲酯(1.45g)与粗的2-((3R,4S)-3-甲氧基-1-((S)-1-苯基乙基)哌啶-4-基)乙酸甲酯(52.35g)合并。将反应混合物在室温搅拌过夜，随后将沉淀物通过过滤收集，用乙酸乙酯(100mL)洗涤并在减压下干燥。在搅拌的时候依次添加水(250mL)、乙酸乙酯(250mL)和碳酸氢钠水性溶液(250mL)以获得固体。在进一步添加乙酸乙酯(750mL)后，使用碳酸钾将pH调节至12并分离各层。将水层用乙酸乙酯(250mL)洗涤，将洗涤溶液和分离的有机层合并并且经无水硫酸镁干燥，将干燥剂过滤掉，并且将滤液在减压下浓缩。将所获得的残余物(46.3g)溶解在乙酸乙酯(400mL)中，并且在搅拌的时候添加4N氯化氢乙酸乙酯溶液(80mL)。向通过在室温下搅拌反应混合物过夜所获得的固体中，依次添加水(250mL)和乙酸乙酯(250mL)，以及伴随搅拌添加碳酸氢钠，随后通过过滤收集沉淀物，将其用乙酸乙酯(40mL)洗涤并在减压下干燥。添加水(750mL)和乙酸乙酯(750mL)以分离各层。将5N氢氧化钠水性溶液(50ml)添加至水层，将其用乙酸乙酯(1000mL)萃取。将有机层合并，经无水硫酸镁干燥，将干燥剂过滤掉并且将滤液在减压下浓缩以获得45.2g残余物。将所述残余物与通过相同的操作单独获得的16.2g残余物合并，溶解在乙酸乙酯(500mL)中，并且在搅拌的时候添加4N氯化氢乙酸乙酯溶液(100mL)。将反应混合物在室温搅拌过夜，随后将沉淀物通过过滤收集，用乙酸乙酯(60mL)洗涤2次并且在减压下干燥。将水(800mL)和乙酸乙酯(800mL)依次添加至所获得的固体，在搅拌的时候添加碳酸氢钠并分离溶液。将5N氢氧化钠水性溶液(50mL)添加至水层，将其用乙酸乙酯(800mL)萃取。将有机层合并，经无水硫酸镁干燥，将干燥剂过滤掉并将滤液在减压下浓缩以获得标题化合物(60.7g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.38(d,J＝7Hz,3H),1.45-1.54(m,1H),1.57-1.67(m,1H),2.03-2.21(m,3H),2.24(dd,J＝16,7Hz,1H),2.50(dd,J＝16,7Hz,1H),2.64(br.s,1H),2.85(br.s,1H),3.27(s,3H),3.29-3.32(m,1H),3.52(q,J＝7Hz,1H),3.65(s,3H),7.23-7.33(m,5H)。
(2l)2-((3R,4S)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸甲酯盐酸盐的合成
将钯活性碳(Pd10％)(0.639g)添加至2-((3R,4S)-3-甲氧基-1-((S)-1-苯基乙基)哌啶-4-基)乙酸甲酯(4.37g)在甲醇(50mL)中的溶液和氯化氢在甲醇(5％-10％，30mL)中的溶液的混合物中，并且在氢气气氛下在室温搅拌16小时。而且，添加钯活性碳(Pd10％)(0.639g)并且在氢气气氛下在室温搅拌24小时。添加钯活性碳(Pd10％)(0.639g)并且在氢气气氛下在室温进一步搅拌24小时。将混合物通过硅藻土过滤并且用甲醇洗涤所述硅藻土。将滤液和洗涤溶液合并并且在减压下浓缩以获得标题化合物(3.81g)。
1H-NMR(400MHz,CD3OD)δ:1.71-1.85(m,2H),2.16-2.25(m,1H),2.25(dd,J＝16,7Hz,1H),2.53(dd,J＝16,7Hz,1H),3.00-3.06(m,2H),3.27(m,1H),3.40(s,3H),3.59-3.63(m,2H),3.67(s,3H)。
(2m)2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨 基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸甲酯的合成
将HOBT(2.280g)和WSC(3.23g)添加至5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-甲酸(6.03g)(参考实例2-(2d))在DMF(100mL)中的溶液，搅拌15分钟，随后依次添加2-((3R,4S)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸甲酯盐酸盐(3.36g)在DMF(50mL)和三乙胺(5.64mL)中的溶液，并且在室温搅拌3小时。将乙酸乙酯(700mL)和水(500mL)添加至反应混合物中，并且将有机层用含有少量氯化钠的水(750mL)洗涤2次。将水层和洗涤溶液依次用乙酸乙酯(750mL)萃取，将有机层合并并且经无水硫酸镁干燥。将干燥剂过滤掉，并且将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(庚烷-乙酸乙酯体系)纯化以获得标题化合物(5.83g)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3,旋转异构体的混合物)δ:1.25-1.75(m,2H),2.05-2.95(m,9H),3.38-3.75(m,9H),4.10-4.46(m,1H),4.54-4.95(m,1H),6.37-6.50(m,1H),6.90-7.28(m,4H),7.64-7.76(m,2H)。
(2n)2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨 基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的合成
将水(30mL)和4N氢氧化锂水性溶液(3.49mL)添加至2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸甲酯(5.73g)在1.4-二噁烷(150mL)中的溶液中，并且在室温搅拌14小时。将DMSO(10mL)和甲酸(3mL)添加至反应混合物中，将其在减压下浓缩。将残余物通过反相硅胶柱色谱法(乙腈-水、0.1％乙酸体系)纯化以获得呈固体的标题化合物(5.124g)。
1H-NMR(500MHz,CD3OD,旋转异构体的混合物)δ:1.24-1.60(m,2H),2.00-2.47(m,4H),2.48-3.12(m,4H),3.31-3.64(m,7H),4.00-4.34(m,1H),4.34-4.65(m,1H),6.84-6.87(m,1H),6.90-7.35(m,4H),7.98-8.01(m,2H)。
[α]D 20:-109.9°(100mg,DMSO,5mL,100mm)。
参考实例3
2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡 唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的X射线衍射实验
将在参考实例2-(2n)中获得的固体2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸溶解在甲醇中并且用乙腈作为储蓄池通过蒸汽扩散法重结晶。使用获得的单晶进行X射线衍射实验。将晶体学数据和结构分析结果示出于表1中，并且将原子坐标数据示出于表2中。这些结果鉴定了标题化合物的绝对结构。
[表1]
Figure GDA0002686189970000291
Figure GDA0002686189970000301
[表2]
Figure GDA0002686189970000302
Figure GDA0002686189970000311
参考实例4
2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡 唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的重结晶
将水(550mL)添加至通过与参考实例2中描述的方法相同的方法获得的2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸(63.5g)、四氢呋喃(156mL)、乙腈(496mL)和水(65mL)的混合物中，同时在95℃的内部温度下搅拌。搅拌30分钟后，添加乙腈(25mL)和水(10mL)以溶解沉淀物。逐滴添加水(3mL)，搅拌30分钟后，逐滴添加乙腈(3mL)直至溶液再次变澄清。在搅拌30分钟后，使内部温度降到50℃并且将反应混合物再搅拌2小时。添加通过与参考实例2中所述的方法相同的方法获得的固体标题化合物(0.05g)，停止加热，并且在将内部温度恢复至室温之后，将反应混合物在室温搅拌3天。将混合物冷却至-5℃的内部温度，并且通过过滤收集固体，并且用比例为4:1:5的乙腈:四氢呋喃:水的混合溶液(3×200mL)洗涤，使用冰水冷却，并且在氮气流下减压干燥，以获得标题化合物的晶体(46.0g)。
粉末X射线衍射法衍射角(2θ±0.2°)：6.1、9.9、11.6、12.7、13.9、17.5、20.6、21.1、23.2、29.4
13C-NMR(100MHz,固态)δ(ppm):15.5,40.5,47.1,54.8,75.0,99.7,132.6,137.5,164.5,174.7
图3示出了参考实例4中获得的晶体的粉末X射线衍射图，并且图4示出了参考实例4中获得的晶体的固态13C NMR谱。
实例1
2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡 唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸盐酸盐的合成
将1mL的乙酸乙酯添加至通过与参考实例2中描述的方法相同的方法获得的2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸(10mg)中。将固体完全溶解在70℃的水浴中。添加3μL的浓盐酸并在室温搅拌过夜。将固体通过过滤收集并且在减压下干燥以获得标题化合物的晶体(9mg)。
将通过与参考实例2中描述的方法相同的方法获得的2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸(1.204g)和乙酸乙酯(120mL)在氮气氛下在70℃搅拌直至固体完全溶解。使溶液回到室温后，添加4N氯化氢乙酸乙酯溶液(4mL)和若干毫克以上获得的标题化合物的晶体。在室温搅拌溶液混合物过夜后，通过过滤收集固体，用乙酸乙酯(5mL)洗涤并在减压下干燥，以获得标题化合物的晶体(1.202g)。
粉末X射线衍射法衍射角(2θ±0.2°)：8.3、11.4、13.1、15.2、15.7、17.3、18.8、19.7、22.3、25.0
13C-NMR(100MHz,固态)δ(ppm):18.5,19.9,56.6,58.4,76.2,77.4,94.4,95.9,129.3,173.5
图1示出了实例1中获得的晶体的粉末X射线衍射图，并且图2示出了实例1中获得的晶体的固态13C NMR谱。
测试实例1细胞内钙浓度测量
将添加有3％胎牛血清(3％FBS)的使用DMEM培养基(英杰公司(Invitrogen))培养的人胚肾细胞系HEK293细胞制备为具有2×105个细胞/mL的浓度，并且涂板在I型胶原包被的384-孔黑色板(透明底)(格瑞纳公司(Greiner))中以便成为25μL/孔并且在CO2培养箱中培养过夜。将用Hanks-20mM Hepes缓冲液(pH 7.4)制备的FLIPR钙分析试剂盒(分子装置公司(Molecular Devices))添加至细胞中以便成为25μL/孔并且在CO2培养箱中培养1小时。将用Hanks-20mM Hepes缓冲液(pH 7.4)制备为5U/mL作为终浓度(BAEE单位)的胰蛋白酶(西格玛奥德里奇公司(SIGMA-ALDRICH)，目录号：T8816，酶学委员会编号3.4.21.4)添加至384-孔深孔聚丙烯板(格瑞纳公司(Greiner))以成为激动剂试剂板。在使用FDSS6000(滨松光子学有限公司(Hamamatsu Photonics K.K.))测量前30分钟，将用Hanks-20mM Hepes缓冲液(pH 7.4)制备的测试化合物添加至细胞以便成为8μL/孔。将添加了测试化合物的细胞板和试剂板放置在FDSS6000上，从试剂板添加22μL/孔激动剂溶液，并且用CCD摄像机测量细胞内钙浓度的变化。测量在37℃下进行120秒，并且使用FDSS6000的内置384-孔自动分液器进行试剂从试剂板向细胞板的添加。
表3示出了测试化合物对细胞内钙升高的抑制活性(IC50(nM))。
[表3]
测试化合物 对细胞内钙升高的抑制活性(IC50(nM))
化合物(I) 3.46
测试实例2溶解度测试
称取约1mg的测试化合物放入试管中，并添加1mL的测试溶液。对于测试溶液，使用0.1M盐酸水溶液(pH 1)和Britton-Robinson缓冲液(pH 3，pH 5和pH 7；离子强度0.3)。将测试溶液在室温振荡24小时，并且随后通过过滤器过滤。通过高效液相色谱法测量滤液中测试化合物的浓度以评估溶解度。表5显示了结果。另外，高效液相色谱(HPLC)条件在以下示出。
[HPLC条件]
柱；YMC-Pack Pro C18，4.6mm×35mm，3μm
流动相A；水:乙腈:70％高氯酸＝900:100:1
流动相B；水:乙腈:70％高氯酸＝100:900:1
流速；2mL/min
柱温；40℃
检测波长；275nm
注射体积；10μL
梯度条件
[表4]
时间(min.) 流动相B(％)
0 5
3 90
5 90
5.1 5
7 5
[表5]
Figure GDA0002686189970000341
测试实例3溶出测试
溶出测试通过桨法(paddle method)使用FaSSIF(通过逐滴添加氢氧化钠水溶液将含有3mM牛磺胆酸钠、0.75mM卵磷脂、29mM磷酸二氢钠和103mM氯化钾的水溶液调节至pH6.5)作为测试溶液进行。将约10mg的测试化合物添加至100mL的测试溶液中。在37℃和50rpm的条件下，使用桨搅拌测试溶液。开始搅拌后，在表6中示出的每个时间点处收集1mL测试溶液，并通过过滤器过滤。通过高效液相色谱法测量滤液中测试化合物的浓度(HPLC条件与测试实例2中描述的条件相同)。表6显示了结果。
[表6]
Figure GDA0002686189970000351

Claims (3)

1.一种由式(I)表示的2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐的晶体，其中，所述晶体在粉末X射线衍射法中在衍射角(2θ±0.2°)为8.3°、11.4°、13.1°、15.2°、15.7°、17.3°、18.8°、19.7°、22.3°和25.0°处具有衍射峰
Figure FDA0003960895840000011
。
2.2-((3R,4S)-1-(5-(4-氯-3,5-二氟苯基)-7-((2-氟-6-甲基苯基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-羰基)-3-甲氧基哌啶-4-基)乙酸的盐酸盐的晶体，其中，所述晶体在固态13C NMR谱中在化学位移(δ±0.5ppm)为18.5ppm、19.9ppm、56.6ppm、58.4ppm、76.2ppm、77.4ppm、94.4ppm、95.9ppm、129.3ppm和173.5ppm处具有峰。
3.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1或2所述的晶体作为活性成分。
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