CN114292924B - 梅花鹿全基因组snp分子标记组合、snp芯片及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了梅花鹿全基因组SNP分子标记组合、SNP芯片及应用,涉及分子标记开发技术领域。包括43316个SNP分子标记。上述SNP分子标记组合对于梅花鹿样本数据量在1.5Gb时位点检出率在95%以上,表明本发明提供的SNP分子标记组合有用信息量多,具有较大的利用价值。此外,本发明开发的SNP分子标记组合在梅花鹿全基因组33条染色体上均匀分布,可以提高相关研究应用的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记开发技术领域,具体而言,涉及梅花鹿全基因组SNP分子标记组合、SNP芯片及应用。
背景技术
单核苷酸多态性(SNP)是指:在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。SNP标记具有准确性高、变异丰富、操作简单等优点,被广泛应用于动物个体鉴别和种源鉴定。目前,CN112210611A专利公开了4个用于鉴别梅花鹿北海道亚种的分子标记,CN107447020B专利公开了24个梅花鹿个体识别的分子标签,现有的这些专利虽然能够一定程度上用于鉴别梅花鹿个体,然而仅仅28个位点难以满足梅花鹿群体的分型和种源鉴定需求。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供系统完整的梅花鹿的SNP标记,以期后续用于梅花鹿群体的分型和种源鉴定。SNP位点的开发对于梅花鹿全基因组关联分析、遗传图谱构建、梅花鹿群体分型和鉴定以及梅花鹿资源的保护具有重要的价值。
本发明提供的SNP标记具有准确性高、变异丰富、操作简单等优点,且开发出的分子标记不受环境因素影响,能直接反应动物基因水平的差异,因而可以被广泛应用于梅花鹿个体鉴别和种源鉴定。
本发明是这样实现的:
本发明提供了一种梅花鹿全基因组SNP分子标记组合,其包括43316个SNP分子标记,43316个SNP分子标记的位点信息具体如下:
其中,位点编号中左侧1~33表示位点所在的染色体,中间数值表示位点在染色体上的位置,位点编号中右侧碱基类型表示该位点在参考基因组中的SNP碱基,参考基因组的全基因组序列的版本号为:MHL_v1.0。
经过样本测试验证,发明人发现,上述SNP分子标记组合对于梅花鹿样本数据量在1.5Gb时位点检出率在95%以上,表明本发明提供的SNP分子标记组合有用信息量多,具有较大的利用价值。
本发明提供的SNP分子标记组合在梅花鹿全基因组33条染色体上均匀分布,可以提高相关研究应用的准确性。
本领域的技术人员可以根据上述SNP分子标记组合开发相应的检测探针、检测引物。
本发明还提供了一种梅花鹿全基因组SNP分子标记组合,梅花鹿全基因组SNP分子标记组合还包括139个GWAS分子标记,139个GWAS分子标记的位点信息具体如下:
1_21328625_C | 3_112183465_G | 5_88305985_A | 7_66091155_A | 10_3298969_G | 20_16138247_G |
1_55465409_C | 3_37243723_T | 5_88353618_T | 7_89934875_C | 10_19285550_C | 20_34170371_T |
1_21328625_C | 3_45633540_C | 5_12436359_T | 7_57408335_A | 11_19056847_C | 20_51189148_T |
1_55465409_C | 4_28354294_A | 5_20738265_C | 7_56997980_C | 11_1160873_A | 20_49326097_A |
1_79155872_A | 4_49495894_C | 5_21848587_A | 7_56980012_A | 11_954791_A | 21_40393065_T |
1_54013883_G | 4_109314507_G | 5_24025004_G | 7_56206726_C | 11_943935_T | 21_51005710_T |
2_62606395_A | 4_7633884_C | 5_24127218_G | 7_56045457_A | 11_563730_A | 21_49117095_T |
2_62531769_G | 4_4405726_C | 5_24593086_C | 7_12896661_G | 12_56981873_G | 21_49040655_C |
2_62508884_T | 4_4296015_G | 6_16841362_A | 7_46448361_C | 12_54457152_A | 21_24942219_C |
2_62377776_T | 4_4274291_T | 6_25736030_G | 7_46326061_T | 12_53570448_G | 21_24391167_C |
2_93165765_G | 4_69819988_T | 6_30709714_A | 7_46236692_G | 13_55632186_C | 21_22781159_C |
2_93038630_G | 9_23581832_C | 6_56637998_C | 7_44568678_C | 13_55168715_C | 21_21451926_C |
2_48957417_A | 9_21990515_C | 6_69198357_C | 7_25886356_A | 13_55104019_C | 21_21289006_G |
2_17520848_C | 9_39293019_C | 6_70982537_A | 8_60716503_A | 13_55060780_T | 22_11340107_T |
2_17894479_A | 9_70380010_T | 6_71320845_G | 8_60438594_A | 13_55042407_T | 22_19387129_T |
2_82496873_A | 9_70197423_G | 30_17964474_G | 8_60396623_G | 13_55026992_A | 23_30142419_T |
15_6154759_C | 9_65739489_G | 30_16929045_C | 8_59823615_C | 13_54963147_T | 23_42089261_A |
15_6304577_C | 14_61733092_C | 30_15046844_C | 8_59787533_G | 13_54949621_C | 23_41827741_G |
15_12646176_G | 14_15611535_T | 30_7287629_A | 8_59723471_G | 13_54732126_C | 23_41675429_G |
17_47279338_T | 14_15584339_A | 30_24530425_C | 8_56079914_G | 13_54712074_A | 23_25136409_A |
18_54959284_G | 14_41242090_C | 30_24390252_C | 8_53467269_T | 13_54692225_G | 23_24796660_G |
19_36698660_A | 24_23200546_C | 27_43002013_G | 28_31577055_T | 13_54617776_G | 23_7733789_G |
19_38266843_G | 25_39946779_A | 27_46067259_T | 28_24845720_C | 31_34022466_T | 31_20728636_T |
19_8512596_G | 27_13749787_A | 27_46081075_C |
其中,位点编号中左侧1~33表示位点所在的染色体,中间数值表示位点在染色体上的位置,位点编号中右侧碱基类型表示该位点在参考基因组中的SNP碱基,参考基因组的全基因组序列的版本号为:MHL_v1.0。
本发明还提供了一种梅花鹿全基因组SNP芯片,SNP芯片包含上述43316个SNP分子标记组合和/或139个梅花鹿全基因组SNP分子标记组合。
由上述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合单独或组合使用、或梅花鹿全基因组SNP芯片在梅花鹿基因分型中的应用。
由上述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合单独或组合使用、或梅花鹿全基因组SNP芯片在梅花鹿全基因组关联分析中的应用。
由上述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合单独或组合使用、或梅花鹿全基因组SNP芯片在梅花鹿聚类分析及亲缘关系鉴定中的应用。
由上述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合单独或组合使用、或梅花鹿全基因组SNP芯片在梅花鹿遗传多样性分析中的应用。
由上述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合单独或组合使用、或梅花鹿全基因组SNP芯片在梅花鹿辅助育种中的应用。
由上述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合在制备梅花鹿全基因组SNP芯片中的应用。
通过制备SNP芯片,结合液相探针杂交的靶向基因型分型技术,容易实现标准化自动化检测和分析。
由上述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合在制备梅花鹿全基因组SNP位点检测试剂盒中的应用。
上述SNP位点检测试剂盒包含检测上述梅花鹿全基因组SNP分子标记组合的探针和/或引物。
本发明具有以下有益效果:
本发明提供的SNP标记具有准确性高、变异丰富、操作简单等优点,且开发出的分子标记不受环境因素影响,能直接反应动物基因水平的差异,因而可以被广泛应用于梅花鹿全基因组关联分析、遗传图谱构建、梅花鹿群体分型和鉴定以及梅花鹿资源的保护。经过样本测试验证,发明人发现,上述SNP分子标记组合对于梅花鹿样本数据量在1.5Gb时位点检出率在95%以上,表明本发明提供的SNP分子标记组合有用信息量多,具有较大的利用价值。此外,本发明开发的SNP分子标记组合在梅花鹿全基因组33条染色体上均匀分布,可以提高相关研究应用的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为设计的探针及覆盖度统计结果图;
图2为位点测试结果图;
图3为SNP标记在不同染色体的分布情况图;
图4为SNP标记在不同染色体的均匀分布图;
图5为Gaps分布情况结果图;
图6为MAF分布统计结果图;
图7为SNP标记在基因结构上的分布情况。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
名词解释:
SNP(Single Nucleotide Polymorphism):单核苷酸多态,指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。
目标区段(Target Segment):目标区段的大小一般为100bp左右,区段内可能只含有1个SNP位点,可能含有多个SNP位点。每个区段内以最终测试挑选的SNP位点作为核心位点。
MAF(Minor Allele Frequency):最小等位基因频率(次等位基因频率),通常是指某位点在特定群体中的不常见的等位基因发生频率,例如TT,TC,CC三个基因型,在群体中C的频率=0.36,T的频率=0.64,则等位基因C就为最小等位基因频率,MAF=0.36。当SNP存在三个等位变异时,将第二常见的等位基因频率定义为MAF(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/docs/rs_attributes.html#gmaf),例如SNP位点有三个allele:A,C,G,A的频率=0.5,C的频率=0.4,G的频率=0.1,则MAF=0.4。一般群体分析中,MAF要求>0.05,因较小的MAF得到的可用信息量较少,会使统计效能降低,易出现假阳性结果。
SNP位点检出率:指某个SNP位点被成功检测到的样本占所有样本的比值,一般要求≥90%,具体情况会依据目标数据及目标位点数进行调整。分析SNP基因型时一般最低深度≥5X,即目标位点至少被5条reads覆盖。
实施例1
本实施例提供了梅花鹿40KSNP分子标记组合的开发和筛选方法。
(1)对178个GWAS位点、50个梅花鹿样本重测序数据和9个种公鹿样本位点数据进行数据挑选。
保留178个GWAS位点;对50个梅花鹿样本重测序数据按照NA<10%、杂合率<15%、MAF≥0.1筛选出155280个位点;取155280个位点与9个种公鹿样本位点的交集,且在交集中筛选在种公鹿中MAF最高,且最多只允许一个样本为NA的背景位点共60K。
(2)进行位点评估。
通过上述的挑选过程,我们最终得到178个GWAS位点和60K的背景位点共60178个位点进行后续的探针设计评估。
设计的探针及覆盖度参照图1所示,探针设计区段覆盖率=设计出探针目标区段个数/目标区段个数。
通过上述的挑选过程,我们得到178个GWAS位点和60K的背景位点共60178个位点进行后续的探针设计评估。其中通过评估的位点一共有50088个,但受限于一张芯片的探针数目,从49939个背景位点中删掉部分密集区域位点只挑选45181个位点,即最后用139个GWAS位点和43316个背景位点共计43465个位点,对应83071根探针用于后续的测试分析。
本实施例提供的梅花鹿40KSNP分子标记组合可以用于制备基因芯片,这些SNP分子标记的应用可以极大程度上提高梅花鹿基因型检测准确度、提高检测水平,降低检测成本。
实验例1
对12个东北鹿样本进行检测,具体方法为:构建文库、杂交捕获、文库质检与测序分析。
1.构建文库。
按照GenoBaits文库构建试剂盒的方法进行DNA文库的构建。
2.文库杂交捕获
利用液相基因芯片测定目标样品在40K SNP位点的基因型。
(1)DNA杂交:
取500ng已完成构建的样品基因组DNA测序文库,加入5μLGenoBaits Block I和2μLGenoBaits Block II,置于Eppendorf Concentrator plus(Eppendorf公司)真空浓缩仪上,在≤70℃的温度下蒸干至干粉。向干粉管中加入8.5μLGenoBaits 2×Hyb Buffer、2.7μLGenoBaitsHyb Buffer Enhancer、2.8μLNuclease-Free Water,用移液器吸打混匀后放置于ABI 9700PCR仪上95℃温育10分钟,然后取出PCR管加入3μL已经合成的探针(探针的浓度为60ng/μL),旋涡震荡混匀后放置于ABI 9700PCR仪上65℃温育2小时,完成探针杂交反应。
(2)DNA捕获
向上一步杂交完成的反应体系中加入100μLGenoBaits DNA Probe Beads,上下吸打10次,放入ABI 9700PCR仪上65℃温育45分钟,使磁珠与探针结合。用100μLGenoBaitsWash Buffer I、150μLGenoBaits Wash BufferII分别对结合探针后的磁珠进行65℃热洗,然后再用100μLGenoBaits Wash Buffer I、150μLGenoBaits Wash Buffer II(和150μLGenoBaits Wash Buffer III分别对磁珠进行常温洗涤。洗涤完成的磁珠用20μLNuclease-Free Water进行重悬。
取13μL重悬后的DNA(带磁珠)加入到新的0.2mLPCR管中,然后加入15μLGenoBaitsPCR Master Mix、2μLGenoBaits Primer Mix配置post-PCR体系,用ABI9700PCR仪进行文库扩增,扩增程序为:95℃预变性5min,95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s;重复2-4步,共15个循环;72℃延伸5min。
向post-PCR产物中加入45μLBeckmenAMPure XP Beads(Beackman公司)并用移液器上下吸打均匀,然后将0.2mL PCR管置于磁力架上至溶液澄清,弃去上清并用75vol%乙醇洗涤磁珠两次,用pH为8.0的Tris-HCl将文库DNA洗脱下来。完成探针的杂交捕获工作。
(3)DNA杂交捕获文库质检
用QubitFluorometric Quantitation(Thermo Fisher)对文库的DNA浓度进行测定,然后用琼脂糖凝胶电泳检测文库DNA的片段大小是否在300-400bp之间。
(4)DNA杂交捕获文库测序
将构建好的DNA文库由石家庄博瑞迪生物技术有限公司进行测序。
(5)基因型数据分析
测序数据经过:
FastQC(www.bioinformatics.babraham.ac.uk/project)质控后,用BWA(bio-bwa.sourceforge.net)的默认参数将测序数据比对到参考基因组上,用GATK(software.broadinstitute.org/gatk)软件对测序数据进行SNP鉴定,位点测试结果参照图2所示。图2显示,在其他梅花鹿群体中,本发明提供的SNP分子标记的位点检出率超出97%。表明本发明提供的SNP分子标记组合有用信息量多,具有较大的利用价值。
图3为SNP标记在不同染色体的分布情况图,目标位点在不同染色体上的个数统计结果:横坐标为染色体ID;左示例Count为位点数/区段数;右示例Length为染色体长度(单位bp)。结果显示,SNP位点在11条染色体上分布较为均匀。
图4为SNP标记在不同染色体的均匀分布图,由于原参考非染色体水平,此处SNP标记均匀分布图只将挑选位点所在的592个序列拼接在一起展示,图中绘图单位长度为100000bp;且因原参考由10031个序列片段组成,挑选时不考虑均匀分布,所以图中位点分布允许存在部分空洞。
图5为Gaps分布情况结果图,若两个区段间的距离大于基因组大小/目标区段数*10,则认为是一个Gap。采用全部区段进行分析,分析原则:后一个区段的Start位置-前一个区段的End位置,得到两个区段间的距离。
图6为MAF分布统计结果图,图6显示本发明提供的SNP组合可用信息量多。区段内核心位点的MAF数值统计,目标位点MAF值越大说明位点的多态性越好。横坐标MAF为MAF值的不同范围,纵坐标Count为该MAF范围内的核心位点数。
图7为SNP标记在基因结构上的分布情况,显示基因间序列中的SNP最多,其次为内含子,外显子中的SNP居于第五水平。横坐标为基因结构类型、纵坐标为该类型下的目标位点数。
本发明筛选出符合评估要求的43465个位点(包括139个GWAS位点和43316个背景位点)和其对应83071根探针进行后续的测试分析,测试使用的12个样本数据量在1.5Gb时位点检出率在97.6%-98.0%之间。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种梅花鹿全基因组SNP分子标记组合,其特征在于,其包括43316个SNP分子标记,43316个SNP分子标记的位点信息具体如下:
其中,位点编号中左侧1~33表示位点所在的染色体,中间数值表示位点在染色体上的位置,位点编号中右侧碱基类型表示该位点在参考基因组中的SNP碱基,参考基因组的全基因组序列的版本号为:MHL_v1.0。
3.一种梅花鹿全基因组SNP芯片,其特征在于,所述SNP芯片包含权利要求1和/或2所述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合。
4.如权利要求1或2所述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合单独或组合使用、或权利要求3所述的梅花鹿全基因组SNP芯片在梅花鹿基因分型中的应用。
5.如权利要求1或2所述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合单独或组合使用、或权利要求3所述的梅花鹿全基因组SNP芯片在梅花鹿全基因组关联分析中的应用。
6.如权利要求1或2所述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合单独或组合使用、或权利要求3所述的梅花鹿全基因组SNP芯片在梅花鹿聚类分析及亲缘关系鉴定中的应用。
7.如权利要求1或2所述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合单独或组合使用、或权利要求3所述的梅花鹿全基因组SNP芯片在梅花鹿遗传多样性分析中的应用。
8.如权利要求1或2所述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合单独或组合使用、或权利要求3所述的梅花鹿全基因组SNP芯片在梅花鹿辅助育种中的应用。
9.权利要求1或2所述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合在制备梅花鹿全基因组SNP芯片中的应用。
10.如权利要求1或2所述的梅花鹿全基因组SNP分子标记组合在制备梅花鹿全基因组SNP位点检测试剂盒中的应用。
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