CN111560473A - 一种用于检测尿液jc病毒的试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测尿液JC病毒的试剂盒，试剂盒包括阳性对照组、待测组和阴性对照组；阳性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV‑F、JCV‑R、JC病毒DNA和ddH2O；待测组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV‑F、JCV‑R和ddH2O；阴性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV‑F、JCV‑R、和ddH2O；其中JC病毒引物序列为：JCV‑F：GGTATACACAGCTTTTGAAGCAACA；JCV‑R：CCTTCCTTTCTCCAAAACTTTTTG。一种用于检测尿液JC病毒的方法，按照先后顺序包括以下步骤：步骤一：待测样本的获取；步骤二：PCR反应液的配置；步骤三：PCR扩增；步骤四：回收DNA；步骤五：测序；步骤六：与JC病毒的序列进行比对。该用于检测尿液JC病毒的试剂盒和方法能够快速检测出尿液中是否带有JC病毒，而且准确度高，周期短，采用特有的JC病毒引物序列，使得检测特异性高。
Description
技术领域
本发明属于生物JC病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测尿液JC病毒的试剂盒和方法。
背景技术
JC病毒(JCV)属人类多瘤病毒，是一种小双链DNA病毒。JCV由PADGETT于1971年等首先在进行性多灶性脑白质病(Progressive Multifocal Lukoenphalapathy，PML)患者中发现并分离出。该病毒只有一种血清型，但可分为30多个基因型。
JCV是一种机会感染性病原，正常人群中血清学阳性率高达80％以上。初次感染一般发生在儿童时期，并且多无症状。JCV可通过分娩(胎盘)、哺乳或长期共同生活接触从母亲传播给子女，也可通过呼吸道、消化道传播。初次感染后，JCV以潜伏状态存在于人体组织，但是当宿主免疫力降低时，病毒可以重新激活复制，并且导致宿主病理改变。
目前没有针对JCV有效的抗病毒药物，早期诊断是JCV感染相关疾病防治的最好手段。确认JCV感染的检测包括检测血清中特异性VP1抗体；对感染者的尿液、脑脊液、血液及病变组织进行JCV DNA检测；对活组织进行原位杂交及免疫组化检测等。由于JCV在人群中感染率很高，抗体检测并非确证活动性JCV感染的可靠方法。所以我们需要一款快速、准确的尿液JC病毒的试剂盒和方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测尿液JC病毒的试剂盒和方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于检测尿液JC病毒的试剂盒，所述试剂盒包括阳性对照组、待测组和阴性对照组；
所述阳性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R、JC病毒DNA和ddH2O；
所述待测组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R和ddH2O；
所述阴性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R、和ddH2O；
其中所述JC病毒引物序列为：
JCV-F：GGTATACACAGCTTTTGAAGCAACA；
JCV-R：CCTTCCTTTCTCCAAAACTTTTTG。
优选的，所述2×Taq Mix包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料。
一种用于检测尿液JC病毒的方法，按照先后顺序包括以下步骤：
步骤一：待测样本的获取：从待测尿液中提取DNA，获得待测样本；
步骤二：PCR反应液的配置：阳性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix25-35μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、JC病毒DNA 2μL、ddH2O补至50μL；待测组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、JCV-F2μL、JCV-R 2μL、样本DNA 2μL、ddH2O补至50μL；阴性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、ddH2O补至50μL；
步骤三：PCR扩增：将上述配置的PCR反应液放入PCR仪中，并设定反应参数；
步骤四：将上述PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将样本中与阳性对照组大小相同的条带回收；
步骤五：将样本回收的DNA进行纯化，然后连接载体送去测序；
步骤六：与JC病毒的序列进行比对，如果一致，则指示该样品中存在JC病毒，如不一致或者样本管中无与阳性对照相同大小的条带，则指示该样品中不存在JC病毒。
优选的，所述步骤三中反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，30s；60℃，30s；72℃，20s，循环次数为40次；72℃，10min。
优选的，所述步骤一从尿液中提取DNA按先后顺序依次为：
尿液样本10ml左右，5000转离心10min,收集底部的沉淀，用枪小心吸走上方的液体，底部仍保留部分液体；
加入TE缓冲液1.5ml，混匀，8000转,离心5min,收集沉淀；
将上述沉淀37℃水浴温育1h后，加入0.2ml浓度为1mg/ml蛋白酶K，然后50℃水浴3h；
拿出冷却至室温，加入等体积的饱和酚溶液，转动离心管8min，接着5000rpm离心15min，吸取上层水相，移至另一离心管中；
向离心管中加入等体积的氯仿﹕异戊醇(24﹕1)，上下转动混匀，5000rpm离心15min，吸取上层水相，移至另一离心管中；
加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，用玻璃棒挑取絮状DNA转入另一离心管中，加70％乙醇0.2ml，5000rpm离心15min，弃上清；
重复上述步骤一次：
室温放置离心管5min，然后加入20μL DEPC水溶解DNA，-20℃冰箱保存备用。
本发明的技术效果和优点：该用于检测尿液JC病毒的试剂盒和方法能够快速检测出尿液中是否带有JC病毒，而且准确度高，周期短，采用特有的JC病毒引物序列，使得检测特异性高。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种用于检测尿液JC病毒的试剂盒，试剂盒包括阳性对照组、待测组和阴性对照组；
阳性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R、JC病毒DNA和ddH2O；
待测组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R和ddH2O；
阴性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R、和ddH2O；
2×Taq Mix包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料
其中JC病毒引物序列为：
JCV-F：GGTATACACAGCTTTTGAAGCAACA；
JCV-R：CCTTCCTTTCTCCAAAACTTTTTG。
一种用于检测尿液JC病毒的方法，按照先后顺序包括以下步骤：
步骤一：待测样本的获取：从待测尿液中提取DNA，获得待测样本，从尿液中提取DNA按先后顺序依次为：
尿液样本10ml左右，5000转离心10min,收集底部的沉淀，用枪小心吸走上方的液体，底部仍保留部分液体；
加入TE缓冲液1.5ml，混匀，8000转,离心5min,收集沉淀；
将上述沉淀37℃水浴温育1h后，加入0.2ml浓度为1mg/ml蛋白酶K，然后50℃水浴3h；
拿出冷却至室温，加入等体积的饱和酚溶液，转动离心管8min，接着5000rpm离心15min，吸取上层水相，移至另一离心管中；
向离心管中加入等体积的氯仿﹕异戊醇(24﹕1)，上下转动混匀，5000rpm离心15min，吸取上层水相，移至另一离心管中；
加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，用玻璃棒挑取絮状DNA转入另一离心管中，加70％乙醇0.2ml，5000rpm离心15min，弃上清；
重复上述步骤一次：
室温放置离心管5min，然后加入20μL DEPC水溶解DNA，-20℃冰箱保存备用；
步骤二：PCR反应液的配置：阳性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix25μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、JC病毒DNA 2μL、ddH2O补至50μL；待测组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、样本DNA 2μL、ddH2O补至50μL；阴性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、ddH2O补至50μL；
步骤三：PCR扩增：将上述配置的PCR反应液放入PCR仪中，并设定反应参数，反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，30s；60℃，30s；72℃，20s，循环次数为40次；72℃，10min；
步骤四：将上述PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将样本中与阳性对照组大小相同的条带回收；
步骤五：将样本回收的DNA进行纯化，然后连接载体送去测序；
步骤六：与JC病毒的序列进行比对，如果一致，则指示该样品中存在JC病毒，如不一致或者样本管中无与阳性对照相同大小的条带，则指示该样品中不存在JC病毒。
实施例二：
一种用于检测尿液JC病毒的试剂盒，试剂盒包括阳性对照组、待测组和阴性对照组；
阳性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R、JC病毒DNA和ddH2O；
待测组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R和ddH2O；
阴性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R、和ddH2O；
2×Taq Mix包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料
其中JC病毒引物序列为：
JCV-F：GGTATACACAGCTTTTGAAGCAACA；
JCV-R：CCTTCCTTTCTCCAAAACTTTTTG。
一种用于检测尿液JC病毒的方法，按照先后顺序包括以下步骤：
步骤一：待测样本的获取：从待测尿液中提取DNA，获得待测样本，从尿液中提取DNA按先后顺序依次为：
尿液样本10ml左右，5000转离心10min,收集底部的沉淀，用枪小心吸走上方的液体，底部仍保留部分液体；
加入TE缓冲液1.5ml，混匀，8000转,离心5min,收集沉淀；
将上述沉淀37℃水浴温育1h后，加入0.2ml浓度为1mg/ml蛋白酶K，然后50℃水浴3h；
拿出冷却至室温，加入等体积的饱和酚溶液，转动离心管8min，接着5000rpm离心15min，吸取上层水相，移至另一离心管中；
向离心管中加入等体积的氯仿﹕异戊醇(24﹕1)，上下转动混匀，5000rpm离心15min，吸取上层水相，移至另一离心管中；
加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，用玻璃棒挑取絮状DNA转入另一离心管中，加70％乙醇0.2ml，5000rpm离心15min，弃上清；
重复上述步骤一次：
室温放置离心管5min，然后加入20μL DEPC水溶解DNA，-20℃冰箱保存备用；
步骤二：PCR反应液的配置：阳性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix30μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、JC病毒DNA 2μL、ddH2O补至50μL；待测组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 30μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、样本DNA 2μL、ddH2O补至50μL；阴性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 30μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、ddH2O补至50μL；
步骤三：PCR扩增：将上述配置的PCR反应液放入PCR仪中，并设定反应参数，反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，30s；60℃，30s；72℃，20s，循环次数为40次；72℃，10min；
步骤四：将上述PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将样本中与阳性对照组大小相同的条带回收；
步骤五：将样本回收的DNA进行纯化，然后连接载体送去测序；
步骤六：与JC病毒的序列进行比对，如果一致，则指示该样品中存在JC病毒，如不一致或者样本管中无与阳性对照相同大小的条带，则指示该样品中不存在JC病毒。
实施例三：
一种用于检测尿液JC病毒的试剂盒，试剂盒包括阳性对照组、待测组和阴性对照组；
阳性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R、JC病毒DNA和ddH2O；
待测组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R和ddH2O；
阴性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R、和ddH2O；
2×Taq Mix包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料
其中JC病毒引物序列为：
JCV-F：GGTATACACAGCTTTTGAAGCAACA；
JCV-R：CCTTCCTTTCTCCAAAACTTTTTG。
一种用于检测尿液JC病毒的方法，按照先后顺序包括以下步骤：
步骤一：待测样本的获取：从待测尿液中提取DNA，获得待测样本，从尿液中提取DNA按先后顺序依次为：
尿液样本10ml左右，5000转离心10min,收集底部的沉淀，用枪小心吸走上方的液体，底部仍保留部分液体；
加入TE缓冲液1.5ml，混匀，8000转,离心5min,收集沉淀；
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重复上述步骤一次：
室温放置离心管5min，然后加入20μL DEPC水溶解DNA，-20℃冰箱保存备用；
步骤二：PCR反应液的配置：阳性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix35μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、JC病毒DNA2μL、ddH2O补至50μL；待测组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 35μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、样本DNA2μL、ddH2O补至50μL；阴性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 35μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、ddH2O补至50μL；
步骤三：PCR扩增：将上述配置的PCR反应液放入PCR仪中，并设定反应参数，反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，30s；60℃，30s；72℃，20s，循环次数为40次；72℃，10min；
步骤四：将上述PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将样本中与阳性对照组大小相同的条带回收；
步骤五：将样本回收的DNA进行纯化，然后连接载体送去测序；
步骤六：与JC病毒的序列进行比对，如果一致，则指示该样品中存在JC病毒，如不一致或者样本管中无与阳性对照相同大小的条带，则指示该样品中不存在JC病毒。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种用于检测尿液JC病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括阳性对照组、待测组和阴性对照组；
所述阳性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R、JC病毒DNA和ddH2O；
所述待测组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R和ddH2O；
所述阴性对照组包括2×Taq Mix、JC病毒引物JCV-F、JCV-R、和ddH2O；
其中所述JC病毒引物序列为：
JCV-F：GGTATACACAGCTTTTGAAGCAACA；
JCV-R：CCTTCCTTTCTCCAAAACTTTTTG。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测尿液JC病毒的试剂盒，其特征在于：所述2×TaqMix包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料。
3.一种根据权利要求1所述的用于检测尿液JC病毒的方法，其特征在于：按照先后顺序包括以下步骤：
步骤一：待测样本的获取：从待测尿液中提取DNA，获得待测样本；
步骤二：PCR反应液的配置：阳性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、JC病毒DNA 2μL、ddH2O补至50μL；待测组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、样本DNA 2μL、ddH2O补至50μL；阴性对照组：总反应体系为50μL，其中包括2×Taq Mix 25-35μL、JCV-F 2μL、JCV-R 2μL、ddH2O补至50μL；
步骤三：PCR扩增：将上述配置的PCR反应液放入PCR仪中，并设定反应参数；
步骤四：将上述PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，将样本中与阳性对照组大小相同的条带回收；
步骤五：将样本回收的DNA进行纯化，然后连接载体送去测序；
步骤六：与JC病毒的序列进行比对，如果一致，则指示该样品中存在JC病毒，如不一致或者样本管中无与阳性对照相同大小的条带，则指示该样品中不存在JC病毒。
4.根据权利要求3所述的一种用于检测尿液JC病毒的方法，其特征在于：所述步骤三中反应参数为：94℃，3min；进入循环程序，94℃，30s；60℃，30s；72℃，20s，循环次数为40次；72℃，10min。
5.根据权利要求3所述的一种用于检测尿液JC病毒的方法，其特征在于：所述步骤一从尿液中提取DNA按先后顺序依次为：
尿液样本10ml左右，5000转离心10min,收集底部的沉淀，用枪小心吸走上方的液体，底部仍保留部分液体；
加入TE缓冲液1.5ml，混匀，8000转,离心5min,收集沉淀；
将上述沉淀37℃水浴温育1h后，加入0.2ml浓度为1mg/ml蛋白酶K，然后50℃水浴3h；
拿出冷却至室温，加入等体积的饱和酚溶液，转动离心管8min，接着5000rpm离心15min，吸取上层水相，移至另一离心管中；
向离心管中加入等体积的氯仿﹕异戊醇(24﹕1)，上下转动混匀，5000rpm离心15min，吸取上层水相，移至另一离心管中；
加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，用玻璃棒挑取絮状DNA转入另一离心管中，加70％乙醇0.2ml，5000rpm离心15min，弃上清；
重复上述步骤一次：
室温放置离心管5min，然后加入20μL DEPC水溶解DNA，-20℃冰箱保存备用。
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| I.J.KORALNIK等: "JC virus DNA load in patients with and without progressive multifocal leukoencephalopathy", 《NEUROLOGY》 * |
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