CN111548388A - 一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种pH响应的非螺旋‑螺旋转变抗菌聚肽及其制备方法。该方法采用有生物相容性的人体必需氨基酸谷氨酸为原料，结合点击化学方法，获得螺旋结构的阳离子聚肽，通过螺旋结构的阳离子聚肽骨架侧链修饰一半马来酸酐衍生物制备得到pH响应的非螺旋‑螺旋转变抗菌聚肽，工艺简单，操作方便，成本低廉，高效实现在特定pH条件下的二级结构转变，有效降低阳离子聚肽的生物毒性、提高阳离子聚肽的生物利用度。本发明通过不同pH响应的酸酐的修饰，可获得不同pH条件转变的非螺旋‑螺旋转变抗菌聚肽，可在不同的生理条件下，实现从低活性的非螺旋结构向高活性的螺旋结构的阳离子聚肽转变，实现对感染部位细菌的杀伤，具有广阔的应用前景。

Description

一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽及其制备方法
技术领域
本发明属于聚肽材料领域，具体涉及一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽材料及其制备方法。
背景技术
超过7000种天然存在的多肽被鉴定出来，这些多肽通常在人类生理中担任着重要作用，包括激素、神经递质、生长因子、离子通道配体或抗感染药物等作用。在过去的十几年中，多肽在医学和生物技术领域得到了广泛的应用，治疗性多肽的研究也因商业原因正在蓬勃复兴。与天然多肽相比，聚合合成的多肽多是序列简单的大分子，其中氨基酸重复多次，保留采用有序二级构象的倾向，例如α-螺旋或β-折叠，这在其他聚合物中是罕见的。事实上，由于聚合多肽可降解性及降解产物无生物毒性，具有广泛的生物医学应用。比如，作为载体，递送核酸药物和化疗药物；作为抗菌材料，破坏细菌的细胞膜，从而杀死细菌。
研究表明，聚肽的二级结构对聚肽的生物活性具有显著的影响。螺旋结构的阳离子聚肽相比于非螺旋的阳离子聚肽可以更好的把药物携带进入细胞，增加胞内的药物含量，提高治疗效果，同样，螺旋结构的阳离子聚肽相比于非螺旋结构的阳离子聚肽可以更好的与细菌细胞膜作用，破坏细菌的细胞膜，高效的杀死细菌。也正是因为螺旋结构聚肽具有较高的生物活性，会无差别的攻击人体正常的细胞，难以在体内直接应用。因此有报道利用聚肽二级的调控，使其在正常组织呈现低毒性非螺旋结构，而在感染组织转变为高抗菌活性螺旋结构。早期的研究多围绕聚谷氨酸和聚赖氨酸展开，然而聚谷氨酸和聚赖氨酸的可调控性很差，只有在极酸条件下或者极碱条件下才会有二级结构的转变，很难在生理条件下应用。熊梦华等人将聚谷氨酸共聚物应用在杀死胃中幽门螺旋杆菌，在胃酸条件下实现从非螺旋向螺旋的转变，实现对细菌的杀伤，但是合成过程非常复杂，pH响应灵敏度低，难以实现精准控制。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种pH响应的非螺旋- 螺旋转变抗菌聚肽及其制备方法。该方法能够使聚肽在更宽pH范围内实现构象可控转变。
本发明的一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽材料按照下述方法合成：如下所示，以L-谷氨酸和3-丁烯-1醇为原料，浓硫酸为脱水剂和吸水剂，催化反应得到谷氨酸衍生物ButLG，再和三光气反应，得到碳酸酯环单体 ButLG-NCA。用烷基胺引发ButLG-NCA单体聚合，得到螺旋结构的聚肽PButLG，然后将巯基乙胺点击在多肽侧链，得到阳离子聚肽PButLG-CA，最后，用马来酸酐衍生物与阳离子多肽侧链的氨基反应，得到pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽。
Figure BDA0002464265710000031
本发明的另一个目的是提供以上方法制备的一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽材料及其作为抗菌材料的应用。
本发明提供的一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽，其结构通式如下所示：
Figure BDA0002464265710000032
其中，n代表碳原子数目，n的取值范围为2-14；y代表骨架多肽重复单元数，y的取值范围为6-20；x代表骨架多肽被修饰的侧链个数，x的取值范围为6-20；
R1、R2为马来酸酐衍生物的残基；R1、R2为马来酸酐残基、苯基马来酸酐残基、柠康酸酐残基、3,4,5,6-四氢苯酐残基或乌头酸酐残基。
所述马来酸酐衍生物的残基为苯基马来酸酐、柠康酸酐、3,4,5,6-四氢苯酐、乌头酸酐残基的其中一种。
所述骨架多肽为侧链氨基的螺旋聚肽。
所述
Figure BDA0002464265710000041
为
Figure BDA0002464265710000042
及
Figure BDA0002464265710000043
中的一种。
本发明提供的一种制备所述的pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的方法，包括如下步骤：
(1)将谷氨酸和无水3-丁烯-1醇混合，然后在冰浴条件下，缓慢滴加浓硫酸，搅拌反应，过滤取滤渣(优选抽滤)，在异丙醇和去离子水中重结晶，过滤取滤渣(优选抽滤)，洗涤，冷冻干燥，得到谷氨酸衍生物ButLG；
(2)用四氢呋喃溶解谷氨酸衍生物：将步骤(1)所述谷氨酸衍生物ButLG 加入四氢呋喃中，混合均匀，然后在冰浴条件下加入三光气，加热反应，除去溶剂，过硅胶柱，得到谷氨酸衍生物碳酸酯环ButLG-NCA；
(3)在有机溶剂中，用烷基胺引发步骤(2)所述谷氨酸衍生物碳酸酯环 ButLG-NCA聚合，沉淀，抽干，得到聚谷氨酸衍生物PButLG(具有螺旋结构的聚肽)；
(4)将聚谷氨酸衍生物PButLG和巯基乙胺溶在溶剂中，加入2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮，通入氮气吹扫后，再用紫外光照点击反应将巯基乙胺点击到聚谷氨酸PButLG，透析，取保留液，冻干，得到阳离子聚肽PButLG-CA；
(5)将阳离子聚肽PButLG-CA溶解在有机溶剂中，然后加入马来酸酐衍生物和三乙胺进行搅拌反应，得到所述pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽。
马来酸酐衍生物修饰后的聚肽为非螺旋多肽。
所述pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的酰胺键是可以酸降解的。
进一步地，步骤(1)所述谷氨酸和无水3-丁烯-1醇的质量体积比为0.5-0.8:1g/mL，所述3-丁烯-1醇与浓硫酸的体积比为2.5-5：1，所述搅拌反应的时间为12-72h。
优选地，步骤(1)所述搅拌反应的时间为12-24h。
优选地，步骤(1)所述洗涤的溶剂为乙醚。
进一步地，步骤(2)所述谷氨酸衍生物ButLG与四氢呋喃的质量体积比为0.05-0.2:1g/mL；所述谷氨酸衍生物ButLG和三光气的摩尔比为0.5-1：1。
优选地，步骤(2)所述谷氨酸衍生物ButLG与四氢呋喃的质量体积比为0.05-0.15：1g/mL；所述谷氨酸衍生物ButLG和三光气的摩尔比为0.8-1。
进一步地，步骤(2)所述加热反应的温度为20-80℃，加热反应的时间为2-5h。
优选地，步骤(2)所述加热反应的温度为40-60℃，加热反应的时间为 2-4h。
进一步地，步骤(3)所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述烷基胺为 8-20个碳原子的伯胺；所述烷基胺与有机溶剂的摩尔体积比为0.05-0.15：1 mol/L。
优选地，步骤(3)所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述烷基胺为8-20 个碳原子的伯胺；所述烷基胺与有机溶剂的摩尔体积比为0.05-0.10：1mol/L。
优选地，步骤(3)所述烷基胺为十六胺。
进一步地，步骤(3)所述烷基胺与谷氨酸衍生物碳酸酯环ButLG-NCA的摩尔比为0.05-0.2：1。
优选地，步骤(3)所述烷基胺与谷氨酸衍生物碳酸酯环ButLG-NCA的摩尔比为0.05-0.15：1。
步骤(3)所述聚谷氨酸衍生物PButLG的聚合度为8-20；
优选地，步骤(3)所述聚谷氨酸衍生物PButLG的聚合度为10。
优选地，步骤(3)所述沉淀溶剂为正己烷和乙醚(V:V＝1:1)。
进一步地，步骤(4)所述聚谷氨酸衍生物PButLG、巯基乙胺和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为1:(20-50):0.1；所述溶剂为DMF(N，N-二甲基甲酰胺)；所述巯基乙胺与溶剂的摩尔体积比为2-4：1mol/L。
优选地，步骤(4)所述聚谷氨酸衍生物PButLG、巯基乙胺和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为1:30:0.1。
进一步地，步骤(4)所述透析所采用的透析袋截留分子量为500-14000Da，所述透析的时间为1-3天；所述紫外光照点击反应使用的紫外光λmax＝365nm，紫外光照射点击反应的时间为10-100min。
优选地，步骤(4)所述透析的时间为24h。
优选地，步骤(4)所述透析所采用的透析袋截留分子量为1000Da。
优选地，步骤(4)所述紫外光照射点击反应的时间为30-60min。
进一步地，步骤(5)所述有机溶剂为甲醇；所述马来酸酐衍生物为苯基马来酸酐、柠康酸酐、3,4,5,6-四氢苯酐、乌头酸酐中的一种；所述搅拌反应的时间为4-24h。
优选地，步骤(5)所述搅拌反应的时间为12-24h。
优选的，步骤(5)所述马来酸酐衍生物修饰PButLG-CA侧链氨基的一半。
由以上所述的制备方法制得一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽材料。
以上所述的一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽材料应用于抗菌。
本发明提供了基于马来酸酐衍生物修饰的具有酸度响应的非螺旋-螺旋可转变的聚肽制备方法及其作为抗菌材料的应用。该材料是通过马来酸酐衍生物和螺旋结构的阳离子多肽PButLG-CA在甲醇中反应制备而得到。上述具有酸度响应的聚肽材料表示为：PButLG-Ma。同时，甲基马来酸酐(柠康酸酐)代替经相同的合成步骤可以得到酸响应的聚肽材料，表示为PButLG-CMA，3,4,5,6- 四氢苯酐代替经相同的合成步骤可以得到酸响应的聚肽材料，表示为 PButLG-DCA，乌头酸酐代替经相同的合成步骤可以得到酸响应的聚肽材料，表示为PButLG-CAA。
上述一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽可按照下述方法合成：马来酸酐衍生物和PButLG-CA在甲醇中，用三乙胺作为缚酸剂，搅拌反应得到 PButLG-MA。同时，甲基马来酸酐代替经相同的合成步骤可以得到酸响应的聚肽材料，表示为PButLG-CMA，3,4,5,6-四氢苯酐代替经相同的合成步骤可以得到酸响应的聚肽材料，表示为PButLG-DCA，乌头酸酐代替经相同的合成步骤可以得到酸响应的聚肽材料，表示为PButLG-CAA，苯基马来酸酐代替经相同的合成步骤可以得到酸响应的聚肽材料，表示为PButLG-PHA。基于马来酸酐衍生物修饰的具有酸度响应的非螺旋-螺旋可转变的聚肽可以高选择性的杀死感染部位细菌。高选择性是指具有酸响应的非螺旋-螺旋可转变的聚肽在血液循环条件下是非螺旋结构的聚肽，具有较低的溶血活性，在细菌感染的微酸环境下，马来酸酐衍生物修饰的酸敏感化学键断裂，聚肽转变为具有高抗菌活性的螺旋结构，显著提高抗菌效果。
本发明提供的制备方法采用有生物相容性的人体必需氨基酸谷氨酸为原料，结合点击化学方法，获得螺旋结构的阳离子聚肽，通过螺旋结构的阳离子聚肽骨架侧链修饰一半马来酸酐衍生物制备得到pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽，工艺简单，操作方便，成本低廉，高效实现在特定pH条件下的二级结构转变，有效降低阳离子聚肽的生物毒性、提高阳离子聚肽的生物利用度。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供的制备方法，基于螺旋结构的骨架聚肽，通过马来酸酐衍生物的侧链修饰，获得非螺旋-螺旋可转变的聚肽，是一种简便、高效的制备新型pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽材料的制备方法；
(2)本发明采用不同pH敏感的马来酸酐衍生物，可以很便捷的得到一系列生理条件pH下可以从非螺旋向螺旋转变的阳离子聚肽，实现二级结构及生物活性的精准控制；
(3)本发明可以显著降低阳离子聚肽的毒性，减少被蛋白的粘附，提高阳离子聚肽在体内的生物利用度；
(4)本发明设计的非螺旋-螺旋可转变的聚肽可以显著降低溶血活性，在酸性条件下转变为螺旋结构的阳离子聚肽，显著提高抗菌效果。
附图说明
图1为实施例中的螺旋-非螺旋可转变聚肽PButLG-Ma的合成路线图；
图2为谷氨酸衍生物ButLG的合成路线(A)和1H NMR表征(B)图；
图3为谷氨酸衍生物的碳酸酯ButLG-NCA的合成路线(A)和1H NMR表征 (B)图；
图4为十六烷基胺引发聚合的聚肽PButLG的合成路线(A)、GPC表征(B) 和1H NMR表征(C)图；
图5为聚肽PButLG点击巯基乙胺后的阳离子聚肽PButLG-CA的合成路线(A) 和1HNMR表征(B)图；
图6为马来酸酐修饰PButLG-CA侧链一半氨基得到PButLG-MMA的核磁路线(A)和1HNMR表征(B)图；
图7为马来酸酐修饰PButLG-CA侧链不同比例的圆二色光谱(A)及螺旋度计算(B)图；
图8为甲基马来酸酐修饰PButLG-CA侧链一半氨基得到PButLG-CMA的合成路线(A)和1H NMR表征(B)图；
图9为HPLC检测聚合物PButLG-CMA在pH＝5.0条件下的降解结果图；
图10为聚合物PButLG-CMA在不同pH条件下的圆二色光谱图；
图11为聚合物PButLG-CMA在pH＝1.0下圆二色光谱(A)及不同pH条件下的螺旋度计算(B)结果图；
图12为PButLG-CMA在不同pH下的对E.coli(A)和S.aureus(B)抗菌活性结果图；
图13为PButLG-CA和PButLG-CMA在pH 7.4或5.5下处理60分钟后和负电荷脂质体培养，脂质体中的染料泄漏结果图(A)；PButLG-CMA在pH 7.4或 5.5不同浓度下，分别和PI孵育后，用流式细胞仪分析细菌对碘化丙啶(PI) 的吸收情况(B)结果图及大肠杆菌的死活染色(C)结果图，10μm/单位；
图14为聚合物PButLG-CAA(A)和PButLG-DCA(B)的结构式，聚合物 PButLG-CAA(C)和PButLG-DCA(D)在不同pH环境降解的圆二色光谱及聚合物PButLG-CAA(E)和PButLG-DCA(F)在不同pH环境的抗菌活性结果图；
图15为不同聚肽PButLG-CA、PButLG-CMA、PButLG-DCA、PButLG-CAA 和PButLG-PHA的溶血活性结果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的制备路线如图1，具体方法如下：
1)谷氨酸衍生物ButLG的制备
取10g谷氨酸于250mL圆底烧瓶中，加入15mL无水3-丁烯-1-醇，将圆底烧瓶置于冰水浴中，在搅拌条件下，加入4mL浓硫酸，去掉冰水浴，搅拌反应12小时，直至反应液变为无色透明；用饱和碳酸钠调节反应液的pH至 7.0，抽滤去掉液体，用去离子水洗涤两次，去掉无机盐；将白色固体转入250 mL圆底烧瓶，加入4mL异丙醇和4mL去离子水，用油浴锅加热到80℃并搅拌，直至完全溶解为无色透明，停止搅拌，降温到室温；抽滤去掉液体，用乙醚洗涤两次，去掉异丙醇；将固体放入样品瓶中，用真空冷冻机冻干样品，得到所述谷氨酸衍生物ButLG。如图2的A部分是合成路线，图2的B部分是ButLG 的核磁氢谱表征，如图2可见，谷氨酸衍生物ButLG的结构正确，无杂质。
2)活性单体ButLG-NCA的制备
称取4.6g干燥的谷氨酸衍生物ButLG于250mL的圆底烧瓶中，用油泵抽12小时，转入手套箱中，加入100mL无水四氢呋喃，转出手套箱，接上干燥的冷凝管，将圆底烧瓶置于冰水浴中，快速加入8.1g的三光气，搅拌均匀，去掉冰水浴，将圆底烧瓶置于油浴锅中，加热至50℃，并搅拌回流，继续反应2.5h；降温停止反应，抽掉溶剂，转入手套箱，过硅胶柱纯化两次。如图 3的A部分是合成路线，图3的B部分是ButLG-NCA的核磁氢谱表征，结构正确，无杂质。
3)聚谷氨酸衍生物PButLG的制备
取2.0g的ButLG-NCA单体于25mL圆底烧瓶中，加入4mL的无水DMF， 200mg的十六烷基胺溶于少量的二氯甲烷，将十六烷基胺溶液加入到圆底烧瓶中，搅拌反应24h，用红外光谱跟踪反应进程，直至反应完全，抽掉溶剂，用少量的二氯甲烷溶解，滴加到50mL的乙醚和正己烷(V:V＝1:1)溶液中沉淀，去掉上清，将沉淀抽干。如图4的A部分是合成路线，图4的B部分是PButLG 的凝胶渗透色谱表征，单分散性，PDI＝1.18，图4的C部分是PButLG的核磁氢谱表征，结构正确，无杂质。
4)阳离子聚肽PButLG-CA的制备
称取1.0g的聚谷氨酸衍生物PButLG于25mL圆底烧瓶中，加入4mL的 DMF溶解，加入1.2g的巯基乙胺盐酸盐，搅拌溶解，通入氮气排除空气，约 15min，加入20mg的2,2-二甲氧基苯基苯乙酮作为催化剂，避光，继续通入氮气15min；用365nm激光催化反应1h，将反应液转入截留分子量为1000 的透析袋中，透析24h，用真空干燥机冻干。如图5的A部分是合成路线，图 5的B部分是PButLG-CA的核磁氢谱表征，结构正确，无杂质。
5)一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽PButLG-CMA的制备
称取1.0g的阳离子聚肽PButLG-CA于500mL圆底烧瓶中，加入100mL 的甲醇溶解，加入0.40g的三乙胺和0.20g的柠康酸酐，搅拌反应24h，抽掉溶剂和三乙胺，用去离子水溶解，用截留分子量为1000的透析袋置于4℃透析24h，用真空干燥机冻干。如图8的A部分是合成路线，图8的B部分是 PButLG-CA的核磁氢谱表征，结构正确，无杂质。
6)一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽PButLG-DCA的制备
称取1.0g的阳离子聚肽PButLG-CA于500mL圆底烧瓶中，加入100mL 的甲醇溶解，加入0.40g的三乙胺和0.26g的3,4,5,6-四氢苯酐，搅拌反应 24h，抽掉溶剂和三乙胺，用去离子水溶解，用截留分子量为1000的透析袋置于4℃透析24h，用真空干燥机冻干。
7)一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽PButLG-CAA的制备
称取1.0g的阳离子聚肽PButLG-CA于500mL圆底烧瓶中，加入100mL 的甲醇溶解，加入0.40g的三乙胺和0.27g的乌头酸酐，搅拌反应24h，抽掉溶剂和三乙胺，用去离子水溶解，用截留分子量为1000的透析袋置于4℃透析24h，用真空干燥机冻干。
8)一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽PButLG-PHA的制备
称取1.0g的阳离子聚肽PButLG-CA于500mL圆底烧瓶中，加入100mL 的甲醇溶解，加入0.40g的三乙胺和0.27g的苯基马来酸酐，搅拌反应24h，抽掉溶剂和三乙胺，用去离子水溶解，用截留分子量为1000的透析袋置于4℃透析24h，用真空干燥机冻干。
实施例2
一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的二级结构调控
1)聚肽侧链电荷影响多肽的螺旋结构
通过在聚肽PButLG-CA的侧链引入不同个数的马来酸酐修饰，测圆二色，探究侧链引入负电荷数量对聚肽二级结构的影响，如图7的A部分中X代表侧链修饰的马来酸酐数量，在侧链修饰5个马来酸酐时候螺旋结构最弱，图7的 B部分中通过螺旋度计算更加直观的体现，当侧链引入一半异种电荷时候，螺旋度最低。
2)合成不响应的非螺旋多肽PButLG-MA
称取1.0g的阳离子聚肽PButLG-CA于500mL圆底烧瓶中，加入100mL 的甲醇溶解，加入0.40g的三乙胺和0.19g的马来酸酐，搅拌反应24h，抽掉溶剂和三乙胺，用去离子水溶解，用截留分子量为1000的透析袋置于4℃透析24h，用真空干燥机冻干。获得非螺旋结构的多肽，如图6的A部分是合成路线，图6的B部分是PButLG-CA的核磁氢谱表征，结构正确，无杂质，研究其二级结构，发现侧链用马来酸酐修饰一半时为非螺旋结构。
3)一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的降解及螺旋结变化
将1.0mg的FITC标记的聚合物PButLG-CMA置于1mL的pH＝5.0缓冲盐中，通过HPLC检测FITC信号(水：乙腈＝5:5，体积比)，检测聚肽的降解，结果如图9所示，聚肽PButLG-CMA约在1小时可以完全降解。
将1.0mg的PButLG-CMA置于10.0mL的不同pH的PB缓冲盐中，测圆二色信号，如图10的A部分，PButLG-CMA螺旋度较低，在pH＝5.0环境约1小时后，螺旋结构基本恢复，图10的B部分为在pH＝5.5环境下的螺旋结构恢复情况，相对缓慢，约2小时，螺旋结构基本恢复，图10的C部分和图10的D部分说明PButLG-CMA在pH＝6.5，pH＝7.4环境螺旋结构基本不变，保持较低的螺旋度。将PButLG-CMA置于pH＝1.0和pH＝7.4环境下，结果如图11的A部分所示，本发明把pH＝1.0时候的螺旋结构定为100％，把pH＝7.4时候的螺旋结构定为0％，计算在不同pH环境下的螺旋结构恢复情况，如图11的B部分，可以很明显的发现低pH环境下的螺旋结构恢复快。同样的方法，本发明测试了 PButLG-CAA和明PButLG-DCA在不同pH环境下的螺旋结构恢复，如图14的A 部分和B部分为对应的结构，图14的C部分和D部分为不同pH下螺旋恢复的情况。
实施例3
pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的抗菌活性及溶血毒性
1)溶血实验：
取适量羊全血于离心管中，用1×PBS稀释，配制4％(v/v)羊血溶液；使用PBS配制一系列浓度的药物溶液，按100μL/管加入到EP管中，再加入等体积的4％羊血；其中，PBS和等体积的4％羊血混合，作为阴性对照组；0.1％Triton和等体积的4％羊血混合，为阳性对照组；样品混匀后置于37℃中孵育 60min。随后，将样品置于4℃进行离心(1000rpm/5min)；离心后，取100 μL的上清到96孔板中，并于576nm处测定吸光度，计算溶血率。计算公式如下：溶血＝(OD实验组-OD阴性组)÷(OD阳性组-OD阴性组)×100％。如图15为不同聚肽PButLG-CA、PButLG-CMA、PButLG-DCA、PButLG-CAA和PButLG-PHA的溶血活性，说明修饰后的非螺旋多肽具有较低的溶血活性，可以更好的体内应用。
2)杀菌动力学：
离心收集大肠杆菌(ATCC35218)，PBS清洗3次，使用不同pH(pH 7.4、6.8、6.5、6.0、5.5和5.0)的M9培养基稀释菌液至合适浓度，再加入一系列浓度的药物溶液，使得细菌终浓度为1×106CFU/mL。将样品置于37℃中孵育，在不同时间点取出样品，按10倍进行梯度稀释，并在琼脂板上涂布菌液；将琼脂板置于37℃中培养12小时后，进行菌落计数，计算细菌存活率。计算公式为：存活率＝抗菌肽处理组的菌落数÷空白对照组的菌落数×100％。如图12的A部分和B部分，图14的E部分和F部分，说明非螺旋-螺旋聚肽可以在酸环境下激活，杀死细菌。
3)脂质体泄露实验：
将POPE(1-棕榈酰-3-油酰-sn-甘油-2-磷酸乙醇胺)和POPG(1-棕榈酰 -2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油)溶解于二氯甲烷中，按POPE：POPG＝3:1，取260μL的POPE(25mg/mL)和230μL的POPG(10mg/mL)于圆底烧瓶，二氯甲烷定容至2mL；旋蒸除去氯仿，形成薄膜；向圆底烧瓶中加入2mL的 ANTS/DPX溶液(ANTS 12.5mM，DPX 45mM)，水化2h；随后，在液氮和温水中反复冻融10次，在脂质体挤压器中挤压通过400nm的聚碳酸酯膜；以含有 10mM Na2HPO4和90mM NaCl的缓冲液(pH 7.0)为洗脱液，使用Sephadex G-50 凝胶柱除去脂质体溶液中的游离染料；将脂质体溶液经过适度稀释后，分别调节其pH至7.4和5.5；取90μL的脂质体溶液和10μL不同浓度的抗菌肽溶液混合，使抗菌肽终浓度为8、16和32μg/mL，并做无药物处理的阴性对照组和0.1％的阳性对照组；样品在室温下避光孵育10min后，于360/530nm处测定荧光强度，计算染料泄漏率。计算公式为：泄漏率＝(荧光强度实验组-荧光强度阴性组)÷(荧光强度阳性组-荧光强度阴性组)。如图13的A部分所示，说明 PButLG-CMA在正常生理环境下不具有破膜活性，在酸性环境下激活后具有和阳离子聚肽PButLG-CA一样，可以破坏膜结构。
4)流式分析仪检测细菌对碘化丙啶的摄取：
离心收集细菌，分别使用pH 7.4和pH 5.5的M9培养基稀释细菌至合适浓度，加入已在pH 7.4和5.5中孵育12小时的抗菌肽溶液(64μg/mL)，使得细菌终浓度为1×107CFU/mL；将样品置于37℃中孵育60min；加入终浓度为25μM的碘化丙啶(PI)，室温下避光染色10min，进行流式检测，分析各组细菌中的PI阳性率。如图13的B部分为PButLG-CMA在不同pH下的结果，说明多肽可以在pH＝5.5环境下被激活，破坏细胞膜，导致PI阳性增加。 5)共聚焦显微镜观察细菌死活染色：
离心收集大肠杆菌(ATCC35218)，LB培养基重悬后，按2×109CFU/mL铺板于共聚焦培养皿中，于37℃中孵育2h；吸走上清，除去游离细菌，分别加已在 pH 7.4和5.5中孵育12小时的抗菌肽溶液(64μg/mL)，在37℃孵育60min；去除药物溶液，加入PI/SYTO9混合液，室温避光染色15min；吸除染料溶液，加入1mL的1％低熔点琼脂糖覆盖皿底，凝固后进行共聚焦显微镜观察。如图 13的C部分，可以看出PButLG-CMA在不同pH下的结果，说明多肽可以在pH＝5.5 环境下被激活，破坏细菌细胞膜，可以杀死细菌。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽，其特征在于，结构通式如下所示：
Figure FDA0002464265700000011
其中，n代表碳原子数目，n的取值范围为2-14；y代表骨架多肽重复单元数，y的取值范围为6-20；x代表骨架多肽被修饰的侧链个数，x的取值范围为6-20；
R1、R2为马来酸酐衍生物的残基；R1、R2为马来酸酐残基、苯基马来酸酐残基、柠康酸酐残基、3,4,5,6-四氢苯酐残基或乌头酸酐残基。
2.一种制备权利要求1所述的pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将谷氨酸和无水3-丁烯-1醇混合，然后在冰浴条件下，滴加浓硫酸，搅拌反应，过滤取滤渣，在异丙醇和水中重结晶，过滤取滤渣，洗涤，冷冻干燥，得到谷氨酸衍生物ButLG；
(2)将步骤(1)所述谷氨酸衍生物ButLG加入四氢呋喃中，混合均匀，然后在冰浴条件下加入三光气，加热反应，除去溶剂，过硅胶柱，得到谷氨酸衍生物碳酸酯环ButLG-NCA；
(3)在有机溶剂中，用烷基胺引发步骤(2)所述谷氨酸衍生物碳酸酯环ButLG-NCA聚合，沉淀，抽干，得到聚谷氨酸衍生物PButLG；
(4)将聚谷氨酸衍生物PButLG和巯基乙胺溶在溶剂中，加入2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮，通入氮气吹扫后，再用紫外光照进行点击反应将巯基乙胺点击到聚谷氨酸PButLG，透析，取保留液，冻干，得到阳离子聚肽PButLG-CA；
(5)将阳离子聚肽PButLG-CA溶解在有机溶剂中，然后加入马来酸酐衍生物和三乙胺进行搅拌反应，得到所述pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽。
3.根据权利要求2所述的pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述谷氨酸和无水3-丁烯-1醇的质量体积比为0.5-2：1g/mL，所述3-丁烯-1醇与浓硫酸的体积比为2-5：1，所述搅拌反应的时间为12-72h。
4.根据权利要求2所述的pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述谷氨酸衍生物ButLG与四氢呋喃的质量体积比为0.05-0.2:1g/mL；所述谷氨酸衍生物ButLG和三光气的摩尔比为0.5-1：1。
5.根据权利要求2所述的pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述加热反应的温度为20-80℃，加热反应的时间为2-5h。
6.根据权利要求2所述的pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述烷基胺为8-20个碳原子的伯胺；所述烷基胺与有机溶剂的摩尔体积比为0.05-0.15：1mol/L。
7.根据权利要求2所述的pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述烷基胺与谷氨酸衍生物碳酸酯环ButLG-NCA的摩尔比为0.05-0.2：1。
8.根据权利要求2所述的pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述聚谷氨酸衍生物PButLG、巯基乙胺和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮的摩尔比为1:(20-50):0.1；所述溶剂为DMF；所述巯基乙胺与溶剂的摩尔体积比为2-4:1mol/L。
9.根据权利要求2所述的pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述透析所采用的透析袋截留分子量为500-14000Da，所述透析的时间为1-3天；所述紫外光照点击反应使用的紫外光λmax＝365nm，紫外光照射点击反应的时间为10-100min。
10.根据权利要求2所述的pH响应的非螺旋-螺旋转变抗菌聚肽的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述有机溶剂为甲醇；所述马来酸酐衍生物为苯基马来酸酐、柠康酸酐、3,4,5,6-四氢苯酐、乌头酸酐中的一种；所述搅拌反应的时间为4-24h。
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