CN111560441A - 一种利用绵羊结构变异区间快速鉴定FecB基因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用绵羊结构变异区间快速鉴定FecB基因的方法。本发明在FecB基因上发现了一个绵羊特有的结构变异，即位于chr6:29413436‑29413526区域的91bp的缺失，且发现该缺失与chr6:A29315643G突变完全连锁，因此可基于该91bp缺失在DNA水平上直接鉴定FecB基因。本发明适用于快速鉴定绵羊个体携带的FecB基因，可用于辅助选育高繁殖性能绵羊个体，为快速培育绵羊优良品种、建立优质资源种群奠定基础。

Description

一种利用绵羊结构变异区间快速鉴定FecB基因的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及利用结构变异(SV)区间鉴定绵羊FecB基因的方法，并应用于分子标记辅助育种和选育。
背景技术
结构变异(SV，structural variation)指基因组水平上大片段的插入(Insertion)、缺失(Deletion)、倒位(Inversion)、易位(Translocation)等变异。利用某些染色体结构变异可以进行品种间的杂交或选育，从而大幅度提高家畜养殖的生产效益和经济效益。
目前已知与绵羊高繁殖力性状相关的基因包括BMP家族，其中最重要的为骨形态发生蛋白ⅠB型受体(BMPR1B)基因。绵羊和山羊遗传学命名委员会将含有FecB(FecundityBooroola)突变的BMPR1B基因命名为FecB基因。FecB基因是控制绵羊繁殖力的主要基因，由BMPR1B基因的编码区突变而来，已有研究结果证实突变位点位于绵羊参考基因组Oar_v4.0(NCBI登录号GCA_000298735.2)的chr6:A29315643G，即在29315643bp由A突变为G。该突变导致氨基酸取代，从而引起高繁(Wilson et al.,2001；Mulsant et al.,2001；Souza etal.,2001)。
由于携带FecB基因的个体繁殖力较高，在绵羊育种实践中，需要鉴定个体是否携带FecB基因，从而选留携带FecB基因的个体，特别是含有纯合突变的个体，这样可以快速提高种群的繁殖力。但基于单碱基差异鉴定FecB基因的方法，需要通过DNA测序或者利用限制性内切酶来进行突变位点的鉴定，检测过程操作繁琐、耗时，且鉴定成本较高。
发明内容
针对目前鉴定绵羊FecB基因的方法所存在的不足，本发明提供了一种利用绵羊结构变异区间快速鉴定FecB基因的方法，可用于辅助选育高繁殖性能绵羊个体，为快速培育绵羊优良品种、建立优质资源种群奠定基础。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的试剂盒，该试剂盒包括FecB基因结构变异区间的扩增引物；所述结构变异区间为定位于绵羊参考基因组(Oar_v4.0)6号染色体:29413436-29413526bp(chr6:29413436-29413526bp)的缺失片段。
优选的，所述结构变异区间采用PCR扩增，相应的所述试剂盒具体包括用于构建PCR反应体系的必要试剂，其中，PCR扩增引物的设计模板选自所述结构变异区间两侧的上游序列区和下游序列区，或者选自某绵羊品种基因组中与所述上游序列区和下游序列区位置对应的区域。
优选的，所述上游序列区、下游序列区的长度均≤1000bp，该上、下游序列是考虑PCR的扩增片段长度限制的情况下，能够确保设计出特异扩增包含目标区域(例如，chr6:29413436bp-29413526bp)对应DNA片段的PCR扩增引物。
优选的，所述绵羊选自阿勒泰羊、澳大利亚美利奴羊、孟加拉绵羊、巴什拜羊、巴音布鲁克绵羊、策勒黑羊、新疆美利奴羊、杜泊绵羊、多浪羊、芬兰羊、加鲁特羊、德国美利奴羊、和田羊、湖羊、藏羊、滩羊、云南乌骨羊或小尾寒羊等品种的个体。
一种利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的方法，包括以下步骤：
以绵羊个体的样本DNA为模板，扩增(例如，采用上述PCR扩增引物)FecB基因结构变异区间，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳的结果(电泳条带数量和大小)，判定绵羊个体在突变位点(chr6:A29315643G)的基因型，从而鉴定FecB基因；所述结构变异区间为定位于绵羊参考基因组(Oar_v4.0)6号染色体:29413436-29413526bp(chr6:29413436-29413526bp)的缺失片段。
优选的，所述样本DNA为提取自绵羊个体的基因组DNA。
上述利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的方法在绵羊分子标记辅助育种和选育中的应用。
优选的，所述FecB基因的纯合个体(即含有纯合突变的个体)在繁殖性能上较优，从而提高种群的繁殖力(例如，提高产羔率)。
本发明的有益效果体现在：
本发明根据所发现的绵羊基因组中FecB基因区别于BMPR1B基因的特征位点(chr6:A29315643G)与结构变异，即位于chr6:29413436-29413526bp的缺失(DEL)之间的连锁关系，依据这一发现，可以构建鉴定FecB基因的试剂盒(主要组成为结构变异区间的扩增引物)，并通过对结构变异区间的扩增和分析，实现对绵羊基因组突变位点(chr6:A29315643G)的基因型(FecB基因纯合、FecB基因杂合等)进行检测，从而可以从分子水平(DNA水平)简便、快速的筛选具有FecB基因的高繁殖力绵羊个体。
进一步的，本发明通过引物设计模板的选择，可以通过PCR扩增-琼脂糖凝胶电泳的检测方法，有效鉴定绵羊个体的FecB基因。
进一步的，本发明依据所发现的结构变异与多个绵羊品种的基因组突变位点(chr6:A29315643G)存在的完全连锁关系，使得对FecB基因的鉴定结果适用范围更广泛。
附图说明
图1为本发明实施例中利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。
(一)利用DNA测序及生物信息学分析技术鉴定绵羊FecB基因的结构变异区间
本发明利用Minimap2软件将湖羊基因组(GCA_011170295.1)与绵羊参考基因组Oar_v4.0(NCBI登录号GCA_000298735.2)进行比对，发现在绵羊FecB基因中存在由一个91bp的缺失形成的结构变异区间，具体位置为绵羊参考基因组6号染色体:29413436-29413526bp，即chr6:29413436-29413526bp。基于该91bp的缺失以及FecB基因上游和下游各500Kb以内所有SNP位点在589只家绵羊(品种包括阿勒泰羊、澳大利亚美利奴羊、孟加拉绵羊、巴什拜羊、巴音布鲁克绵羊、策勒黑羊、新疆美利奴羊、杜泊绵羊、多浪羊、芬兰羊、加鲁特羊、德国美利奴羊、和田羊、湖羊、藏羊、滩羊、云南乌骨羊及小尾寒羊)中的频率分布，发现该91bp的缺失与FecB基因的单核苷酸位点chr6:29315643(即chr6:A29315643G突变)完全连锁。因此该91bp的缺失可用于直接鉴定FecB基因。
(二)利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的实例(湖羊)
根据位于6号染色体:29413436-29413526区域的91bp的缺失与FecB基因位点(chr6:29315643)的连锁关系，以待测湖羊(2019年11月于陕西榆林采集血液样本)的基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判定是否含有FecB基因，具体过程如下(参见图1)：
1.提取待测绵羊的血液基因组DNA
参考文献Sambrock et al(2002)方法，提取待检测湖羊个体基因组DNA。
2.针对绵羊参考基因组chr6:29413436-29413526区域设计特异性PCR扩增引物
基于湖羊在结构变异区间(chr6:29413436-29413526bp)的基因组序列，针对其侧翼序列，使用Primer5.0软件设计如下所示的PCR扩增引物，用于扩增包含上述结构变异区间(91bp缺失)的DNA片段。PCR引物序列可以为：
上游引物：5`-CCACGAAGACTTCAGAGGGAC-3`
下游引物：5`-AGCAGCTGTTGCTTTTGAACT-3`
3.PCR扩增
以待测湖羊基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到0.2mL EppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系见表1。
表1.PCR反应体系
Figure BDA0002513997960000041
PCR反应程序如下：
Figure BDA0002513997960000042
4.琼脂糖凝胶电泳
PCR扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶浓度为1％-2％)，观察电泳条带，根据条带数量和大小，进行FecB基因的判定。
根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，含有FecB基因(BB)的纯合个体电泳条带长度最短(为302bp)，野生纯合型(++)条带长度最长(为392bp)，比含有FecB基因的纯合个体电泳条带长91bp，杂合子(B+)有两条条带，分别对应FecB基因纯合型(BB，302bp)和野生纯合型(++，392bp)的条带。
(三)利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的实例(小尾寒羊)
小尾寒羊血液样本于2019年8月采集自河南洛阳，具体鉴定过程参照(二)。
总之，本发明在FecB基因上发现了一个绵羊特有的结构变异，即位于chr6:29413436-29413526区域的91bp的缺失，且发现该缺失与chr6:A29315643G突变完全连锁，因此可基于该91bp缺失在DNA水平上直接鉴定FecB基因。本发明适用于快速鉴定绵羊个体携带的FecB基因，可用于辅助选育高繁殖性能绵羊个体，加快建立优质绵羊资源种群，以及通过引入杂交快速培育优良绵羊品种，从而显著提高绵羊养殖的生产效益和经济效益。

Claims (9)

1.一种利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括FecB基因结构变异区间的扩增引物；所述结构变异区间为定位于绵羊参考基因组6号染色体:29413436-29413526bp的缺失片段。
2.根据权利要求1所述一种利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的引物，其特征在于：所述结构变异区间采用PCR扩增，PCR扩增引物的设计模板选自所述结构变异区间两侧的上游序列区和下游序列区，或者选自某绵羊品种基因组中与所述上游序列区和下游序列区位置对应的区域。
3.根据权利要求2所述一种利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的引物，其特征在于：所述上游序列区、下游序列区的长度均≤1000bp。
4.根据权利要求1所述一种利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的引物，其特征在于：所述绵羊的品种为阿勒泰羊、澳大利亚美利奴羊、孟加拉绵羊、巴什拜羊、巴音布鲁克绵羊、策勒黑羊、新疆美利奴羊、杜泊绵羊、多浪羊、芬兰羊、加鲁特羊、德国美利奴羊、和田羊、湖羊、藏羊、滩羊、云南乌骨羊或小尾寒羊。
5.一种利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：
以绵羊个体的样本DNA为模板，扩增FecB基因结构变异区间，对扩增产物进行电泳，根据电泳的结果鉴定FecB基因；所述结构变异区间为定位于绵羊参考基因组6号染色体:29413436-29413526bp的缺失片段。
6.根据权利要求5所述一种利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的方法，其特征在于：所述样本DNA为提取自绵羊个体的基因组DNA。
7.一种如权利要求5所述的利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的方法在绵羊分子标记辅助育种和选育中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述FecB基因的纯合个体在繁殖性能上较优。
9.一种利用绵羊结构变异区间鉴定FecB基因的引物，其特征在于：该引物为FecB基因结构变异区间的扩增引物；所述结构变异区间为定位于绵羊参考基因组6号染色体:29413436-29413526bp的缺失片段。
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