CN111601619A

CN111601619A - 用于抗体药物偶联物的亲水性连接体

Info

Publication number: CN111601619A
Application number: CN201880085150.3A
Authority: CN
Inventors: A·韩
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2017-11-07
Filing date: 2018-11-06
Publication date: 2020-08-28
Also published as: EP3706805A2; WO2019094395A2; KR20200085807A; JP2021502341A; SG11202004151YA; JP2024045283A; AU2018365946A1; CA3080857A1; MX2020004691A; EA202091135A1; IL313068A; JP7426931B2; IL274427A; WO2019094395A3; IL274427B1

Abstract

本发明描述了蛋白质药物偶联物及其组合物，其可用于例如，将药物靶向特异性递送至细胞。通过将本发明所述这些化合物、组合物及偶联物施用于特定靶细胞，减少了由非特异性结合现象例如由非靶细胞引起的副作用。在某些实施方案，本发明提供了化合物、组合物和偶联物，其在连接体‑有效负载及其蛋白质偶联物中包括亲水性残基。

Description

用于抗体药物偶联物的亲水性连接体

本PCT国际申请要求并享有于2018年5月9日提交的美国临时申请号62/669,034、于2017年11月7日提交的PCT国际申请PCT/US17/60434(公开为WO 2018/089373)、以及于2017年11月7日提交的美国非临时申请号15/806,197(公开为US 2018/0155389)的优先权；所有所述申请的内容通过引用其全文并入本申请用于所有目的。

发明领域

本发明提供了新颖的蛋白质(例如抗体)、包含亲水性增溶基团的药物偶联物和/或包含亲水性增溶基团的连接体，以及用于治疗疾病、病症和病况的方法，所述方法包括施用包含亲水性增溶基团和/或其连接体的蛋白质药物偶联物。

发明背景

抗体-药物偶联物(ADC)是与生物活性小分子偶联的抗体。ADC选择性地将有效药物递送至靶向表达细胞，从而潜在地降低了脱靶副作用和/或毒性并改善了治疗指数。许多有效负载(即药物)的亲脂性质可对ADC的特性产生不利影响，以致有效负载无法有效地被递送至靶细胞。亲脂性有效负载的生物利用度低，可缩小ADC治疗的治疗窗口。此外，有效负载的疏水性质可对它们与抗体的偶联(在水性条件下进行的反应)提出挑战。因此，持续需要开发用于蛋白质偶联物(例如ADC)的亲水性连接体，其将使得偶联亲脂性有效负载、改善生物靶标的调节、改善生物利用度以及改善治疗窗具有可行性。

发明摘要

本发明提供了可用于治疗，例如，可用于治疗疾病、病症和病况，包括但不限于代谢性疾病、增殖性疾病以及其他疾病和病症的化合物。

在一个实施方案，本发明提供了化合物或其药学上可接受的盐，其包括：蛋白质结合剂，所述蛋白质结合剂经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个亲水性基团部分，其中所述共价连接体直接或间接与各个所述结合剂、所述有效负载基团部分和所述亲水性基团部分连接。

在另一实施方案，本发明提供了化合物，其包括：活性基团(reactive group)，所述活性基团经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个亲水性基团部分，其中所述共价连接体直接或间接与各个所述活性基团、所述有效负载基团部分和所述亲水性基团部分连接。

在另一实施方案，本发明提供了具有与抗体或其抗原结合片段连接的上述或本发明所述化合物的抗体-药物偶联物。

在另一实施方案，本发明提供了治疗有需要的患者的疾病、病症或病况的方法，所述方法包括向所述患者施用本发明所述的化合物。本发明还提供了使用本发明所述化合物在治疗本发明所述疾病、病症或病况中的用途。本发明进一步提供了使用本发明所述化合物在制备治疗本发明所述疾病、病症或病况的药物中的用途。在一些实施方案，所述化合物是抗体-药物偶联物。

在另一实施方案，本发明提供了制备抗体-药物偶联物的方法，其包括以下步骤：在适于在结合剂和连接体-有效负载化合物之间形成键的条件下，使所述结合剂与本发明所述的连接体-有效负载化合物接触。

附图简要说明

图1示出了三种不同类型的有效负载化合物。

图2示出了制备化合物1a、1c、1e、1f、1i、1j、1k、1m、1q、Ib、Id、Ie-1、If-1、IIb、IIId、IIIe和IVb的合成方法。

图3示出了制备化合物1h、1l、Ig和Ih-1的合成方法。

图4示出了制备有效负载B和C的合成方法。

图5示出了制备有效负载D的合成方法。

图6示出了制备中间体3a、3b、3c和3g的一般合成方法A。

图7示出了制备中间体3d和3f的一般合成方法。

图8示出了制备中间体3e的合成方法。

图9示出了制备中间体4a的合成方法。

图10示出了制备中间体4b的合成方法。

图11示出了制备中间体5a至5g的合成方法。

图11A示出了制备中间体10a的合成方法。

图11B示出了制备中间体10b的合成方法。

图11C示出了制备中间体10a、10b、10c和10d的合成方法。

图12示出了制备中间体6c的合成方法。

图13示出了制备中间体6d的合成方法。

图13A示出了制备中间体6b的合成方法。

图13B示出了制备中间体6f的合成方法。

图14示出了制备中间体7a、7c、7e、7f、7i、7k、7m、7q、7ab、7ad、7ae、7bb、7cb和7fb的一般合成方法E。

图15示出了制备中间体7h和7l的一般合成方法F。

图15A示出了制备中间体7ah的一般合成方法。

图15B示出了制备中间体8c的合成方法。

图16示出了制备化合物1a的一般合成方法G。

图17示出了制备化合物1a、1c、1e、1f、1h、1i、1j、1k、1l、1m、1q、Ib、Id、If-1、IIb、IIId、IIIe和IVb的一般合成方法H。

图18示出了组织蛋白酶B切割连接体-有效负载以释放游离有效负载的可切割片段。

图18A示出了制备Ig和Ih-1的合成方法。

图18B示出了组织蛋白酶B切割连接体-有效负载以释放游离有效负载的可切割片段。

图19示出了抗体药物偶联的一般合成方法的实例。

图20示出了在本发明所述方法中可代替d-Lys使用的试剂。

发明详述

本发明提供了可用于治疗，例如，受试者血脂异常、代谢性疾病、炎症或神经退行性疾病的化合物、组合物和方法。

在描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应理解，本发明使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而并非旨在进行限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本发明使用的术语“约”或“大约”当在引用特定的所列举的数值中使用时，是指所述值可与所列举的值相差不超过1％。例如，本发明使用的表述“约100”包括99和101以及介于其间的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。

尽管与本发明描述的那些方法或材料/物料相似或等同的任何方法和材料/物料均可用于本发明的实践或测试中，但现在描述优选的方法和材料/物料。本说明书中提及的所有专利、专利申请和非专利出版物均通过引用其全文并入本发明。

定义

当提及本发明提供的化合物时，除非另有说明，否则以下术语具有以下含义。除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本发明提供的术语存在多个定义的情况下，除非另有说明，否则以所述这些定义为准。

本发明使用的“烷基”是指一价且饱和的烃基基团部分。烷基是任选取代的，且可以是直链、支链或环状的，即环烷基。烷基包括但不限于具有1-20个碳原子，即C_1-20烷基；1-12个碳原子，即C_1-12烷基；1-8个碳原子，即C_1-8烷基；1-6个碳原子，即C_1-6烷基；和1-3个碳原子，即C_1-3烷基的那些基团。烷基基团部分的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、戊基基团部分、己基基团部分、环丙基、环丁基、环戊基和环己基。戊基基团部分包括但不限于正戊基和异戊基。己基基团部分包括但不限于正己基。

本发明使用的“亚烷基”是指二价烷基基团。除非另有说明，否则亚烷基包括但不限于1-20个碳原子。亚烷基基团任选地如本发明所述被烷基取代。在一些实施方案，亚烷基是未取代的。

在未指定其立体化学的情况下，氨基酸或氨基酸残基的名称旨在涵盖氨基酸的L形式、氨基酸的D形式或其外消旋混合物。

本发明使用的“卤代烷基”是指如上所定义的烷基，其中所述烷基包括至少一个选自卤素例如氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)或碘(I)的取代基。卤代烷基的实例包括但不限于，-CF₃、-CH₂CF₃、–CCl₂F和–CCl₃。

本发明使用的“烯基”是指包含至少两个碳原子和一个或多个非芳族碳-碳双键的一价烃基基团部分。烯基是任选取代的，且可以是直链、支链或环状的。烯基包括但不限于具有2-20个碳原子，即C_2-20烯基；2-12个碳原子，即C_2-12烯基；2-8个碳原子，即C_2-8烯基；2-6个碳原子，即C_2-6烯基；和2-4个碳原子，即C_2-4烯基的那些基团。烯基基团部分的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基和环己烯基。

本发明使用的“炔基”是指包含至少两个碳原子和一个或多个碳-碳三键的一价烃基基团部分。炔基是任选取代的，且可以是直链、支链或环状的。炔基包括但不限于具有2-20个碳原子，即C_2-20炔基；2-12个碳原子，即C_2-12炔基；2-8个碳原子，即C_2-8炔基；2-6个碳原子，即C_2-6炔基；和2-4个碳原子，即C_2-4炔基的那些基团。炔基基团部分的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基和丁炔基。

本发明使用的“烷氧基”是指一价且饱和的烃基基团部分，其中所述烃包括与氧原子连接的单键，和其中所述自由基位于氧原子上，例如乙氧基CH₃CH₂–O·。烷氧基取代基与它们通过所述烷氧基取代基的氧原子取代的化合物连接。烷氧基是任选取代的，且可以是直链、支链或环状的，即环烷氧基。烷氧基包括但不限于具有1-20个碳原子，即C_1-20烷氧基；1-12个碳原子，即C_1-12烷氧基；1-8个碳原子，即C_1-8烷氧基；1-6个碳原子，即C_1-6烷氧基；和1-3个碳原子，即C_1-3烷氧基的那些。烷氧基基团部分的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、异丁氧基、戊氧基基团部分、己氧基基团部分、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基和环己氧基。

本发明使用的“卤代烷氧基”是指如上所定义的烷氧基，其中所述烷氧基包括至少一个选自卤素例如F、Cl、Br或I的取代基。

本发明使用的“芳基”是指一价基团部分，其是芳族化合物的原子团，其中所述环原子均是碳原子。芳基是任选取代的，且可以是单环或多环的，例如双环或三环。芳基基团部分的实例包括但不限于具有6至20个环碳原子，即C_6-20芳基；6至15个环碳原子，即C_6-15芳基，和6至10个环碳原子，即C_6-10芳基的那些。芳基基团部分的实例包括但不限于苯基、萘基、芴基、薁基、蒽基、菲基和芘基。

本发明使用的“芳基烷基”或“芳烷基”是指烷基化合物原子团的一价基团部分，其中所述烷基化合物被芳香族取代基取代，即，所述芳香族化合物包括与烷基基团连接的单键，和其中所述自由基位于所述烷基基团上。芳基烷基基团通过所述烷基基团与所示的化学结构连接。芳基烷基可以由以下结构表示，例如，

其中B是芳族基团部分，例如苯基。芳基烷基是任选取代的，即所述芳基基团和/或所述烷基基团，可以如本发明所述的那样被取代。芳基烷基的实例包括但不限于苄基。

本发明使用的“烷基芳基”是指芳基化合物原子团的一价基团部分，其中所述芳基化合物被烷基取代基取代，即，所述芳基化合物包括与烷基基团连接的单键，其中所述自由基位于所述芳基基团上。烷基芳基基团通过所述芳基基团与所示的化学结构连接。烷基芳基可以由以下结构表示，例如，

其中B是芳族基团部分，例如苯基。烷基芳基是任选取代的，即所述芳基基团和/或所述烷基基团，可以如本发明所述的那样被取代。烷基芳基的实例包括但不限于甲苯甲酰基。

本发明使用的“芳氧基/芳基氧基”是指芳族化合物原子团的一价基团部分，其中所述环原子均为碳原子，和其中所述环被氧基取代，即所述芳族化合物包括与氧原子连接的单键，和其中所述自由基位于氧原子上，例如苯氧基

芳氧基取代基与它们通过此氧原子取代的化合物连接。芳氧基是任选取代的。芳氧基包括但不限于具有6至20个环碳原子，即C_6-20芳氧基；6至15个环碳原子，即C_6-15芳氧基，和6至10个环碳原子，即C_6-10芳氧基的那些基团。芳氧基基团部分的实例包括但不限于苯氧基、萘氧基和蒽氧基。

本发明使用的“R^aR^bN-芳基氧基”是指芳族化合物原子团的一价基团部分，其中所述环原子均为碳原子，和其中所述环被至少一个R^aR^bN-取代基和至少一个氧基取代，即所述芳族化合物包括与R^aR^bN-取代基连接的单键和与氧原子连接的单键，其中所述自由基位于氧原子上，例如

R^aR^bN-芳基氧基取代基与它们通过此氧原子取代的化合物连接。R^aR^bN-芳基氧基是任选取代的。R^aR^bN-芳基氧基包括但不限于具有6至20个环碳原子，例如，C_6-20(R^aR^bN)_n-芳基氧基，6至15个环碳原子，例如，C_6-15(R^aR^bN)_n-芳基氧基，和6至10个环碳原子，例如，C_6-10(R^aR^bN)_n-芳基氧基的那些，其中n表示R^aR^bN–取代基的数目。R^aR^bN-芳基氧基基团部分的实例包括但不限于4–(二甲基氨基)–苯氧基，

本发明使用的“亚芳基”是指芳族化合物的二价基团部分，其中所述环原子仅为碳原子。亚芳基是任选取代的，且可以是单环或多环的，例如双环或三环。亚芳基基团部分的实例包括但不限于具有6至20个环碳原子，即C_6-20亚芳基；6至15个环碳原子，即C_6-15亚芳基；和6至10个环碳原子，即C_6-10亚芳基的那些。

本发明使用的“杂烷基”是指其中一个或多个碳原子被杂原子替换的烷基。本发明使用的“杂烯基”是指其中一个或多个碳原子被杂原子替换的烯基。本发明使用的“杂炔基”是指其中一个或多个碳原子被杂原子替换的炔基。合适的杂原子包括但不限于氮、氧和硫原子。杂烷基是任选取代的。杂烷基基团部分的实例包括但不限于氨基烷基、磺酰基烷基、亚磺酰基烷基。杂烷基基团部分的实例还包括但不限于甲氨基、甲磺酰基和甲基亚磺酰基。

本发明使用的“杂芳基”是指芳族化合物原子团的一价基团部分，其中所述环原子包含碳原子和至少一个氧、硫、氮或磷原子。杂芳基基团部分的实例包括但不限于具有5至20个环原子，5至15个环原子，和5至10个环原子的那些。杂芳基是任选取代的。

本发明使用的“亚杂芳基”是指其中所述芳环的一个或多个环原子被氧、硫、氮或磷原子替换的亚芳基。亚杂芳基是任选取代的。

“杂环烷基”是指其中一个或多个碳原子被杂原子替换的环烷基。合适的杂原子包括但不限于氮、氧和硫原子。杂环烷基是任选取代的。杂环烷基基团部分的实例包括但不限于吗啉基、哌啶基、四氢吡喃基、吡咯烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、二氧杂环戊烷基、二硫杂环戊烷基、四氢吡喃基或四氢噻喃基。

本发明使用的“含N的杂环烷基”是指其中一个或多个碳原子被杂原子替代、和其中至少一个杂原子是氮原子的环烷基。合适的杂原子除氮原子之外，还包括但不限于氧原子和硫原子。含N的杂环烷基是任选取代的。含N的杂环烷基基团部分的实例包括但不限于吗啉基、哌啶基、吡咯烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、或噻唑烷基。

本发明使用的“任选取代的”，当用于描述基团部分，例如任选取代的烷基时，是指此基团部分任选地与一个或多个取代基连接。此类取代基的实例包括但不限于卤素，氰基，硝基，任选取代的卤代烷基，叠氮基，环氧基，任选取代的杂芳基，任选取代的杂环烷基，

其中R^A、R^B和R^C在每次出现时，分别独立地为氢原子、烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、杂烷基、杂芳基、或杂环烷基，或R^A和R^B同与它们连接的原子一起形成饱和或不饱和的碳环，其中所述环是任选取代的，和其中一个或多个环原子任选地被杂原子替代。在某些实施方案，当基团部分任选地被任选取代的杂芳基、任选取代的杂环烷基或任选取代的饱和或不饱和碳环取代时，所述任选取代的杂芳基、任选取代的杂环烷基或任选取代的饱和或不饱和碳环上的取代基，如果它们被取代，则不被进一步任选地被另外的取代基取代的取代基取代。在一些实施方案，当本发明所述的基团任选地被取代时，除非另有说明，与所述基团连接的取代基是未被取代的。

本发明使用的“结合剂”是指能够与给定结合配偶体(例如抗原)特异性结合的任何分子，例如蛋白质。

本发明使用的“连接体”是指使所述结合剂与本发明所述的一个或多个化合物(例如，本发明所述的有效负载化合物和亲水性基团)共价连接的二价、三价、或多价基团部分。

本发明使用的“酰胺合成条件”是指适于促进形成酰胺，譬如，通过羧酸、活化的羧酸、或酰卤与胺进行反应的反应条件。在一些实施例，“酰胺合成条件”是指适于在羧酸和胺之间促进形成酰胺键的反应条件。在所述这些实施例的一些中，所述羧酸首先在活化羧酸与胺反应形成酰胺之前转化为活化羧酸。实现酰胺形成的适宜条件包括，但不限于，利用试剂来实现羧酸与胺之间反应的那些，包括但不限于，二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、(苯并三氮唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)、(7-偶氮苯并三氮唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyAOP)、三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐(PyBrOP)、O-(苯并三氮唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(苯并三氮唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟硼酸盐(TBTU)、1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三氮唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐(HATU)、2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、2-氯-1,3-二甲基咪唑鎓六氟磷酸盐(CIP)、2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)、和羰二咪唑(CDI)。在一些实施例，首先将羧酸转化为活化的羧酸酯，然后与胺反应形成酰胺键。在一些实施方案，羧酸与试剂反应。所述试剂通过使羧酸去质子来活化羧酸，然后由于去质子化的羧酸亲核进攻到质子化试剂上，从而与去质子化的羧酸形成产物复合物。对于某些羧酸，相较羧酸转化成活化酯之前，所述活化羧酸酯更容易受到胺的亲核进攻。此举导致酰胺键形成。因此，所述羧酸被描述为活化的。示例性试剂包括DCC和DIC。

本发明使用的“牛磺酸”是指试剂

或基团

其中

表示所述牛磺酸通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。本发明使用的“双牛磺酸”是指基团

其中

表示所述双牛磺酸通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

本发明使用的“立体异构体形式”是指化合物中不同基团的相对空间取向。立体异构体形式包括对映异构体、非对映异构体和/或其混合物。

本发明使用的“区域异构体”或“区域异构体的混合物”是指得自用合适的炔类化合物处理的合适的叠氮化物(例如，-N₃或PEG-N₃衍生抗体)的1,3-环加成产物或应变促进的炔烃-叠氮化物环加成产物(SPAAC)(也称为点击反应)。在某些实施方案，例如，所述区域异构体和区域异构体的混合物的特征在于如下所示的点击反应产物：

仅作为示例，化合物A1'的区域异构体，即为化合物A2'、A3'、A4'，如下所示，其中各

分别为与所述结合剂连接的键；和各

分别为与所述有效负载连接的键：

在某些实施方案，可在生成产物的合成方法中使用一种以上的合适的叠氮化物和一种以上的合适的炔烃，其中每对叠氮化物-炔烃可参与一个或多个独立的点击反应以生成区域异构的点击反应产物的混合物。例如，技术人员将认识到，第一合适的叠氮化物可独立地与第一合适的炔烃反应，第二合适的叠氮化物可在生成产物的途中独立地与第二合适的炔烃反应，从而生成本发明所述的ADC样本中的四种可能的点击反应区域异构体或所述四种可能的点击反应区域异构体的混合物。例如，本领域技术人员将认识到，第一合适的叠氮化物可在生成产物的途中独立地与第一合适的炔烃反应，从而生成本发明所述的连接体-有效负载样本中的两种可能的点击反应区域异构体或两种可能的点击反应区域异构体的混合物。

本发明使用的术语“残基”是指化合物内化学反应后保留的化学基团部分。例如，术语“氨基酸残基”或“N-烷基氨基酸残基”是指氨基酸或N-烷基氨基酸与合适的偶联配偶体进行酰胺偶联或肽偶联的产物；其中，例如，在氨基酸或N-烷基氨基酸的酰胺偶联或肽偶联之后将水分子排出，从而得到氨基酸残基或N-烷基氨基酸残基掺入其中的产物。

本发明使用的“治疗有效量”是指足以在患者治疗或控制疾病或病症，或延迟或最小化与疾病或病症相关的一种或多种症状时，提供治疗益处的(化合物的)量。

本发明使用的“糖”或“糖基团”或“糖残基”是指可包含3-碳(丙糖)单元、4-碳(丁糖)单元、5-碳(戊糖)单元、6-碳(己糖)单元、7-碳(庚糖)单元、或其组合的碳水化合物基团部分，并且可以是单糖、二糖、三糖、四糖、五糖、寡糖、或任何其他多糖。在一些实施例，“糖”或“糖基团”或“糖残基”包含呋喃糖类(例如，呋喃核糖、呋喃果糖)或吡喃糖类(例如，吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖)、或其组合。在一些实施例，“糖”或“糖基团”或“糖残基”包含醛糖类或酮糖类、或其组合。单糖的非限制性实例包括核糖、脱氧核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、和果糖。二糖的非限制性实例包括蔗糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖、和海藻糖。其他“糖”或“糖基团”或“糖残基”包括多糖类和/或寡糖类，包括但不限于直链淀粉、支链淀粉、糖原、菊粉、和纤维素。在一些实施例，“糖”或“糖基团”或“糖残基”是氨基糖。在一些实施例，“糖”或“糖基团”或“糖残基”是通过其氨基基团与分子其余部分连接，以与所述分子的所述其余部分形成酰胺键(即葡糖酰胺)的葡糖胺残基(1-氨基-1-脱氧-D-葡萄糖醇)。

某些基团、分子/基团部分、取代基、和原子被描述为具有与键相交的波浪线，以指示所述基团、分子/基团部分、取代基、原子通过其进行连接的原子。譬如，被丙基基团取代的苯基基团可表示为：

具有下述结构：

本发明使用的，通过环原子之间的键连接到环状基团(例如，芳环、杂芳环、稠环、和饱和或不饱和环烷基或杂环烷基)的取代基的图示说明意在表示，除非另有说明，环状基团可根据本发明所阐述的技术或即时公开的涉及本领域已知的技术，在环状基团的任何环位置或稠环基团的任何环上被取代基取代。譬如，所述基团

其中下标q是从0至4的整数，和其中取代基R¹的位置一般性地描述，即不直接连接至键合线结构的任何顶点，即特定的环碳原子，包括以下，其中取代基R¹与特定环碳原子连接的基团的非限制性实例：

本发明使用的短语“亲水性连接体(HL)”是指包含如本发明定义的亲水性基团(HG)以及如本发明定义的间隔基团SP²的基团部分。

本发明使用的短语“活性(反应性)连接体(reactive linker)”是指包含活性(反应性)基团和间隔基团的一价基团，例如，如

所示，其中RG'是活性基团，SP¹是间隔基团。如本发明所述，活性(反应性)连接体可包含一个以上活性(反应性)基团和一个以上间隔基团。所述间隔基团是将活性(反应性)基团桥接至另一个基团(例如有效负载)或还桥接至结合剂的任何二价或三价基团部分。所述活性连接体(L、LL)与同它们连接的有效负载一起，组成可用作制备本发明所述抗体偶联物的合成前体的中间体(“连接体-有效负载”)。所述活性连接体包含一个或一个以上的活性基团RG(RG¹、RG²、或RG')，其是能够与另一基团(例如，本发明所述的抗体、经修饰的抗体、或其抗原结合片段、或亲水性基团)的活性部分反应的官能团或基团部分。由所述活性基团与所述抗体、经修饰的抗体、或其抗原结合片段反应产生的基团部分与所述连接基团一起，组成本发明所述的偶联物的“结合剂连接体”(“BL”)部分。在某些实施方案，所述“活性基团”是与抗体或其抗原结合片段的半胱氨酸残基或赖氨酸残基反应的官能团或基团部分(例如，马来酰亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯)。

在某些实施方案，所述“活性基团”是能够进行点击化学反应(参见，例如clickchemistry,Huisgen Proc.Chem.Soc.1961,Wang et al.J.Am.Chem.Soc.2003,and Agardet al.J.Am.Chem.Soc.2004)的官能团或基团部分。在所述点击化学反应的一些实施方案中，所述活性基团是能够与叠氮化物进行1,3-环加成反应的炔烃。能够与叠氮化物进行1,3-环加成反应的炔在本发明中也称为“点击化学残基”。此类合适的活性基团包括但不限于应变炔烃类，例如适用于应变促进的炔-叠氮化物环加成(SPAAC)的那些，环炔烃类，例如环辛炔类、苯并环化的炔烃类、和在没有铜催化剂的情况下能够与炔烃类化合物进行1,3-环加成反应的炔烃类。合适的炔烃类还包括但不限于二苯并氮杂环辛炔或

例如

二苯并环辛炔或

例如

二芳基氮杂环辛炔酮或

例如

二氟化环辛炔或

取代的例如氟化炔烃类，氮杂环炔烃类，二环[6.1.0]壬炔或

(BCN，其中R是烷基、烷氧基、或酰基)，和其衍生物类，例如

特别有用的炔烃类包括

其他炔烃类包括

包含此类活性基团的连接体-有效负载可用于偶联已用叠氮基官能化的抗体。此类官能化抗体包括用叠氮基-聚乙二醇基团官能化的抗体。在某些实施方案，此类官能化抗体通过在转谷氨酰胺酶的存在下，用带有氨基基团和叠氮基的化合物处理具有至少一个谷氨酰胺残基(例如重链Gln295)的抗体，从而衍生得到。

在某些实施方案，所述抗体或谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子在至少一个多肽链序列中包含至少一个谷氨酰胺残基。在某些实施方案，所述抗体或谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子包含两个重链多肽，其中每个具有一个Gln295残基。在进一步的实施方案，所述抗体或谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子在重链Gln295以外的位点处包含一个或多个谷氨酰胺残基。本发明包括带有本发明所述的N297Q突变的抗体。简言之，在一些实施方案，在酶转谷氨酰胺酶存在下，用伯胺化合物处理包含谷氨酰胺残基的抗体，如下文更详细描述的。在一些实施方案，在酶转谷氨酰胺酶存在下，用伯胺化合物处理包含Asn297Gln(N297Q)残基的抗体，如下文更详细描述的。在一些实施方案，在酶转谷氨酰胺酶存在下，用伯胺化合物处理包含Gln295(Q295)残基的抗体，如下文更详细描述的。在一些实施方案，在酶转谷氨酰胺酶存在下，用伯胺化合物处理包含Gln55(Q55)残基的抗体，如下文更详细描述的。譬如，在一些实施方案，可通过定点诱变以去除或破坏序列或在除了任何干扰结构之外的位点处插入谷氨酰胺残基来制备此类抗体。此类抗体也可从天然来源或人工来源分离得到。

抗体的氨基酸序列可使用任何已知的编号方案进行编号，包括由Kabat等人描述的方案(“卡巴(Kabat)”编号方案)；Al-Lazikani et al.,1997,J.Mol.Biol.,273:927-948中描述的方案(“柯西亚(Chothia)”编号方案)；MacCallum et al.,1996,J.Mol.Biol.262:732-745中描述的方案(“接触(Contact)”编号方案)；Lefranc et al.,Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77中描述的方案(“IMGT”编号方案)；以及Honegge andPlückthun,J.Mol.Biol.,2001,309:657-70中描述的方案(“AHo”编号方案)。除非另有说明，否则本发明中使用的编号方案是卡巴(Kabat)编号方案。然而，编号方案的选择并不旨在暗示不存在它们的序列的差异，并且本领域技术人员可通过检查一个或多个抗体的氨基酸序列来容易地确认序列位置。除非另有说明，否则当提及抗体重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号方案”(例如，如Kabat等人所报告，见上文)。

术语“非糖基化抗体”或“无糖基化抗体”是指不包含可能干扰转谷氨酰胺化反应的糖基化序列的抗体，例如在一个或多个重链的N297处不具有糖基团的抗体。在特定实施方案，抗体重链具有N297突变。换言之，根据Kabat等人公开的EU编号系统，所述抗体被突变为在位置297处不再具有天冬酰胺残基。在特定实施方案，抗体重链具有N297Q或N297D突变。可通过定点诱变来去除或破坏糖基化序列或通过定点诱变将谷氨酰胺残基插入除任何干扰糖基化位点或任何其他干扰结构之外的位点来制备此类抗体。此类抗体也可从天然来源或人工来源分离得到。

术语“去糖基化抗体”是指其中N297处的糖基团被去除从而打开Q295以进行转谷氨酰胺化的抗体。在特定实施方案，本发明提供了包括将抗体(例如N297抗体)去糖基化的额外步骤的方法。

在一些实施例，在生物偶联反应中使用的炔类化合物对于Cu(I)点击化学偶联反应是有用的。在一些实施例，在偶联反应中使用的炔类化合物在2-氰基苯并噻唑(CBT)反应中与1,2-氨基硫醇反应。在一些实施例，在逆电子需求狄尔斯-阿尔德(Diels Alder)反应中，所使用的炔为BCN、BCN的衍生物或反式环辛烯(TCO)。参见，例如，Wang et al.,J.Am.Chem.Soc.；(Article),2012,134(6),2950-2953。

在一些实施例，所述活性基团是炔烃，例如

其可通过点击化学与叠氮化物(例如

)反应，以形成点击化学产物，例如

在一些实施例，所述基团与经修饰的抗体或其抗原结合片段上的叠氮化物反应。在一些实施例，所述活性基团是炔烃，例如

其可通过点击化学与叠氮化物(例如

)反应，以形成点击化学产物，例如

在一些实施例，所述活性基团是炔烃，例如

其可通过点击化学与叠氮化物(例如

)反应，以形成点击化学产物，例如

在一些实施例，所述活性基团是官能团，例如

其与抗体或其抗原结合片段上的半胱氨酸残基反应，与其形成键，例如

其中Ab是指抗体或其抗原结合片段，S是指半胱氨酸残基上的S原子，所述官能团通过此半胱氨酸残基上的S原子与Ab结合。在一些实施例，所述活性基团是官能团，例如

其与抗体或其抗原结合片段上的赖氨酸残基反应，与其形成键，例如

其中Ab是指抗体或其抗原结合片段，NH是指赖氨酸侧链残基上的NH原子，所述官能团通过此赖氨酸侧链残基上的NH原子与Ab结合。

本发明使用的短语“结合剂连接体”、或“BL”是指使结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)与本发明所述的有效负载化合物(例如，MMAE、双八氢菲羧酰胺类化合物、类固醇类)、以及任选地与一个或多个侧链化合物连接、结合或键合的任何二价、三价、或多价基团或基团部分。通常，本发明所述的抗体偶联物的合适结合剂连接体是足以稳定以利用抗体的循环半衰期，并且同时能够在抗原介导的偶联物内化后释放其有效负载的那些。连接体可以是可切割的或不可切割的。可切割的连接体是内化后由细胞内代谢切割的连接体，例如通过水解、还原或酶促反应进行切割。不可切割的连接体是通过内化后抗体的溶酶体降解来释放附接的有效负载的连接体。合适的连接体包括但不限于酸不稳定连接体，水解不稳定连接体，酶促可切割连接体，还原不稳定连接体，自降解(self-immolative)连接体和不可切割连接体。合适的连接体还包括但不限于是或包含肽类，葡糖苷酸类，琥珀酰亚胺-硫醚类，聚乙二醇(PEG)单元类，腙类，ε-己酰单元类，二肽单元类，缬氨酸-瓜氨酸单元类，和对氨基苄基(PAB)单元类的那些。在一些实施方案，所述结合剂连接体(BL)包含通过活性连接体(RL)的活性基团(RG)与结合剂(例如，抗体、经修饰的抗体、或其抗原结合片段)的活性部分进行反应形成的基团部分。

在一些实施例，所述BL包含以下基团部分：

其中

是与所述结合剂连接的键。在一些实施例，所述BL包含以下基团部分：

其中

其中

其中

是与所述抗体或其抗原结合片段的所述半胱氨酸连接的键。在一些实施例，所述BL包含以下基团部分：

其中

是与所述抗体或其抗原结合片段的所述赖氨酸连接的键。

偶联物和有效负载

在一些实施例，本发明提供了化合物或其药学上可接受的盐，其包括：结合剂，所述结合剂经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个亲水性基团部分，其中所述共价连接体直接或间接与各个所述结合剂、所述有效负载基团部分和所述亲水性基团部分连接。

在一些其他实施例，本发明提供了化合物或其药学上可接受的盐，其包括：蛋白质，所述蛋白质经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个亲水性基团部分，其中所述共价连接体直接或间接与各个所述蛋白质、所述有效负载基团部分和所述亲水性基团部分连接。在一些实施方案，所述蛋白质是抗体或其抗原结合片段。

如本发明所示，在一些实施例，所述结合剂直接连接至共价连接体，例如赖氨酸氨基酸。这意味着所述结合剂与所述赖氨酸氨基酸共价连接体相距一个键位置。在所述这些实例的一些中，所述共价连接体还直接连接至有效负载基团部分。这意味着所述共价连接体与有效负载(例如但不限于美登素类化合物(maytansinoid)、MMAE、类固醇、LXR调节剂、或本发明所述的任何有效负载)相距一个键位置。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体还直接连接至所述亲水性基团部分。这意味着所述共价连接体与亲水性残基(例如本发明所述的亲水性残基)相距一个键位置。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体是赖氨酸氨基酸或其衍生物。

在其他实施例，所述结合剂间接连接至共价连接体。这意味着所述结合剂与所述共价连接体相距一个以上的键位置。这也意味着所述结合剂通过另一基团部分与所述共价连接体连接。例如，所述结合剂可连接至马来酰亚胺基团，所述马来酰亚胺基团连接至聚乙二醇基团，所述聚乙二醇基团连接至所述共价连接体。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体还间接连接至有效负载基团部分。这意味着所述共价连接体与有效负载(例如但不限于MMAE、类固醇、LXR调节剂、或本发明所述的任何有效负载)相距一个以上的键位置。这也意味着所述共价连接体通过另一基团部分与所述有效负载连接。例如，所述共价连接体可连接至二肽，例如但不限于Val-Ala或Val-Cit，其可连接至PAB，所述PAB可连接至所述有效负载。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体还间接连接至亲水性基团部分。这意味着所述共价连接体与亲水性残基(例如本发明所述的亲水性残基)相距一个以上的键位置。这也意味着所述共价连接体通过另一基团部分与所述亲水性基团部分连接。例如，所述共价连接体可连接至聚乙二醇基团，所述聚乙二醇基团可连接至活性基团，所述活性基团可连接至所述亲水性残基。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体是赖氨酸氨基酸或其衍生物。

在某些实施例，所述亲水性残基包含末端亲水性基团。在一些实施例，所述亲水性残基包含至少一个牛磺酸基团。在一些实施例，所述亲水性残基包含磺酸基团。在一些案例中，所述亲水性残基包含末端磺酸基团。在进一步的实施例中，所述亲水性残基包含一个以上的磺酸基团。在一些案例中，所述亲水性残基包含一个以上的末端磺酸基团。

本发明描述了式(I)所示化合物：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或衍生物，

其中，在式(I)中，BA是结合剂；L是三价连接体；HL是亲水性残基；PA是有效负载残基；和下标n是从1至30的整数。在一些实施例，可存在一个以上的三价连接体L。在一些实施例，n是从1至4的整数。在一些实施例，n是1。在一些实施例，n是2。在一些实施例，n是3。在一些实施例，n是4。

在其中一个实施例，式(I)所示化合物是式(II)的化合物：

其中，在式(II)中，BA是结合剂；LL是三价连接体；RG¹和RG²均为活性基团残基；SP¹和SP²在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基；HG是亲水性残基；PA是有效负载残基；下标n是从1至30的整数；和下标q是0或1。在一些实施例，可存在一个以上的三价连接体LL。在一些实施例，n是从1至4的整数。在一些实施例，n是1。在一些实施例，n是2。在一些实施例，n是3。在一些实施例，n是4。在一些实施例，HG是末端亲水性基团。在一些实施例，HG包含一个末端磺酸基团(SO₃H)或其盐。在其他实施例，HG包含一个以上的末端磺酸基团或其盐。在一些实施例，HG包含一个末端牛磺酸基团或其盐。在其他实施例，HG包含一个以上的末端牛磺酸基团或其盐。在一些实施例，HG包含一个末端膦酸基团(PO₃H)或其盐。在其他实施例，HG包含一个以上的末端膦酸基团或其盐。在一些实施例，HG包含一个末端胺基团或其盐。在其他实施例，HG包含一个以上的末端胺基团或其盐。在另外的实施例，HG包含一个末端季胺基团或其盐。在另外的实施例，HG包含一个以上的末端季胺基团或其盐。在一些实施例，HG包含一个末端糖基团或其盐。在其他实施例，HG包含一个以上的末端糖基团或其盐。

在一些实施例，式(I)或式(II)所示化合物包含其中下标n为1、2、3或4的化合物的混合物。在一些实施例，式(I)或式(II)所示化合物包含其中下标n为2的化合物的混合物。在一些实施例，式(I)或式(II)所示化合物包含其中下标n为4的化合物的混合物。

在其中一个实施例，式(I)所示化合物具有式(III)所示结构：

其中

环A与所述三唑稠合，和环A选自由环烷基、环烯基、杂环烷基、和杂环烯基组成的组；其中环烷基、环烯基、杂环烷基和杂环烯基均任选地被烷基、-OH、或-NR^aR^b取代，其中R^a和R^b各自为烷基或H。

在另一实施例，式(I)所示化合物具有式(IV)所示结构：

在式(IV)中，BA、RG¹、SP¹、RG²、SP²和HG均具有上述定义，AA¹是包含氨基酸残基的三价连接体，并直接或间接连接至抗体、有效负载和亲水性基团；AA²是二肽残基、三肽残基、或四肽残基；和PAB是

其中所述

表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子；下标p是0或1；和下标q是0或1。在一些实施例，下标p是0和下标q是0。在一些实施例，下标p是1；和下标q是0。在一些实施例，下标p是0；和下标q是1。在一些实施例，下标p是1；和下标q是1。在一些实施例，SP¹包含0-5个聚乙二醇(PEG)残基。在一些实施例，SP²包含0-5个PEG残基。在一些实施例，SP¹在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：C_1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH₂-CH₂-O)_e、-NH-CH₂-CH₂-(-O-CH₂-CH₂)_e-C(O)-、-C(O)-(CH₂)_u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH₂)_v-、聚甘氨酸(例如，((甘氨酸)₄-丝氨酸)_f，其中下标f是从1至6的整数)、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在一些实施例，SP²在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：C_1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH₂-CH₂-O)_e、-NH-CH₂-CH₂-(-O-CH₂-CH₂)_e-C(O)-、-C(O)-(CH₂)_u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH₂)_v-、聚甘氨酸(例如，((甘氨酸)₄-丝氨酸)_f，其中下标f是从1至6的整数)、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在一些实施例，AA¹或AA²中的任一个在每种情况下，分别独立地包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，AA¹是选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，AA¹是具有三个官能团以连接至有效负载、结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)以及包含亲水性基团的连接体的氨基酸，例如赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸、或酪氨酸。在某些实施方案，AA¹是赖氨酸。在某些实施方案，AA¹是赖氨酸或赖氨酸的衍生物。在某些实施方案，AA¹是L-赖氨酸。在某些实施方案，所述AA¹是D-赖氨酸。在某些实施方案，AA¹是谷氨酰胺。在某些实施方案，AA¹是谷氨酸。在某些实施方案，AA¹是天冬氨酸。在某些实施方案，AA²是缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA²是瓜氨酸-缬氨酸。在某些实施方案，所述AA²是缬氨酸-丙氨酸。在某些实施方案，所述AA²是丙氨酸-缬氨酸。在某些实施方案，所述AA²是缬氨酸-甘氨酸。在某些实施方案，所述AA²是甘氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是谷氨酰胺-缬氨酸-丙氨酸。在某些实施方案，((甘氨酸)₄-丝氨酸)_f是(甘氨酸)₄-丝氨酸。

在一些实施例，式(I)或式(II)或式(III)或式(IV)所示化合物具有式(IVa)、式(IVb)或式(IVc)所示结构：

在式(IVa)、(IVb)和(IVc)中，BA、RG¹、SP¹、RG²、SP²、HG和下标p均具有上述定义，AA¹是包含氨基酸残基的三价连接体，并直接或间接连接至抗体、有效负载和亲水性基团；AA²是二肽残基、三肽残基、或四肽残基；和PAB是

其中所述

表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。在一些实施例，SP¹包含0-5个聚乙二醇(PEG)残基。在一些实施例，SP²包含0-5个PEG残基。在一些实施例，SP¹在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：C_1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH₂-CH₂-O)_e、-NH-CH₂-CH₂-(-O-CH₂-CH₂)_e-C(O)-、-C(O)-(CH₂)_u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH₂)_v-、聚甘氨酸(例如，((甘氨酸)₄-丝氨酸)_f，其中下标f是从1至6的整数)、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在一些实施例，SP²在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：C_1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH₂-CH₂-O)_e、-NH-CH₂-CH₂-(-O-CH₂-CH₂)_e-C(O)-、-C(O)-(CH₂)_u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH₂)_v-、聚甘氨酸(例如，((甘氨酸)₄-丝氨酸)_f，其中下标f是从1至6的整数)、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在一些实施例，AA¹或AA²中的任一个在每种情况下，分别独立地包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，AA¹是选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，所述AA¹是赖氨酸。在某些实施方案，AA¹是具有三个官能团以连接至有效负载、结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)以及包含亲水性基团的连接体的氨基酸，例如赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸、或酪氨酸。在某些实施方案，AA¹是赖氨酸或赖氨酸的衍生物。在某些实施方案，AA¹是L-赖氨酸。在某些实施方案，所述AA¹是D-赖氨酸。在某些实施方案，AA¹是谷氨酰胺。在某些实施方案，AA¹是谷氨酸。在某些实施方案，AA¹是天冬氨酸。在某些实施方案，所述AA²是缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA²是瓜氨酸-缬氨酸。在某些实施方案，所述AA²是缬氨酸-丙氨酸。在某些实施方案，所述AA²是丙氨酸-缬氨酸。在某些实施方案，所述AA²是缬氨酸-甘氨酸。在某些实施方案，所述AA²是甘氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是谷氨酰胺-缬氨酸-丙氨酸。在某些实施方案，((甘氨酸)₄-丝氨酸)_f是(甘氨酸)₄-丝氨酸。

在一些实施例，式(I)或式(II)或式(III)或式(IV)所示化合物分别具有式(Va)、(Vb)、(Vc)或(Vd)所示结构：

在式(Va)、(Vb)、(Vc)和(Vd)中，BA、RG¹、SP¹、RG²、SP²和HG均具有上述定义。AA²是二肽残基、三肽残基、或四肽残基；和PAB是

其中所述

表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子；下标p是0或1；和下标e在每种情况下，分别独立地为从0至6的整数，或分别独立地为从0至5的整数。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。在任一这些实施例中，下标e是1、2、3、或4。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。在一些实施例，下标e是5。在一些实施例，下标e是6。在一些实施例，SP¹在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：C_1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH₂-CH₂-O)_e、-NH-CH₂-CH₂-(-O-CH₂-CH₂)_e-C(O)-、-C(O)-(CH₂)_u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH₂)_v-、聚甘氨酸(例如，((甘氨酸)₄-丝氨酸)_f，其中下标f是从1至6的整数)、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在一些实施例，SP²在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：C_1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH₂-CH₂-O)_e、-NH-CH₂-CH₂-(-O-CH₂-CH₂)_e-C(O)-、-C(O)-(CH₂)_u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH₂)_v-、聚甘氨酸(例如，((甘氨酸)₄-丝氨酸)_f，其中下标f是从1至6的整数)、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在一些实施例，任一AA²在每种情况下，分别独立地包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，所述AA²是缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA²是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA²是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA²是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA²是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA²是甘氨酸-缬氨酸。在某些实施方案，((甘氨酸)₄-丝氨酸)_f是(甘氨酸)₄-丝氨酸。

在式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物中，RG¹和RG²在每种情况下，分别独立地为点击化学残基。在一些实施例，RG¹和RG²在每种情况下，分别独立地包含三唑或稠合三唑。在一些实施例，RG¹和RG²在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：

其中所述

表示所述RG¹或RG²通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

在某些实施方案，

是

在某些实施方案，

是

在某些实施方案，

是

在一些实施方案，

是

在某些实施例，RG¹和RG²在每种情况下，分别独立地如表R所示。

表R

其中所述

在一些实施例，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，HG是–(CH₂)_1-5SO₃H、–(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5SO₃H、–(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5SO₃H、–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5SO₃H、–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5SO₃H)₂、–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5SO₃H)₂、或–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5SO₃H)₂，其中n是1、2、3、4、或5，和m是1、2、3、4、或5。在一个实施方案，HG是–(CH₂)_1-5SO₃H。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5SO₃H，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5SO₃H，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5SO₃H，其中m是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5SO₃H)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5SO₃H)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5SO₃H)₂，其中m是1、2、3、4、或5。

在一些实施例，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，HG是–(CH₂)_1-5PO₃H、–(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5PO₃H、–(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5PO₃H、–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5PO₃H、–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5PO₃H)₂、–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5PO₃H)₂、或–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5PO₃H)₂，其中n是1、2、3、4、或5，和m是1、2、3、4、或5。在一个实施方案，HG是–(CH₂)_1-5PO₃H。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5PO₃H，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5PO₃H，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5PO₃H，其中m是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5PO₃H)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5PO₃H)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5PO₃H)₂，其中m是1、2、3、4、或5。

在一些实施例，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，HG是–(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃、–(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃、–(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃、–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃、–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃)₂、–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃)₂、或–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃)₂，其中n是1、2、3、4、或5，m是1、2、3、4、或5，和R^M在每次出现时，分别独立地为H、C_1-6烷基、C_3-7环烷基或C_1-6烷基-C_3-7环烷基，或者，两个R^M同与之连接的氮原子一起形成3-7个原子组成的杂环烷基环。在一个实施方案，HG是–(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃，其中m是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃)₂，其中m是1、2、3、4、或5。

在一些实施例，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，HG是–(CH₂)_1-5N⁺Me₃、–(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5N⁺Me₃、–(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺Me₃、–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺Me₃、–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺Me₃)₂、–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺Me₃)₂、或–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺Me₃)₂，其中n是1、2、3、4、或5，和m是1、2、3、4、或5。在一个实施方案，HG是–(CH₂)_1-5N⁺Me₃。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5N⁺Me₃，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺Me₃，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺Me₃，其中m是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺Me₃)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺Me₃)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺Me₃)₂，其中m是1、2、3、4、或5。

在一些实施例，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，HG是

或其盐，

其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。在一个实施例，HG是

或其盐。在另一实施例，HG是

或其盐。在一个实施例，HG是

或其盐。在另一实施例，HG是

或其盐。

在一些实施例，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，HG是胺、或其盐，例如，季胺，如

其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

在其他实施例，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，HG是膦酸、或其盐，例如

其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。在其他实施例，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，HG是膦酸、或其盐，例如

其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

在又一其他实施方案，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，HG是糖残基，例如

(半乳糖)、

(葡糖胺)、或

(麦芽糖)，其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

在一些案例中，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，SP¹和SP²在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地选自由以下组成的组：C_1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH₂-CH₂-O)_e、-NH-CH₂-CH₂-(-O-CH₂-CH₂)_e-C(O)-、-C(O)-(CH₂)_u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH₂)_v-、聚甘氨酸(例如，((甘氨酸)₄-丝氨酸)_f，其中下标f是从1至6的整数)、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在一些实施例，SP¹和SP²在每种情况下，分别独立地如表S所示。

表S

表R的行和表S的行的任何组合可存在于本发明所述的式(I)所示化合物中。

在一些实施例，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，

是选自由以下组成的组：

或其立体异构体形式、或其区域异构体、或其区域异构体的混合物，其中

各

分别为与所述结合剂连接的键；和

各

分别为与所述有效负载残基连接的键。

是选自由以下组成的组：

各

分别为与所述结合剂连接的键；和

各

分别为与所述有效负载残基连接的键。

在一些实施例，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，在结构式

或其立体异构体形式、或其区域异构体、或其区域异构体的混合物中，RG¹是

HG是

HG是

各

分别为与所述结合剂连接的键；

各

分别为与所述有效负载残基连接的键；和

各

分别表示所述基团通过其与所述分子其余部分连接的原子。

在一些实施例，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，LL具有式(LL1)所示结构：

其中R^AA1、R^AA2和R^AA3各自独立地为氨基酸侧链，其中至少一个直接或间接与–(RG²)_q-SP²-HG连接。

在一些案例中，对于式LL1，R^AA1是直接或间接与HG连接的赖氨酸侧链、谷氨酰胺侧链、谷氨酸侧链、或天冬氨酸侧链，和R^AA2与R^AA3分别是缬氨酸和丙氨酸侧链或分别是缬氨酸和瓜氨酸侧链。

在一些案例中，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，AA²是

其中R^AA2、R^AA3、R^AA4和R^AA5各自独立地为氨基酸侧链，其中至少一个直接或间接与–(RG²)_q-SP²-HG连接，其中所述

表示AA²通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。在一些实施例，R^AA2、R^AA3、R^AA4和R^AA5在每种情况下，分别独立地为氨基酸侧链，所述氨基酸侧链是选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，或其衍生物，或其组合的侧链。

其中所述

表示AA²通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

在一个实施例，AA²是

在另一实施例，AA²是

在一些案例中，对于式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，下标e是4。在一些案例中，对于式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，下标e是5。

在一些实施方案，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，所述结合剂(BA)是抗体或其抗原结合片段。在一些实施例，所述抗体或其抗原结合片段结合肿瘤表达的抗原。在一些实施例，所述抗体或其抗原结合片段结合巨噬细胞表达的抗原。在一些实施例，所述结合剂(BA)是抗体或其抗原结合片段，其对选自由以下组成的组的抗原具有选择性：AXL，BAFFR，BCMA，BCR–列表组分(BCR–list components)，BDCA2，BDCA4，BTLA，BTNL2，BTNL3，BTNL8，BTNL9，C10orf54，CCR1，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CCR10，CD11c，CD137，CD138，CD14，CD168，CD177，CD19，CD20，CD209，CD209L，CD22，CD226，CD248，CD25，CD27，CD274，CD276，CD28，CD30，CD300A，CD33，CD37，CD38，CD4，CD40，CD44，CD45，CD46，CD48，CD5，CD52，CD55，CD56，CD59，CD62E，CD68，CD69，CD70，CD74，CD79a，CD79b，CD8，CD80，CD86，CD90.2，CD96，CLEC12A，CLEC12B，CLEC7A，CLEC9A，CR1，CR3，CRTAM，CSF1R，CTLA4，CXCR1/2，CXCR4，CXCR5，DDR1，DDR2，DEC-205，DLL4，DR6，FAP，FCamR，FCMR，FcR's，Fire，GITR，HHLA2，HLA II类，HVEM，ICOSLG，IFNLR1，IL10R1，IL10R2，IL12R，IL13RA1，IL13RA2，IL15R，IL17RA，IL17RB，IL17RC，IL17RE，IL20R1，IL20R2，IL21R，IL22R1，IL22RA，IL23R，IL27R，IL29R，IL2Rg，IL31R，IL36R，IL3RA，IL4R，IL6R，IL5R，IL7R，IL9R，整合素(Integrins)，LAG3，LIFR，MAG/Siglec-4(唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-4)，MMR，MSR1，NCR3LG1，NKG2D，NKp30，NKp46，PDCD1，PROKR1，PVR，PVRIG，PVRL2，PVRL3，RELT，SIGIRR，Siglec-1(唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-1)，Siglec-10，Siglec-5，Siglec-6，Siglec-7，Siglec-8，Siglec-9，SIRPA，SLAMF7，TACI，TCR–列表组分/assoc(TCR-list components/assoc)，PTCRA，TCRb，CD3z，CD3，TEK，TGFBR1，TGFBR2，TGFBR3，TIGIT，TLR2，TLR4，TROY，TSLPR，TYRO，VLDLR，VSIG4，和VTCN1。

在一些实施例，对于式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示的任何化合物，PA是选自由以下组成的组的基团的残基：海兔毒素(dolastatin)，奥瑞他汀(auristatin)，美登素类化合物(maytansinoid)，植物生物碱类化合物(plant alkaloid)，紫杉烷类(taxane)，长春花生物碱类化合物(vinca alkaloid)，类固醇(steroid)，和肝X受体(LXR)调节剂。在一些案例中，PA是海兔毒素(dolastatin)。在一些案例中，PA是奥瑞他汀(auristatin)。在一些案例中，PA是美登素类化合物(maytansinoid)。在一些案例中，PA是植物生物碱类化合物(plant alkaloid)。在一些案例中，PA是紫杉烷类(taxane)。在一些案例中，PA是长春花生物碱类化合物(vincaalkaloid)。在一些案例中，PA是类固醇(steroid)。在一些案例中，PA是LXR调节剂。在一些案例中，LXR调节剂是LXR激动剂。在一些实施方案，LXR调节剂是LXR拮抗剂。在一些实施例，PA是图1中所示的任何化合物。在一些案例中，PA是类固醇，例如糖皮质激素。其他合适的有效负载包括高度疏水的那些，例如由于其亲水性质而不适合于Ab偶联条件的那些，例如，诸如吡咯并苯并二氮杂卓类(PBD)、SN38(7-乙基-10-羟基-喜树碱)的有效负载，等等。在某些实施方案，本发明提供了具有本发明任一通式所示的抗体-药物偶联物，其中PA是疏水性有效负载基团部分。

在一些实施方案，式(I)中的有效负载是海兔毒素(dolastatin)或其合成类似物。在某些实施方案，式(I)所示化合物中的有效负载是具有单甲基奥瑞他汀D(MMAD)、MMAE单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、或单甲基奥瑞他汀F(MMAF)、或其立体异构体的结构的奥瑞他汀类(auristatins)。

在某些方面，本发明所述的式(I)的化合物是蛋白质-药物偶联物，例如抗体-药物偶联物，其包含抗原结合蛋白(例如抗体)、奥瑞他汀(auristatin)有效负载和亲水性基团部分。

在某些实施方案，式(I)所示化合物中的有效负载是美登素类化合物(maytansinoid)。美登素类化合物有效负载披露在于2016年3月25日提交的、发明名称为“MAYTANSINOID DERIVATIVES,CONJUGATES THEREOF,AND METHODS OF USE”的美国非临时申请号15/081,759中，其公开为美国专利公开号2016/0375147，并且披露在于2017年1月24日提交的、发明名称为“MAYTANSINOID DERIVATIVES,CONJUGATES THEREOF,AND METHODSOF USE”的美国非临时申请号15/414,537中，其公告为美国专利号9,950,076，两者均通过引用并入本发明。在某些实施方案，PA是DM1、DM3、或DM4。在某些实施方案，PA是

在某些实施方案，PA是

其中A是任选取代的亚芳基或亚杂芳基。在某些实施方案，PA是

在特定实施方案，波浪线表示与LL连接的键。

在某些方面，本发明所述的式(I)的化合物是蛋白质-药物偶联物，例如抗体-药物偶联物，其包含抗原结合蛋白(例如抗体)、美登素类化合物(maytansinoid)有效负载、和亲水性基团部分。

在某些实施方案，式(I)所示化合物中的有效负载是式(A)所示的糖皮质激素类：

其中

R¹和R²分别独立地为–H、烷基、烷基-C(O)-O–、–OH、或卤素；或者R¹和

R²一起形成

其中R⁴是烷基、芳基、芳基烷基、或含N的杂环烷基，

其中所述烷基、芳基、芳基烷基和含N的杂环烷基在每种情况下，分别独立任选地被-NR^AaR^Ab取代；

R³是–OH、R^Z-C(O)-X–、杂烷基、哌啶基、–NR^AaR^Ab、-氧基芳基–NR^AaR^Ab或-Z-A'(R^P)_t；

R^Z是烷基；

X是O或NR^Aa；

Z是S、S(O)、S(O)₂、SO₂NR^Aa、O、C(O)NR^Aa、C(O)、或NR^Aa；

A'是芳基、芳基烷基、或杂芳基；

R^P在每种情况下，分别独立地为卤素、任选取代的烷基、–OH、或-NR^AaR^Ab；

R^Aa和R^Ab在每种情况下，分别独立地为–H、任选取代的烷基、或任选取代的芳基；

下标a是从0至19的整数；和

t是从1至3的整数；

条件是：

(1)(a)当R¹是–OH时，或(b)当R¹和R²一起形成

其中R⁴是C_1-9烷基或

时，R³不为–OH，和

(2)R³不为

和

R^5A和R^5B各自独立地为卤素或氢原子。

在此类实施方案的一些中，R³是NH₂。在此类实施方案的一些中，R³是

其中

表示R³通过其与式(I)中相邻基团连接的原子。

在某些实施方案，PA选自

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在根据任一式1110-1140的某些实施方案中，R³是-O-芳基、-NR^AaR^Ab、-亚烷基-NR^AaR^Ab、-X-亚芳基-Y-NR^AaR^Ab、-X-亚杂芳基-Y-NR^AaR^Ab、或含N的杂环烷基；其中X不存在，或X是-N-、-CH₂-、或-O-；其中Y不存在，或Y是-CH₂-；和R⁴是烷基、芳基、烷基芳基、或芳基烷基。在某些实施方案，R³是-O-亚芳基-NR^AaR^Ab、-O-亚杂芳基-NR^AaR^Ab；其中芳基或杂芳基任选地被卤素、氘、羟基、或甲氧基取代。在某些实施方案，R³是-O-苯基-NR^AaR^Ab、-O-亚杂芳基-NR^AaR^Ab；其中苯基或杂芳基任选地被卤素或氘取代。在某些实施方案，R⁴是正丙基。在某些实施方案，R^Aa和R^Ab各自独立地为氢或烷基。在特定实施方案，R^Aa和R^Ab中的任一个任选地被与LL连接的键取代。

在某些实施方案，PA是

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在某些实施方案，PA是

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体。在此类实施方案中，波浪线表示与LL连接的键。

在一些实施方案，PA是选自由以下组成的组：

或其药学上可接受的立体异构体，其中所述PA作为残基通过所述R³基团进行连接，例如，所述偶联物包含通过连接至所述有效负载的伯胺或仲胺的残基的键与连接体进行连接的上述有效负载。

在某些方面，本发明所述的式(I)的化合物是蛋白质-药物偶联物，例如抗体-药物偶联物，其包含抗原结合蛋白(例如抗体)、式(A)的有效负载、和亲水性基团部分。

类固醇有效负载公开在于2018年1月8日提交的、发明名称为“STEROIDS ANDANTIBODY CONJUGATES THEREOF”的美国临时申请号62/614,905，以及公开在于2017年11月7日提交的、发明名称为“STEROIDS AND PROTEIN-CONJUGATES THEREOF”的美国非临时申请号15/806,197中，两者均通过引用并入本发明。

在某些实施方案，式(I)所示化合物中的有效负载是LXR调节剂，其具有式(B)所示结构：

或其药学上可接受的立体异构体形式，其中，

W是–CH₂–、–N(H)–、或–O–；

R^B1是–H、–OH、–NH₂、烷基、或–OP(O)(OR⁶)(OH)–OP(O)(OR⁶)₂；

R^B2是–H、–OH、–CH₂NH₂、R^B3、R^B4、R^B5、或–O–R^B5，其中R^B1和R^B2不同时为–H；

R^B3是–N(R⁶)₂；

R^B4是–X–Y–Z；

X是选自由–O–和–N(H)–组成的组；

Y是选自由亚烷基、取代的亚烷基(包括但不限于氧代取代(即＝O))、亚杂烷基、和取代的亚杂烷基(包括但不限于氧代取代(即＝O))组成的组；

Z是选自由–OH和–NH₂组成的组；

R^B5是烷基、杂环烷基、或取代的杂环烷基，其中各杂环烷基或取代的杂环烷基包含选自N和O的1、2或3个杂原子，并包括至少一个–OH和–CH₂OH取代基、或至少一个伯氮或仲氮，例如O-葡萄糖；

各R⁶，在每种情况下，分别独立地为–H、氨基酸残基、N-烷基氨基酸残基、肽、或烷基；和

各R⁷分别独立地为卤素、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、–CN、O-葡萄糖、O-氨基酸残基、和O-PEG_b，其中各下标b分别为从0至3的整数。

在特定实施方案，R^B1或R^B2被与LL连接的键取代。在某些实施方案，PA选自：

在特定实施方案，波浪线表示与LL连接的键。

在某些实施方案，PA是选自由以下组成的组：

或其药学上可接受的立体异构体形式，其中PA作为残基通过R^B1或R^B2基团进行连接，例如，所述偶联物包含通过连接至所述有效负载的伯胺或仲胺的残基的键与连接体进行连接的上述有效负载。

在某些方面，本发明所述的式(I)的化合物是蛋白质-药物偶联物，例如抗体-药物偶联物，其包含抗原结合蛋白(例如抗体)、式(B)的有效负载、和亲水性基团部分。

LXR调节剂有效负载公开于2017年5月18日提交的、发明名称为“BIS-OCTAHYDROPHENANTHRENE CARBOXAMIDES AND PROTEIN CONJUGATES THEREOF”的美国临时申请号62/508,327中，其通过引用并入本发明。

在本发明所示的实施方案的范围内还考虑了于2015年9月14日提交的、发明名称为“BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES,CONJUGATES THEREOF,AND THERAPEUTIC USES”的美国非临时申请14/776,668，其公开为美国专利申请公开号2016/0030591，以及于2016年2月23日提交的、发明名称为“PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING MACROLIDEDIASTEREOMERS,METHODS OF THEIR SYNTHESIS AND THERAPEUTIC USES”的美国非临时申请号14/913,965，其公开为美国专利申请公开号2016/0354482中公开的有效负载，上述披露的有效负载通过引用并入本发明。

在一些实施例，式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物是抗体药物偶联物(ADC)，其中BA是Ab，和Ab是抗体或其抗原结合片段。在一些实施例，式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物是选自由以下组成的组的偶联物：

或其立体异构体形式、或其区域异构体、或其区域异构体的混合物，其中，

各Ab分别是抗体、或其抗原结合片段；

PA是有效负载残基；和

下标n是从1至30的整数。

在一些实施例，式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物是抗体药物偶联物(ADC)，其中BA是Ab，和Ab是抗体或其抗原结合片段，所述抗体药物偶联物选自由以下组成的组：

或其立体异构体形式、或其区域异构体、或其区域异构体的混合物，其中各Ab分别为抗体、或其抗原结合片段，和下标n是从1至30的整数。在一些实施方案，n是从1至4的整数。在一些实施方案，n是2。在一些实施方案，n是4。

在一些实施例，BA是式(Ab-1)所示的经修饰的抗体：

其中所述

表示Ab-1通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

在一些实施例，式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物是抗体药物偶联物(ADC)，其中BA是具有本发明所述定义的Ab-1，其中Ab是抗体或其抗原结合片段，所述抗体药物偶联物选自由以下组成的组：

本发明提供了包含式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物、或其药学上可接受的盐的药物组合物，以及药学上可接受的辅料。

本发明还提供了治疗有需要的患者的疾病或病症的方法，其包含向所述患者施用式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)中任一所示的化合物、或包含式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物的组合物。

另一方面，本发明提供了化合物，所述化合物包含活性连接体，所述活性连接体经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个亲水性残基，其中所述共价连接体直接或间接与各个所述活性连接体、所述有效负载基团部分和所述亲水性残基连接。

另一方面，本发明提供了式(VI)所示化合物：

其中：

RG'是活性基团；

L是三价连接体；

HL是亲水性残基；和

PA是有效负载残基。

在一个实施例，式(VI)所示化合物具有式(VII)所示结构：

其中：

LL是三价连接体；

RG'是活性基团；

RG²是活性基团残基；

SP¹和SP²在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地为间隔基团残基；

HG是亲水性残基；

PA是有效负载残基；和

下标q是0或1。

在一个实施例，式(VII)所示化合物具有式(VIII)所示结构：

其中

在另一实施例，式(VII)所示化合物具有式(IX)所示结构：

其中：

AA¹是包含氨基酸残基的三价连接体；

AA²是二肽残基、三肽残基、或四肽残基；和

PAB是

其中所述

表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子；

下标p是0或1；和

下标q是0或1。

在某些实施例，式(IX)所示化合物是具有式(IXa)、式(IXb)或式(IXc)所示结构的式(IX)的化合物：

AA¹是包含氨基酸残基的三价连接体，并直接或间接连接至抗体、有效负载和亲水性基团。在一些实施例，AA¹或AA²中的任一个在每种情况下，分别独立地包含选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，AA¹是选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的氨基酸。在某些实施方案，AA¹是具有三个官能团以连接至有效负载、结合剂(例如，抗体或其抗原结合片段)以及包含亲水性基团的连接体的氨基酸，例如赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸、或酪氨酸。在某些实施方案，AA¹是赖氨酸。在某些实施方案，AA¹是谷氨酰胺。在某些实施方案，AA¹是赖氨酸或赖氨酸的衍生物。在某些实施方案，AA¹是L-赖氨酸。在某些实施方案，AA¹是D-赖氨酸。在某些实施方案，AA¹是谷氨酸。在某些实施方案，AA¹是天冬氨酸。在某些实施方案，所述AA²是缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA²是瓜氨酸-缬氨酸。在某些实施方案，所述AA²是缬氨酸-丙氨酸。在某些实施方案，所述AA²是丙氨酸-缬氨酸。在某些实施方案，所述AA²是缬氨酸-甘氨酸。在某些实施方案，所述AA²是甘氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是谷氨酰胺-缬氨酸-丙氨酸。

在某些实施例，式(IXa)、式(IXb)或式(IXc)所示化合物具有式(Xa)、(Xb)、(Xc)或(Xd)所示结构：

其中：

下标e在每种情况下，分别独立地为从0至6的整数、或分别独立地为从0至5的整数。在一些实施例，下标p是0。在一些实施例，下标p是1。在任一这些实施例中，下标e是1、2、3、或4。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。在一些实施例，下标e是5。在一些实施例，下标e是6。在某些实施方案，所述AA²是缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA²是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA²是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA²是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA²是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA²是甘氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在某些实施方案，所述赖氨酸是L-赖氨酸。在某些实施方案，所述赖氨酸是D-赖氨酸。

在某些实施方案，RG'在每种情况下，分别独立地为点击化学残基。在一些实施例，RG'在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：

其中所述

表示所述RG'通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。在一个案例中，RG'是

在另一案例中，RG'是

在一些实施例，RG'是

在一些实施例，RG'是

在一些实施例，RG'是

在一些实施例，RG'是

在一些实施例，RG'是

在一些实施例，RG'是

在一些实施例，RG'是

在一些实施例，RG'是

在一些实施例，RG²在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：

其中所述

表示所述RG²通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

在某些实施方案，

是

在某些实施方案，

是

在某些实施方案，

是

在某些实施方案，

是

在某些实施例，RG'和RG²在每种情况下，分别独立地如表R'所示。

表R'

其中所述

表示所述RG'或RG²通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

表R'的行和本发明所述的间隔基团SP²的任何组合可存在于本发明所述的式(VI)所示化合物中。

在某些实施例，对于式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，HG是

其中

所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

在一些实施例，对于式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，HG是–(CH₂)_1-5SO₃H、–(CH₂)_n”–NH-(CH₂)_1-5SO₃H、–(CH₂)_n”–C(O)NH-(CH₂)_1-5SO₃H、–(CH₂CH₂O)_m”–C(O)NH-(CH₂)_1-5SO₃H、–(CH₂)_n”–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5SO₃H)₂、–(CH₂)_n”–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5SO₃H)₂、或–(CH₂CH₂O)_m”–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5SO₃H)₂，其中下标n”是1、2、3、4、或5，和下标m”是1、2、3、4、或5。在一个实施方案，HG是–(CH₂)_1-5SO₃H。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n”–NH-(CH₂)_1-5SO₃H，其中下标n”是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n”–C(O)NH-(CH₂)_1- ₅SO₃H，其中下标n”是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m”–C(O)NH-(CH₂)_1- ₅SO₃H，其中下标m”是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n”–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5SO₃H)₂，其中下标n”是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n”–C(O)N((CH₂)_1- ₅C(O)NH(CH₂)_1-5SO₃H)₂，其中下标n”是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m”–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5SO₃H)₂，其中下标m”是1、2、3、4、或5。

在一些实施例，对于式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，HG是–(CH₂)_1-5PO₃H、–(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5PO₃H、–(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5PO₃H、–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5PO₃H、–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5PO₃H)₂、–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5PO₃H)₂、或–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5PO₃H)₂，其中n是1、2、3、4、或5，和m是1、2、3、4、或5。在一个实施方案，HG是–(CH₂)_1-5PO₃H。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5PO₃H，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5PO₃H，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5PO₃H，其中m是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5PO₃H)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5PO₃H)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5PO₃H)₂，其中m是1、2、3、4、或5。

在一些实施例，对于式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，HG是–(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃、–(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃、–(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃、–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃、–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃)₂、–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃)₂、或–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃)₂，其中n是1、2、3、4、或5，m是1、2、3、4、或5，和R^M在每次出现时，分别独立地为H、C_1-6烷基、C_3-7环烷基或C_1-6烷基-C_3-7环烷基，或者，两个R^M同与之连接的氮原子一起形成3-7个原子组成的杂环烷基环。在一个实施方案，HG是–(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃，其中m是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺(R^M)₃)₂，其中m是1、2、3、4、或5。

在一些实施例，对于式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，HG是–(CH₂)_1-5N⁺Me₃、–(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5N⁺Me₃、–(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺Me₃、–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺Me₃、–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺Me₃)₂、–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺Me₃)₂、或–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺Me₃)₂，其中n是1、2、3、4、或5，和m是1、2、3、4、或5。在一个实施方案，HG是–(CH₂)_1-5N⁺Me₃。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–NH-(CH₂)_1-5N⁺Me₃，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是-(CH₂)_n–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺Me₃，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)NH-(CH₂)_1-5N⁺Me₃，其中m是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺Me₃)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂)_n–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺Me₃)₂，其中n是1、2、3、4、或5。在另一实施方案，HG是–(CH₂CH₂O)_m–C(O)N((CH₂)_1-5C(O)NH(CH₂)_1-5N⁺Me₃)₂，其中m是1、2、3、4、或5。

或其盐。在某些实施例，对于式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，HG是

或其盐。在一个实施例，HG是

或其盐。在另一实施例，HG是

或其盐。

在一些实施例，对于式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，HG是胺、或其盐，例如季胺，如

其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

其中所述

其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

在又一其他实施例，对于式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，HG是糖残基，例如

(半乳糖)、

(葡糖胺)、或

(麦芽糖)，其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

在某些实施例，对于式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，SP¹和SP²在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地选自由以下组成的组：C_1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH₂-CH₂-O)_e、-NH-CH₂-CH₂-(-O-CH₂-CH₂)_e-C(O)-、-C(O)-(CH₂)_u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH₂)_v-、聚甘氨酸(例如，((甘氨酸)₄-丝氨酸)_f，其中下标f是从1至6的整数)、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。在某些实施例，对于式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，SP¹和SP²在每种情况下，分别独立地如表S所示。在某些实施方案，((甘氨酸)₄-丝氨酸)_f是(甘氨酸)₄-丝氨酸。

在一些实施例，对于式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，

是选自由以下组成的组：

各

分别为与所述有效负载残基连接的键。

是选自由以下组成的组：

各

分别为与所述有效负载残基连接的键。

在一些实施例，对于式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，LL具有式(LL1)所示结构：

其中R^AA1、R^AA2和R^AA3各自独立地为氨基酸侧链，其中至少一个直接或间接与–(RG²)_q-SP²-HG连接。在一些案例中，R^AA1是直接或间接与HG连接的赖氨酸侧链、谷氨酰胺侧链、谷氨酸侧链、或天冬氨酸侧链，和R^AA2与R^AA3分别是缬氨酸和丙氨酸侧链或分别是缬氨酸和瓜氨酸侧链。

在一些实施例，对于式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，AA²是

表示AA²通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。在一些实施例，R^AA2、R^AA3、R^AA4和R^AA5在每种情况下，分别独立地为氨基酸侧链，所述氨基酸侧链是选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸，其衍生物，或其组合的侧链。

其中所述

表示AA²通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

在一些实施例，对于式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，下标e是4。在一些实施例，对于式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，下标e是5。

在一些实施例，对于式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，PA是选自由以下组成的组的基团的残基：海兔毒素(dolastatin)，奥瑞他汀(auristatin)，美登素类化合物(maytansinoid)，植物生物碱类化合物(plant alkaloid)，紫杉烷类(taxane)，长春花生物碱类化合物(vinca alkaloid)，类固醇(steroid)，和肝X受体(LXR)调节剂。在一些案例中，PA是海兔毒素(dolastatin)。在一些案例中，PA是奥瑞他汀(auristatin)。在一些案例中，PA是美登素类化合物(maytansinoid)。在一些案例中，PA是植物生物碱类化合物(plant alkaloid)。在一些案例中，PA是紫杉烷类(taxane)。在一些案例中，PA是长春花生物碱类化合物(vincaalkaloid)。在一些案例中，PA是类固醇(steroid)。在一些案例中，PA是LXR调节剂。在一些案例中，LXR调节剂是LXR激动剂。在一些案例中，LXR调节剂是LXR拮抗剂。

在某些实施例，对于式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，其是选自由以下组成的组：

或其立体异构体形式、或其区域异构体、或其区域异构体的混合物，其中PA是有效负载残基。

在一些实施例，对于式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示的任何化合物，其是选自由以下组成的组：

或其立体异构体形式、或其区域异构体、或其区域异构体的混合物。

本发明还提供了制备式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物的方法，其包含以下步骤：在适于在结合剂(BA)和化合物之间形成键的条件下，使所述结合剂(BA)与式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示化合物接触。在一个实施例，所述结合剂是包含叠氮基团

的经修饰的结合剂，其中所述

表示所述叠氮基团通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

本发明提供了连接体-有效负载，所述连接体-有效负载包含与连接体连接的式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)任一所示化合物。

本发明提供了连接体-有效负载，所述连接体-有效负载包含与所述有效负载的氧原子或伯氮原子或仲氮原子连接的式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)任一所示化合物。

本发明还提供了抗体-药物-偶联物，所述抗体-药物-偶联物包含与抗体或其抗原结合片段连接的上述化合物或连接体-有效负载。

一方面，本发明提供了治疗受试者增殖性疾病、代谢性疾病、炎症或神经退行性疾病的方法，其包含向所述受试者施用有效治疗量的式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物、或包含式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物的药物组合物。

一方面，本发明提供了治疗受试者的疾病、病症或病况的方法，其包含向所述受试者施用有效治疗量的式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物、或包含式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物的药物组合物。

一方面，本发明提供了治疗受试者增殖性疾病的方法，其包含向所述受试者施用有效治疗量的式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物、或包含式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物的药物组合物。

一方面，本发明提供了治疗受试者代谢性疾病的方法，其包含向所述受试者施用有效治疗量的式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物、或包含式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物的药物组合物。

一方面，本发明提供了治疗受试者炎症的方法，其包含向所述受试者施用有效治疗量的式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物、或包含式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物的药物组合物。

一方面，本发明提供了治疗受试者神经退行性疾病的方法，其包含向所述受试者施用有效治疗量的式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物、或包含式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物的药物组合物。

在一些实施例，本发明提供了包含本发明所述化合物(包括任一前述化合物)、或其药学上可接受的盐的药物组合物，以及药学上可接受的辅料。

本领域技术人员将认识到，氨基酸残基可以是非手性或手性的，例如，L-氨基酸或D-氨基酸。氨基酸通常包括氨基酸侧链。所述侧链可以是技术人员已知的任何氨基酸的侧链。在某些实施方案，所述侧链是组氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、精氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、硒代半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸、高甘氨酸(例如β-高甘氨酸)、或酪氨酸的侧链。本领域技术人员将认识到，所述肽可以是非手性或手性的，例如，包括外消旋的DL-氨基酸、或非外消旋的D-或L-氨基酸、及其非对映异构体混合物。所述肽的侧链如上述氨基酸的上下文中所述。本领域技术人员将认识到，N-烷基氨基酸残基在氨基酸的末端氨基基团或肽的末端氨基基团处包含如本发明所定义的烷基取代基。

在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是从1至30的整数。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是1。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是2。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是3。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是4。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是5。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是6。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是7。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是8。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是9。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是10。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是11。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是12。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是13。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是14。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是15。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是16。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是17。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是18。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是19。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是20。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是21。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是22。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是23。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是24。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是25。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是26。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是27。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是28。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是29。在一些实施例，包括前述任一实施例，下标n是30。

结合剂(BA)

可用于本发明提供的任何偶联物的合适的结合剂包括但不限于抗体类、淋巴因子类、激素类、生长因子类、病毒受体类、白介素类、或任何其他细胞结合分子类或物质类或肽结合分子类或物质类。合适的结合剂还包括多肽类。

在一些实施例，包括前述任一实施例，所述结合剂(BA)选自任何多肽。多肽的实例包括但不限于，天然多肽类和非天然多肽类。多肽的实例包括但不限于，由经遗传修饰的生物体产生的那些。

在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA选自受体类、细胞因子类、蛋白质类、酶类、结合剂类、乳肽类、核糖体肽类、非核糖体肽类、蛋白胨类、和肽片段类。在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA选自抗菌肽类、速激肽类、血管活性肠肽类、胰多肽相关肽类、阿片肽类、和降钙素肽类。在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA选自B型利钠肽(BNP)、乳三肽类、神经肽类、脂肽类、朊间质类、或激素类。

在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA选自包含连接在一起的两个或两个以上氨基酸的短氨基酸链。在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA选自分别具有连接在一起的2、3或4个氨基酸的二肽类(Val-Cit)、三肽类、和四肽类(例如Val-Gly-Ser-Ala)。在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA选自二肽类、三肽类、四肽类、五肽类、六肽类、七肽类、八肽类、九肽类、十肽类、十一肽类、和二十肽类。

在一些实施例，包括前述任一实施例，所述BA选自任何蛋白质类。在一些实施例，所述蛋白质仅包括天然氨基酸类。在一些实施例，所述蛋白质还包括非天然氨基酸类。在一些实施方案，所述结合剂是抗体或其抗原结合片段。所述抗体可以是本领域技术人员已知的任何形式。本发明使用的术语“抗体”是指包含至少一个互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物，所述互补决定区(CDR)与特定抗原特异性结合或相互作用。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包含四条多肽链，通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链，以及其多聚体(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(本发明缩写为HCVR或V_H)和重链恒定区。所述重链恒定区包含三个结构域，C_H1、C_H2和C_H3。每条轻链包含轻链可变区(本发明中缩写为LCVR或V_L)和轻链恒定区。所述轻链恒定区包含一个结构域(C_L1)。所述V_H和V_L区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。在本发明的不同实施方案中，适用于本发明化合物的所述抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是天然、或人工修饰的。可基于两个或更多个CDR的并列分析来定义氨基酸共有序列。本发明使用的术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。本发明使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括任何天然存在的、可酶促得到的、合成的、或基因工程化的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术，例如涉及操纵和表达编码抗体可变结构域和任选恒定结构域的DNA的蛋白水解消化或重组基因工程技术，由完整抗体分子衍生得到。此种DNA是已知的和/或容易从例如商业来源，DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)得到，或可以合成得到。可对DNA进行测序和化学操作或通过使用分子生物学技术进行操作，例如，将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或删除氨基酸等。抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体或受约束的FR3-CDR3-FR4肽的高变区的氨基酸残基(例如，分离的互补决定区(CDR)，例如CDR3肽)组成的最小识别单元。其他工程化分子，如结构域特异性抗体类，单结构域抗体类，结构域缺失抗体类，嵌合抗体类，CDR嫁接抗体类，双抗体类，三抗体类，四抗体类，微抗体类，纳米抗体类(例如一价纳米抗体类，二价纳米抗体类等)，小型模块化免疫药物类(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域类，也均包含在本发明所使用的表述“抗原结合片段”内。抗体的抗原结合片段通常包含至少一个可变结构域。所述可变结构域可具有任何大小或氨基酸组成，并且通常包含至少一个CDR，所述至少一个CDR与一个或多个框架序列相邻或在框内。在具有与V_L结构域相关的V_H结构域的抗原结合片段中，所述V_H和V_L结构域可以任何合适的排列相对于彼此进行定位。譬如，所述可变区可以是二聚的并含有V_H-V_H、V_H-V_L或V_L-V_L二聚体。或者，所述抗体的抗原结合片段可包含单体V_H或V_L结构域。在某些实施方案，抗体的抗原结合片段可包含至少一个可变结构域，所述可变结构域与至少一个恒定结构域共价连接。可在本发明公开的抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)V_H-C_H1；(ii)V_H-C_H2；(iii)V_H-C_H3；(iv)V_H-C_H1-C_H2；(v)V_H-C_H1-C_H2-C_H3；(vi)V_H-C_H2-C_H3；(vii)V_H-C_L；(viii)V_L-C_H1；(ix)V_L-C_H2；(x)V_L-C_H3；(xi)V_L-C_H1-C_H2；(xii)V_L-C_H1-C_H2-C_H3；(xiii)V_L-C_H2-C_H3；和(xiv)V_L-C_L。在可变结构域和恒定结构域的任何构型中，包括上文列出的任何示例性构型，所述可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可以通过完整或部分铰链或连接体区域进行连接。铰链区可由至少2个(例如，5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸导致单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。与完整的抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合单独的抗原或结合同一抗原上的不同表位。任何多特异性抗体形式，包括本发明公开的示例性双特异性抗体形式，可使用本领域可用的常规技术，适用于本发明抗体的抗原结合片段。在本发明所述的某些实施方案中，本发明所述抗体是人抗体。本发明使用的术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。然而，本发明使用的术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植到人框架序列上的抗体。术语“人抗体”不包括在天然存在的、未经修饰的生物体中通常不经修饰或人为干预/操作而存在的天然存在的分子。在一些实施方案，本发明所述抗体可以是重组人抗体。本发明使用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)；从重组、组合人抗体文库分离的抗体(下文进一步描述)；从动物(例如小鼠)分离的抗体，所述动物是人免疫球蛋白基因的转基因动物(参见例如，Taylor etal.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)；或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案，对此种重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用转基因人Ig序列的动物时，进行体内体细胞诱变)，并因此重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列是衍生自人种系V_H和V_L序列并与之相关的序列，其在体内可不天然存在于人抗体种系库中。人抗体可以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键连接在一起。在第二种形式中，所述二聚体不通过链间二硫键连接，并且形成约75-80kDa的分子，其由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成。即使在亲和纯化后，这些形式也极难分离。在各种完整IgG同种型中出现第二种形式的频率是由于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸置换可以显著地将第二种形式(Angal et al.(1993)Molecular Immunology 30:105)的出现降低至通常使用人IgG1铰链观察到的水平。本发明公开内容包括在铰链、C_H2或C_H3区域中具有一个或多个突变的抗体，所述突变可能是例如在生成中所需的，以提高所需抗体形式的产量。本发明所述抗体可以是分离的抗体。本发明使用的“分离的抗体”是指已经从其天然环境的至少一种组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，为了本发明的目的，已从生物体的至少一种组分或从其中天然存在或天然产生的抗体的组织或细胞中分离或除去的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经过至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。与衍生抗体的相应种系序列相比，本发明使用的抗体可在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失。通过将本发明公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定此类突变。本发明包括抗体及其抗原结合片段，其衍生自本发明公开的任何氨基酸序列，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生抗体的种系序列的相应残基，或突变为另一个人种系序列的相应残基，或突变为相应种系残基的保守氨基酸置换(此类序列变化在本发明中统称为“种系突变”)。本领域普通技术人员从本发明公开的重链和轻链可变区序列开始，可容易地生成许多抗体和抗原结合片段，所述抗体和抗原结合片段包含一个或多个个体种系突变或其组合。在某些实施方案，V_H和/或V_L结构域内的所有框架和/或CDR残基突变回在衍生抗体的原始种系序列中发现的残基。在其他实施方案，仅有某些残基突变回原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内发现的突变残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3中发现的突变残基。在其他实施方案，将一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同种系序列(即，种系序列不同于最初衍生抗体的种系序列)的相应残基。此外，本发明所述抗体可包含框架和/或CDR区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个体残基突变为特定种系序列的相应残基，而某些与原始种系序列不同的其他残基保持或突变为不同种系序列的相应残基。一旦得到，可容易地测试含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所需特性，例如改善的结合特异性，增加的结合亲和力，改善或增强的拮抗或激动的生物学特性(视情况而定)，降低的免疫原性等。以这种一般方式得到的抗体和抗原结合片段均包括在本发明中。可用于本发明化合物的抗体还包括抗体，其包含具有一个或多个保守置换的本发明公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中任一个的变体。术语“表位”是指与抗体分子的可变区中被称为互补位的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可具有一个以上的表位。因此，不同的抗体可结合抗原上的不同区域并且可具有不同的生物学效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位是由线性多肽链不同区段在空间上并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖类、磷酰基类或磺酰基类基团部分。

在某些实施方案，所述抗体包含轻链。在某些实施方案，所述轻链是κ轻链。在某些实施方案，所述轻链是λ轻链。在某些实施方案，所述抗体包含重链。在某些方面，所述重链是IgA。在某些方面，所述重链是IgD。在某些方面，所述重链是IgE。在一些方面，所述重链是IgG。在一些方面，所述重链是IgM。在一些方面，所述重链是IgG1。在一些方面，所述重链是IgG2。在一些方面，所述重链是IgG3。在一些方面，所述重链是IgG4。在一些方面，所述重链是IgA1。在一些方面，所述重链是IgA2。

在一些实施方案，所述抗体是抗体片段。在一些方面，所述抗体片段是Fv片段。在一些方面，所述抗体片段是Fab片段。在一些方面，所述抗体片段是F(ab')₂片段。在一些方面，所述抗体片段是Fab'片段。在一些方面，所述抗体片段是scFv(sFv)片段。在一些方面，所述抗体片段是scFv-Fc片段。

在一些实施方案，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案，所述抗体是多克隆抗体。

在一些实施方案，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案，所述抗体是人抗体。

所述抗体可对认为适合本领域技术人员的任何抗原具有结合特异性。在某些实施方案，所述抗原是跨膜分子(例如受体)或生长因子。示例性抗原包括但不限于诸如以下分子：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白类；α1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体化激素；胰高血糖素；凝血因子类，例如vmc因子，IX因子，组织因子(TF)和vonWillebrands因子；抗凝血因子类，例如蛋白C；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；RANTES(调节正常T细胞表达和分泌的激活)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-I-α)；血清白蛋白，例如人血清白蛋白；抑制穆勒(Muellerian)物质；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β-内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶(DNase)；19E；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素类或生长因子类的受体；蛋白A或蛋白D；类风湿因子类；神经营养因子，例如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养素-3、-4、-5或-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子例如NGF-β；血小板源性生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，例如aFGF和bFGF；成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)，表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II(IGF-I和IGF-II)；des(I-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白类，EpCAM，GD3，FLT3，PSMA，PSCA，MUCI，MUCI6，STEAP，CEA，TENB2，EphA受体类，EphB受体类，叶酸受体，FOLRI，间皮素，畸胎瘤衍化生长因子抗原C端(cripto)，αvβ6(alphavbeta6)，整合素类，VEGF，VEGFR，EGFR，转铁蛋白受体，IRTA1，IRTA2，IRTA3，IRTA4，IRTA5；CD蛋白质类，例如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80、CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CDI52，或与一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合的抗体，其公开于美国专利公开号2008/0171040或美国专利公开号2008/0305044中，所述专利申请通过引用其全部内容并入本发明；促红细胞生成素；骨诱导因子类；免疫毒素类；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α，干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子类(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素类(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体类；表面膜蛋白类；衰变加速因子；病毒抗原，例如HIV包膜的一部分；转运蛋白类；归巢受体类；地址素类；调节蛋白类；整合素类，例如CDlla、CDllb、CDllc、CDI8、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，例如AFP、ALK、B7H4、BAGE蛋白质类、β-连环素、brc-abl、BRCA1、BORIS、CA9(碳酸酐酶IX)、半胱天冬酶-8、CD20、CD40、CD123、CDK4、CEA、CLEC12A、c-kit、cMET、CTLA4、细胞周期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、内皮糖蛋白、Epcam、EphA2、ErbB2/Her2、ErbB3/Her3、ErbB4/Her4、ETV6-AML、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白质类(例如GAGE-1、GAGE-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/EBNA1、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IGF1R、LGR5、LMP2、MAGE蛋白质类(例如，MAGE-1、-2、-3、-4、-6、和-12)、MART-1、间皮素、ML-IAP、Muc1、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NGEP、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PDGFR-α、PDGFR-β、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、PLAC1、PRLR、PRAME、PSCA、PSGR、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白质类、Ras、RGS5、Rho、SART-1、SART-3、Steap-1(前列腺跨膜上皮抗原-1)、Steap-2、STn、生存素、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、Tn、TNFRSF17、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、和尿溶蛋白-3(uroplakin-3)，以及任何上述多肽的片段。在一些实施方案，所述抗原是肿瘤抗原，包括对特定类型的肿瘤特异的抗原或在特定类型的肿瘤上共有、过度表达或修饰的抗原。实例包括但不限于：患有肺癌的α-辅肌动蛋白-4(alpha-actinin-4)，患有黑素瘤的ARTC1，患有慢性粒细胞白血病的BCR-ABL融合蛋白，患有黑素瘤的B-RAF、CLPP或Cdc27，患有鳞状细胞癌的CASP-8，和患有肾细胞癌的hsp70-2，以及以下共有的肿瘤特异性抗原，例如：BAGE-1、GAGE、GnTV、KK-LC-1、MAGE-A2、NA88-A、TRP2-INT2。在一些实施方案，所述抗原是PRLR或HER2。在一些实施方案，所述抗体是抗PRLR抗体或抗HER2抗体。

所述结合剂连接体可通过抗体或抗原结合分子内特定氨基酸处的附接而与所述结合剂(例如，抗体或抗原结合分子)连接。可在本发明此方面的上下文中使用的示例性氨基酸附接包括，例如，赖氨酸(参见例如，US 5,208,020；US 2010/0129314；Hollander etal.,Bioconjugate Chem.,2008,19:358–361；WO2005/089808；US 5,714,586；US 2013/0101546；和US 2012/0585592)，半胱氨酸(参见例如，US 2007/0258987；WO 2013/055993；WO 2013/055990；WO 2013/053873；WO 2013/053872；WO 2011/130598；US2013/0101546；和US 7,750,116)，硒代半胱氨酸(参见例如，WO 2008/122039；和Hofer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2008,105:12451–12456)，甲酰甘氨酸(参见例如，Carrico etal.,Nat.Chem.Biol.,2007,3:321–322；Agarwal et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2013,110:46–51，和Rabuka et al.,Nat.Protocols,2012,10:1052–1067)，非天然氨基酸(参见例如，WO 2013/068874，和WO 2012/166559)，和酸性氨基酸(参见例如，WO 2012/05982)。连接体也可通过与碳水化合物的附接而与抗原结合蛋白偶联(参见例如，US2008/0305497，WO 2014/065661，和Ryan et al.,Food&Agriculture Immunol.,2001,13:127–130)。

在一些实施例，所述结合剂是抗体或抗原结合分子，和所述抗体通过赖氨酸残基与所述连接体连接。在一些实施方案，所述抗体或抗原结合分子通过半胱氨酸残基与所述连接体连接。

连接体还可通过基于转谷氨酰胺酶的化学酶偶联而偶联至一个或多个谷氨酰胺残基上(参见例如，Dennler et al.,Bioconjugate Chem.2014,25,569–578)。例如，在转谷氨酰胺酶存在下，抗体的一个或多个谷氨酰胺残基可与伯胺化合物偶联。伯胺类化合物包括有效负载或连接体-有效负载，其通过转谷氨酰胺酶介导的偶联直接提供抗体药物偶联物。伯胺类化合物还包括被活性基团官能化的连接体和间隔基团，随后可与进一步的化合物反应以合成抗体药物偶联物。包含谷氨酰胺残基的抗体可从天然来源分离得到或经工程改造以包含一个或多个谷氨酰胺残基而得到。用于将谷氨酰胺残基工程化为抗体多肽链(谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子)的技术均包含在本领域技术人员的技术范围内。在某些实施方案，所述抗体是无糖基化的。

在某些实施方案，所述抗体或谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子在至少一个多肽链序列中包含至少一个谷氨酰胺残基。也可采用位点特异性偶联技术将偶联引导至抗体或抗原结合蛋白的特定残基(参见，例如，Schumacher et al.JClinImmunol(2016)36(Suppl 1):100)。位点特异性偶联技术包括但不限于通过转谷氨酰胺酶进行的谷氨酰胺偶联(参见，例如，Schibli,Angew Chemie Inter Ed.2010,49,9995)。在某些实施方案，所述抗体或谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子包含两个重链多肽，其中每个具有一个Gln295残基。在进一步的实施方案中，所述抗体或谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子在除重链295以外的位点处(例如，在Gln55(Q55)处)包含一个或多个谷氨酰胺残基。本发明包括此部分带有本发明所述的N297Q突变的抗体。简言之，在一些实施方案，在酶转谷氨酰胺酶的存在下，用伯胺化合物处理包含谷氨酰胺残基的抗体，如下文更详细描述的。示例性N297突变体是Asn297Gln(N297Q)突变体。例如，在一些实施方案，可通过定点诱变以去除或破坏序列或以在除了任何干扰结构之外的位点插入谷氨酰胺残基来制备此类抗体。此类抗体也可从天然来源或人工来源分离得到。所述插入的谷氨酰胺残基中的酰胺基团可与适合于本发明所述的点击化学反应的叠氮基团连接。有利地，可控制插入的谷氨酰胺残基的数目，因此，也可控制抗体或谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子中叠氮基团的数目，从而可改善对抗体-药物比值(ADR)的控制，例如，参见实施例29和表5。

在特定实施例，对于本发明所述的式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物，本发明所述的任何抗体药物偶联物样本中的药物抗体比值(DAR)为约2(即n是2)。在此类实施例中，所述抗体或抗原结合分子包含两个重链多肽，其中每个重链多肽具有一个Gln295残基，每个Gln295残基均与适用于本发明所述的点击化学反应的叠氮基团连接，因此DAR为约2。

在另一特定实施例，对于本发明所述的式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物，本发明所述的任何抗体药物偶联物样本中的药物抗体比值为约4(即n是4)。在此类实施例中，所述抗体或抗原结合分子包含两个重链多肽，其中每个重链多肽具有一个Gln295残基，每个Gln295残基均与适用于本发明所述的点击化学反应的叠氮基团连接。此外，所述抗体或抗原结合分子在偶联之前通过定点诱变进行进一步修饰，以去除或破坏序列或在除了任何干扰结构的位点处插入谷氨酰胺残基。例如，每个重链中的N297突变体，Asn297Gln(N297Q)突变体，与叠氮基团连接。因此，谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子包含适用于本发明所述的点击化学反应的4个叠氮基团，因此DAR为约4。参见图19。

在另一特定实施例，对于本发明所述的式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物，本发明所述的任何抗体药物偶联物样本中的药物抗体比值为约5或约6(即n是5或6)。在此类实施例中，所述抗体或抗原结合分子包含两个重链多肽，其中每个重链多肽具有一个Gln295残基，和每个Gln295残基均与适用于本发明所述的点击化学反应的叠氮基团连接。此外，所述抗体或抗原结合分子在偶联之前通过定点诱变进行进一步修饰，以去除或破坏序列或在除了任何干扰结构的位点处插入谷氨酰胺残基。例如，每个重链中的N297突变体，Asn297Gln(N297Q)突变体，与叠氮基团连接。在某些实施例，待偶联的抗体在其可变区中包含一个或多个另外的天然存在的谷氨酰胺残基，其可被转谷氨酰胺酶接近并因此能够进行偶联，例如Gln55(Q55)。在这些实施例中，通过转谷氨酰胺酶偶联后的抗体的DAR值将高于4。因此，所述谷氨酰胺基修饰的抗体或抗原结合分子可包含适用于本发明所述的点击化学反应的5或6个叠氮基团，因此DAR为约5或约6。

在一些实施方案，本发明所述偶联物的BA是抗体或其抗原结合片段。在一些实施例，与本发明所述的式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)、式(IXa)、式(IXb)、式(IXc)、式(Xa)、式(Xb)、式(Xc)、或式(Xd)所示化合物反应的结合剂是抗体或其抗原结合片段。在此类实施例中，所述结合剂是抗体或其抗原结合片段，任选地被叠氮基修饰，或所述结合剂是本发明所述的式Ab-1的经修饰抗体或其抗原结合片段、或其组合。在一些实施方案，本发明所述的偶联物衍生自叠氮基官能化的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案，本发明所述的偶联物衍生自PEG官能化的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案，本发明所述的偶联物衍生自叠氮基和PEG官能化的抗体或其抗原结合片段，其中所述PEG在第一末端附接至抗体或其抗原结合片段，和所述PEG在第二末端附接至适用于本发明所述的点击化学反应的叠氮基团。在一些实施方案，本发明所述偶联物的BA是

其中w'是从1至10的整数。

在一些实施例，本发明所述的d-Lys可用图20所示的试剂代替。

伯胺类化合物

可用于由包含谷氨酰胺的抗体(或抗原结合化合物)的转谷氨酰胺酶介导的偶联的伯胺化合物可以是普通技术人员认为有用的任何伯胺化合物。通常，伯胺化合物具有式H₂N-R所示结构，其中R可以是与抗体和反应条件相配的任何基团。在某些实施方案，R是烷基、取代的烷基、杂烷基、或取代的杂烷基。

在一些实施方案，所述伯胺化合物包含活性基团或保护的活性基团。有用的活性基团包括叠氮化物类、炔烃类、环炔烃类、硫醇类、醇类、酮类、醛类、酸类、酯类、酰肼类、苯胺类、和胺类。在某些实施方案，所述活性基团选自由叠氮化物、炔烃、巯基、环炔烃、醛、和羧基组成的组。

在某些实施方案，所述伯胺化合物具有式H₂N-LL-X所示结构，其中LL是二价间隔基团，和X是活性基团或保护的活性基团。在特定实施方案，LL是二价聚乙二醇(PEG)基团。在某些实施方案，X是选自由-SH、–N₃、炔烃、醛和四唑组成的组。在特定实施方案，X是–N₃。

在某些实施方案，所述伯胺化合物具有以下通式之一的结构：

H₂N-(CH₂)_n'-X；

H₂N-(CH₂CH₂O)_n'-(CH₂)_p'-X；

H₂N-(CH₂)_n'-N(H)C(O)-(CH₂)_m'-X；

H₂N-(CH₂CH₂O)_n'-N(H)C(O)-(CH₂CH₂O)_m'-(CH₂)_p'-X；

H₂N-(CH₂)_n'-C(O)N(H)-(CH₂)_m'-X；

H₂N-(CH₂CH₂O)_n'-C(O)N(H)-(CH₂CH₂O)_m'-(CH₂)_p'-X；

H₂N-(CH₂)_n'-N(H)C(O)-(CH₂CH₂O)_m'-(CH₂)_p'-X；

H₂N-(CH₂CH₂O)_n'-N(H)C(O)-(CH₂)_m'-X；

H₂N-(CH₂)_n'-C(O)N(H)-(CH₂CH₂O)_m'-(CH₂)_p'-X；和

H₂N-(CH₂CH₂O)_n'-C(O)N(H)-(CH₂)_m'-X；

其中下标n'是选自1至12的整数；

下标m'是选自0至12的整数；

下标p'是选自0至2的整数；

和X是选自由以下组成的组：–SH、–N₃、–C≡CH、–C(O)H、四唑、和以下之一：

在上文中，任何所述烷基或亚烷基(即-CH₂-)基团可任选地被例如C_1-8烷基、甲基甲酰基、或–SO₃H取代。在某些实施方案，所述烷基基团均是未取代的。

在某些实施方案，所述伯胺化合物是选自由以下组成的组：

在特定实施方案，所述伯胺化合物是：

在以下实施例中提供了上述反应的示例性条件。

连接体

本发明所述偶联物的连接体LL部分是一个基团部分，例如二价基团部分，其将结合剂共价连接至本发明所述的有效负载化合物。在其他情况下，连接体LL是将结合剂共价连接至本发明所述的有效负载化合物的三价或多价基团部分。合适的连接体可在例如Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins；Phillips,G.L.,Ed.；Springer Verlag:New York,2013；Antibody-Drug Conjugates；Ducry,L.,Ed.；Humana Press,2013；Antibody-Drug Conjugates；Wang,J.,Shen,W.-C.,and Zaro,J.L.,Eds.；SpringerInternational Publishing,2015中获悉，各文献的内容通过引用其整体并入本发明。有效负载化合物包括图1中的化合物，以及其与连接体LL连接或结合后的残基。本领域技术人员将认识到，有效负载基团部分的某些官能团便于连接至连接体和/或结合剂。所述这些基团包括胺类、羟基类、磷酸盐/酯类和糖类。

在某些实施方案，所述连接体在生理条件下是稳定的。在某些实施方案，所述连接体是可切割的，例如，能够在酶存在下或在特定pH范围或pH值下释放至少所述有效负载部分。在一些实施方案，连接体包含酶可切割的基团部分。示例性酶可切割的基团部分包括但不限于肽键类、酯键类、腙类、和二硫键类。在一些实施方案，所述连接体包含组织蛋白酶可切割的连接体。

在一些实施方案，所述连接体包含不可切割基团部分。在一些实施方案，所述不可切割的连接体衍生自

或其残基。在一些实施方案，所述不可切割的连接体-有效负载是

或其区域异构体。在一些实施方案，所述不可切割的连接体衍生自

或其区域异构体。在一个实施方案，所述连接体是马来酰亚胺环己烷羧酸酯或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸(MCC)。在所述结构中，

表示与结合剂连接的键。在所述结构中，在一些实施例，

表示由例如结合剂和连接体有效负载的反应产生的点击化学残基。

在一些实施方案，合适的连接体包括但不限于与单一结合剂(例如抗体)的两个半胱氨酸残基进行化学键合的那些。此类连接体可用于模拟由于偶联过程而被破坏的所述抗体的二硫键。

在一些实施方案，所述连接体包含一个或多个氨基酸。合适的氨基酸包括天然、非天然的、标准、非标准的、蛋白原、非蛋白原的、和L-或D-型α-氨基酸。在一些实施方案，所述连接体包含丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸、或其衍生物、或其组合。在某些实施方案，所述氨基酸的一个或多个侧链连接至如下所述的侧链基团。在一些实施方案，所述连接体包含缬氨酸和瓜氨酸。在一些实施方案，所述连接体包含赖氨酸、缬氨酸和瓜氨酸。在一些实施方案，所述连接体包含赖氨酸、缬氨酸和丙氨酸。在一些实施方案，所述连接体包含缬氨酸和丙氨酸。

在一些实施方案，所述连接体包含自降解基团。所述自降解基团可以是技术人员已知的任何此类基团。在特定实施方案，所述自降解基团是对氨基苄基(PAB)或其衍生物。有用的衍生物包括对氨基苄氧基羰基(PABC)。本领域技术人员将认识到，自降解基团能够进行化学反应，所述化学反应从有效负载中释放连接体的剩余原子。

在某些实施方案，活性基团包括但不限于炔类。在某些实施方案，所述炔类是在不存在铜催化剂的情况下能够与叠氮化物进行1,3-环加成反应的炔烃，如应变炔烃。应变炔烃是适于应变促进的炔-叠氮化物环加成(SPAAC)的那些，环炔烃类，例如环辛炔类，苯并环化的炔烃类。合适的炔烃类还包括但不限于，二苯并氮杂环辛炔或

二苯并环辛炔或

二芳基氮杂环辛炔酮或

二氟化环辛炔或

取代的例如氟化炔烃类，氮杂-环炔烃类，二环[6.1.0]壬炔或

和其衍生物。特别有用的炔烃包括

在某些实施方案，所述结合剂直接连接至活性基团RG。在某些实施方案，所述结合剂通过间隔基团连接至活性基团RG。在特定实施方案，所述结合剂通过PEG间隔基团连接至活性基团。在某些实施方案，所述结合剂通过采用一个或多个叠氮基进行官能化来制备。每个叠氮基基团能够与RG中的炔反应形成RG¹或RG'。在特定实施方案，所述结合剂采用与谷氨酰胺残基连接的–PEG-N₃衍生得到。本发明提供了示例性–N₃衍生的结合剂，其制备方法，以及其与RG反应的方法。在某些实施方案，RG是适于参与1,3-环加成的炔烃，和RG¹或RG'是由RG与叠氮基官能化的结合剂反应形成的1,2,3-三唑基基团部分。作为进一步的实例，在某些实施方案，RG连接至结合剂，所述结合剂如

所示，或各区域异构体的混合物。各R和R'分别具有本发明所述定义。

以类似的方式，本发明所述的各个HG可以是叠氮基官能化的亲水性基团，其与RG中的炔反应以形成RG²。

在某些实施方案，RG¹或RG'衍生自活性基团与抗体或其抗原结合片段的半胱氨酸残基或赖氨酸残基的反应。在某些实施方案，RG¹或RG'衍生自点击化学反应。在所述点击化学反应的一些实施方案中，RG¹或RG'衍生自炔和叠氮化物之间的1,3-环加成反应。此类RG¹或RG'的非限制性实例包括衍生自应变炔类化合物的那些，例如适用于应变促进炔-叠氮化物环加成(SPAAC)的那些，环炔烃类例如环辛炔类，苯并环化的炔烃类、以及在没有铜催化剂的情况下，能够与叠氮化物进行1,3-环加成反应的炔烃类。合适的RG¹或RG'还包括但不限于，衍生自DIBAC、DIBO、BARAC、取代的例如氟化炔烃类、氮杂-环炔烃类、BCN、和其衍生物的那些。包含此类RG¹或RG'基团的偶联物可衍生自已被叠氮基官能化的抗体。此类官能化的抗体包括被叠氮基-聚乙二醇基团官能化的抗体。在某些实施方案，此类官能化抗体在酶转谷氨酰胺酶(例如微生物转谷氨酰胺酶)存在下，通过使包含至少一个谷氨酰胺残基的抗体与式H₂N–LL'–N₃所示化合物(其中LL'是二价聚乙二醇基团)反应衍生得到。抗体的合适谷氨酰胺残基包括Q295或Q55，或通过插入或突变(例如N297Q突变)衍生的那些。

技术人员将认识到PAB和PABC可分别作为对氨基苄氧基羰基和对氨基苄基氨基甲酸酯的残基，它们分别具有以下结构：

已显示PAB和PABC残基可促进体外和体内切割某些连接体。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dLys(COT-PEG₆)-VC-PAB。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dLys(COT-PEG_e-牛磺酸)-VC-PAB。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG₄-dLys(COT-双牛磺酸)-VC-PAB。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dGlu(牛磺酸)-VC-PAB。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dLys(COT-PEG₄-牛磺酸)-VC-PAB。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dLys(COT-PEG₄-牛磺酸)-VA。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dLys(COT-PEG₄-牛磺酸)-VC。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dGlu(牛磺酸)-VC。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dLys(COT-PEG_e-牛磺酸)-VA。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dLys(COT-PEG_e-牛磺酸)-VC。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dLys(COT-PEG_e-N⁺Me₃)-vcPAB。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dLys(COT-PEG_e-膦酸(phosphate))-vcPAB。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是5。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dLys(COT-半乳糖)-vcPAB。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是MAL-PEG_e-dLys(COT-半乳糖)-vcPAB。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dGlu(葡糖酰胺)-vcPAB。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是MAL-PEG_e-dGlu(葡糖酰胺)-vcPAB。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是COT-PEG_e-dLys(COT-PEG_e-N⁺Me₃)-vcPAB。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是BCN-PEG_e-dLys(COT-PEG_e-N⁺Me₃)-vcPAB。下标e是从0至5的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。在一些实施例，下标e是5。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG_e-dLys(COT-PEG_e-N⁺Me₃)-VA。下标e是从0至4的整数。在一些实施例，下标e是0。在一些实施例，下标e是1。在一些实施例，下标e是2。在一些实施例，下标e是3。在一些实施例，下标e是4。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG₄-dLys(COT-PEG₆)-VC-PAB。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG₄-dLys(COT-PEG₄-牛磺酸)-VC-PAB。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG₄-dLys(COT-双牛磺酸)-VC-PAB。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG₄-dGlu(牛磺酸)-VC-PAB。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG₄-dLys(COT-PEG₄-牛磺酸)-VA。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG₄-dLys(COT-PEG₄-牛磺酸)-VC。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG₄-dGlu(牛磺酸)-VC。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG₄-dLys(COT-PEG₄-N⁺Me₃)-vcPAB。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG₄-dLys(COT-PEG₅-膦酸)-vcPAB。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG₄-dLys(COT-半乳糖)-vcPAB。

在一些实施方案，所述连接体是MAL-PEG₄-dLys(COT-半乳糖)-vcPAB。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG₄-dGlu(葡糖酰胺)-vcPAB。

在一些实施方案，所述连接体是MAL-PEG₄-dGlu(葡糖酰胺)-vcPAB。

在一些实施方案，所述连接体是COT-PEG₄-dLys(COT-PEG₄-N⁺Me₃)-vcPAB。

在一些实施方案，所述连接体是BCN-PEG₄-dLys(COT-PEG₄-N⁺Me₃)-vcPAB。

在一些实施方案，所述连接体是DIBAC-PEG₄-dLys(COT-PEG₄-N⁺Me₃)-VA。

活性连接体-有效负载

本发明提供的偶联物可由包含如上所述的活性基团RG¹或RG'或RG²的活性连接体-有效负载制备得到。可根据以下所述方法将活性连接体有效负载连接至本发明所述的亲水性基团和/或结合剂。

在一些实施方案，本发明提供了活性连接体-有效负载，其包含活性基团，所述活性基团经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个亲水性基团部分，其中所述共价连接体直接或间接与各个所述活性基团、所述有效负载基团部分和所述亲水性基团部分连接。

如本发明所示，在一些实施例，所述活性基团直接连接至共价连接体，例如赖氨酸氨基酸。这意味着所述活性基团与所述共价连接体相距一个键位置。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体还直接连接至有效负载基团部分。这意味着所述共价连接体与有效负载(例如但不限于MMAE、类固醇、LXR调节剂、或本发明所述的任何有效负载)相距一个键位置。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体还直接连接至亲水性基团部分。这意味着所述共价连接体与亲水性残基(例如本发明所述的亲水性残基)相距一个键位置。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体是赖氨酸氨基酸或其衍生物。

在其他实施例，所述活性基团间接连接至共价连接体。这意味着所述活性基团与共价连接体相距一个以上的键位置。这也意味着所述活性基团通过另一基团部分与所述共价连接体连接。例如，所述活性基团可连接至聚乙二醇基团，所述聚乙二醇基团连接至所述共价连接体。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体还间接连接至有效负载部分。这意味着所述共价连接体与有效负载(例如但不限于MMAE、或类固醇、或本发明所述的任何有效负载)相距一个以上的键位置。这也意味着所述共价连接体通过另一基团部分与所述有效负载连接。例如，所述共价连接体可连接至二肽，例如但不限于Val-Ala或Val-Cit，其可连接至PAB，所述PAB可连接至所述有效负载。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体还间接连接至亲水性基团部分。这意味着所述共价连接体与亲水性基团部分(例如本发明所述的亲水性残基)相距一个以上的键位置。这也意味着所述共价连接体通过另一基团部分与所述亲水性残基连接。例如，所述共价连接体可连接至聚乙二醇基团，所述聚乙二醇基团可连接至活性基团，所述活性基团可连接至所述亲水性残基。在所述这些实施例的一些中，所述共价连接体是赖氨酸氨基酸或其衍生物。

在本发明所述通式中，各AA¹分别为氨基酸。在本发明所述通式的一些实施例中，各AA²分别为氨基酸。在本发明所述通式的一些实施例中，各AA²分别为二肽。在本发明所述通式的一些实施例中，各AA²分别为三肽。各AA¹或AA²的合适氨基酸包括天然、非天然的、标准、非标准的、蛋白原、非蛋白原的、L-型或D-型氨基酸。在一些实施方案，所述连接体包含丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸、或其衍生物、或其组合。在某些实施方案，所述氨基酸的一个或多个侧链连接至如下所述的侧链基团。在某些实施方案，AA¹是选自丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、或瓜氨酸、或其衍生物、或其组合的氨基酸。在某些实施方案，AA¹是具有三个官能团的氨基酸，其可连接至有效负载、结合剂(例如抗体或其抗原结合片段)、以及包含亲水性基团的连接体，例如赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或酪氨酸。在某些实施方案，AA¹是赖氨酸。在某些实施方案，AA¹是谷氨酰胺。在某些实施方案，AA¹是赖氨酸或赖氨酸的衍生物。在某些实施方案，AA¹是L-赖氨酸。在某些实施方案，所述AA¹是D-赖氨酸。在某些实施方案，AA¹是谷氨酸。在某些实施方案，所述AA²是缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA²是瓜氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA²是缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA²是丙氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA²是缬氨酸-甘氨酸。在一些实施方案，所述AA²是甘氨酸-缬氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是谷氨酰胺-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是赖氨酸-缬氨酸-瓜氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸。在一些实施方案，所述AA¹-AA²是谷氨酰胺-缬氨酸-丙氨酸。

在一些实施方案，AA²是选自缬氨酸-瓜氨酸、瓜氨酸-缬氨酸、赖氨酸-苯丙氨酸、苯丙氨酸-赖氨酸、缬氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-缬氨酸、苏氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-苏氨酸、丝氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-丝氨酸、苯丙氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-苯丙氨酸、亮氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-亮氨酸、异亮氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-异亮氨酸、甘氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-甘氨酸、谷氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-谷氨酸、瓜氨酸-天冬酰胺、天冬酰胺-瓜氨酸、丙氨酸-天冬酰胺、或天冬酰胺-丙氨酸的二肽。

在一些实施例，AA¹-AA²是赖氨酸-缬氨酸–丙氨酸或丙氨酸–缬氨酸-赖氨酸。

在一些实施例，AA¹-AA²是赖氨酸-缬氨酸–瓜氨酸或瓜氨酸–缬氨酸-赖氨酸。

在一些实施例，AA²是缬氨酸–瓜氨酸或瓜氨酸–缬氨酸。

在一些实施例，AA²是缬氨酸–丙氨酸或丙氨酸–缬氨酸。

在一些实施例，AA¹-AA²是

在所述这些实施例的一些中，R^AA1是氨基酸侧链，R^AA2是氨基酸侧链，和R^AA3是直接或间接与亲水性基团部分连接的氨基酸侧链。

在一些实施例，R^AA1是缬氨酸侧链。

在一些实施例，R^AA2是丙氨酸侧链。

在一些实施例，R^AA2是瓜氨酸侧链。

在一些实施例，AA¹-AA²是

在所述这些实施例的一些中，R^AA1是氨基酸侧链，和其中R^AA2是氨基酸侧链。

在一些实施例，AA²是

在一些实施例，AA²是

在一些实施例，AA²是

在一些实施例，本发明提供了包含本发明所述化合物的连接体-有效负载。

在一些实施例，本发明提供了连接体-有效负载，所述连接体-有效负载包含与本发明所述任何化合物的氧原子或伯氮原子或仲氮原子连接的本发明所述的化合物。

在一些实施例，本发明提供了抗体-药物-偶联物，所述抗体-药物-偶联物包含与抗体或其抗原结合片段连接的本发明所述化合物或连接体-有效负载。

本发明提供的偶联物可由具有活性基团RG的活性连接体-有效负载制备得到，如上文以及实施例部分和附图中所述。可根据本发明所述的方法，例如在实施例部分和附图中所述的方法，将活性连接体有效负载连接至亲水性基团和/或结合剂。

在一些实施方案，所述活性连接体-有效负载是：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体形式、或其区域异构体，其中PAB¹是PAB或PABC，如本发明所述的PAB或PABC；p是0或1；R^AA9是甲基或-(CH₂)₃-NH-C(＝O)-NH₂；和RG'、RG²、PA、SP²和HG均具有本发明所述定义。

在某些实施方案，RG'是

其中各

分别表示所述基团通过其与所述分子的其余部分连接的原子。

在一些实施方案，活性连接体有效负载是：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体形式、或其区域异构体，其中PAB¹是PAB或PABC，如本发明所述；p是0或1；R^AA9是甲基或-(CH₂)₃-NH-C(＝O)-NH₂；和PA、SP²和HG均具有本发明所述定义。在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载A。在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载B。在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载C。在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载D。在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载E。

在一些实施方案，活性连接体有效负载是：

在一些实施方案，活性连接体有效负载是：

在一些实施方案，活性连接体有效负载是：

在一些实施方案，活性连接体有效负载是：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体形式、或其区域异构体，其中PAB¹是PAB或PABC，

如本发明所述；p是0或1；R^AA9是甲基或-(CH₂)₃-NH-C(＝O)-NH₂；和PA与HG均具有本发明所述定义。

在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载A。

在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载B。

在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载C。

在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载D。

在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载E。

在一些实施方案，活性连接体有效负载是：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体形式、或其区域异构体，其中PAB¹是PAB或PABC，如本发明所述；p是0或1；R^AA9是甲基或-(CH₂)₃-NH-C(＝O)-NH₂；和PA与HG均具有本发明所述定义。在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载A。在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载B。在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载C。在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载D。在这些实施方案的一些中，HG是如本发明所定义的牛磺酸或双牛磺酸，和PA是图1所示的有效负载E。

在一些实施方案，活性连接体有效负载是：

在一些实施方案，活性连接体有效负载是：

在本发明所述的活性连接体有效负载的任何实施例中，所述活性连接体有效负载通过叠氮化物(例如通过点击化学)与应变炔的反应而与结合剂(例如，本发明定义的Ab或Ab-1)连接。在其他实施方案，所述活性连接体有效负载通过对所述活性连接体有效负载中的琥珀酰亚胺基团部分的亲核进攻而与结合剂(例如，本发明定义的Ab或Ab-1)连接。

在一些实施方案，活性连接体有效负载是：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、或立体异构体形式、或其区域异构体，其中PAB¹是PAB或PABC，如本发明所述；p是0或1；R^AA9是甲基或-(CH₂)₃-NH-C(＝O)-NH₂；和PA具有本发明所述定义。在此类实施例中，包含叠氮化物的亲水性连接体经由叠氮化物(例如，通过点击化学)与应变炔的反应而与活性连接体有效负载连接。

制备化合物的方法

本发明提供的化合物可通过本领域技术人员显而易见的任何方法制备、分离或得到。在以下实施例中详细描述了示例性制备方法。在某些实施方案，本发明提供的化合物可根据实施例和图1-19中所述方法制备得到。

本发明所述的偶联物可通过在标准偶联条件下，将本发明所述的连接体-有效负载与结合剂例如抗体偶联来合成得到(参见例如，Doronina et al.Nature Biotechnology2003,21,7,778，其通过引用其全部内容并入本发明)。当所述结合剂是抗体时，所述抗体可通过抗体的一个或多个半胱氨酸或赖氨酸残基偶联至连接体-有效负载。连接体-有效负载可以，例如通过使抗体经受还原剂(例如二硫苏糖醇)的作用以切割抗体的二硫键，例如通过凝胶过滤纯化所述还原的抗体，然后用含有合适的活性基团部分(例如马来酰亚胺基基团)的连接体-有效负载处理所述抗体，从而与半胱氨酸残基偶联。合适的溶剂包括但不限于水、DMA、DMF、和DMSO。含有活性基团例如活化酯或酰基卤基团的连接体-有效负载可以与抗体的赖氨酸残基偶联。合适的溶剂包括但不限于水、DMA、DMF、和DMSO。偶联物可使用已知的蛋白质技术进行纯化，包括例如体积排除色谱法、透析法和超滤/渗滤法。

结合剂，例如抗体，也可通过点击化学反应进行偶联。在所述点击化学反应的一些实施方案中，连接体-有效负载包括能够与叠氮化物进行1,3-环加成反应的活性基团，例如炔。此类合适的活性基团如上所述。所述抗体包括一个或多个叠氮基团。此类抗体包括用例如叠氮基-聚乙二醇基团官能化的抗体。在某些实施方案，此类官能化抗体通过在转谷氨酰胺酶存在下，用伯胺化合物处理具有至少一个谷氨酰胺残基(例如重链Gln295)的抗体，进行衍生得到。此类抗体还可包含Asn297Gln(N297Q)突变体。在某些实施方案，此类官能化抗体通过在转谷氨酰胺酶存在下，用伯胺化合物处理具有至少两个谷氨酰胺残基(例如重链Gln295和重链Gln297)的抗体，进行衍生得到。此类抗体包括Asn297Gln(N297Q)突变体。在某些实施方案，所述抗体具有如本段所述的两条重链，用于总共两个或总共四个谷氨酰胺残基。在某些情况下，待偶联的抗体在其可变区中含有一个或多个其他天然存在的谷氨酰胺残基，转谷氨酰胺酶可接近它并因此能够进行偶联，例如Gln55。在这些情况下，经转谷氨酰胺酶偶联后的抗体的DAR值可高于4。此类抗体包括Asn297Gln(N297Q)突变体。在一些实施方案，抗体具有如本段中所述的两个重链，用于总共两个或总共四个或总共五个或六个谷氨酰胺残基。

在某些实施方案，所述抗体在EU编号体系中在编号为295的一个或多个重链位置处包含谷氨酰胺残基。在本发明中，此位置称为谷氨酰胺295，或称为Gln295，或称为Q295。技术人员将认识到，这是许多抗体的野生型序列中的保守谷氨酰胺残基。在其他有用的实施方案中，可将所述抗体工程化以包含谷氨酰胺残基。修饰抗体序列以包括谷氨酰胺残基的技术均包含在本领域技术人员的技术范围内(参见例如，Ausubel et al.CurrentProtoc.Mol.Biol.)。

在某些实施方案，所述抗体包含两个谷氨酰胺残基，每个重链中有一个。在特定实施方案，所述抗体在每个重链中包含Q295残基。在进一步的实施方案，所述抗体包含1、2、3、4、5、6、7、8个、或更多个谷氨酰胺残基。所述这些谷氨酰胺残基可在重链中、轻链中、或在重链和轻链两者中。所述这些谷氨酰胺残基可以是野生型残基、或工程化残基。所述抗体可根据标准技术制备得到。在某些实施方案，所述抗体包含Q55残基。

本领域技术人员将认识到，抗体通常在重链序列中的残基Q295附近的残基N297处进行糖基化。残基N297处的糖基化可干扰残基Q295处的转谷氨酰胺酶(Dennler et al.，同上)。因此，在有利的实施方案中，所述抗体未被糖基化。在某些实施方案，所述抗体是去糖基化的或非糖基化的。在特定实施方案，抗体重链具有N297突变。换言之，所述抗体突变为在位置297处不再具有天冬酰胺残基。在特定实施方案，抗体重链具有N297Q突变。此类抗体可通过定点诱变以除去非糖基化序列或使非糖基化序列无效或通过定点诱变将谷氨酰胺残基插入除任何干扰糖基化位点或任何其他干扰结构之外的位点，来制备得到。还可从天然来源或人工来源中分离此类抗体。

然后不干扰糖基化的抗体用伯胺化合物处理。在某些实施方案，无糖基化或非糖基化的抗体用伯胺化合物处理以生成谷氨酰胺基修饰的抗体。在某些实施方案，去糖基化的抗体与伯胺化合物反应以生成谷氨酰胺基修饰的抗体。

伯胺可以是在转谷氨酰胺酶存在下能够与谷氨酰胺残基形成共价键的任何伯胺。有用的伯胺如下所述。所述转谷氨酰胺酶可以是本领域技术人员认为合适的任何转谷氨酰胺酶。在某些实施方案，所述转谷氨酰胺酶是催化伯胺化合物上的游离胺基团与谷氨酰胺残基的侧链上的酰基基团之间的异肽键形成的酶。转谷氨酰胺酶也称为蛋白质-谷氨酰胺-γ-谷氨酰转移酶。在特定实施方案，所述转谷氨酰胺酶被分类为EC 2.3.2.13。所述转谷氨酰胺酶可以来自认为合适的任何来源。在某些实施方案，所述转谷氨酰胺酶是微生物。有用的转谷氨酰胺酶已从茂原链轮丝菌(Streptomyces mobaraense)、肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneum)、灰肉链霉菌(Streptomyces griseo-carneum)、淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中分离得到。也可使用非微生物的转谷氨酰胺酶，包括哺乳动物的转谷氨酰胺酶。在某些实施方案，所述转谷氨酰胺酶可通过任何技术生成或从本领域技术人员认为合适的任何来源得到。在特定实施方案，所述转谷氨酰胺酶得自商业来源。

在特定实施方案，所述伯胺化合物包含能够在转谷氨酰胺化之后进一步反应的活性基团。在所述这些实施方案中，可将谷氨酰胺基修饰的抗体与活性有效负载化合物或活性连接体-有效负载化合物反应或用活性有效负载化合物或活性连接体-有效负载化合物处理以形成抗体-有效负载偶联物。在某些实施方案，所述伯胺化合物包含本发明所述的叠氮化物。

在某些实施方案，将谷氨酰胺基修饰的抗体与活性连接体-有效负载反应或用活性连接体-有效负载处理以形成抗体-有效负载偶联物。所述反应可在本领域技术人员认为合适的条件下进行。在某些实施方案，使谷氨酰胺基修饰的抗体与活性连接体-有效负载化合物在适于在谷氨酰胺基修饰的抗体与连接体-有效负载化合物之间形成键的条件下接触。合适的反应条件是本领域技术人员周知的。

此类反应的实例提供在以下实施例中。

在一些实施例，本发明提供了制备偶联物的方法，其包括在偶联条件下处理化合物和结合剂或使化合物与结合剂接触，其中所述化合物包含经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个环糊精基团部分的活性连接体，其中所述共价连接体直接或间接与各个所述活性连接体、所述有效负载基团部分和所述环糊精基团部分连接。在一些实施例，与结合剂反应的化合物是式(VI)所示化合物：

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、或衍生物，其中RG'是活性基团；L是三价连接体；HL是亲水性残基；和PA是有效负载残基。

在一些实施例，与式(II)所示化合物反应的结合剂是抗体或其抗原结合片段。

在一些实施例，在本发明中，所述D-Lys可用图20所示的试剂代替。

在一些实施例，含环糊精的基团部分可在选自[3+2]点击反应、Diels-Alder反应、还原胺化、光点击反应、或其他反应的生物正交反应中反应。

适用于本发明方法的其他有用的生物正交反应包括但不限于施陶丁格(Staudinger)连接反应，点击反应，四嗪连接反应和光点击反应。

以下参考文献示出了可与本发明所述的生物正交反应一同使用的示例性反应和试剂：Zheng,Mengmeng,et al.,Molecules 2015,20,3190-3205，其内容通过引用其整体并入本发明用于所有目的。

药物组合物和治疗方法

本发明提供了治疗和预防疾病、病况或病症的方法，其包含施用治疗或预防有效量的本发明公开的一种或多种化合物，例如本发明提供通式所示的一种或多种化合物。本领域技术人员将认识到疾病、病症和/或病况包括但不限于与本发明所列抗原相关的那些。

本发明所述化合物可单独施用或与一种或多种其他治疗剂一同施用。可在施用本发明所述化合物之前、同时或之后不久施用一种或多种其他治疗剂。本发明还包括药物组合物，其包含任何本发明所述化合物与一种或多种其他治疗剂组合，以及治疗方法，所述方法包含向有需要的受试者施用此类组合。

合适的其他治疗剂包括但不限于：第二糖皮质激素，自身免疫治疗剂，激素，生物药，或单克隆抗体。合适的治疗剂还包括但不限于本发明所述化合物的任何药学上可接受的盐类、酸类或衍生物类。

在本发明所述方法的一些实施方案中，可在限定的时间疗程中向受试者施用多剂量的本发明所述化合物(或包含本发明所述化合物和本发明提及的任何其他治疗剂的组合的药物组合物)。根据本发明内容的此方面的方法包括向受试者依次施用多剂量的本发明所述化合物。本发明使用的“依次施用”是指在不同的时间点，例如在以预定间隔(例如，小时、天、周、或月)隔开的不同天，将化合物的每个剂量施用于受试者。本发明包含以下方法，所述方法包含依次向患者施用单一初始剂量的本发明所述化合物，随后施用一个或多个二次剂量的所述化合物，以及任选地后续施用一个或多个三次剂量的所述化合物。

术语“初始剂量”，“二次剂量”，和“三次剂量”是指本发明所述化合物的给药时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时给药的剂量(也称为“基线剂量”)；“二次剂量”是在所述初始剂量给药后施用的剂量；和“三次剂量”是在所述二次剂量给药后施用的剂量。所述初始、二次和三次剂量均可含有相同量的本发明所述化合物，但通常可在给药频率方面彼此不同。在一些实施方案，在治疗过程中，所述初始、二次和/或三次剂量中所含的化合物的量彼此变化(例如，酌情上调或下调)。在一些实施方案，在治疗方案开始时，将两种或更多种(例如，2、3、4或5种)剂量施用为“负荷剂量”，随后以较不频繁的方式施用后续剂量(例如“维持剂量”)。

在本发明所述的一些示例性实施方案中，每个二次和/或三次剂量在紧随前述剂量之后进行给药1至26周(例如，1、1¹/₂、2、2¹/₂、3、3¹/₂、4、4¹/₂、5、5¹/₂、6、6¹/₂、7、7¹/₂、8、8¹/₂、9、9¹/₂、10、10¹/₂、11、11¹/₂、12、12¹/₂、13、13¹/₂、14、14¹/₂、15、15¹/₂、16、16¹/₂、17、17¹/₂、18、18¹/₂、19、19¹/₂、20、20¹/₂、21、21¹/₂、22、22¹/₂、23、23¹/₂、24、24¹/₂、25、25¹/₂、26、26¹/₂、或更多)。本发明使用的短语“紧随前述剂量”是指在多次给药的序列中，在施用紧邻下一个剂量之前，对患者施用本发明化合物的剂量，在所述给药序列中不存在干预剂量。

本发明此方面的方法可包含向患者施用任何数量的二次和/或三次剂量的本发明化合物。譬如，在一些实施方案，仅向患者施用单次二次剂量。在其他实施方案，向患者施用两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多次)二次剂量。同理，在一些实施方案，仅向患者施用单次的三次剂量。在其他实施方案，向患者施用两次或更多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多次)三次剂量。给药方案可在特定受试者的寿命期内无限期地进行，或者直至此种治疗不再是治疗需要或有利的。

在涉及多个二次剂量的实施方案中，每个二次剂量可以与其他二次剂量相同的频率施用/给药。譬如，每个二次剂量可在紧随前述剂量之后，对患者进行给药1至2周或1至2个月。同理，在涉及多个三次剂量的实施方案中，每个三次剂量可以与其他三次剂量相同的频率施用/给药。譬如，每个三次剂量可在紧随前述剂量之后，对患者进行给药2至12周。在本发明的一些实施方案中，向患者施用二次和/或三次剂量的频率可在治疗方案的过程中变化。也可根据临床检查后的个体患者的需要，由医师在治疗过程中调整给药频率。

本发明包括其中以第一频率(例如，每周一次，每两周一次，每三周一次，每月一次，每两个月一次等)向患者施用2至6次负荷剂量，然后以较不频繁的方式向患者施用两次或更多次维持剂量的给药方案。例如，根据本发明的此方面，如果以每月一次的频率施用负荷剂量，那么维持剂量可以每6周施用一次，每两个月施用一次，每三个月施用一次等。

本发明包括本发明所述化合物和/或偶联物(例如式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)所示化合物)的药物组合物，譬如，组合物包含本发明所述化合物、其盐、立体异构体、多晶型物，和药学上可接受的载体、稀释剂、和/或辅料。合适的载体、稀释剂和辅料的实例包括，但不限于：用于维持适当组合物pH值的缓冲剂类(例如，柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液、草酸盐缓冲液等)，载体蛋白类(如人血清白蛋白)，盐水，多元醇类(例如，海藻糖、蔗糖、木糖醇、山梨糖醇等)，表面活性剂类(例如，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚氧乙烯酸酯(polyoxolate)等)，抗微生物剂类，和抗氧化剂类。

在一些实施例，本发明提供了治疗疾病、病症或病况的方法，包括向患有所述病症的患者施用治疗有效量的式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)的化合物或其药物组合物。

在一些实施例，本发明提供了预防疾病、病症或病况的方法，包括向患有所述病症的患者施用预防有效量的式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(IVa)、式(IVb)、式(IVc)、式(Va)、式(Vb)、式(Vc)、或式(Vd)的化合物或其药物组合物。

在一些实施例，本发明提供了治疗或预防选自由以下组成的组的疾病、病症、或病况的方法：增殖性疾病，神经退行性疾病，免疫性疾病，自身免疫性疾病，炎性疾病，皮肤病，代谢性疾病，心血管疾病，和胃肠道疾病。

本发明提供了调节细胞中LDLR(低密度脂蛋白受体)蛋白表达或胆固醇外排的方法，其包含使所述细胞与抗体药物偶联物(ADC)接触，其中所述ADC包含靶向所述细胞的抗体，亲水性残基，和LXR激动剂。

所述增殖性疾病可以是技术人员已知的任何增殖性疾病。在某些实施方案，所述增殖性疾病包括但不限于肿瘤学疾病，其中所述肿瘤学疾病可以是技术人员已知的任何癌症疾病。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防黑素瘤的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防转移性黑素瘤的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防肺癌的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防对EGFR-酪氨酸激酶抑制剂耐药的肺癌的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防口腔癌的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防口腔鳞状细胞癌的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防前列腺癌的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防霍奇金淋巴瘤的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防乳腺癌的方法。

所述神经退行性疾病可以是技术人员已知的任何神经退行性疾病。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防阿尔茨海默病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防帕金森病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防亨廷顿病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防肌萎缩性侧索硬化症的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防髓磷脂基因表达的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防髓鞘化和再髓鞘化病况、疾病或病症的方法。

所述免疫疾病可以是技术人员已知的任何免疫疾病。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防炎症性肠病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防溃疡性结肠炎的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防克罗恩病的方法。

所述炎性疾病可以是技术人员已知的任何炎性疾病。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防关节炎的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防类风湿性关节炎的方法。

所述代谢性疾病可以是技术人员已知的任何代谢性疾病。在某些实施方案，血脂异常选自由以下组成的组：高脂血症，高胆固醇血症，高甘油三酯血症，高脂蛋白血症，HDL缺乏症，ApoA-I缺乏症，和心血管疾病例如冠状动脉疾病(包括，例如，治疗和预防心绞痛、心肌梗塞、和心源性猝死)；动脉粥样硬化(包括，例如，治疗和预防动脉粥样硬化)；和再狭窄(包括，例如，预防或治疗由于诸如气囊血管成形术之类的医疗程序而形成的动脉粥样硬化斑块)。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防糖尿病的方法。

所述心血管疾病可以是技术人员已知的任何心血管疾病。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防动脉粥样硬化的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防源自异常巨噬细胞加工的动脉粥样硬化的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防源自氧化的低密度脂蛋白(oxLDL)形成的动脉粥样硬化的方法，其中巨噬细胞不能加工氧化的低密度脂蛋白(oxLDL)。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防缺血性心脏病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防中风的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防高血压性心脏病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防主动脉瘤的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防心内膜炎的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防外周动脉疾病的方法。在某些实施方案，本发明提供了治疗或预防本段提供的任何疾病的组合的方法。

在一些实施例，本发明阐述了调节核受体功能的方法。通过非限制性实例，所述功能可选自炎性介质(例如细胞因子、趋化因子)的表达/分泌，胆固醇调节，胆固醇摄入，胆固醇外排，胆固醇氧化、迁移、趋化性，细胞凋亡和坏死，炎性活性，脂质调节，细胞凋亡、迁移、趋化性，基因转录，和蛋白质表达。

在一些实施例，本发明阐述了治疗有需要的患者的疾病或病症的方法，所述方法包含向患者施用本发明所述的化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。

在一些实施例，本发明阐述了抗体-药物偶联物的方法，所述方法包含以下步骤：在适于在结合剂与化合物之间形成键的条件下，使所述结合剂与连接体-有效负载化合物接触。

在一些实施例，本发明阐述了治疗受试者增殖性疾病、代谢性疾病、炎症或神经退行性疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效治疗量的本发明所述化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。

在一些实施例，本发明阐述了治疗受试者的疾病、病症、或病况的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效治疗量的本发明所述化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。

在一些实施例，本发明阐述了治疗受试者增殖性疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效治疗量的本发明所述化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。

在一些实施例，本发明阐述了治疗受试者代谢性疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效治疗量的本发明所述化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。

在一些实施例，本发明阐述了治疗受试者炎症的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效治疗量的本发明所述化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。

在一些实施例，本发明阐述了治疗受试者神经退行性疾病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效治疗量的本发明所述化合物或药物组合物。在一些实施例，所施用的化合物是本发明所述的抗体-药物偶联物。

实施例

除非另有明确说明，否则试剂和溶剂均得自商业来源，例如国药集团化学试剂有限公司(Sinopharm Chemical ReagentCo.(SCRC))、Sigma-Aldrich、Alfa或其他供应商。

在Bruker AVIII 400或Bruker AVIII 500上记录¹H NMR和其他NMR光谱。用Nuts软件或MestReNova软件处理数据，测定内标(例如四甲基硅烷(TMS))低磁场的质子位移百万分率(ppm)。

HPLC-MS测定在Agilent 1200HPLC/6100SQ系统上运行，使用以下条件：

用于HPLC-MS测定的方法A包括作为流动相：A：水(0.01％三氟乙酸(TFA))和B：乙腈(0.01％TFA)；梯度相：5％的B，其在15分钟(min)内增加至95％的B；流速：1.0mL/min；色谱柱SunFire C18，4.6x50mm，3.5μm；柱温：50℃。检测器：模数转换器(ADC)蒸发光散射检测器(ELSD)，二极管阵列检测器(DAD)(214nm和254nm)，电喷雾电离-大气压电离(ES-API)。

用于HPLC-MS测定的方法B包括作为流动相：A：水(10mM NH₄HCO₃)和B：乙腈；梯度相：在15分钟(min)内由5％的B增加至95％的B；流速：1.0mL/min；色谱柱：XBridge C18，4.6x50mm，3.5μm；柱温：50℃。检测器：ADC ELSD，DAD(214nm和254nm)，质量选择检测器(MSD)(ES-API)。

LC-MS测定在Agilent 1200HPLC/6100SQ系统上运行，使用以下条件：

用于LC-MS测定的方法A包含作为仪器：WATERS 2767；色谱柱：Shimadzu Shim-Pack，PRC-ODS，20x250mm，15μm，两个串联连接；流动相：A：水(0.01％TFA)，B：乙腈(0.01％TFA)；梯度相：在3分钟内由5％的B增加至95％的B；流速：1.8-2.3mL/min；色谱柱：SunFireC18，4.6x50mm，3.5μm；柱温：50℃；检测器：ADC ELSD，DAD(214nm和254nm)，ES-API。

用于LC-MS测定的方法B包括作为仪器：Gilson GX-281；色谱柱：Xbridge PrepC18 10μm OBD，19x250mm；流动相：A：水(10mM NH₄HCO₃)，B：乙腈；梯度相：在3分钟内由5％的B增加至95％的B；流速：1.8-2.3mL/min；色谱柱：XBridge C18，4.6x50mm，3.5μm；柱温：50℃。检测器：ADC ELSD，DAD(214nm和254nm)，MSD(ES-API)。

在Gilson GX-281仪器上以酸性(方法A)或碱性(方法B)溶剂体系进行制备型高压液相色谱(制备型HPLC)。所述酸性溶剂体系采用Waters SunFire 10μm C18柱(

250x19mm)，和用于制备型HPLC的溶剂A是水/0.05％TFA，和溶剂B是乙腈。洗脱条件是线性梯度，其在20分钟的时间段内以30mL/min的流速，从5％的溶剂B增至100％的溶剂B。所述碱性溶剂体系包括Waters Xbridge 10μm C18柱(

250x 19mm)，和用于制备型HPLC的溶剂A是水/10mM碳酸氢铵(NH₄HCO₃)，和溶剂B是乙腈。洗脱条件是线性梯度，其在20分钟的时间段内以30mL/min的流速，从5％的溶剂B增至100％的溶剂B。

使用Agela Flash Column silica-CS柱在Biotage仪器上进行快速色谱法；在Biotage仪器上使用Boston ODS或Agela C18柱进行反相快速色谱法。

分析型手性HPLC方法-SFC条件

仪器：SFC方法(SFC Method Station)(Thar,Waters)

柱子：CHIRALPAKAD-H/AS-H/OJ-H/OD-H 4.6×100mm,5μm(Daicel)

柱温：40℃

流动相：CO₂/IPA(0.1％DEA)＝55/45

流速：4.0mL/min

背压：120Bar

进样量：2μL

制备型手性HPLC方法-SFC条件

仪器：SFC-80(Thar,Waters)

柱子：CHIRALPAKAD-H/AS-H/OJ-H/OD-H 20×250mm,10μm(Daicel)

柱温：35℃

流动相：CO₂/IPA(0.2％甲醇氨)＝30/70

流速：80g/min

背压：100bar

检测波长：214nm

循环时间：6.0min

样品溶液：将1500mg溶于70mL甲醇

进样量：2mL(载量：42.86mg/针)

如本发明使用的，无论是否具体定义了特定缩写，在所述方法、方案和实施例中使用的符号和惯例均与当代科学文献(例如，《美国化学学会杂志》或《生物化学杂志》)中使用的那些一致。具体但不限于，以下缩写可用于实施例和整个说明书。

具体但不限于，以下缩写可用于实施例和整个说明书：

制备方法

表1

有效负载列表

表2

带电的连接体有效负载列表

实施例1

连接体有效负载的一般制备方法(参见图2)

由Fmoc-vcPAB-PNP(2a)、Fmoc-Val-Ala-OH(2b)和Fmoc-Val-Cit-OH(2c)与有效负载A-D开始得到氨基甲酸酯类化合物(3a-g)来合成连接体-有效负载1(1h和1l除外)。由3a-f与Fmoc-D-Lys-COT(4a)来合成得到酰胺类化合物(5a-h)。将5a-f与叠氮化物(6a-d)环合得到7。最后，将7与酸8a或其活化酯8b反应，得到连接体-有效负载1(1h和1l除外)。

由Fmoc-vcPAB-PNP(2a)、Fmoc-Val-Ala-OH(2b)和Fmoc-Val-Cit-OH(2c)与有效负载A-E开始得到氨基甲酸酯类化合物(3a-g)来合成连接体-有效负载I、II、III和IV(Ig-1、Ih-1、1h和1l除外)。由3a-g与Fmoc-D-Lys-COT(4a)来合成得到酰胺类化合物(5a-g)。将5a-g与叠氮化物(6a-g)环合得到7。最后，将7与酸8a或其活化酯8b-e反应，得到连接体-有效负载I、II、III和IV(Ig-1、Ih-1除外)。

实施例2

有效负载1h和1l的制备(参见图3)

在EDCI的缩合条件下，由3b和3e分别与Fmoc-dGlu-牛磺酸(4b)开始缩合反应，随后进行脱Fmoc反应，最后用活化酯8b进行酰胺化，来合成连接体-有效负载1h和1l。由3b和3e分别与Fmoc-dGlu-牛磺酸(4b)开始缩合反应，随后进行脱Fmoc反应，最后用活化酯8b进行酰胺化，来合成连接体-有效负载1h和1l。

由3a与Fmoc-dGlu-乙缩醛葡糖酰胺(4c)开始进行酰胺偶联反应，随后与8e进行缩合，最后用TFA脱保护，并随后与8b进行缩合，来合成连接体-有效负载Ig-1和Ih-1。

实施例3

连接体有效负载B和C的制备(参见图4)

MMAE(A)可商购得到，CAS号为474645-27-7。根据图4，由商购的醋酸氟轻松9(CAS：67-73-2)开始制备得到甾族有效负载B和C。将通过在高氯酸存在下与丁醛进行缩酮交换，由9得到的化合物10转化为甲磺酸酯11，然后用叠氮化物基团部分替换甲磺酸酯基团以形成12，将其进一步还原为胺B。另外，11中的甲磺酸酯基团部分也将被4-氨基苯酚替换，得到苯胺C。

(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-8-(2-羟基乙酰基)-9,13-二甲基-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-16-酮(10)

在10℃下，向醋酸氟轻松(9，0.90g，2.0mmol)和硅胶(18g)的庚烷混合物中加入丁醛(0.27mL，3.0mmol)，所得悬浮液在10-20℃下搅拌10分钟。在0℃下，向混合物中滴加高氯酸(70％，0.68mL，8.3mmol)。然后将反应混合物在10-20℃下搅拌过夜。根据TLC和LCMS监测，大部分醋酸氟轻松9耗尽。将反应混合物用石油醚稀释，然后用饱和Na₂CO₃水溶液淬灭。将悬浮液过滤，所得固体用DCM/甲醇(v/v＝1)洗。合并的滤液真空浓缩。所得残余物经硅胶快速色谱法纯化(0-100％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到化合物10(0.15g，16％收率)为白色固体。ESI m/z:467.1(M+H)⁺。

2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基甲磺酸酯(11)

在0℃下，向化合物10(0.28g，0.65mmol)和三乙胺(0.13g，1.3mmol)的DCM(3mL)溶液中加入甲磺酰氯(89mg，0.78mmol)。混合物在0℃下搅拌0.5小时后，将反应混合物用DCM(20mL)稀释。混合物用水(20mL×2)洗，经无水Na₂SO₄干燥，过滤，真空浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱在硅胶上纯化(0-50％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到化合物11(0.26g，>99％收率)为白色固体。ESI m/z:545(M+H)⁺。

(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-叠氮基乙酰基)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-16-酮(12)

在50℃下，将化合物11(1.0g，1.8mmol)和叠氮化钠(1.2g，18mmol)的丙酮(15mL)悬浮液搅拌过夜。将混合物冷却至室温，然后倒入水(80mL)中。含水混合物用乙酸乙酯(50mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(30mL)洗，经无水Na₂SO₄干燥，过滤，真空浓缩，得到粗制化合物12(0.90g，＞99％收率)为黄色固体，其无需进一步纯化直接用于下一步骤。ESIm/z:492(M+H)⁺。

有效负载B

(1S,2S,4R,6R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-(2-氨基乙酰基)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-16-酮；三氟乙酸盐(化合物B)

向化合物12(0.85g，1.7mmol)的THF(20mL)溶液中加入盐酸水溶液(1N，10mL)。混合物在28-32℃下搅拌直至变澄清，然后向混合物中加入三苯膦(0.68g，2.6mmol)。所得黄色澄清溶液在室温下搅拌18小时。将混合物真空浓缩，残余物经反相快速色谱法纯化(0-50％乙腈的TFA(0.05％)水溶液)，得到化合物B(0.56g，57％收率，TFA盐)为类白色固体。ESI m/z:466(M+H)⁺。¹H NMR(400MHz,MeOD_d4)δ7.33(d,J＝9.9Hz,1H),6.40-6.29(m,2H),5.69-5.45(m,1H),4.93-4.92(m,1H),4.71(t,J＝4.3Hz,1H),4.35-4.27(m,2H),3.90-3.84(m,1H),2.81-2.54(m,1H),2.42-2.06(m,3H),1.82-1.32(m,11H),1.09-0.87(m,6H)ppm。¹⁹FNMR(376MHz,CD₃OD)δ-77.01,-166.24,-166.92,-188.81,-188.83ppm。分析型HPLC:100％，保留时间：6.86min(方法A)。

有效负载C

(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-8-[2-(4-氨基苯氧基)乙酰基]-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-16-酮(C)

将化合物11(93mg，0.17mmol)、4-氨基苯酚(37mg，0.34mmol)和碳酸铯(0.11g，0.34mmol)的丙酮(0.5mL)混合物回流2小时。将混合物冷却至室温，并用H₂O(10mL)稀释。混合物用乙酸乙酯(10mL×3)萃取。合并的有机层用水(20mL)和盐水(20mL)洗，经Na₂SO₄干燥，过滤，真空浓缩。所得残余物经制备型HPLC纯化，得到有效负载C(6.0mg，6.3％收率)为白色固体。ESI m/z:298(M/2+H)⁺,558(M+H)⁺(10％)。¹H NMR(500MHz,MeOD_d4)δ7.34(d,J＝10.0Hz,1H),6.78-6.71(m,4H),6.37-6.33(m,2H),5.63-5.49(m,1H),5.10-4.99(m,1H),4.77-4.63(m,2H),4.33(d,J＝9.1Hz,1H),2.74-2.57(m,1H),2.39-2.13(m,3H),1.98-1.31(m,12H),1.03-0.93(m,6H)ppm。分析型HPLC：纯度97.4％，保留时间：7.55min(方法B)。

实施例4

有效负载D的制备(参见图5)

(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酸甲酯(14)

向罗汉松酸(13，90g，0.33mol)的甲醇(200mL)和甲苯(600mL)溶液中加入(三甲基硅烷基)重氮甲烷(2M的己烷溶液，200mL)。反应混合物在室温下搅拌2小时。然后根据LCMS监测，罗汉松酸完全耗尽。真空除去挥发物，将残余物在石油醚(2L)中研磨，得到化合物14(91g，96％收率)为白色固体。ESI m/z:289(M+H)⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO_d6)δ8.95(s,1H),6.79(d,J＝8.2Hz,1H),6.63(d,J＝2.4Hz,1H),6.48(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H),3.58(s,3H),2.80-2.55(m,2H),2.20-2.02(m,3H),1.96-1.71(m,2H),1.56-1.45(m,2H),1.27(t,J＝13.5Hz,1H),1.21(s,3H),1.09(td,J＝13.5,4.1Hz,1H),0.91(s,3H)ppm。

(1S,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酸甲酯(20)

将化合物14(12g，40mmol)和碳酸铯(14g，44mmol)的DMF(100mL)混合物在20-25℃下搅拌15分钟。在室温下，向所得混合物中加入苄基溴(7.1mL，60mmol)。混合物在室温下搅拌4小时后，将所得混合物倒入冷水中，然后用乙酸乙酯萃取。合并的有机溶液用水和盐水洗，经硫酸钠干燥，真空浓缩。粗产物经快速色谱法纯化(0-10％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到标题化合物20(13g，89％收率)为白色固体。ESI m/z:379(M+H)⁺。¹H NMR(500MHz,MeOD_d4)δ7.60-7.20(m,5H),7.00-6.82(m,2H),6.73(d,J＝7.1Hz,1H),5.03(s,2H),3.66(s,3H),2.95-2.58(m,2H),2.36-2.10(m,3H),2.10-1.85(m,2H),1.70-1.48(m,2H),1.44-1.21(m,4H),1.15(t,J＝17.2Hz,1H),1.01(s,3H)ppm。

(1S,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羧酸(21)

将化合物20(11g，29mmol)和叔丁醇钾(33g，0.29mol)的DMSO(0.19L)混合物在100℃下搅拌1小时，直至完全脱去甲基，通过LCMS和TLC进行监测。混合物冷却至25℃后，将混合物用盐酸水溶液(1N)淬灭，然后用乙酸乙酯萃取。合并的有机溶液用盐水洗，经硫酸钠干燥，真空浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(0-24％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到化合物21(7.5g，71％收率)为白色固体。ESI m/z:365(M+H)⁺。¹H NMR(500MHz,MeOD_d4)δ7.42(d,J＝7.4Hz,2H),7.36(t,J＝7.5Hz,2H),7.30(t,J＝7.3Hz,1H),6.92(d,J＝8.4Hz,1H),6.87(d,J＝2.5Hz,1H),6.72(dd,J＝8.4,2.5Hz,1H),5.02(s,2H),2.82(dd,J＝16.3,4.4Hz,1H),2.77-2.65(m,1H),2.24(d,J＝13.2Hz,2H),2.19(dd,J＝13.8,6.0Hz,1H),2.11-1.96(m,2H),1.64-1.56(m,1H),1.53(d,J＝11.0Hz,1H),1.35(td,J＝13.3,3.7Hz,1H),1.30(s,3H),1.13(s,3H),1.11-1.05(m,1H)ppm。

(1S,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酸五氟苯酯(22)

向21(9.6g，26mmol)的DMF(100mL)溶液中加入DIPEA(14mL，79mmol)和2,2,2-三氟乙酸全氟苯酯(15g，53mmol)。所得混合物在室温下搅拌过夜，通过LCMS进行监测。然后将反应混合物用乙醚(200mL)稀释，并用水(300mL)和盐水(200mL)洗。有机溶液经硫酸钠干燥，真空浓缩。所得残余物经快速色谱法纯化(0-10％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到化合物22(12g，88％收率)为白色固体。ESI m/z:531(M+H)⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO_d6)δ7.43(d,J＝7.1Hz,2H),7.38(t,J＝7.4Hz,2H),7.31(t,J＝7.2Hz,1H),6.93(dd,J＝10.2,5.5Hz,2H),6.76(dd,J＝8.4,2.5Hz,1H),5.05(s,2H),2.81(dd,J＝16.3,4.5Hz,1H),2.77-2.68(m,1H),2.28-2.19(m,2H),2.18(dd,J＝13.4,5.6Hz,1H),2.00-1.83(m,2H),1.74(d,J＝11.8Hz,1H),1.65(d,J＝14.1Hz,1H),1.47(s,3H),1.38-1.27(m,2H),1.08(s,3H)ppm。

N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-(苄氧基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酸叔丁酯(23)

在-78℃下，向化合物18(2.3g，6.2mmol)的THF(20mL)溶液中滴加n-BuLi(2.5M的己烷溶液，5.5mL，14mmol)。反应在此温度下搅拌1小时。向混合物中加入22(3.0g，5.6mmol)的THF(20mL)溶液，然后将所得混合物在10-20℃下搅拌过夜，直至化合物22耗尽，通过LCMS进行监测。反应用饱和氯化铵水溶液淬灭，然后用乙酸乙酯萃取。合并的有机溶液用水和盐水洗，经硫酸钠干燥，真空浓缩。所得残余物经快速色谱法纯化(0-30％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到化合物23(1.59g，51％收率)为白色固体。ESI m/z:719(M+1)⁺。

N-[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酸叔丁酯(24)

在氮气保护下，向23(2.0g，2.78mmol)的乙酸乙酯(40mL)溶液中加入湿的钯/碳(10％Pd，0.9g)。将混合物脱气并用氢气充满，然后在室温下、在氢气球下搅拌过夜，直至23完全耗尽，通过LCMS进行监测。混合物通过硅藻土过滤，滤液真空浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱法纯化(0-55％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到24(1.06g，61％收率)为白色固体。ESIm/z:629(M+H)⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO_d6)δ9.10(s,1H),8.98(s,1H),8.11(s,1H),7.40(s,1H),7.15(d,J＝7.5Hz,1H),6.90(d,J＝8.4Hz,1H),6.81(d,J＝8.3Hz,1H),6.63(d,J＝2.3Hz,1H),6.50(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H),2.84(td,J＝16.3,3.8Hz,2H),2.77-2.64(m,2H),2.30-2.22(m,2H),2.14(t,J＝10.9Hz,4H),2.00-1.80(m,4H),1.65-1.54(m,4H),1.45(s,9H),1.34-1.28(m,2H),1.27(d,J＝2.5Hz,6H),1.15-1.08(m,2H),0.99(s,6H)ppm。

有效负载D

(1S,4aS,10aR)-N-[(1S,4aS,10aR)-6-氨基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酰胺(D)

在室温下，向化合物24(0.17g，0.27mmol)的DCM(10mL)溶液中滴加TFA(3mL)。反应混合物在室温下搅拌1小时，直至根据LCMS监测已脱去Boc。真空浓缩除去挥发物，所得残余物经制备型HPLC(方法B)纯化，得到D(0.10g，70％收率)为白色固体。

ESI m/z:529.3(M+1)⁺。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.14(s,1H),6.92(d,J＝8.3Hz,1H),6.86(d,J＝8.1Hz,1H),6.73(d,J＝2.5Hz,1H),6.65-6.57(m,2H),6.50(dd,J＝8.1,2.3Hz,1H),4.75(s,1H),3.49(s,1H),2.99-2.85(m,2H),2.79(tt,J＝11.6,5.8Hz,2H),2.34-2.14(m,6H),2.15-1.95(m,4H),1.74-1.51(m,5H),1.46-1.34(m,2H),1.30(s,6H),1.21-1.06(m,8H)ppm。

¹H NMR(400MHz,DMSO_d6)δ8.99(s,1H),8.09(s,1H),6.81(d,J＝8.0Hz,1H),6.68(d,J＝8.0Hz,1H),6.63(d,J＝2.5Hz,1H),6.50(dd,J＝8.0,2.5Hz,1H),6.48(d,J＝2.5Hz,1H),6.34(dd,J＝8.0,2.5Hz,1H),4.69(s,2H),2.86-2.60(m,4H),2.28-2.10(m,6H),1.94-1.75(m,4H),1.65-1.53(m,4H),1.35-1.20(m,8H),1.20-1.06(m,2H),0.98(s,6H)ppm。

¹³C NMR(100MHz,DMSO_d6)δ174.03,173.92,155.34,148.39,147.63,146.43,129.56,129.09,124.60,121.65,113.23,112.58,111.81,110.77,52.32,52.09,45.56,45.52,39.20,39.36,38.23,38.17,37.18,37.12,31.08,31.00,27.65,27.64,23.08,23.03,21.43,21.27,19.64,19.61ppm。

HPLC(方法B)：保留时间：8.92min，纯度：99.4％。手性HPLC：>99.9％(在柱AD、AS、OD和OJ中)。

旋光度(α)：+2.53°(1.7g/100mL THF,25℃)。

有效负载E

(1S,4aS,10aR)-6-((S)-2-氨基-3-羟基丙酰胺基)-N-((1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酰胺(E)

在25℃下，向Fmoc-Ser-OH(30mg，0.1mmol)的DMF(1mL)溶液中加入HATU(38mg，0.1mmol)和DIPEA(39mg，0.3mmol)。所得混合物在此温度下搅拌1小时。然后向混合物中加入D(30mg，0.06mmol)，将反应混合物在25℃下搅拌16h。向混合物中加入哌啶(0.2mL)，所得混合物在室温下再搅拌30分钟。真空除去挥发物，所得残余物经制备型HPLC(方法B)直接纯化，得到所需产物(18mg，51％收率)为白色固体。ESI m/z:616(M+1)⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO-_d6)δ9.74(br s,1H,CONH-Ph),9.00(s,1H,OH),8.11(s,1H,酰亚胺啶(imidine)的NH),7.58(s,1H),7.41(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),6.96(d,J＝8.4Hz,1H),6.82(d,J＝8.3Hz,1H),6.63(d,J＝2.3Hz,1H),6.50(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H),4.82(t,J＝5.5Hz,1H,Ser上的OH),3.62-3.45(m,3H),2.97-2.61(m,4H),2.33-2.21(m,2H),2.21-2.03(m,4H),1.96-1.77(m,4H),1.70-1.50(m,4H),1.36-1.20(m,8H),1.23-1.06(m,2H),1.06-0.93(m,6H)ppm。

实施例5

中间体3a-c、3g的制备(参见图6)

一般方法A：室温下，向有效负载(A、B、C或E，1.0当量)的DMF(0.3mL/10mg有效负载)溶液中加入Fmoc-vcPAB-PNP 2a(1.1当量)、HOBt(1.5当量)和DIPEA(2.0当量)。混合物在室温下搅拌3小时，直至有效负载完全耗尽，通过LCMS进行监测。向反应混合物中加入二乙胺(0.03mL/10mg有效负载)，混合物在室温(18-30℃)下搅拌1小时，直至脱去Fmoc。将混合物过滤，滤液真空浓缩。所得残余物经反相快速色谱法或制备型HPLC纯化，得到标题化合物(3a、3b、3c或3g)。

4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基(S)-1-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧丁烷-2-基氨基)-3-甲基-1-氧丁烷-2-基(甲基)氨基甲酸酯(3a)(vcPAB-MMAE)

[参考文献：WO2012/166560]根据一般方法A，由化合物2a(90mg，纯度75％，88μmol)和有效负载A(45mg，63μmol)得到化合物3a(28mg，40％收率)为白色粉状物。ESI m/z:1123.5(M+H)⁺。¹H NMR(DMSO_d6,500MHz):δ10.12(br s,1H),8.25-8.05(m,2H),7.89-7.58(m,3H),7.34-7.16(m,7H),5.98(t,J＝5.5Hz,1H),5.42-5.34(m,3H),5.06-4.95(m,2H),4.78-4.57(m,1H),4.51-4.26(m,3H),3.80-3.40(m,2H),3.28-3.18(m,7H),3.12-2.84(m,10H),2.43-2.40(m,1H),2.30-2.27(m,1H),2.15-1.91(m,5H),1.96-1.68(m,4H),1.59-1.34(m,6H),1.06-0.93(m,6H),0.90-0.70(m,26H)ppm。

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯(3b)

根据一般方法A，由化合物2a(93mg，0.20mmol)和有效负载B，并通过反相快速色谱法(50-80％乙腈的碳酸氢铵水溶液(10mM))纯化后得到化合物3b为白色固体。ESI m/z:871(M+H)⁺。

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酸酯(3c)

根据一般方法A，由化合物2a(0.10g，0.22mmol)和有效负载C，并通过反相快速色谱法(50-80％乙腈的碳酸氢铵水溶液(10mM))纯化后得到化合物3c(160mg，76％收率)为白色固体。ESI m/z:963.4(M+H)⁺。

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}-2-羟基乙基]氨基甲酸酯(3g)

向Fmoc-vc-PAB-PNP(58mg，76μmol)和E(36mg，58μmol)的DMF(3mL)溶液中加入HOBt(7.9mg，58μmol)和DIPEA(15mg，0.12mmol)，混合物在30℃下搅拌16小时。然后根据LCMS监测，化合物E完全耗尽。向所得混合物中加入二乙胺(0.1mL)，将其在室温搅拌1小时直至脱去Fmoc，通过LCMS进行监测。反应混合物过滤后，将滤液直接经制备型HPLC(方法B)纯化，得到化合物3g(36mg，48％收率)为浅黄色固体。ESI m/z:1021(M+1)⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO_d6)δ10.02(s,1H),9.82(s,1H),9.00(s,1H),8.69-8.65(m,1H),8.11-8.00(m,4H),7.65-7.53(m,3H),7.40-7.30(m,3H),7.30-7.20(m,1H),6.96(d,J＝8.0Hz,1H),6.81(d,J＝8.0Hz,1H),6.65-6.61(m,1H),6.50(dd,J＝8.0Hz,2.0Hz,1H),6.00-5.95(m,1H),5.48(s,2H),5.00-4.95(m,3H),4.60-4.40(m,1H),4.25-4.20(m,1H),3.65-3.55(m,4H),3.15-2.55(m,10H),2.40-2.20(m,3H),2.20-2.00(m,5H),2.00-1.80(m,4H),1.86-1.55(m,6H),1.27(d,J＝4.8Hz,9H),1.20-1.10(m,2H),0.97-0.90(m,6H)ppm。

实施例6

中间体3d和3f的制备(参见图7)

一般方法B：在室温下，向Fmoc-Val-Ala-OH(2b，1.2当量)的DMF(25mL/g有效负载)溶液中加入HATU(1.5当量)和DIPEA(3.0当量)。混合物在室温下搅拌5分钟，然后加入有效负载(C或D，1.0当量)。将混合物再搅拌2小时，LCMS显示反应完成。向反应混合物中加入二乙胺(5当量)。将混合物在室温下搅拌2小时，直至根据LCMS监测已完全脱去Fmoc。将混合物过滤，滤液真空浓缩。所得残留物经反相快速色谱法纯化(0-100％乙腈的碳酸氢铵水溶液(10mM))或制备型HPLC(方法B)纯化，得到所需产物(3d或3f，从有效负载开始的收率为64-72％)。

(2S)-2-氨基-N-[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]-3-甲基丁酰胺(3d)

根据一般方法B，由化合物2b(0.50g，0.90mmol)和有效负载C，并通过反相快速色谱法(0-100％乙腈的碳酸氢铵水溶液(10mM))纯化后得到化合物3d(0.69g，72％收率)为粘稠黄色油状物。ESI m/z:728(M+H)⁺。

(1S,4aS,10aR)-6-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-N-((1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酰胺(3f)

根据一般方法B，由化合物2b和有效负载D(53mg，0.10mmol)，并通过制备型HPLC(方法B)纯化后得到化合物3f(45mg，64％收率)为白色固体。ESI m/z:699(M+1)⁺。¹H NMR(500MHz,MeOD_d4)δ8.40(s,1H),7.47(s,1H),7.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.03(d,J＝8.3Hz,1H),6.88(d,J＝8.2Hz,1H),6.72(d,J＝2.4Hz,1H),6.56(dd,J＝8.3,2.4Hz,1H),4.60-4.48(m,1H),3.22-3.11(m,1H),3.02-2.93(m,1H),2.92-2.76(m,3H),2.74-2.70(m,1H),2.43-2.31(m,3H),2.28(d,J＝14.1Hz,3H),2.16-1.96(m,3H),1.81(s,1H),1.78-1.65(m,4H),1.53-1.42(m,4H),1.38(d,J＝5.3Hz,6H),1.33-1.22(m,2H),1.14(d,J＝6.6Hz,6H),1.09(d,J＝18.6Hz,6H)ppm。

实施例7

中间体3e的制备(参见图8)

(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)-N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)戊酰胺(3e)

在室温下，向Fmoc-Val-Cit-OH(0.23g，0.43mmol)的DMF(5mL)溶液中加入HATU(0.38g，0.43mmol)和DIPEA(93mg，0.72mmol)。混合物在室温下搅拌5分钟，然后加入有效负载C(0.20g，0.36mmol)。将混合物再搅拌2小时，LCMS显示反应完成。向反应混合物中加入二乙胺(0.5mL)。混合物在室温下搅拌1小时，直至根据LCMS监测Fmoc完全脱去。将混合物过滤，滤液真空浓缩。所得残余物经反相快速色谱法纯化(0-100％乙腈的碳酸氢铵水溶液(10mM)，然后是甲醇)，得到化合物3e(从有效负载C开始的收率为38％)。ESI m/z:814(M+1)⁺。

实施例8

中间体4的制备(参见图9)

中间体4a是通过将Fmoc-(D)-Lys-OH用市售活化酯25进行酰胺化合成得到。

(2R)-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酸(4a)

向化合物25(65mg，0.23mmol，CAS：1425803-45-7)的DMF(2mL)混合物中加入Fmoc-D-Lys-OH(85mg，0.23mmol)和三乙胺(52mg，0.51mmol)。反应混合物在室温下搅拌30分钟。混合物通过反相快速色谱法(0-100％乙腈的水溶液(0.05％TFA))直接分离，得到中间体4a(85mg，收率70％)为白色固体。ESI m/z:533(M+H)+。¹H NMR(MeODd₄,500MHz):δ7.70(d,J＝7.5Hz,2H),7.59(t,J＝8.0Hz,2H),7.30(t,J＝7.5Hz,2H),7.22(t,J＝7.4Hz,2H),4.35-4.22(m,2H),4.22-4.09(m,2H),4.09-3.99(m,1H),3.94-3.81(m,1H),3.79-3.67(m,1H),3.15(t,J＝6.9Hz,2H),2.17-1.96(m,3H),1.96-1.86(m,1H),1.85-1.66(m,4H),1.66-1.41(m,5H),1.41-1.25(m,3H)ppm。

实施例9

中间体4b的制备(参见图10)

中间体4b是由Fmoc-(D)-Glu-O^tBu(26)合成得到。化合物26用HOSu活化，然后用牛磺酸进行酰胺化，得到化合物27，继而将其用TFA水解，得到中间体4b。

2-[(4R)-5-(叔丁氧基)-4-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-5-氧戊酰胺基]乙烷-1-磺酸(27)

在室温下，向Fmoc-(D)-Glu-O^tBu(26)(2.0g，4.7mmol)的DCM(20mL)溶液中加入HOSu(1.1g，9.6mmol)和EDCI(1.8g，9.4mmol)。混合物在RT下搅拌过夜，通过LCMS进行监测。将反应混合物用DCM(100mL)稀释，然后用水(50mL×2)和盐水(50mL)洗，经无水硫酸钠干燥，真空浓缩。将残余物溶于DMF(2mL)，并向此溶液中加入牛磺酸(1.2g，9.6mmol)和DIPEA(1.4g，14mmol)。所得混合物在室温下搅拌过夜，直至根据LCMS监测反应完成。反应混合物经制备型HPLC(方法B)直接纯化，得到化合物27(2.0g，81％收率)为白色固体。ESI m/z:477(M–55+H)⁺。

(2R)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-4-[(2-磺乙基)氨基甲酰基]丁酸(4b)

向化合物27(0.52g，0.98mmol)的DCM(2mL)溶液中加入TFA(2mL)。反应混合物在室温下搅拌3小时，直至根据LCMS监测水解完成。真空除去挥发物，所得残余物经反相快速色谱法纯化(0-100％乙腈的碳酸氢铵水溶液(10mM))，得到中间体4b(0.45g，97％收率)为白色固体。ESI m/z:477(M+H)⁺。¹H NMR(DMSO_d6,500MHz)δ7.89(d,J＝7.5Hz,2H),7.72(d,J＝7.5Hz,2H),7.42(t,J＝7.5Hz,2H),7.34(t,J＝7.5Hz,2H),7.21-7.17(br s,1H),4.27-4.23(m,2H),3.82-3.79(m,1H),3.27-3.19(m,1H),2.71-2.67(m,1H),2.54(t,J＝7.5Hz,2H),2.13-1.89(m,2H),1.80-1.75(m,1H),1.07-1.06(m,4H)ppm(质子COOH未示出)。

化合物4c是通过J.Org.Chem.2010,75,3685-3691中概述的合成方法制备得到，并以25％的总收率得到化合物4c。ESI m/z:613.3(M+H)⁺。

实施例10

中间体5a-g的制备(参见图11)

一般方法D：在室温下，向化合物4a(1.2当量)的DMF溶液(0.2mL/10mg 4a)中加入HATU(1.4当量)和DIPEA(3当量)。将混合物在室温下搅拌5分钟，然后加入化合物3(1.0当量)。将反应混合物在室温下搅拌2小时，直至化合物3a-g完全耗尽，通过LCMS进行监测。向反应混合物中加入二乙胺(5.0当量)。混合物在室温下搅拌2小时。将混合物过滤，滤液浓缩。所得残余物经反相快速色谱法(0-100％乙腈的碳酸氢铵水溶液(10mM))或制备型HPLC(方法B)纯化，得到化合物5a-g。

4-((2S)-2-((2S)-2-((2R)-2-氨基-6-(2-(环辛-2-炔基氧基)乙酰胺基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基(S)-1-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧丁烷-2-基氨基)-3-甲基-1-氧丁烷-2-基(甲基)氨基甲酸酯(5a)

根据一般方法D，由化合物3a(38mg，34μmol)和化合物4(34mg，64μmol)得到化合物5a(17mg，35％收率)为白色固体。ESI m/z:1415(M+1)⁺。¹H NMR(DMSO_d6,400MHz)δ10.09-10.02(m,1H),8.54(d,J＝8.4Hz,1H),8.38(d,J＝7.5Hz,1H),8.35-8.26(m,0.5H),8.12-8.02(m,3H),7.94-7.85(m,0.5H),7.66-7.54(m,3H),7.34-7.23(m,6H),7.20-7.13(m,1H),6.08-5.97(m,1H),5.54-5.37(m,3H),5.13-4.94(m,2H),4.52-4.21(m,6H),4.03-3.70(m,4H),3.63-3.51(m,1H),3.25-3.17(m,8H),3.13-2.82(m,10H),2.31-1.91(m,10H),1.85-1.64(m,9H),1.64-1.25(m,15H),1.07-0.96(m,6H),0.90-0.74(m,26H)ppm。

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯(5b)

根据一般方法D，由化合物3b(0.20g，0.23mmol)开始，并通过制备型HPLC(方法B)分离后得到化合物5b(0.12g，45％收率)为白色固体。ESI m/z:1385(M+1)⁺。¹H NMR(400MHz,MeOD_d4)δ7.65-7.55(m,2H),7.40-7.26(m,3H),6.39-6.27(m,2H),5.65-5.45(m,1H),5.13-5.01(m,2H),4.71-4.50(m,2H),4.40-4.14(m,4H),4.11-3.82(m,3H),3.46-3.39(m,1H),3.29-3.09(m,4H),2.76-2.54(m,1H),2.41-2.10(m,7H),2.09-1.99(m,1H),1.96-1.80(m,5H),1.78-1.21(m,23H),1.06-0.82(m,12H)ppm。

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酸酯(5c)

根据一般方法D，由化合物3c(55mg，54μmol)和4a，得到化合物5c(0.10g，57％收率)为白色固体。ESI m/z:1255.5(M+1)⁺。¹H NMR(400MHz,MeOD_d4)δ7.61(d,J＝8.4Hz,2H),7.32-7.39(m,5H),6.84-6.88(m,2H),6.31-6.36(m,2H),5.05-5.16(m,3H),4.71-4.83(m,1H),4.50-4.54(m,1H),4.18-4.33(m3H),3.00-2.85(m,2H),3.40-3.51(m,1H),3.00-3.29(m,6H),1.31-2.35(m,34H),1.29(t,J＝7.2Hz,2H),0.93-1.02(m,12H)ppm。

(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]己酰胺(5d)

根据一般方法D，由化合物3d(0.28g，0.38mmol)开始，并通过制备型HPLC(方法B)分离后得到化合物5d(0.21g，46％收率)为白色固体。ESI m/z:1021.5(M+1)⁺。¹H NMR(400MHz,MeOD_d4)δ7.33-7.60(m,3H),6.87-6.91(m,2H),6.32-6.37(m,2H),5.47-5.65(m,1H),5.07-5.30(m,1H),4.72-4.86(m,3H),4.34-4.51(m,3H),3.83-4.20(m,3H),3.33-3.49(m,1H),3.14-3.27(m,3H),2.59-2.75(m,1H),1.31-2.39(m,33H),0.93-1.05(m,12H)ppm。

(2R)-2-氨基-N-[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺(5e)

根据一般方法D，由化合物3e(0.10g，0.12mmol)开始，并通过反相快速色谱法(0-100％乙腈的碳酸氢铵水溶液(10mM))纯化后得到化合物5d(0.12g，88％收率)为白色固体。ESI m/z:553.7(M/2+1)⁺。

(1S,4aS,10aR)-6-((2S)-2-((2S)-2-((2R)-2-氨基-6-(2-(环辛-2-炔基氧基)乙酰胺基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)-N-((1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基)-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-甲酰胺(5f)

根据一般方法D，由化合物3f(80mg，0.11mmol)开始，并通过制备型HPLC(方法B)分离后得到化合物5f(48mg，84％收率)为白色固体。ESI m/z:991.5(M+1)⁺。

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}-2-羟基乙基]氨基甲酸酯(5g)

在室温下，向化合物4a(24mg，44μmol)的DMF(2mL)溶液中依次加入HATU(17mg，44μmol)和化合物3g(35mg，34μmol)。混合物在室温下搅拌几分钟，直至混合物均匀。在室温下通过注射器向此混合物中加入DIPEA(8.8mg，68μmol)。所得混合物在室温下搅拌2小时，直至根据LCMS监测3g已大部分耗尽。然后在室温下向此反应混合物中滴加二乙胺或哌啶(0.1mL，过量)^[1]，将混合物搅拌1小时，直至脱去Fmoc基团，通过LCMS进行监测。反应混合物经制备型HPLC(方法B)直接纯化，得到化合物5g(15mg，33％收率)为白色固体。ESI m/z:1313.6(M+H)⁺。¹H NMR(500MHz,MeOD_d4)δ7.59(d,J＝8.5Hz,2H),7.51(s,1H),7.36-7.26(m,3H),7.01(d,J＝8.5Hz,1H),6.88(d,J＝8.0Hz,1H),6.72-6.71(m,1H),6.57-6.54(m,1H),5.09(s,2H),4.64-4.52(m,1H),4.35-4.28(m,2H),4.21(d,J＝7.0Hz,1H),4.01-3.98(m,1H),3.88-3.84(m,3H),3.43(t,J＝6.5Hz,1H),3.26-3.10(m,4H),3.00-2.76(m,3H),2.38-2.24(m,7H),2.19-2.02(m,9H),1.98-1.78(m,4H),1.74-1.54(m,12H),1.45-1.26(m,14H),1.13(s,6H),1.00(t,J＝7.5Hz,6H)ppm。

实施例10-1

化合物10a-d的制备(图11C)

化合物10a-d根据图11C所示的酰胺偶联方法制备得到。

化合物10a-d的一般方法D2：在室温下，向DIBAC-suc-PEG₄-酸8a(1.1-1.3当量)的DMF溶液(1mL/5-10mg8a)中加入HATU(1.5当量)和DIPEA(5.0当量)。混合物在室温下搅拌半小时，然后加入化合物3(1.0当量)。所得混合物在室温下搅拌直至化合物3被耗尽，通过LCMS进行监测。将反应化合物过滤后，滤液直接经制备型HPLC纯化，得到化合物10a-d。

实施例10A

化合物10a的制备(参见图11A)

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯10a

在室温下，通过注射器向Fmoc-VC-PAB-PNP(10-1，0.17g，0.22mmol)和化合物B(93mg，0.20mmol)的DMF(3mL)溶液中加入DIPEA(51mg，0.40mmol)。混合物在室温下搅拌3小时，并根据LCMS监测大部分物料耗尽。向所得混合物中加入哌啶(0.3mL，过量)，并将反应混合物在室温下搅拌1小时，直至完全脱去Fmoc，通过LCMS进行监测。混合物通过膜过滤后，将滤液直接经制备型HPLC(方法B)纯化，得到化合物3b(0.13g，73％收率)为白色固体。ESI m/z:871(M+1)⁺。

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0⁴,⁹]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0²,⁹.0⁴,⁸.0¹³,¹⁸]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酸酯10a

在室温下，向酸8a(30mg，54μmol)的DMF(5mL)溶液中依次加入DIPEA(13mg，0.10mmol)和HATU(31mg，81μmol)。所得混合物在此温度下搅拌0.5小时，然后加入胺3b(43mg，50μmol)。反应混合物在室温下搅拌3小时，直至胺完全耗尽，通过LCMS进行监测。反应混合物通过膜过滤，然后将滤液经制备型HPLC(方法B)进行分离，得到化合物10a(16mg，23％收率)为白色固体。ESI m/z:1406(M+H)⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO_d6)δ9.99(s,1H),8.11(d,J＝7.5Hz,1H),7.88(d,J＝8.5Hz,1H),7.80-7.75(m,1H),7.70-7.66(m,1H),7.65-7.60(m,3H),7.53-7.33(m,6H),7.33-7.28(m,3H),6.30(dd,J＝10.0Hz,1.5Hz,1H),6.11(s,1H),6.10-6.00(m,1H),5.72-5.55(m,2H),5.41(s,2H),5.05-5.01(m,1H),4.97(s,2H),4.80-4.72(m,1H),4.60-4.58(m,1H),4.43-4.33(m,1H),4.25-4.10(m,3H),3.88-3.80(m,1H),3.65-3.55(m,3H),3.50-3.40(m,12H),3.30-3.25(m,2H),3.12-2.90(m,4H),2.70-2.55(m,2H),2.48-2.35(m,2H),2.30-2.20(m,2H),2.15-1.95(m,4H),1.86-1.65(m,3H),1.64-1.54(m,5H),1.49(s,4H),1.46-1.34(m,5H),0.90-0.80(m,12H)ppm。分析型HPLC：100％，保留时间：7.40min(方法B)。溶解度：0.02mg/mL水。

实施例10B

1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-{[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基]氨基甲酰基}-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺10b的制备(参见图11B)

根据图11B所示的酰胺偶联方法进行制备。根据一般方法D2，将胺3f(20mg，29μmol)、酸8a(18mg，33μmol)、HATU(33mg，87μmol)和DIPEA(33mg，87μmol)在15-20℃下、于1mLDMF中搅拌16小时，反应混合物经制备型HPLC(方法B)进行纯化。10b的收率：10mg，28％。ESIm/z:1234(M+H)⁺。

¹H NMR(500MHz,CH₃OD_d4)δ7.65(d,J＝7.4Hz,1H),7.62-7.51(m,2H),7.48-7.28(m,6H),7.27-7.21(m,1H),7.00(d,J＝8.5Hz,1H),6.88(d,J＝8.0Hz,1H),6.72(d,J＝2.4Hz,1H),6.56(dd,J＝8.3,2.4Hz,1H),5.15-5.10(m,1H),4.52-4.43(m,1H),4.20(d,J＝6.5Hz,0.5H),4.04(d,J＝7.9Hz,0.5H),3.77-3.64(m,3H),3.63-3.49(m,12H),3.47-3.39(m,2H),3.24(t,J＝5.5Hz,2H),2.99-2.66(m,5H),2.57-2.42(m,2H),2.42-1.94(m,14H),1.76-1.63(m,4H),1.48-1.21(m,13H),1.14-1.10(m,6H),1.05-0.97(m,6H)ppm。

分析型HPLC：>99％，保留时间：9.21min(方法B)。

溶解度：<0.1mg/mL水。

实施例10C

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酸酯(10c)

根据一般方法D2，由化合物3c(58mg，60μmol)和化合物8a，得到化合物10c(20mg，22％收率)为白色固体。ESI m/z:1499(M+H)⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO_d6)δ10.02(s,1H),9.59(s,1H),8.14(d,J＝7.6Hz,1H),7.88(d,J＝8.8Hz,1H),7.80-7.75(m,1H),7.70-7.66(m,1H),7.65-7.60(m,3H),7.53-7.45(m,3H),7.40-7.28(m,7H),6.84(d,J＝9.2Hz,2H),6.30(dd,J＝10.4Hz,1.6Hz,1H),6.11(s,1H),6.10-6.00(m,1H),5.72-5.55(m,1H),5.52(s,1H),5.43(s,2H),5.16-5.05(m,4H),4.88-4.70(m,3H),4.43-4.33(m,1H),4.25-4.20(m,2H),3.65-3.55(m,3H),3.50-3.40(m,12H),3.30-3.25(m,2H),3.12-2.90(m,4H),2.70-2.55(m,2H),2.48-2.43(m,1H),2.40-2.35(m,1H),2.30-2.20(m,2H),2.15-1.95(m,4H),1.86-1.75(m,2H),1.64-1.54(m,5H),1.49(s,4H),1.46-1.34(m,4H),1.23(s,2H),0.90-0.80(m,12H)ppm。溶解度：<0.01mg/mL水。

实施例10D

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(10d)

根据一般方法D2，由vcPAB-MMAE 3a(6.9mg，6.1μmol)和化合物8a，得到化合物10d(2.0mg，20％收率)为白色固体。ESI m/z:830(M/2+H)⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO_d6)δ9.98(s,1H),8.29(s,1H),8.11(d,J＝7.3Hz,1H),8.04(s,1H),7.92-7.82(m,2H),7.75(t,J＝5.1Hz,1H),7.68(d,J＝7.2Hz,1H),7.65-7.53(m,3H),7.53-7.42(m,3H),7.41-7.22(m,9H),7.22-7.10(m,1H),6.06-5.91(m,1H),5.75(s,1H),5.40(s,2H),5.33(d,J＝4.8Hz,1H),5.15-4.91(m,3H),4.79-4.57(m,1H),4.54-4.46(m,1H),4.46-4.32(m,2H),4.32-4.17(m,2H),4.08-3.88(m,2H),3.67-3.53(m,4H),3.50-3.40(m,12H),3.27-3.15(m,8H),3.14-2.91(m,8H),2.91-2.80(m,3H),2.62-2.53(m,1H),2.41-2.33(m,2H),2.32-2.19(m,2H),2.17-2.05(m,2H),2.05-1.90(m,4H),1.86-1.65(m,5H),1.64-1.52(m,2H),1.52-1.40(m,2H),1.39-1.27(m,2H),1.07-0.95(m,6H),0.90-0.67(m,26H)ppm。

实施例11

中间体6c的制备(参见图12)

如图12所示，通过将牛磺酸与活化酯30进行酰胺化来合成叠氮基中间体6c。

1-叠氮基-15-氧-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷-18-磺酸(6c)

向2,5-二氧吡咯烷-1-基1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯30(0.10g，0.26mmol)和牛磺酸(39mg，0.31mmol)的无水DMF(4mL)溶液中加入二异丙基乙胺(15mg，0.52mmol)。混合物在25℃下搅拌过夜。将反应混合物过滤，所得溶液经制备型HPLC(方法A)纯化，得到中间体6c(0.80g，收率78％)为无色油状物。ESI m/z:399.1(M+H)⁺。¹H NMR(500MHz,D₂O)δ3.69(t,J＝6.0Hz,2H),3.64-3.59(m,14H),3.49(t,J＝6.5Hz,2H),3.41(t,J＝4.5Hz,2H),3.00(t,J＝7.0Hz,2H),2.45(t,J＝6.0Hz,2H)ppm。

实施例11A

如图13A所示，通过将化合物6b-1与活化酯30进行酰胺化来合成叠氮基中间体6b。

[2-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)乙基]三甲基氯化铵(6b)

向叠氮基-PEG₄-NHS 30(0.19g，0.50mmol)的无水DMF(4mL)溶液中加入化合物6b-1(83mg，0.60mmol)和DIPEA(19g，1.5mmol)。混合物在25℃下搅拌过夜。将混合物过滤，所得滤液经制备型HPLC(方法A)纯化，得到化合物6b(0.13g，64％收率)为无色油状物。ESI m/z:376(M+H)⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO_d6)δ3.65-3.58(m,4H),3.58-3.45(m,16H),3.45-3.30(m,12H),2.35(t,J＝6.5Hz,2H)ppm。

实施例11B

叠氮基中间体6a通过商购得到，CAS号为86770-69-6。

实施例11C

[2-(1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15

通过用叠氮化物基团部分置换溴，然后水解，由化合物6d-1合成得到叠氮基中间体6f。

17-叠氮基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基膦酸(6f)(参见图13B)

向10mL圆底烧瓶中加入6d-1(50mg，0.11mmol)、叠氮化钠(28mg，0.43mmol)、乙腈(2mL)和水(2mL)。混合物在80℃下搅拌16小时。LCMS显示6d-1完全耗尽。将反应冷却至室温，真空除去乙腈。将所得残余物在乙酸乙酯(20mL)和水(20mL)之间分层。有机层用H₂O(15mL×2)和盐水(15mL)洗，经无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，得到6d-2(35mg，收率76％，ESIm/z:428.2(M+H)⁺)为红色油状物，将其溶于无水DMF(2mL)。在0℃下，向此溶液中加入三甲基溴硅烷(TMSBr，0.12g，0.32mmol)。混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌16小时。真空除去挥发物，将残余物与干燥的甲苯共蒸发(3次)。将残余物溶于水并进行冻干，得到粗制的6f(粗品收率>100％)为油状物，其无需进一步纯化即可用于下一步骤。

实施例11E

叠氮基中间体6e通过商购得到，CAS号为35899-89-9。

实施例11F

叠氮基中间体麦芽糖-N₃(6g)是根据Tetrahedron Letters,2001,42(7),1325-1328中所述方法合成得到。

实施例12

中间体6d的制备(参见图13)

如图13所示方法来合成具有双磺酸的叠氮基中间体6d。叠氮基乙胺31与2当量的溴乙酸酯32反应，然后水解，得到双酸33，将其与五氟苯酚34反应转化为活化酯35。将化合物35用牛磺酸进行酰胺化，得到中间体6d。

2-{2-[(2-叠氮基乙基)({[(2-磺乙基)氨基甲酰基]甲基})氨基]乙酰胺基}乙烷-1-磺酸(6d)

向2-叠氮基乙胺31(0.52g，6.0mmol)的乙腈(50mL)溶液中加入2-溴乙酸叔丁酯32(2.6g，13mmol)和碳酸钠(3.2g，30mmol)。所得悬浮液回流16小时。冷却至室温后，将混合物过滤，滤液真空浓缩，得到黄色油状物(1.6g，ESI m/z:315(M+H)⁺)。将0.62g油状产物溶于盐酸的二氧六环溶液(4N，10mL)。混合物在25℃下搅拌过夜，LCMS显示反应完成。真空除去挥发物，得到化合物33(0.39g，ESI m/z:203(M+H)⁺)的盐酸盐，将其0.20g溶于DCM(5mL)，无需进一步纯化即可用于下一步骤。向溶液中加入DIC(0.38g，3.0mmol)、DIPEA(0.77g，6.0mmol)和五氟苯酚34(0.55g，3.0mol)。反应混合物在室温下搅拌过夜。LCMS显示反应完成。将混合物真空浓缩，得到粗品35(ESI m/z:289(M/2+Na)⁺)，将其溶于DMF(5mL)。向所得溶液中加入牛磺酸(0.38g，3.0mmol)和DIPEA(0.52g，4.0mmol)。混合物在25℃下搅拌过夜，所得混合物直接经反相快速色谱法纯化(0-10％乙腈的水溶液(含0.01％TFA))，得到化合物6d(0.18g，从2-叠氮基乙胺开始的收率为34％)为白色固体。ESI m/z:417(M+H)⁺。

实施例13

中间体7a、7c、7e、7f、7j、7k、7l、7m、7q、7ab、7ad、7ae、7bb、7cb、7fb的制备(参见图14)

一般方法E：在室温下，向化合物5的DMF溶液(0.5mL/10mg 5)中加入叠氮基中间体6(1.5当量)和DIPEA(0.1mL/10mg 5)。反应在室温下搅拌24小时，LCMS显示反应完成。反应混合物经制备型HPLC直接纯化，得到化合物7为白色固体。

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-(2-{[1-(17-羟基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1-基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基]氧基}乙酰胺基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(7a)

根据一般方法E，由化合物5a(30mg，21μmol)与化合物6a(20mg，64μmol)，得到化合物7a(30mg，74％收率)为白色固体。ESI m/z:862(M/2+H)⁺。¹H NMR(MeOD_d4,500MHz):δ7.66-7.57(m,2H),7.44-7.29(m,6H),7.26-7.18(m,1H),5.25-5.04(m,2H),4.88-4.74(m,2H),4.70-4.47(m,2H),4.59-4.48(m,4H),4.29-4.17(m,4H),4.00-3.95(m,2H),3.93-3.88(m,2H),3.76-3.70(m,1H),3.69-3.64(m,10H),3.62-3.59(m,2H),3.59-3.55(m,8H),3.49-3.42(m,2H),3.38-3.36(m,4H),3.31-3.28(m,3H),3.27-3.17(m,3H),3.15-3.06(m,3H),3.00-2.87(m,4H),2.57-2.46(m,2H),2.41-2.18(m,2H),2.17-1.99(m,5H),1.98-1.86(m,3H),1.85-1.68(m,6H),1.67-1.54(m,9H),1.50-1.36(m,4H),1.34-1.25(m,1H),1.22-1.12(m,6H),1.06-0.98(m,11H),0.96-0.93(m,3H),0.92-0.84(m,9H),0.79(m,2H).ppm。

2-{1-[4-({[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨

基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙烷-1-磺酸(7c)

根据一般方法E，由化合物5a(28mg，20μmol)与化合物6c(20mg，50μmol)，得到化合物7c(20mg，56％收率)为白色固体。ESI m/z:907.3(M/2+H)⁺。

2-{1-[4-({[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙烷-1-磺酸(7e)

根据一般方法E，由化合物5b(60mg，52μmol)与化合物6c，得到化合物7e(60mg，74％收率)为白色固体。ESI m/z:781(M/2+H)⁺。¹H NMR(400MHz,MeOD_d4)δ7.61(d,J＝8.5Hz,2H),7.39-7.28(m,3H),6.39-6.30(m,2H),5.66-5.46(m,1H),5.29-5.13(m,1H),5.12-5.04(m,3H),4.72-4.60(m,2H),4.56-4.49(m,2H),4.36-3.84(m,8H),3.76-3.70(m,2H),3.66-3.54(m,14H),3.30-3.23(m,2H),3.21-3.04(m,3H),3.03-2.97(m,2H),2.96-2.84(m,1H),2.75-2.52(m,1H),2.50-2.42(m,2H),2.39-2.01(m,6H),1.99-1.78(m,6H),1.74-1.22(m,22H),1.03-0.87(m,12H)ppm。

2-[2-({2-[4-({[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]乙基}({[(2-磺乙基)氨基甲酰基]甲基})氨基)乙酰胺基]乙烷-1-磺酸(7f)

根据一般方法E，由化合物5b(0.10g，86μmol)与化合物6d，得到化合物7f(65mg，48％收率)为白色固体。ESI m/z:790(M/2+H)⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO_d6)δ10.1-10.0(m,1H),8.60-8.50(m,1H),8.40-8.30(m,1H),8.30-8.20(m,2H),8.15-8.00(m,4H),7.60-7.55(m,2H),7.50-7.40(m,1H),7.30-7.20(m,4H),6.30(d,J＝10.5Hz,1H),6.15-6.00(m,2H),5.70-5.55(m,3H),4.98(s,2H),4.80-4.70(m,1H),4.59(t,J＝4.0Hz,1H),4.50-4.45(m,1H),4.40-4.35(m,2H),4.25-4.10(m,2H),3.95-3.80(m,4H),3.20-2.90(m,10H),2.85-2.75(m,2H),2.70-2.60(m,4H),2.31-2.10(m,3H),2.10-1.95(m,6H),1.80-1.65(m,6H),1.65-1.55(m,7H),1.40-1.20(m,12H),1.20-1.10(m,1H),1.06(t,J＝7.0Hz,1H),1.02-1.00(m,1H),0.90-0.80(m,16H)ppm。

2-{1-[4-({[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙烷-1-磺酸(7i)

根据一般方法E，由化合物5c(55mg，54μmol)与化合物6c，得到化合物7i(53mg，收率43％)为白色固体。ESI m/z:827.6(m/2+H)⁺。¹HNMR(400MHz,MeOD_d4)δ7.63-7.61(m,2H),7.40-7.29(m,5H),6.89-6.85(m,2H),6.38-6.33(m,2H),5.65-5.48(m,1H),5.31-5.06(m,4H),4.91-4.70(m,4H),4.65-4.22(m,5H),4.07-3.86(m,5H),3.74-3.63(m,16H),3.33-2.82(m,4H),2.76-1.21(m,39H),1.06-0.93(m,12H)ppm。

2-{1-[4-({[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙烷-1-磺酸(7j)

根据一般方法E，由化合物5d(55mg，54μmol)与化合物6c，得到化合物7j(70mg，67％收率)为白色固体。ESI m/z:709.9(M/2+H)⁺。¹H NMR(400MHz,MeOD_d4)δ7.58-7.48(m,2H),7.35(d,J＝8.8Hz,1H),6.92-6.88(m,2H),6.38-6.34(m,1H),6.33(s,1H),5.65-5.46(m,1H),5.31-5.07(m,2H),4.87-4.44(m,7H),4.36-4.13(m,2H),4.06-3.87(m,5H),3.75-3.55(m,16H),3.33-2.60(m,6H),2.47-1.79(m,13H),1.72-1.43(m,21H),1.03-0.94(m,12H)ppm。

2-{1-[4-({[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙烷-1-磺酸(7k)

根据一般方法E，由化合物5e(60mg，54μmol)与化合物6c，得到化合物7k(50mg，61％收率)为白色固体。ESI m/z:753(M/2+H)⁺。

1-(4-(2-((R)-5-氨基-6-((S)-1-((S)-1-((4bS,8S,8aR)-8-((1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基氨基甲酰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基氨基)-1-氧丙烷-2-基氨基)-3-甲基-1-氧丁烷-2-基氨基)-6-氧己基氨基)-2-氧乙氧基)-4,5,6,7,8,9-六氢-1H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基)-15-氧-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷-18-磺酸(7m)

根据一般方法E，由化合物5f(40mg，40μmol)与化合物6c，得到化合物7m(52mg，77％收率)为白色固体。ESI m/z:695.4(M/2+H)⁺。

2-{1-[4-({[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}-2-羟基乙基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)-4-(氨基甲酰基氨基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙烷-1-磺酸(7q)

在0℃下，向化合物6c(20mg，50μmol)的水(1mL)溶液中滴加饱和NaHCO₃水溶液直至pH～7。然后通过注射器向所述搅拌溶液中加入化合物5？(28mg，21μmol)的乙腈(1mL)溶液。混合物在25℃下搅拌过夜。反应混合物用LCMS监测，直至化合物5？完全耗尽。将反应混合物过滤，并经制备型HPLC(方法A)纯化，得到化合物7q(15mg，41％收率)为白色固体。ESIm/z:856.5(M/2+1)⁺。

(2-{1-[4-({[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙基)三甲基氯化铵(7ab)

根据一般方法，由化合物5a(55mg，39μmol)与化合物6b，除了在50℃下搅拌过夜，得到化合物7ab(50mg，70％收率)为白色固体。ESI m/z:896[(M+H)/2]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO_d4)δ9.35(s,1H),8.95(s,1H),8.43-8.34(m,1H),8.07-8.00(m,1H),7.91-7.83(m,1H),7.79-7.60(m,4H),7.33-7.23(m,6H),7.20-7.13(m,1H),6.30-5.80(m,1H),5.49-5.34(m,1H),5.12-4.83(m,3H),4.77-4.71(m,1H),4.54-4.38(m,4H),4.27(t,J＝11.6Hz,1H),4.03-3.93(m,4H),3.85-3.75(m,5H),3.59(t,J＝6.2Hz,3H),3.50-3.40(m,15H),3.38-3.35(m,2H),3.26-3.16(m,7H),3.13-3.03(m,14H),2.99-2.92(m,4H),2.89-2.78(m,4H),2.44-2.38(m,1H),2.34(t,J＝6.2Hz,2H),2.30-2.22(m,2H),2.15-1.93(m,6H),1.85-1.42(m,19H),1.37-1.23(m,3H),1.06-0.96(m,7H),0.94-0.71(m,27H)ppm。

{17-[4-({[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1-基}膦酸(7ad)

根据一般方法，由化合物5a(18mg，13μmol)与化合物6f(14mg，38μmol)，得到化合物7ad(15mg，58％收率)为白色固体。ESI m/z:893.9(M/2+H)⁺。¹H NMR(MeOD_d4,500MHz):δ7.98-7.91(m,1H),7.79-7.59(m,2H),7.41-7.20(m,6H),5.51-5.06(m,2H),4.78-4.53(m,6H),4.29-3.88(m,9H),3.78-3.75(m,3H),3.64-3.58(m,16H),3.47-3.36(m,6H),3.29-3.07(m,8H),3.01-2.80(m,4H),2.58-2.05(m,10H),1.96-1.32(m,26H),1.21-1.14(m,6H),1.02-0.71(m,25H)ppm。

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-6-[2-({1-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基}氧基)乙酰胺基]己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基

N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(7ae)

根据一般方法，由化合物5a(6.0mg，4.2μmol)与化合物6e(3.0mg，15μmol)，得到化合物7ae的反应溶液，并直接用于下一步骤。ESI m/z:811(M/2+H)⁺。

(2-{1-[4-({[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0²,⁹.0⁴,⁸.0¹³,¹⁸]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙基)三甲基氯化铵(7bb)

根据一般方法E，由5b(40mg，34μmol)和6b，除了在50℃下搅拌过夜，并通过制备型HPLC(方法B)纯化后，得到化合物7bb(40mg，76％收率)为白色固体。ESI m/z:770[(M+18)/2]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO_d6)δ10.13-8.87(m,2H),8.58-8.21(m,2H),8.09-7.85(m,2H),7.82-7.64(m,3H),7.63-7.55(m,1H),7.49-7.37(m,1H),7.34-7.16(m,3H),6.34-6.21(m,1H),6.15-5.99(m,2H),5.78-5.42(m,3H),5.01-4.83(m,3H),4.81-4.69(m,2H),4.63-4.47(m,2H),4.45-4.34(m,2H),4.27-4.07(m,3H),4.04-3.96(m,1H),3.91-3.70(m,6H),3.60(t,J＝6.2Hz,2H),3.53-3.40(m,14H),3.15-3.01(m,11H),3.00-2.88(m,3H),2.83-2.73(m,1H),2.68-2.56(m,1H),2.38-2.19(m,4H),2.13-1.93(m,4H),1.87-1.74(m,2H),1.71-1.64(m,2H),1.62-1.18(m,22H),1.14-1.02(m,1H),0.97-0.70(m,12H)ppm。

(2-{1-[4-({[(5R)-5-氨基-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙基)三甲基铵(7cb)

根据一般方法，由6b(44mg，35μmol)在室温下搅拌24小时，并通过反相快速色谱法(0-100％乙腈的TFA水溶液(0.03％))纯化后，得到化合物7cb(44mg，收率77％)为白色固体。ESI m/z:816.0(m/2+H)⁺；544.5(M/3+H)⁺。

1-(4-(2-(((R)-5-氨基-6-(((S)-1-(((S)-1-(((4bS,8S,8aR)-8-(((1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-羰基)氨基甲酰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基)氨基)-1-氧丙烷-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧丁烷-2-基)氨基)-6-氧己基)氨基)-2-氧乙氧基)-4,5,6,7,8,9-六氢-1H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基)-N,N,N-三甲基-15-氧-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷-18-铵(7fb)

根据一般方法，由6b(50mg，50μmol)在室温下搅拌24小时，并通过反相快速色谱法(0-30％乙腈的TFA水溶液(0.03％))纯化后，得到化合物7fb(50mg，73％收率)为白色固体。ESI m/z:684(M/2+H)⁺。

实施例14

中间体7h、7l的制备(参见图15)

一般方法F：在室温下，向化合物4b(1.2当量)的DMF(40mL/g化合物3)溶液中依次加入EDCI(1.5当量)、HOBt(2.0当量)、化合物3(3b或3e，1.0当量)和三乙胺(3.0当量)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。LCMS显示化合物4b完全耗尽(化合物3未耗尽)。向反应中加入二乙胺(6mL/g化合物3，过量)。反应混合物在室温下搅拌2小时，直至根据LCMS监测已脱去Fmoc。将反应混合物直接经反相快速色谱法纯化(0-100％乙腈的碳酸氢铵水溶液(10mM))，得到化合物7(7h或7l，25-26％收率)为白色固体，未反应的化合物3可回收。

2-[(4R)-4-氨基-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}丁酰胺基]乙烷-1-磺酸(7h)

根据一般方法F，由3b(50mg，57μmol)与4b，并经反相快速色谱法(0-100％乙腈的水溶液)，回收得到17mg化合物3b(回收收率为34％)纯化后，得到化合物7h(17mg，26％收率)为白色固体。ESI m/z:1107(M+H)⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO_d6)δ10.07(s,1H),8.31(d,J＝7.0Hz,2H),7.81(t,J＝5.5Hz,1H),7.61-7.60(m,2H),7.45-7.42(m,1H),7.30-7.27(m,3H),6.30(d,J＝10Hz,1H),6.11-6.03(m,2H),5.86-5.82(m,1H),5.70-5.57(m,2H),5.46(s,2H),4.97(s,2H),4.78-4.76(m,1H),4.59(t,J＝4.5Hz,1H),4.41-4.12(m,4H),3.86-3.80(m,1H),3.64-3.58(m,1H),3.21-3.16(m,1H),3.01-2.90(m,6H),2.56(t,J＝7.5Hz,2H),2.35-2.32(m,2H),2.17-2.14(m,2H),2.09-1.28(m,18H),1.17-1.14(m,1H),0.97(t,J＝6.5Hz,2H),0.89-0.84(m,10H)ppm。

2-[(4R)-4-氨基-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}丁酰胺基]乙烷-1-磺酸(7l)

根据一般方法F，由3e(80mg，98μmol)与4b，并经反相快速色谱法(0-100％乙腈的水溶液)纯化后，得到化合物7l(26mg，25％收率)为白色固体。ESI m/z:525.8(M/2+H)⁺。

中间体7ah的制备(参见图15A)

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-氨基-4-{[(2S)-2-[(4R,5R)-5-[(4R)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基]-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基]-2-羟基乙基]氨基甲酰基}丁酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(7ah)

在室温下，向中间体4c(25mg，41μmol)的DMF(1mL)溶液中加入HATU(23mg，61μmol)。所得溶液在室温下搅拌1小时。向此悬浮液中加入vcPAB-MMAE 3a(28mg，25μmol)的DMF(1mL)溶液，然后加入NMM(1滴，过量)。反应混合物在室温下搅拌3小时，使其变澄清。反应通过LCMS进行监测，直至化合物3a完全耗尽。然后向反应混合物中加入二乙胺(过量)，然后所得混合物在室温下搅拌过夜。根据LCMS监测反应完成。真空除去挥发物，所得残余物经反相快速色谱法纯化(0-100％乙腈的TFA水溶液(0.5％))，得到化合物7ah(25mg，67％收率)为白色固体。ESI m/z:1495(M+H)⁺。¹H NMR(MeOD_d4,500MHz):δ7.65-7.55(m,2H),7.46-7.28(m,6H),7.23(t,J＝7.1Hz,1H),5.27-5.02(m,2H),4.72-4.47(m,4H),4.30-4.05(m,6H),4.03-3.78(m,4H),3.78-3.65(m,1H),3.61-3.40(m,4H),3.39-3.27(m,5H),3.26-3.16(m,2H),3.17-3.08(m,3H),3.00-2.91(m,3H),2.58-2.11(m,7H),2.10-1.52(m,12H),1.50-1.25(m,15H),1.24-1.11(m,6H),1.05-0.69(m,26H)ppm。

实施例14A

中间体8c的制备(参见图15B)

1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-羧酸(8c)

在室温下，向化合物36(0.50g，1.8mmol)和37(0.65g，1.8mmol)的DMF(3mL)混合物中加入DIPEA(1.2g，9.0mmol)。混合物在室温下搅拌30分钟。将反应混合物直接经制备型HPLC(方法A)纯化，得到OCT-PEG₄-酸(8c)(0.70g，91％收率)为浅黄色油状物。ESI m/z:430(M+H)⁺。

使用类似于制备8c的方法，使用本领域技术人员已知的合适的起始物料来制备得到8d和8e。

实施例15

1a的制备(参见图16)

在室温下，向DIBAC-suc-PEG₄-酸8a(1.2-1.3当量)的DMF溶液(1mL/10mg 8a)中加入HATU(1.3当量)和DIPEA(5.0当量)。混合物在室温下搅拌半小时，然后加入化合物7a(1.0当量)的DMF溶液(0.6mg/10mg 7a)。所得混合物在室温下搅拌直至化合物7耗尽，通过LCMS进行监测。将反应混合物过滤后，滤液直接经制备型HPLC纯化，得到化合物1a。

一般方法G(由8a、8c或8d开始)：在室温下，向酸8(8a、8c或8d，1.2-1.3当量)的DMF溶液(1mL/10mg 8)中加入HATU(1.3当量)和DIPEA(5.0当量)。混合物在室温下搅拌半小时，然后加入化合物7(1.0当量)的DMF溶液(0.6mg/10mg 7)。所得混合物在室温下搅拌直至化合物7耗尽，通过LCMS进行监测。将反应混合物过滤后，滤液直接经制备型HPLC纯化，得到连接体-有效负载1和II-V。

实施例16

1a、1c、1e、1f、1h、1i、1j、1k、1l、1m、1q的制备(参见图17)

一般方法H(由8b或8e开始)：在室温下，向化合物7(1.0当量)的DMF溶液(1mL/50mg)中加入化合物DIBAC-PEG₄-NHS 8b(1.1-1.2当量)和DIPEA(5.0当量)。反应混合物在室温下搅拌3小时。反应混合物经制备型HPLC直接纯化，得到化合物1。

实施例17

1a的制备(参见图17)

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-6-(2-{[1-(17-羟基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1-基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基]氧基}乙酰胺基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(1a)

根据一般方法G，由化合物7a(25mg，15μmol)与化合物8a(10mg，18μmol)，得到连接体-有效负载1a(24mg，73％收率)为白色固体。ESI:753(M/3+H)⁺。¹H NMR(500MHz,MeOD_d4)δ7.74-7.69(m,2H),7.67-7.64(m,1H),7.63-7.59(m,1H),7.53-7.45(m,3H),7.42-7.29(m,9H),7.25-7.20(m,1H),5.22-5.05(m,3H),4.70-4.49(m,4H),4.47-4.43(m,1H),4.33-4.29(m,1H),4.27-4.16(m,4H),4.00-3.95(m,2H),3.92-3.87(m,2H),3.77-3.69(m,2H),3.68-3.63(m,10H),3.61-3.52(m,21H),3.49-3.41(m,5H),3.38-3.36(m,4H),3.30-3.27(m,3H),3.27-3.22(m,3H),3.20-3.14(m,2H),3.12(s,1H),3.10-3.03(m,1H),2.99-2.86(m,4H),2.82-2.68(m,2H),2.56-2.12(m,10H),2.11-1.97(m,5H),1.91-1.79(m,5H),1.76-1.53(m,10H),1.48-1.37(m,3H),1.34-1.26(m,1H),1.21-1.12(m,14H),1.06-0.93(m,14H),0.92-0.81(m,10H)ppm。

实施例17A

Ib的制备(参见图17)

(2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙基)三甲基铵(Ib)

根据一般方法G，由化合物7ab(45mg，25μmol)与化合物8a(16mg，29μmol)，得到连接体-有效负载Ib(16mg，27％收率)为白色固体。ESI m/z:766[(M+H)/3]⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO_d6):δ9.78(s,1H),8.34-8.04(m,5H),7.95-7.83(m,2H),7.79-7.74(m,1H),7.70-7.56(m,5H),7.52-7.43(m,3H),7.40-7.11(m,12H),6.08(s,1H),5.43(s,2H),5.06-5.00(m,2H),4.76-4.71(m,1H),4.54-4.39(m,4H),4.35-4.15(m,4H),4.03-3.92(m,2H),3.85-3.73(m,5H),3.64-3.55(m,5H),3.46-3.43(m,20H),3.25-3.16(m,11H),3.13-3.05(m,15H),3.00-2.93(m,5H),2.89-2.82(m,4H),2.80-2.73(m,2H),2.61-2.55(m,1H),2.42-2.32(m,5H),2.31-2.20(m,4H),2.15-2.04(m,4H),2.03-1.95(m,4H),1.83-1.65(m,8H),1.57-1.38(m,11H),1.30-1.19(m,10H),1.06-0.96(m,7H),0.87-0.76(m,20H)ppm。

实施例18

1c的制备(参见图17)

2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙烷-1-磺酸(1c)

根据一般方法H，由化合物7c(20mg，11μmol)与化合物8b(7.1mg，11μmol)，得到1c(5.0mg，19％收率)为白色固体。ESI m/z:1174.7(M/2+H)⁺。¹H NMR(MeOD_d4,500MHz):δ8.38-8.17(m,2H),7.99-7.87(m,2H),7.77-7.56(m,4H),7.49-7.20(m,9H),5.36(t,J＝4.5Hz,1H),5.21-5.07(m,4H),4.71-4.18(m,9H),3.98-3.88(m,5H),3.74-3.43(m,37H),3.37-3.36(m,6H),3.29-3.12(m,6H),3.00-2.88(m,6H),2.75-2.33(m,5H),2.32-1.78(m,17H),1.64-1.34(m,15H),1.20-1.13(m,6H),1.03-0.76(m,30H)ppm。

实施例18A

Id的制备(图17)

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-6-(2-{[1-(14-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基]氧基}乙酰胺基)己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基

N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(Id)

根据一般方法G，由化合物7ad(12mg，6.7μmol)与化合物8a(4.4mg，8.0μmol)，得到连接体-有效负载Id(3.0mg，19％收率)为白色固体。ESI m/z:774.7(M/3+H)⁺。¹H NMR(MeOD_d4,500MHz):δ8.00-7.90(m,1H),7.94-7.61(m,4H),7.49-7.47(m,3H),7.41-7.14(m,9H),5.37-5.03(m,5H),4.70-4.44(m,6H),4.34-3.90(m,7H),3.77-3.42(m,38H),3.37-3.35(m,4H),3.29(s,3H),3.27-3.01(m,9H),2.97-2.87(m,6H),2.75-2.59(m,2H),2.53-2.16(m,9H),2.06-1.81(m,12H),1.64-1.32(m,19H),1.20-1.13(m,6H),1.03-0.79(m,21H)ppm。分析型HPLC：95％，保留时间：5.56和6.64min(方法B)。

实施例18B

Ie-1的制备(图17)

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-6-[2-({1-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基}氧基)乙酰胺基]己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基

N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(Ie-1)(含三唑异构体)

根据一般方法H，由7ae(反应溶液)和8b，并通过制备型HPLC(方法B)纯化后，得到含三唑异构体的化合物Ie-1(通过HPLC测定的比率为3/2)(13mg，由5a开始的收率为30％)为白色固体。ESI m/z:1078(M/2+H)⁺(100％),2156.9(M+H)⁺(10％)。¹H NMR(DMSO_d6,500MHz):δ9.69(m,1H),8.08-8.30(m,4H),7.84-7.89(m,1H),7.61-7.75(m,6H),7.45-7.49(m,2H),7.16-7.37(m,10H),5.96(m,1H),5.34-5.51(m,4H),4.97-5.16(m,5H),4.62-4.75(m,4H),3.92-4.49(m,9H),3.77-3.80(m,3H),3.40-3.72(m,18H),3.24(s,3H),3.23(s,2H),3.18-3.20(m,4H),2.88-3.17(m,17H),2.54-2.83(m,2H),2.35-2.42(m,2H),2.22-2.29(m,3H),1.96-2.15(m,7H),1.72-1.82(m,5H),1.28-1.65(m,16H),0.87-1.05(m,6H),0.75-0.87(m,27H)。分析型HPLC：异构体1：60.3％，保留时间：7.34min；异构体2：39.7％，保留时间：7.41min(方法B)。

实施例18C

If-1的制备(图17)

{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-6-[2-({1-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-4-基}氧基)乙酰胺基]己酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(If-1)

根据一般方法H，由7ae(反应溶液)和8e，并通过制备型HPLC(方法A)纯化后，得到含三唑异构体的化合物If-1(通过HPLC测定的比率为3/2)(1.5mg，由5a开始的收率为18％)为白色固体。ESI m/z:974.7(M/2+H)⁺(100％),1972(M+Na)⁺(20％)。¹H NMR(DMSO_d6,500MHz):δ9.69(s,1H),8.19-7.97(m,4H),7.92-7.83(m,1H),7.66-7.54(m,3H),7.36-7.23(m,6H),7.22-7.12(m,2H),7.01(s,2H),6.87(s,2H),6.68-6.59(m,2H),6.03-5.93(m,1H),5.47-5.26(m,5H),5.20-5.11(m,1H),5.07-4.95(m,2H),4.80-4.58(m,3H),4.53-4.38(m,2H),4.36-4.12(m,5H),4.04-3.94(m,2H),3.84-3.76(m,3H),3.68-3.37(m,21H),3.26-3.17(m,7H),3.13-2.96(m,7H),2.90-2.81(m,3H),2.44-2.34(m,2H),2.31-2.21(m,2H),2.18(s,3H),2.15-1.94(m,9H),1.77-1.74(m,2H),1.69-1.59(m,4H),1.56-1.42(m,9H),1.32-1.27(m,2H),1.06-0.96(m,6H),0.90-0.72(m,26H)ppm。分析型HPLC：异构体1：76.0％，保留时间：7.19min；异构体2：24.0％，保留时间：7.28min(方法A)。

实施例18D

Ig的制备(图18)

{4-[(2S)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-4-{[(2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基甲酰基}丁酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]-5-(氨基甲酰基氨基)戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(Ig)

在0℃下，向中间体7ah(40mg，27μmol)的DCM(3mL)混合物中滴加TFA(0.25mL)。混合物在室温下搅拌1小时直至7ah耗尽。根据LCMS监测完成脱保护。真空除去挥发物，将所得残余物(ESI m/z:708(M/2+H)⁺)溶于DMF(2mL)。向溶液中加入中间体8b(17mg，27μmol)和三乙胺(8.2mg，81μmol)。混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物经制备型HPLC(方法B)直接纯化，得到Ig(8.0mg，从7ah开始的两步收率为15％)为白色固体。ESI m/z:650.8(M/3+H)⁺(100％),975(M/2+H)⁺(40％)。¹H NMR(DMSO_d6,500MHz):δ9.75(s,1H),8.31-8.06(m,5H),7.91-7.88(m,1H),7.75-7.74(m,2H),7.68-7.61(m,5H),7.50-7.46(m,3H),7.39-7.24(m,11H),7.17-7.15(m,1H),5.99(s,1H),5.41-5.34(m,3H),5.04-5.01(m,2H),4.77-4.75(m,1H),4.48-4.18(m,11H),4.05-3.95(m,3H),3.62-3.55(m,7H),3.47-3.17(m,14H),3.12-2.97(m,10H),2.88-2.83(m,3H),2.60-2.54(m,1H),2.53-2.51(m,2H),2.42-2.36(m,2H),2.29-2.21(m,3H),2.17-1.99(m,8H),1.79-1.71(m,7H),1.54-1.44(m,3H),1.36-1.28(m,2H),1.05-0.97(m,8H),0.88-0.75(m,28H)ppm。分析型HPLC：96.9％，保留时间：7.58min(方法B)。

实施例18E

Ih-1的制备(图18)

{4-[(2S)-5-(氨基甲酰基氨基)-2-[(2S)-2-[(2R)-2-[1-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-4-{[(2R,3S,4S,5S)-2,3,4,5,6-五羟基己基]氨基甲酰基}丁酰胺基]-3-甲基丁酰胺基]戊酰胺基]苯基}甲基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-{[(1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙烷-2-基]氨基甲酰基}-1-甲氧基-2-甲基乙基]吡咯烷-1-基]-3-甲氧基-5-甲基-1-氧庚烷-4-基](甲基)氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]-N-甲基氨基甲酸酯(Ih-1)

向中间体7ah(10mg，6.7μmol)的DMF(1mL)溶液中加入中间体8e(5.9mg，13μmol)和DIPEA(1.7mg，13μmol)。混合物在室温下搅拌24小时，直至根据LCMS监测10a大部分耗尽。将反应混合物通过膜过滤，所得过滤物经制备型HPLC(方法A)纯化(ESI m/z:912(M/2+H)⁺)。将冻干后的残余物溶于乙腈(2mL)，并向溶液中加入脱水氯化铜(II)(19mg，0.12mmol)。混合物在室温下搅拌两天。通过LCMS检测到所需的Ih质量为主要产物。过滤除去无机盐后，所得溶液直接经制备型HPLC(方法A)纯化，得到Ih-1(2.0mg，从7ah开始的两步收率为17％)为白色固体。ESI m/z:1742.7(M+H)⁺,1764.8(M+Na)⁺。¹H NMR(DMSO_d6,500MHz):δ9.75(s,1H),8.42-7.84(m,5H),7.79-7.70(m,1H),7.68-7.52(m,3H),7.44-7.11(m,8H),7.02(s,2H),6.04-5.93(m,1H),5.45-5.31(m,3H),5.15-4.57(m,5H),4.53-3.91(m,14H),3.84-3.74(m,1H),3.63-3.53(m,8H),3.52-3.09(m,9H),3.04-2.92(m,4H),2.90-2.82(m,3H),2.42-2.36(m,2H),2.32-2.21(m,2H),2.19-1.92(m,8H),1.90-1.15(m,23H),1.06-0.97(m,6H),0.90-0.71(m,26H)ppm。分析型HPLC：99.4％，保留时间：6.09min(方法A)。

实施例19

1e的制备(参见图17)

2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙烷-1-磺酸(1e)

根据一般方法H，由化合物7e(47mg，30μmol)和8b，得到化合物1e(28mg，45％收率)为白色固体。ESI m/z:1049(M/2+H)⁺。¹H NMR(500MHz,MeODd4)δ7.75-7.57(m,4H),7.48-7.43(m,3H),7.38-7.23(m,6H),6.37-6.28(m,2H),5.65-5.43(m,1H),5.17-5.03(m,3H),4.69-4.59(m,2H),4.52-4.47(m,1H),4.45-4.41(m,1H),4.34-4.25(m,2H),4.23-4.13(m,2H),4.07-3.86(m,5H),3.77-3.68(m,4H),3.64-3.54(m,22H),3.52-3.47(s,3H),3.46-3.40(m,4H),3.29-3.21(m,4H),3.20-3.14(m,2H),3.10-3.01(m,1H),3.00-2.95(m,2H),2.92-2.84(m,1H),2.76-2.60(m,2H),2.47-2.42(m,2H),2.40-2.25(m,5H),2.23-2.13(m,3H),2.07-1.97(m,3H),1.90-1.79(m,4H),1.71-1.55(m,14H),1.52-1.42(m,3H),1.40-1.29(m,8H),1.07-0.85(m,12H)ppm。分析型HPLC：98％，保留时间：5.88min(方法B)。

实施例19A

IIb的制备(图17)

(2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0⁴ ^,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙基)三甲基氯化铵(IIb)

根据一般方法G，由化合物7bb(35mg，23μmol)和8a，并经反相快速色谱法(0-100％乙腈的碳酸氢铵水溶液(10mM)，然后100％甲醇)纯化后，得到化合物IIb(25mg，52％收率)为白色固体。ESI m/z:1037[(M+18)/2]⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO_d6)δ9.82-9.74(m,1H),8.30(s,1H),8.21-8.08(m,2H),7.92-7.82(m,1H),7.76(t,J＝5.5Hz,1H),7.69-7.58(m,3H),7.53-7.18(m,9H),6.34-6.26(m,1H),6.15-6.03(m,2H),5.71-5.53(m,1H),5.43(s,2H),5.31(t,J＝12.4,7.8Hz,1H),5.10-4.90(m,3H),4.79-4.72(m,1H),4.58(t,J＝4.2Hz,1H),4.52(t,1H),4.44-4.28(m,3H),4.25-4.11(m,3H),3.88-3.74(m,4H),3.64-3.55(m,3H),3.49-3.42(m,20H),3.13-3.02(m,12H),3.00-2.91(m,3H),2.81-2.73(m,1H),2.61-2.54(m,1H),2.41-2.32(m,3H),2.29-2.19(m,3H),2.12-1.93(m,7H),1.83-1.73(m,3H),1.70-1.62(m,3H),1.60-1.31(m,20H),1.31-1.19(m,17H),1.15-1.04(m,3H),0.89-0.79(m,12H)ppm。

实施例20

1f的制备(参见图17)

2-[2-({2-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0⁴ ^,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]乙基}({[(2-磺乙基)氨基甲酰基]甲基})氨基)乙酰胺基]乙烷-1-磺酸(1f)

根据一般方法H，由化合物7f(60mg，38μmol)和8b，得到化合物1f(25mg，31％收率)为白色固体。ESI m/z:1058(M/2+H)⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO_d6)δ9.62-9.58(m,1H),8.25-8.00(m,6H),7.90-7.80(m,1H),7.77(t,J＝5.5Hz,1H),7.70-7.60(m,4H),7.55-7.25(m,12H),6.30(d,J＝10.5Hz,1H),6.10(s,1H),6.05-5.95(m,1H),5.70-5.55(m,2H),5.40(s,2H),5.10-4.90(m,4H),4.80-4.70(m,1H),4.59(t,J＝4.0Hz,1H),4.50-4.35(m,2H),4.35-4.25(m,2H),4.25-4.10(m,3H),3.90-3.75(m,3H),3.65-3.50(m,5H),3.50-3.40(m,16H),3.20-3.05(m,12H),3.00-2.80(m,6H),2.65-2.55(m,6H),2.40-2.35(m,1H),2.30-2.20(m,5H),2.10-1.95(m,5H),1.85-1.70(m,4H),1.65-1.30(m,18H),0.90-0.80(m,12H)ppm。分析型HPLC：97％，保留时间：6.82min(方法B)。

实施例21

1h的制备(参见图17)

2-[(4R)-4-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{[({2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙基}氨基甲酰基)氧基]甲基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}丁酰胺基]乙烷-1-磺酸(1h)

根据一般方法H，由化合物7h(20mg，18μmol)和8b，并经反相快速色谱法(0-100％乙腈的碳酸氢铵水溶液(10mM))纯化后，得到化合物1h(11mg，37％收率)为白色固体。ESIm/z:821.3(M/2+H)⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO_d6)δ9.70(s,1H),8.22(d,J＝7.0Hz,1H),8.10(d,J＝7.0Hz,2H),7.95-7.61(m,7H),7.51-7.26(m,11H),6.30(d,J＝10Hz,1H),6.11(s,1H),6.01-5.99(m,1H),5.69-5.57(m,2H),5.41(s,2H),5.22-4.92(m,4H),4.78-4.58(m,1H),4.35-4.13(m,5H),3.86-3.80(m,1H),3.62-3.40(m,14H),3.30-3.28(m,4H),3.10-2.73(m,5H),2.63-2.53(m,2H),2.41-2.20(m,3H),2.09-1.57(m,13H),1.48-1.12(m,15H),0.90-0.84(m,10H)ppm。分析型HPLC：96％，保留时间：7.28min(方法B)。

实施例22

1i的制备(参见图17)

2-(1-{4-[({5-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0¹³ ^,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基}氨基甲酰基)甲氧基]-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基)乙烷-1-磺酸(1i)

根据一般方法H，由化合物7i(46mg，28μmol)和8b，得到化合物1i(28mg，46％收率)为白色固体。ESI m/z:1095.0(M/2+H)⁺。¹H NMR(400MHz,MeOD_d4)δ7.42-7.23(m,15H),6.87-6.83(m,2H),6.36-6.31(m,2H),5.64-5.47(m,1H),5.29-5.05(m,5H),4.94-4.90(m,1H),4.84-4.59(m,2H),4.49-4.41(m,2H),4.34-4.26(m,2H),4.16-4.13(m,1H),4.02-3.86(m,4H),3.72-3.68(m,3H),3.66-3.34(m,31H),3.24-3.14(m,5H),3.08-2.83(m,4H),2.73-2.60(m,2H),2.46-2.36(m,9H),2.12-1.19(m,32H),1.05-0.90(m,12H)ppm。分析型HPLC：100％，保留时间：7.62min(方法B)。

实施例23

1j的制备(参见图17)

2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙烷-1-磺酸(1j)

根据一般方法H，由化合物7j(66mg，47μmol)和8b，得到化合物1j(40mg，44％收率)为白色固体。ESI m/z:977.5(M/2+H)⁺。¹H NMR(400MHz,MeOD_d4)δ7.66-7.55(m,4H),7.48-7.24(m,7H),6.90-6.85(m,2H),6.35(d,J＝10.0Hz,1H),6.32(s,1H),5.64-5.47(m,1H),5.28-5.07(m,3H),4.85-4.60(m,3H),4.50-4.44(m,2H),4.34-4.25(m,2H),4.12-3.88(m,5H),3.73-3.49(m,29H),3.45-3.39(m,3H),3.25-3.20(m,3H),3.14-2.86(m,5H),2.74-2.63(m,2H),2.46-1.27(m,41H),1.05-0.92(m,12H)ppm。分析型HPLC：95％，保留时间：7.55min(方法B)。

实施例24

1k的制备(参见图17)

2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙烷-1-磺酸(1k)

根据一般方法H，由化合物7k(50mg，33μmol)和8b，得到化合物1k(30mg，44％收率)为白色固体。ESI m/z:680(M/3+H)⁺。¹H NMR(500MHz,DMSO_d6)δ9.51(s,1H),8.30-7.97(m,3H),7.92-7.84(m,1H),7.80-7.73(m,2H),7.68(d,J＝7.5Hz,1H),7.62(d,J＝7.9Hz,1H),7.50-7.45(m,4H),7.38-7.26(m,4H),7.08(br s,3H),6.90-6.78(m,2H),6.30(d,J＝10.5Hz,1H),6.11(s,1H),6.01-5.94(m,1H),5.72-5.55(m,1H),5.52(s,1H),5.39(s,2H),5.12(d,J＝18.5Hz,1H),5.03(d,J＝14.5Hz,1H),4.84(d,J＝18.5Hz,1H),4.80-4.71(m,2H),4.55-4.49(m,1H),4.42(t,J＝5.5Hz,1H),4.38-4.12(m,4H),3.81-3.76(m,4H),3.62-3.53(m,4H),3.46-3.39(m,21H),3.33-3.25(m,4H),3.09-2.93(m,7H),2.81-2.78(m,1H),2.64-2.52(m,8H),2.40-2.36(m,2H),2.27-2.20(m,5H),2.09-1.98(m,5H),1.61-1.35(m,29H),0.89-0.83(m,11H)ppm。

实施例24A

IIId的制备(图17)

(2-{1-[4-({[(5R)-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙基)三甲基铵(IIId)

根据一般方法G，由化合物7cb(20mg，12μmol)和8c(5.2mg，12μmol)，并经反相快速色谱法(0-100％乙腈的TFA(0.01％)水溶液)纯化后，得到化合物IIId(8mg，32％收率)为黄色固体。ESI m/z:681.7(M/3+H)⁺；1021.7(M/2+H)⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO_d6)δ9.73-9.67(m,1H),9.61-9.54(m,1H),8.26-8.20(m,1H),8.19-8.04(m,2H),7.91-7.77(m,1H),7.66-7.57(m,3H),7.40-7.26(m,4H),6.84-6.78(m,2H),6.30(d,J＝10Hz,1H),6.12(s,1H),6.01-5.99(m,1H),5.72-5.42(m,4H),5.24-5.06(m,3H),4.91-4.73(m,3H),4.55-4.16(m,7H),3.89-3.73(m,5H),3.58(t,J＝10.4Hz,3H),3.49-3.41(m,29H),3.26-3.22(m,4H),3.08(s,9H),3.04-2.93(m,4H),2.77-2.62(m,3H),2.40-1.98(m,13H),1.89-1.02(m,41H),0.89-0.84(m,9H)ppm。

实施例24B

IIIe的制备(图17)

(2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-({[(1R,8S,9S)-二环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基]羰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-{[4-({[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]氨基甲酰基}丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙基)三甲基铵(IIIe)

根据一般方法G，由化合物7cb(25mg，15μmol)和8d(6.8mg，15μmol)，并经反相快速色谱法(0-100％乙腈的TFA(0.01％)水溶液)纯化后，得到化合物IIIe(4mg，13％收率)为黄色固体。ESI m/z:685.6(M/3+H)⁺。¹H NMR(400MHz,MeOD_d4)δ7.77-7.71(m,2H),7.40-7.34(m,5H),6.90-6.86(m,2H),6.38-6.33(m,2H),5.66-5.47(m,1H),5.38-5.24(m,1H),5.14-5.02(m,2H),4.76-4.58(m,4H),4.52-4.27(m,6H),4.19-4.11(m,3H),3.99-3.86(m,4H),3.75-3.42(m,37H),3.30-3.27(m,3H),3.17(s,9H),3.16-3.00(m,2H),3.0-2.84(m,1H),2.72-2.46(m,4H),2.38-2.04(m,15H),1.83-1.31(m,27H),1.06-0.90(m,13H)ppm。

实施例25

1l的制备(参见图17)

2-[(4R)-4-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-4-{[(1S)-1-{[(1S)-4-(氨基甲酰基氨基)-1-[(4-{2-[(1S,2S,4R,8S,9S,11S,12R,13S,19S)-12,19-二氟-11-羟基-9,13-二甲基-16-氧-6-丙基-5,7-二氧杂五环[10.8.0.0^2,9.0^4,8.0^13,18]二十烷-14,17-二烯-8-基]-2-氧乙氧基}苯基)氨基甲酰基]丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}丁酰胺基]乙烷-1-磺酸(1l)

根据一般方法H，由化合物7l(20mg，19μmol)和8b，得到化合物1l(6.0mg，20％收率)为白色固体。ESI m/z:793(M/2+H)⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO_d6)δ9.81-9.48(m,1H),8.32-8.18(m,1H),8.12-7.96(m,2H),7.81-7.60(m,4H),7.58-7.43(m,5H),7.41-7.25(m,5H),7.18-6.98(m,2H),6.88-6.81(m,2H),6.30(d,J＝10.3Hz,1H),6.11(s,1H),6.02-5.95(m,1H),5.71-5.52(m,2H),5.40(s,2H),5.15-5.00(m,2H),4.86-4.74(m,2H),4.34-4.13(m,4H),3.63-3.54(m,2H),3.48-3.42(m,9H),3.30-3.28(m,2H),3.12-3.05(m,2H),3.01-2.92(m,2H),2.62-2.56(m,1H),2.42-2.37(m,1H),2.29-2.20(m,3H),2.12-1.95(m,7H),1.86-1.70(m,5H),1.64-1.56(m,4H),1.52-1.22(m,14H),0.92-0.81(m,14H)ppm。

实施例26

1m的制备(参见图17)

2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙烷-1-磺酸(1m)

根据一般方法H，由化合物7m(30mg，22μmol)和8b，得到化合物1m(15mg，37％收率)为白色固体。ESI m/z:642(M/3+H)⁺。¹H NMR(400MHz,DMSO_d6)δ9.68-9.27(m,1H),8.99(s,1H),8.23-7.85(m,4H),7.79-7.71(m,2H),7.76-7.42(m,6H),7.39-7.28(m,3H),7.21(s,1H),7.09(s,1H),6.96-6.93(m,2H),6.81(d,J＝8.4Hz,1H),6.63(d,J＝2.4Hz,1H),6.50(dd,J＝8.4Hz,2.4Hz,1H),5.02(d,J＝14.0Hz,1H),4.93-4.72(m,1H),4.53-4.09(m,5H),3.82-3.75(m,4H),3.62-3.53(m,3H),3.51-3.38(m,23H),3.30-3.27(m,6H),3.12-2.67(m,10H),2.61-2.54(m,4H),2.39-1.52(m,31H),1.45-1.08(m,18H),1.01-0.98(m,6H),0.90-0.82(m,6H)ppm。

实施例26A

IVb的制备(图17)

(2-{1-[4-({[(5R)-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}乙基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}-5-{1-[2-(环辛-2-炔-1-基氧基)乙酰胺基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙基)三甲基铵(IVb)

根据一般方法G，由化合物7fb(20mg，15μmol)和8c，并经制备型HPLC(方法A)纯化后，得到化合物IVb(6mg，23％收率)为黄色固体。ESIm/z:889.8(M/2+H)⁺,593.5(M/3+H)⁺。¹HNMR(500MHz,DMSO_d6)δ9.30(d,J＝8.5Hz,1H),9.02(s,1H),8.76(d,J＝5.5Hz,1H),8.54-8.48(m,1H),8.32-7.76(m,6H),7.62-7.60(m,2H),7.53-7.51(m,2H),7.44(d,J＝8.0Hz,1H),6.95(d,J＝8.5Hz,1H),6.81(d,J＝8.5Hz,1H),6.63(s,1H),6.50(d,J＝8.0Hz,1H),5.33-4.71(m,2H),4.55-4.05(m,7H),3.88-3.74(m,6H),3.61-3.58(m,4H),3.50-3.42(m,44H),3.26-3.24(m,4H),3.08(s,9H),2.84-2.65(m,3H),2.44(t,J＝6.5Hz,2H),2.35-1.26(m,35H),1.16-1.13(m,2H),1.02-0.98(m,6H),0.89-0.84(m,6H)ppm。

实施例27

1q的制备(参见图17)

2-{1-[4-({[(5R)-5-[1-(4-{2-氮杂三环[10.4.0.0^4,9]十六碳-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基}-4-氧丁酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基]-5-{[(1S)-1-{[(1S)-1-({4-[({[(1S)-1-{[(4bS,8S,8aR)-8-({[(1S,4aS,10aR)-6-羟基-1,4a-二甲基-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢菲-1-基]甲酰胺基}羰基)-4b,8-二甲基-4b,5,6,7,8,8a,9,10-八氢菲-3-基]氨基甲酰基}-2-羟基乙基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}氨基甲酰基)-4-(氨基甲酰基氨基)丁基]氨基甲酰基}-2-甲基丙基]氨基甲酰基}戊基]氨基甲酰基}甲氧基)-1H,4H,5H,6H,7H,8H,9H-环辛并[d][1,2,3]三唑-1-基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺基}乙烷-1-磺酸(1q)

向化合物7q(15mg，8.8μmol)和商购DIBAC-Suc-PEG₄-OSu(5.7mg，8.8μmol，CAS1427004-19-0)的DMF(1mL)溶液中加入DIPEA(2.3mg，18μmol)，混合物在室温下搅拌2小时。真空除去大部分挥发物，所得残余物经制备型HPLC(方法B)纯化，得到1q(6.0mg，30％收率)为白色固体。ESI m/z:1123.8(M/2+H)⁺,749.5(M/3+H)⁺。¹H NMR(500MHz,MeOD_d4)δ7.76-7.16(m,14H),7.06-7.00(m,1H),6.88(d,J＝8.5Hz,1H),6.72-6.71(m,1H),6.56-6.55(m,1H),5.39-5.33(m,1H),5.14-5.09(m,5H),4.61(s,18H),4.50-4.43(m,2H),4.33-4.30(m,1H),3.99(s,2H),3.89-3.85(m,3H),3.73-3.42(m,28H),3.25-2.72(m,8H),2.45(t,J＝7.5Hz,2H),2.36-1.96(m,18H),1.81-1.51(m,12H),1.45-1.32(m,15H),1.12-0.89(m,12H)ppm。

表2B和表2B-1总结了连接体-有效负载的结果：HPLC纯度和HPLC上的LC保留时间，来自质谱的M/Z。分析型HPLC和MS方法描述于一般方法中。

表2B.连接体-有效负载的化学物理性质

1.可能存在COT-异构体。

表2B-1.连接体-有效负载的化学物理性质

1.可能存在两个区域异构体。

实施例28

本实施例示出了在体外脂多糖(LPS)介导的IL-1β释放测定试验中，包含SO₃H基团部分的抗MSR1抗体类固醇非细胞毒性ADC的活性。

对于所述测定试验，将THP-1细胞以40,000个细胞/孔接种到96孔板的培养基(所述培养基含有RPMI，补充有10％FBS和青霉素/链霉素)中，并用200nM佛波醇(Phorbol)肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)分化3天。经过3天的分化之后，将抗体药物偶联物以及未偶联抗体新鲜培养基的三倍连续稀释液以100nM至0.01nM的终浓度加至细胞中。板中的最后一个孔用作仅包含培养基的空白对照。72小时后，将细胞用5μg/mL的LPS(InVivoGen，目录号tlrl-eklps)处理5小时。然后收集细胞培养基，并按照制造商的说明书使用V-PLEXProinflammatory Panel 1人用试剂盒(Meso Scale Diagnostics，目录号15049D-2)来测定IL-1β。随后在MSD读板仪(Meso Scale Discovery)上读取所述板。IC₅₀值是通过10点响应曲线上的四参数逻辑斯蒂方程(GraphPadPrism)进行确定。所有IC₅₀值均以摩尔(M)浓度表示。

如表1A所示，与不含SO₃H基团部分的类固醇连接体有效负载偶联的H1H21234N-N297Q(H1H21234N-N297Q-实施例10A)表现出对LPS介导的THP1细胞IL-1β释放的抑制，IC₅₀值为1.73nM，且释放的IL-1β降低至97.2pg/mL。与含SO₃H基团部分的类固醇连接体有效负载偶联的H1H21234N-N297Q(H1H21234N-N297Q-实施例19)表现出对LPS介导的THP1细胞IL-1β释放的抑制，IC₅₀值为1.97nM，且释放的IL-1β降低至97.17pg/mL。未偶联的抗体表现出对LPS介导的THP1细胞IL-1β释放的抑制，IC₅₀值为22.9nM，释放的IL-1β降低至343.7pg/mL，表明与偶联的抗体相比缺乏功效。

表1A：抗MSR1 Ab-类固醇ncADC对LPS诱导的THP1细胞IL-1β释放的活性

pH稳定性

pH稳定性如下进行评估。将0.1mg的样品溶于0.2-0.3mL DMSO，然后将所得溶液逐滴加至不同的pH缓冲液(1mL)中，同时在测试期间保持澄清溶液。从几个时间点(例如，72小时内)收集样本，并通过LC-MS来测定pH稳定性。pH缓冲液制备如下：pH 8.0的硼酸钠缓冲液：向900mL蒸馏水中加入9.534g十水合硼酸钠、1.461g氯化钠和0.393gDTPA，确保所有粉状物完全溶解，然后通过加水使最终体积达到1L。pH 7.4的硼酸钠缓冲液：向900mL蒸馏水中加入900ml Milli-Q水(超纯水)、9.534g十水合硼酸钠、1.461g氯化钠和0.393gDTPA，确保所有粉状物完全溶解，然后通过加水使最终体积达到1L。pH 5.0的琥珀酸缓冲液：向150mL蒸馏水中加入10mM琥珀酸，然后通过添加0.5M NaOH调节pH值为pH 5.0，然后通过加水使最终体积达到250mL。pH 7.4的PBS缓冲液：市售得到。通过LCMS在72小时时评估稳定性。

溶解性

溶解度测试的方法：将1mg测试样品溶于1mL DMSO，并制备标准溶液A(4.5mL，100μg/mL)、B(4.5mL，10μg/mL)、C(4.5mL，1μg/mL)、D(5mL，0.1μg/mL)。

标准溶液	样品量(mg)	DMSO(％)	总体积(mL)	浓度(mg/mL)
					DMSO	1	100％	1	1
A	0.5	10％	5	0.1
					B	0.05	1％	5	0.01
C	0.005	0.10％	5	0.001
					D	0.0005	0.01％	5	0.0001

将DMSO溶液(1mg/mL，0.5mL)用水(4.5mL)稀释以生成溶液A(0.1mg/mL，5mL，0.5mg)。将溶液A(0.1mg/mL，0.5mL)用水(4.5mL)稀释以生成溶液B(0.01mg/mL，5mL，0.05mg)。将溶液B(0.01mg/mL，0.5mL)用水(4.5mL)稀释以生成溶液C(1μg/mL，5mL，5μg)。将溶液C(1μg/mL，0.5mL)用水(4.5mL)稀释以生成溶液D(0.1μg/mL，5mL，0.5μg)。将测试样品(0.05mg)悬浮于水(1mL)中，并超声处理5-30分钟以使样品溶解。如果未观察到澄清溶液，则将所得悬浮液离心并收集澄清的上清液用于分析。所有标准溶液A、B、C、D和试样溶液均使用同一方法在同一台LC-MS仪器上进行测试。通过LCMS来评估溶解度并基于标准曲线进行计算。表3和表3-1示出了来自这些实验的数据。

表3.连接体-有效负载的pH稳定性、溶解度数据

Y：在室温下于pH 7.4或8的缓冲液中可稳定3天以上；

表3-1.连接体-有效负载的pH稳定性、溶解度数据

Y：在室温下于pH 7.4或8的缓冲液中可稳定3天以上。

实施例29

ADC偶联物(参见图19)

本实施例说明了将有效负载与抗体或其抗原结合片段进行位点特异性偶联的一般方法。

以下实施例说明了制备偶联物的方法。将具有人IgG1同种型的无糖基化抗体的BupH^TM溶液(pH7.6-7.8)与≥200摩尔当量的叠氮基-dPEG₃-胺(MW.218.26g/mol)混合。将所得溶液与转谷氨酰胺酶(25U/mL；5UMTG/mg抗体)混合，使抗体的终浓度为0.5–10mg/mL，然后将溶液在37℃下孵育4-24小时，同时轻轻振荡。通过SDS-PAGE或ESI-MS监测反应。反应完成后，通过体积排除色谱法(SEC)除去过量的胺和MTG，以生成叠氮基官能化的抗体(mAb-N₃)。此产物在SDS-PAGE和ESI-MS上进行分析。将叠氮基-dPEG₃-胺添加至抗体的两个位点-Q295和Q297-，使得所述4DAR无糖基化的抗体-PEG₃-叠氮化物偶联物增加804Da。通过胰蛋白酶消化的重链的肽序列作图，在EEQ^LinkerYQ^LinkerSTYR(EEQ^连接体YQ^连接体STYR)处鉴定和确证所述4DAR叠氮基官能化抗体的偶联位点。

通过叠氮基官能化抗体(mAb-N₃)与含有连接体-有效负载(LP)的炔之间的[2+3]点击反应制备得到具有针对MSR1、HER2(或PRLR)的人IgG1或IgG4且含有N297Q突变的位点特异性无糖基化抗体药物偶联物(ADC)。FeID1是非结合性对照抗体。

如表5所示，将含有N297Q突变的位点特异性无糖基化抗体与胺-PEG₃-N₃偶联，生成叠氮基官能化抗体偶联物(mAb-N₃)，包括抗MSR1 Ab–PEG₃–N₃、抗FelD1 Ab–PEG₃–N₃、抗HER2Ab–PEG₃–N₃、抗PRLRAb–PEG₃–N₃。

通过将mAb–PEG₃–N₃(1-12mg/mL)在溶于适当有机溶剂(如DMSO、DMF或DMA)(即，反应混合物包含5-20％的有机溶剂，v/v)中的≥6摩尔当量LP的水性介质(例如PBS，含5％甘油的PBS，HBS)中，在24℃至37℃下孵育30分钟至24小时，来制备具有连接体-有效负载(LP)的位点特异性抗体偶联物。通过ESI-MS监测反应进程，若不存在mAb–PEG₃–N₃，表明偶联完成。通过SEC用PBS进行洗脱，或通过蛋白A柱色谱用酸性缓冲液进行洗脱，然后用Tris(pH8.0)中和，来除去过量的LP和有机溶剂。所述经纯化的偶联物通过SEC、SDS-PAGE和ESI-MS进行分析。表5中列出了来自相应LP的MMAE抗体偶联物、类固醇抗体偶联物和LXR激动剂抗体偶联物，它们的分子量和ESI-DAR值。

在具体实施例中，在室温下，用6摩尔当量的来自表2的连接体有效负载(LP)(浓度为10mg/mL的DMSO溶液)处理0.800mLPBSg(PBS，5％甘油，pH 7.4)中的叠氮基官能化抗体(1mg)2小时，然后通过体积排除色谱法(SEC，Superdex200 HR，GE Healthcare)除去过量的连接体有效负载(LP)。通过超速离心法浓缩最终产物，并通过UV、SEC、SDS-PAGE和ESI-MS进行表征。

通过LC–ESI–MS对ADC进行表征

通过LC-ESI-MS对ADC样品的完整质量进行测定，以确定药物-有效负载分布曲线并计算平均DAR。将各个测试样品(20-50ng，5uL)上样至AcquityUPLC ProteinBEH C4色谱柱(10Kpsi，

1.7μm，75μm×100mm；目录号186003810)。脱盐3分钟后，洗脱蛋白质，并通过Waters SynaptG2-Si质谱仪得到质谱。表5列出了裸抗体、叠氮基官能化抗体偶联物(mAb-N₃)、LP和ADC的分子量(MW)。如表5所示，大多数位点特异性ADC的位点特异性偶联物均具有3.9-4DAR。

表5.偶联物列表

实施例30

本实施例说明了使用组织蛋白酶B切割测定试验来评估当连接体上存在SO₃H基团部分、N⁺Me₃基团部分、膦酸基团部分、或半乳糖基团部分时，对类固醇有效负载或LXR激动剂有效负载的切割效率的影响。

对于所述测定试验，将连接体-有效负载储备溶液(10mM连接体-有效负载的DMSO溶液)加至pH值为5的100mM NaOAc、10mM二硫苏糖醇溶液中，以得到50μM底物溶液。将pH值为5的50mM NaOAc、1mM EDTA中的人肝组织蛋白酶B(Athens Research&Technology，目录号16-12-030102)加至底物溶液中。将所述组织蛋白酶B和底物溶液与和不与10mM组织蛋白酶B抑制剂(CA074；APE Bio，目录号A1926)混合，并在37℃下孵育4小时。孵育4小时后，加入乙酸，然后加入乙腈以终止反应。然后将淬灭的样品以14,000rpm进行离心。然后将等份的上清液用等体积的水稀释，并通过LC/MS进行分析以确定释放的有效负载的量。组织蛋白酶B的稳定性和活性通过与组织蛋白酶B的200μM荧光底物(Santa Cruz Biotechnology，目录号207975)(激发波长为340nm/发射波长为425nm的荧光)一同孵育来确证。

如表1B所示，不含SO₃H基团部分的LXR激动剂连接体有效负载当用组织蛋白酶B处理4小时时，释放了13.6％的游离有效负载，而含有SO₃H基团部分的LXR激动剂连接体有效负载当用组织蛋白酶B处理4小时时，释放了44.2％的游离有效负载。不含SO₃H基团部分的类固醇连接体有效负载当用组织蛋白酶B处理4小时时，释放了7.5％-17.2％的游离有效负载，而含有SO₃H基团部分的类固醇连接体有效负载当用组织蛋白酶B处理4小时时，释放了79.6％的游离有效负载。表1C和表1D示出了使用组织蛋白酶B处理连接体有效负载时释放游离有效负载的其他数据。

表1B：组织蛋白酶B测定试验中含有SO₃H基团部分和不含SO₃H基团部分的连接体-有效负载释放的有效负载的量(参见图18)

表1C：组织蛋白酶B测定试验中含有不同SO₃H连接体的连接体-有效负载释放的有效负载的量(参见图18)

表1D：组织蛋白酶B测定试验中由连接体-有效负载(图19)释放的有效负载百分比(％)

实施例31

本实验通过测定随时间变化的溶酶体切割，来说明当抗MSR1抗体类固醇非细胞毒性ADC(ncADC)中存在亲水性连接体时，对类固醇有效负载的切割效率的影响。

对于所述测定试验，将ncADC加至新鲜制备的溶酶体工作溶液中，所述工作溶液含有1倍量分解代谢缓冲液(Xenotech，目录号K5200)和0.125mg/mL人肝溶酶体蛋白(Xenotech，目录号H0610.L)。将含有0.25μM ncADC的200μL所得混合物于37℃下孵育24小时，同时轻轻振荡。分别在0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和24小时时取20μL等分试样，然后转移至含有80μL冷乙腈的平板中以使溶酶体失活并使蛋白质沉淀。在2,000rpm下离心5分钟后，将上清液的等分试样用等体积的水稀释，然后通过LC-MS进行分析以确定有效负载的释放量。

如表1E所示，不含亲水性连接体的ncADC类固醇偶联物(H1H21234N-N297Q-实施例10A)在24小时时间点释放了548nM类固醇。而含有亲水性连接体的ncADC类固醇偶联物(H1H21234N-N297Q-实施例19)在24小时时间点释放了760nM类固醇。

表1E：含有亲水性连接体和不含亲水性连接体的类固醇释放量

上述实施方案和实施例旨在仅是说明性的而非限制性的。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验便可以确定具体化合物、材料/物料和程序/方法的许多等同物。所有此类等同物均认为包含在本发明范围内，并被所附权利要求所涵盖。

Claims

1.化合物，或其药学上可接受的溶剂化物、立体异构体或衍生物，其包含结合剂，所述结合剂经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个亲水性残基，其中所述共价连接体直接或间接与各个所述结合剂、所述有效负载基团部分和所述亲水性残基连接。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述亲水性残基包含末端亲水性基团。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述亲水性残基包含磺酸基团或其盐。

4.根据权利要求1或2所述的化合物，其中所述亲水性残基包含季胺或其盐、膦酸基团或其盐、或糖残基。

5.根据权利要求1所述的化合物，其具有式(I)所示结构：

其中：

BA是结合剂；

L是三价连接体；

HL是亲水性残基；

PA是有效负载残基；和

下标n是从1至30的整数。

6.根据权利要求5所述的化合物，其具有式(II)所示结构：

其中：

BA是结合剂；

LL是三价连接体；

RG¹和RG²均为活性基团残基；

HG是亲水性残基；

PA是有效负载残基；

下标n是从1至30的整数；和

下标q是0或1。

7.根据权利要求5或6所述的化合物，其中下标n是1、2、3或4。

8.根据权利要求5所述的化合物，其具有式(III)所示结构：

其中，

环A与所述三唑稠合，和环A选自由环烷基、环烯基、杂环烷基、和杂环烯基组成的组；

其中环烷基、环烯基、杂环烷基和杂环烯基均任选地被烷基、-OH、或-NR^aR^b取代，其中R^a和R^b各自为烷基或H。

9.根据权利要求6所述的化合物，其具有式(IV)所示结构：

其中：

AA¹是包含氨基酸残基的三价连接体；

AA²是二肽残基、三肽残基、或四肽残基；和

PAB是

其中所述

表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子；

下标p是0或1；和

下标q是0或1。

10.根据权利要求9所述的化合物，其具有式(IVa)、式(IVb)或式(IVc)所示结构：

11.根据权利要求10所述的化合物，其中AA¹是赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、或天冬氨酸。

12.根据权利要求10所述的化合物，其分别具有式(Va)、(Vb)、(Vc)或(Vd)所示结构：

其中：

下标e在每种情况下，分别独立地为从0至6的整数。

13.根据权利要求9-12任一项所述的化合物，其中RG¹和RG²在每种情况下，分别独立地为点击化学残基。

14.根据权利要求9-12任一项所述的化合物，其中RG¹和RG²在每种情况下，分别独立地包含三唑或稠合三唑。

15.根据权利要求9-14任一项所述的化合物，其中RG¹和RG²在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：

其中所述

16.根据权利要求9-15任一项所述的化合物，其中HG是

其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

17.根据权利要求9-15任一项所述的化合物，其中HG是

其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

18.根据权利要求9-15任一项所述的化合物，其中HG是

其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

19.根据权利要求9-15任一项所述的化合物，其中HG是

其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

20.根据权利要求9-19任一项所述的化合物，其中SP¹和SP²在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地选自由以下组成的组：C_1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH₂-CH₂-O)_e、-NH-CH₂-CH₂-(-O-CH₂-CH₂)_e-C(O)-、-C(O)-(CH₂)_u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH₂)_v-、(甘氨酸)₄-丝氨酸、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。

21.根据权利要求9-19任一项所述的化合物，其中

是选自由以下组成的组：

各

分别为与所述结合剂连接的键；和

各

分别为与所述有效负载残基连接的键。

22.根据权利要求9-19任一项所述的化合物，其中

是选自由以下组成的组：

各

分别为与所述结合剂连接的键；和

各

分别为与所述有效负载残基连接的键。

23.根据权利要求6所述的化合物，其中LL具有式(LL1)所示结构：

24.根据权利要求23所述的化合物，其中R^AA1是直接或间接与HG连接的赖氨酸侧链、谷氨酰胺侧链、谷氨酸侧链、或天冬氨酸侧链，和R^AA2与R^AA3分别是缬氨酸和丙氨酸侧链或分别是缬氨酸和瓜氨酸侧链。

25.根据权利要求9-12任一项所述的化合物，其中AA²是

其中R^AA2、R^AA3、R^AA4和R^AA5各自独立地为氨基酸侧链，其中至少一个直接或间接与

–(RG²)_q-SP²-HG连接，其中所述

表示AA²通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

26.根据权利要求9-12任一项所述的化合物，其中AA²是

其中所述

表示AA²通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

27.根据权利要求12-26任一项所述的化合物，其中下标e是4。

28.根据权利要求1-27任一项所述的化合物，其中所述结合剂(BA)是抗体或其抗原结合片段。

29.根据权利要求1-27任一项所述的化合物，其中所述结合剂(BA)是抗体或其抗原结合片段，其对选自由以下组成的组的抗原具有选择性：AXL，BAFFR，BCMA，BCR–列表组分(BCR–list components)，BDCA2，BDCA4，BTLA，BTNL2，BTNL3，BTNL8，BTNL9，C10orf54，CCR1，CCR3，CCR4，CCR5，CCR6，CCR7，CCR9，CCR10，CD11c，CD137，CD138，CD14，CD168，CD177，CD19，CD20，CD209，CD209L，CD22，CD226，CD248，CD25，CD27，CD274，CD276，CD28，CD30，CD300A，CD33，CD37，CD38，CD4，CD40，CD44，CD45，CD46，CD48，CD5，CD52，CD55，CD56，CD59，CD62E，CD68，CD69，CD70，CD74，CD79a，CD79b，CD8，CD80，CD86，CD90.2，CD96，CLEC12A，CLEC12B，CLEC7A，CLEC9A，CR1，CR3，CRTAM，CSF1R，CTLA4，CXCR1/2，CXCR4，CXCR5，DDR1，DDR2，DEC-205，DLL4，DR6，FAP，FCamR，FCMR，FcR's，Fire，GITR，HHLA2，HLA II类，HVEM，ICOSLG，IFNLR1，IL10R1，IL10R2，IL12R，IL13RA1，IL13RA2，IL15R，IL17RA，IL17RB，IL17RC，IL17RE，IL20R1，IL20R2，IL21R，IL22R1，IL22RA，IL23R，IL27R，IL29R，IL2Rg，IL31R，IL36R，IL3RA，IL4R，IL6R，IL5R，IL7R，IL9R，整合素(Integrins)，LAG3，LIFR，MAG/Siglec-4(唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-4)，MMR，MSR1，NCR3LG1，NKG2D，NKp30，NKp46，PDCD1，PROKR1，PVR，PVRIG，PVRL2，PVRL3，RELT，SIGIRR，Siglec-1(唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素-1)，Siglec-10，Siglec-5，Siglec-6，Siglec-7，Siglec-8，Siglec-9，SIRPA，SLAMF7，TACI，TCR–列表组分/assoc(TCR-list components/assoc)，PTCRA，TCRb，CD3z，CD3，TEK，TGFBR1，TGFBR2，TGFBR3，TIGIT，TLR2，TLR4，TROY，TSLPR，TYRO，VLDLR，VSIG4，和VTCN1。

30.根据权利要求1-29任一项所述的化合物，其中PA是选自由以下组成的组的基团的残基：海兔毒素(dolastatin)，奥瑞他汀(auristatin)，美登素类化合物(maytansinoid)，植物生物碱类化合物(plant alkaloid)，紫杉烷类(taxane)，长春花生物碱类化合物(vinca alkaloid)，类固醇(steroid)，和肝X受体(LXR)调节剂。

31.根据权利要求1-30任一项所述的化合物，其选自由以下组成的组：

各Ab分别为抗体、或其抗原结合片段；

PA是有效负载残基；和

下标n是从1至30的整数。

32.根据权利要求1-30任一项所述的化合物，其选自由以下组成的组：

各Ab分别为抗体、或其抗原结合片段；和

下标n是从1至30的整数。

33.根据权利要求1-32任一项所述的化合物，其中BA是式(Ab-1)所示的经修饰的抗体：

其中所述

表示Ab-1通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

34.根据权利要求1-33任一项所述的化合物，其选自由以下组成的组：

各Ab分别为抗体、或其抗原结合片段；和

下标n是从1至30的整数。

35.药物组合物，其包含权利要求1-34任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的辅料。

36.治疗有需要的患者的疾病或病症的方法，其包含向所述患者施用权利要求1-34任一项所述的化合物或权利要求35所述的组合物。

37.化合物，其包含活性连接体，所述活性连接体经由共价连接体连接至至少一个有效负载基团部分并经由共价连接体连接至至少一个亲水性残基，其中所述共价连接体直接或间接与各个所述活性连接体、所述有效负载基团部分和所述亲水性残基连接。

38.根据权利要求37所述的化合物，其具有式(VI)所示结构：

其中：

RG是活性基团；

L是三价连接体；

HL是亲水性残基；和

PA是有效负载残基。

39.根据权利要求38所述的化合物，其具有式(VII)所示结构：

其中：

LL是三价连接体；

RG是活性基团；

RG²是活性基团残基；

HG是亲水性残基；

PA是有效负载残基；和

下标q是0或1。

40.根据权利要求39所述的化合物，其具有式(VIII)所示结构：

其中

41.根据权利要求39所述的化合物，其具有式(IX)所示结构：

其中：

AA¹是包含氨基酸残基的三价连接体；

AA²是二肽残基、三肽残基、或四肽残基；和

PAB是

其中所述

表示所述PAB通过其与所述通式中相邻基团连接的原子；

下标p是0或1；和

下标q是0或1。

42.根据权利要求41所述的化合物，其具有式(IXa)、式(IXb)或式(IXc)所示结构：

43.根据权利要求42所述的化合物，其中AA¹是赖氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、或天冬氨酸。

44.根据权利要求42所述的化合物，其具有式(Xa)、(Xb)、(Xc)、或(Xd)所示结构：

其中：

下标e在每种情况下，分别独立地为从0至6的整数。

45.根据权利要求38-44任一项所述的化合物，其中RG在每种情况下，分别独立地为点击化学残基。

46.根据权利要求38-44任一项所述的化合物，其中RG在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：

其中所述

表示所述RG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

47.根据权利要求38-46任一项所述的化合物，其中RG²在每种情况下，分别独立地选自由以下组成的组：

其中所述

表示所述RG²通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

48.根据权利要求39-47任一项所述的化合物，其中HG是

其中

所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

49.根据权利要求39-47任一项所述的化合物，其中HG是

其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

50.根据权利要求39-47任一项所述的化合物，其中HG是

其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

51.根据权利要求39-47任一项所述的化合物，其中HG是

其中所述

表示所述HG通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

52.根据权利要求39-51任一项所述的化合物，其中SP¹和SP²在每种情况下，分别独立地不存在，或分别独立地选自由以下组成的组：C_1-6亚烷基、-NH-、-C(O)-、(-CH₂-CH₂-O)_e、-NH-CH₂-CH₂-(-O-CH₂-CH₂)_e-C(O)-、-C(O)-(CH₂)_u-C(O)-、-C(O)-NH-(CH₂)_v-、(甘氨酸)₄-丝氨酸、和其组合，其中下标e是从0至4的整数，下标u是从1至8的整数，和下标v是从1至8的整数。

53.根据权利要求39-52任一项所述的化合物，其中

是选自由以下组成的组：

各

分别为与所述有效负载残基连接的键。

54.根据权利要求39-52任一项所述的化合物，其中

是选自由以下组成的组：

各

分别为与所述有效负载残基连接的键。

55.根据权利要求39所述的化合物，其中LL具有式(LL1)所示结构：

56.根据权利要求55所述的化合物，其中R^AA1是直接或间接与HG连接的赖氨酸侧链、谷氨酰胺侧链、谷氨酸侧链、或天冬氨酸侧链，和R^AA2与R^AA3分别是缬氨酸和丙氨酸侧链或分别是缬氨酸和瓜氨酸侧链。

57.根据权利要求41-54任一项所述的化合物，其中AA²是

–(RG²)_q-SP²-HG连接，其中所述

表示AA²通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

58.根据权利要求41-54任一项所述的化合物，其中AA²是

其中所述

表示AA²通过其与所述通式中相邻基团连接的原子。

59.根据权利要求44-52任一项所述的化合物，其中下标e是4。

60.根据权利要求37-59任一项所述的化合物，其中PA是选自由以下组成的组的基团的残基：海兔毒素(dolastatin)，奥瑞他汀(auristatin)，美登素类化合物(maytansinoid)，植物生物碱类化合物(plant alkaloid)，紫杉烷类(taxane)，长春花生物碱类化合物(vinca alkaloid)，类固醇(steroid)，和肝X受体(LXR)调节剂。

61.根据权利要求37-60任一项所述的化合物，其选自由以下组成的组：