CN104645348B - 一种水凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水凝胶，由载药颗粒、具有式II所示结构的改性壳聚糖、包括式III和式IV所示结构嵌段的聚‑γ‑谷氨酸星型嵌段共聚物、包括式V和式VI所示结构嵌段的聚‑L‑赖氨酸星型嵌段共聚物和溶剂制备得到；所述载药颗粒由具有式I所示结构的改性葡聚糖和药物制备得到。本发明提供的水凝胶是基于静电作用和席夫碱键交联的水凝胶，通过将物理静电作用和席夫碱键化学交联相结合，使本发明提供的水凝胶强度较高而且稳定性好，能够满足临床注射的要求，而且其中的载药颗粒作为化学交联剂，能够使水凝胶中药物缓慢释放，实现药物在病灶部位的靶向释放和富集，从而提高药物的治疗效果。本发明还提供了一种水凝胶的制备方法。

Description

一种水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及靶向给药技术领域，尤其涉及一种水凝胶及其制备方法。

背景技术

水凝胶是一种三维网络高分子体系，形状稳定，且其内部能够吸收保持大量的水分，类似于天然细胞的外基质结构，可将细胞和生物分子固定在其内部，从而构建组织工程支架，用于缺损组织和器官的修复。同时，水凝胶还可作为“外壳”装载药物，水凝胶负载药物后可在体内肿瘤病灶部位向体液中持续释放药物，在抗肿瘤靶向药物领域具有重要的应用。

临床上，水凝胶可通过手术移植或注射方式进入体内，将水凝胶通过手术的方式植入体内，需要预先制成与缺损组织器官或病灶部位相适应的具有特殊形貌的水凝胶多孔结构支架，在水凝胶多孔结构支架中包载种子细胞或药物活性分子；但是，缺损组织器官或病灶部位的形状复杂且非常不规则，因此很难做到预成型支架的形状与修复部位完全相贴合，而且制备预成型支架的过程易受外界环境影响而增加受细菌或病毒感染的风险；另外，通过手术的方法植入预成型水凝胶支架，很容易造成植入部位的手术创伤及并发炎症。相比于通过手术移植的方式将水凝胶注入体内，采用注射的方式向体内注入水凝胶具有明显的优势，通过注射的方式将具有一定流动性的水凝胶前体植入体内，水凝胶前体很容易充满整个具有不规则形状的缺损或病灶部位，手术创伤微小且易于操作，降低了植入体对机体组织的侵入性。

现有的可注射水凝胶具有以下特性，注射前水凝胶前体能保持低粘度的溶胶状态，具有流动性，易于注射；注射后水凝胶前体可快速进行凝胶化，并在短时间内形成凝胶；水凝胶具有较好的可生物降解性，而且其降解产物具有较好的生物相容性。但是，目前可注射的水凝胶由于其自身的溶胀特性以及内部的多孔结构，导致了这种水凝胶会出现突释效应，影响水凝胶中药物的药效发挥。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水凝胶及其制备方法，本发明提供的水凝胶具有较好的缓释效果，使其中的药物更好的发挥药效。

本发明提供了一种水凝胶，由载药颗粒、改性壳聚糖、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物、聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物和溶剂制备得到；

所述载药颗粒由改性葡聚糖和药物制备得到，所述改性葡聚糖具有式I所示的结构：

式I中，z为50～600；R为-H或具有式1所示结构的基团：

所述改性壳聚糖具有式II所示的结构：

式II中，400≤(m+n)≤600；R₁为-H或具有式2所示结构的基团：

式2中，200≤h≤300；

所述聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物包括式III所示结构的嵌段和式IV所示结构的嵌段：

式III中，40≤r≤230；

式IV中，40≤k≤140；

所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物包括式V所示结构的嵌段和式VI所示结构的嵌段：

式V中，40≤t≤230；

式VI中，40≤L≤140。

优选的，所述溶剂选自缓冲溶液、生理盐水或组织培养液。

优选的，所述载药颗粒在所述水凝胶中的质量含量为0.2％～1％。

优选的，所述改性壳聚糖在所述水凝胶中的质量含量为2％～4％。

优选的，所述聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物在所述水凝胶中的质量含量为2％～3％。

优选的，所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物在所述水凝胶中的质量含量为1.8％～3.8％。

本发明提供的水凝胶中载药颗粒作为交联剂，与改性壳聚糖和聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物交联，在水凝胶的内部形成席夫碱键，载药颗粒表面含有经氧化修饰后产生的活性醛基，有利于与蛋白类抗肿瘤药物的化学结合；聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物和聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物之间的静电作用使本发明提供的水凝胶具有较高的强度和较短的成胶时间，可在临床上通过注射的方式将本发明提供的水凝胶输送至病灶部位原位成型，而且其中的载药颗粒作为化学交联剂，能够使水凝胶中药物缓慢释放，实现药物在病灶部位的靶向释放和富集，从而提高药物的治疗效果。实验结果表明，本发明提供的水凝胶在20000秒时储能模量达到10⁴Pa，弹性强度较高；本发明提供的水凝胶的成胶时间可控制在1分钟～20分钟之内，满足临床注射的要求；本发明提供的水凝胶中的药物10天的释放量为40％～60％，释放缓慢；本发明提供的水凝胶与癌细胞共培养后癌细胞的活性值为30％～88％，治疗癌细胞效果好。

本发明提供了一种水凝胶的制备方法，包括：

将载药颗粒、改性壳聚糖、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物、聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物和溶剂混合，得到水凝胶；

所述载药颗粒由改性葡聚糖和药物制备得到，所述改性葡聚糖具有式I所示的结构：

式I中，y为50～600；R为-H或具有式1所示结构的基团：

所述改性壳聚糖具有式II所示的结构：

式II中，400≤(m+n)≤600；R₁为-H或具有式2所示结构的基团：

式2中，200≤h≤300；

所述聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物包括式III所示结构的嵌段和式IV所示结构的嵌段：

式III中，40≤r≤230；

式IV中，40≤k≤140；

所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物包括式V所示结构的嵌段和式VI所示结构的嵌段：

式V中，40≤t≤230；

式VI中，40≤L≤140。

优选的，所述载药颗粒的制备方法为：

将葡聚糖胶束和药物溶液混合，得到混合溶液，所述葡聚糖胶束由具有式I所示结构的改性葡聚糖制备得到；

式I中，y为50～600；R为-H或具有式1所示结构的基团：

将所述混合溶液依次进行超滤和干燥，得到载药颗粒。

优选的，所述聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物的制备方法为：

将端氨基化四臂-聚乙二醇和γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐在溶剂中进行聚合反应，得到聚合反应产物，所述端氨基化四臂-聚乙二醇具有式3所示的结构：

式3中，40≤u≤230；

将所述聚合反应产物与酸性溶液进行去保护反应，得到聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶剂为乙酸，所述酸性溶液的溶质为三氟乙酸和氢溴酸。

优选的，所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物的制备方法为：

将氨基化四臂-聚乙二醇与N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐在溶剂中进行聚合反应，得到聚合反应产物，所述端氨基化四臂-聚乙二醇具有式3所示的结构：

式3中，40≤u≤230；

将所述聚合反应产物与酸性溶液进行去保护反应，得到聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶剂为乙酸，所述酸性溶液的溶质为三氟乙酸和氢溴酸。

本发明提供的水凝胶制备方法原料易得，成本较低，工艺简单；本发明提供的方法制备得到的水凝胶具有良好的降解性和生物相容性，本发明提供的方法制备得到的水凝胶内部呈三维多孔结构，具有较好的稳定性和弹性强度，成胶时间较短；而且本发明提供的方法制备得到的水凝胶中药物缓慢释放，使药物在病灶部位的靶向释放和富集，从而提高药物的治疗效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1制备得到的改性葡聚糖的核磁共振氢谱图；

图2为本发明实施例4制备得到的改性葡聚糖的核磁共振氢谱图；

图3为本发明实施例14制备得到的改性壳聚糖的核磁共振氢谱图；

图4为本发明实施例17制备得到的聚-γ-谷氨酸星型段共聚物的核磁共振氢谱图；

图5为本发明实施例20制备得到的聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物的核磁共振氢谱图；

图6为本发明实施例23制备得到的水凝胶的储能模量动态时间谱图；

图7为本发明实施例6制备的载药颗粒的和实施例23制备得到的水凝胶中的药物在磷酸盐缓冲溶液中释放时间的数据图；

图8为本发明实施例12制备的载药颗粒的和实施例24制备得到的水凝胶中的药物在磷酸盐缓冲溶液中释放时间的数据图；

图9为不含药物的水凝胶、本发明实施例23制备得到的水凝胶、本发明实施例24制备得到的水凝胶、本发明实施例25制备得到的水凝胶分别与癌细胞共培养后癌细胞的活性值数据图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种水凝胶，由载药颗粒、改性壳聚糖、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物、聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物和溶剂制备得到。在本发明中，所述载药颗粒由具有式I所示结构的改性葡聚糖制备得到：

式I中，z为50～600；R为-H或具有式1所示结构的基团：

在本发明的实施例中，z为60～560；在其他的实施例中，z为100～500；在另外的实施例中，z为200～400。

在本发明的实施例中，所述改性葡聚糖的制备方法可以为：

将葡聚糖和高碘酸盐进行反应，得到改性葡聚糖，所述改性葡聚糖具有式I所示的结构，式I中R为-H；在本发明的其他实施例中，可以在溶剂中将葡聚糖和高碘酸盐进行反应，得到改性葡聚糖。在本发明的实施例中，葡聚糖和高碘酸盐反应的溶剂可以为水；在其他的实施例中，葡聚糖和高碘酸盐反应的溶剂可以为纯水。

在本发明的实施例中，葡聚糖和高碘酸盐的反应时间可以为12小时～24小时。在本发明的实施例中，葡聚糖和高碘酸盐的反应温度可以为20℃～30℃；在其他的实施例中，葡聚糖和高碘酸盐的反应温度可以为25℃。在本发明的实施例中，可以在避光的条件下将葡聚糖和高碘酸盐进行反应。在本发明的实施例中，可以在搅拌的条件下将葡聚糖和高碘酸盐进行反应。

在本发明的实施例中，所述高碘酸盐可以碱金属高碘酸盐；在其他的实施例中，所述高碘酸盐可以为高碘酸钠。在本发明的实施例中，葡聚糖和高碘酸盐的摩尔比可以为1:(0.1～1)；在其他的实施例中，葡聚糖和高碘酸盐的摩尔比可以为1:(0.3～0.7)。

在本发明的实施例中，葡聚糖和高碘酸盐反应完成后，将得到的反应产物依次进行沉降、分离、透析和干燥，得到改性葡聚糖。在本发明的实施例中，沉降的试剂可以酮类化合物或醇类化合物；在其他的实施例中，沉降的试剂可以为丙酮或乙醇。在本发明的实施例中，透析的分子量可以为3500道尔顿～7000道尔顿。在本发明的实施例中，干燥的方法可以为冷冻干燥。在本发明的实施例中，所述冷冻干燥的温度可以为-75℃～-85℃。

在本发明的其他实施例中，所述改性葡聚糖的制备方法还可以为：

将葡聚糖、胆固醇甲酰氯和三乙胺在溶剂中进行反应，得到中间产物；

将所述中间产物和高碘酸盐进行反应，得到改性葡聚糖，所述改性葡聚糖具有式I所示的结构，式I中的R为具有式1所示结构的基团。

在本发明的实施例中，葡聚糖、胆固醇甲酰氯和三乙胺的反应温度为25℃～40℃。在本发明的实施例中，葡聚糖、胆固醇甲酰氯和三乙胺的反应时间为24小时～48小时。在本发明的实施例中，可以将葡聚糖、胆固醇甲酰氯和三乙胺在搅拌的条件下进行反应。

在本发明的实施例中，所述葡聚糖、胆固醇甲酰氯和三乙胺的摩尔比可以为1:(0.1～0.2)：(0.2～0.4)；在其他的实施例中，所述葡聚糖、胆固醇甲酰氯和三乙胺的摩尔比可以为1:(0.14～0.18)：(0.25～0.35)。在本发明的实施例中，葡聚糖、胆固醇甲酰氯和三乙胺反应的溶剂为二氯甲烷和二甲基亚砜。在本发明的实施例中，所述二氯甲烷和二甲基亚砜的体积比为(0.3～0.6)：1。

在本发明的实施例中，葡聚糖、胆固醇甲酰氯和三乙胺反应完成后，将得到的反应产物依次进行沉降、分离和干燥，得到中间产物。在本发明的实施例中，沉降葡聚糖、胆固醇甲酰氯和三乙胺反应产物的试剂为二氯甲烷。在本发明的实施例中，干燥葡聚糖、胆固醇甲酰氯和三乙胺反应产物的方法为真空干燥。

在本发明的实施例中，得到中间产物后，将所述中间产物和高碘酸盐进行反应，得到改性葡聚糖。在本发明的实施例中，可以将所述中间产物分散在水相中，向所述中间产物中加入高碘酸盐进行反应，得到改性葡聚糖。在本发明的实施例中，所述中间产物和高碘酸盐反应的温度和时间与上述技术方案所述葡聚糖和高碘酸盐反应的温度和时间一致，在此不再赘述。

在本发明中，所述高碘酸盐与上述技术方案所述高碘酸盐一致，在此不再赘述。在本发明的实施例中，所述中间产物和高碘酸盐的摩尔比可以为1:(0.1～1)；在其他的实施例中，所述中间产物和高碘酸盐的摩尔比可以为1:(0.3～0.6)。

在本发明的实施例中，所述载药颗粒的制备方法可以为：

将葡聚糖胶束和药物溶液混合，得到混合溶液，所述葡聚糖胶束由上述具有式I所示结构的改性葡聚糖制备得到；

将所述混合溶液依次进行过滤和干燥，得到载药颗粒。

在本发明的实施例中，可以将葡聚糖胶束溶解于水相中与药物溶液混合，得到混合溶液。在本发明的实施例中，所述混合的时间可以为6小时～12小时。在本发明的实施例中，所述混合的温度可以为30℃～40℃。在本发明的实施例中，可以在搅拌的条件下进行所述混合。

在本发明的实施例中，所述葡聚糖胶束的制备方法可以为：

将改性葡聚糖依次进行溶解、稀释、透析、过滤和干燥，得到葡聚糖胶束。

在本发明的实施例中，所述溶解的试剂可以为二甲基亚砜。在本发明的实施例中，所述溶解的时间可以为12小时～24小时。在本发明的实施例中，所述溶解的温度可以为35℃～45℃。在本发明的实施例中，可以在搅拌的条件下进行溶解。

在本发明的实施例中，所述稀释的试剂可以为水；在其他的实施例中，所述稀释的试剂可以为去离子水。在本发明的实施例中，所述稀释试剂的体积为上述技术方案所述溶解试剂体积的2倍～5倍。在本发明的实施例中，可以在搅拌的条件下进行所述稀释。在本发明的实施例中，所述搅拌的方法可以为超声搅拌。在本发明的实施例中，所述稀释的时间为5小时～8小时。

在本发明的实施例中，所述透析的时间可以为2天～3天。在本发明的实施例中，可以在透析袋中进行所述透析。在本发明的实施例中，可以采用滤膜进行过滤。在本发明的实施例中，所述滤膜的孔径可以为0.4微米～0.5微米；在其他的实施例中，所述滤膜的孔径可以为0.44微米～0.46微米。在本发明的实施例中，干燥改性葡聚糖的方法可以为冷冻干燥。

在本发明中，所述改性葡聚糖与上述技术方案所述改性葡聚糖一致，在此不再赘述。在本发明的实施例中，所述药物溶液中的药物可以为蛋白类抗肿瘤药物；在其他的实施例中，所述药物溶液中的药物可以为白介素或干扰素。在本发明的实施例中，所述药物溶液的溶剂可以为水。在本发明的实施例中，所述药物溶液的质量浓度为0.01％～0.05％；在其他的实施例中，所述药物溶液的质量浓度为0.02％～0.04％。

在本发明的实施例中，得到混合溶液后，将所述混合溶液依次进行过滤和干燥，得到载药颗粒。在本发明的实施例中，过滤混合溶液的方法可以为超滤。在本发明的实施例中，干燥混合溶液的方法可以为冷冻干燥。

在本发明中，所述载药颗粒具有较高的载药率，本发明提供的载药颗粒的载药率为8％～9％。在本发明的实施例中，所述载药颗粒负载白介素的载药率为8.3％，负载干扰素的载药率为8.7％。在本发明的实施例中，可以将葡聚糖胶束与不同的药物进行结合制备得到不同药物联合应用的载药颗粒，增强治疗效果；如采用白介素和干扰素的混合药物溶液制备载药颗粒。

在本发明中，所述改性壳聚糖具有式II所示的结构：

式II中，400≤(m+n)≤600；R₁为-H或具有式2所示结构的基团：

式2中，200≤h≤300。

在本发明的实施例中，式II中，450≤(m+n)≤550。在本发明的实施例中，式2中，230≤h≤270。

在本发明的实施例中，所述改性壳聚糖的制备方法可以为：

将壳聚糖和碱性溶液进行反应，得到反应产物；

在催化剂的作用下，将所述反应产物和环氧丙烷在反应介质中进行反应，得到改性壳聚糖。

在本发明的实施例中，壳聚糖和碱性溶液反应的温度为20℃～30℃。在本发明的实施例中，壳聚糖和碱性溶液反应的时间为1小时～2小时。在本发明的实施例中，可以在搅拌的条件下将壳聚糖和碱性溶液进行反应。

在本发明的实施例中，所述壳聚糖的数均分子量可以为30000～100000；在其他的实施例中，所述壳聚糖的数均分子量可以为40000～80000；在另外的实施例中，所述壳聚糖的数均分子量可以为50000～60000。在本发明的实施例中，所述碱性溶液中的溶质可以为氢氧化钠。在本发明的实施例中，所述碱性溶液的质量浓度可以为0.8mol/L～1.2mol/L。在本发明的实施例中，所述壳聚糖和碱性溶液的质量比可以为1:(10～50)；在其他的实施例中，所述壳聚糖和碱性溶液的质量比可以为1:(20～40)；在另外的实施例中，所述壳聚糖和碱性溶液的质量比可以为1:(25～35)。

在本发明的实施例中，壳聚糖和碱性溶液反应完成后，将得到的产物进行冷冻，得到反应产物。在本发明的实施例中，所述冷冻的温度可以为-15℃～-20℃。在本发明的实施例中，所述冷冻的时间可以为12小时～24小时。

在本发明的实施例中，得到反应产物后，在催化剂的作用下，将所述反应产物和环氧丙烷在反应介质中进行反应，得到改性壳聚糖。在本发明的实施例中，所述反应产物和环氧丙烷的反应温度可以为40℃～60℃。在本发明的实施例中，所述反应产物和环氧丙烷的反应时间可以为5小时～10小时。

在本发明的实施例中，可以向所述反应产物中加入反应介质、环氧丙烷和催化剂进行反应，得到改性壳聚糖。在本发明的实施例中，所述反应介质可以为醇类化合物；在其他的实施例中，所述反应介质可以为异丙醇。在本发明的实施例中，所述催化剂可以为四甲基氢氧化铵；在其他的实施例中，所述催化剂可以为四甲基氢氧化铵溶液。在本发明的实施例中，所述四甲基氢氧化铵溶液的质量浓度可以为0.8％～1.2％。

在本发明的实施例中，所述环氧丙烷和反应介质的体积比为(0.5～2):1；在其他的实施例中，所述环氧丙烷和反应介质的体积比为(1～1.5):1。在本发明的实施例中，所述反应产物和环氧丙烷的摩尔比可以为1:(14～56)；在其他的实施例中，所述反应产物和环氧丙烷的摩尔比可以为1:(20～50)；在另外的实施例中，所述反应产物和环氧丙烷的摩尔比可以为1:(30～40)。在本发明的实施例中，所述催化剂和环氧丙烷的摩尔比可以为1:(10～100)；在其他的实施例中，所述催化剂和环氧丙烷的摩尔比可以为1:(20～80)；在另外的实施例中，所述催化剂和环氧丙烷的摩尔比可以为1:(30～60)。

在本发明的实施例中，所述反应产物和环氧丙烷反应完成后，将得到的反应溶液的pH值调节至7.0后依次进行沉降、分离、透析和干燥，得到改性壳聚糖。在本发明的实施例中，调节反应溶液的pH值至7.0的试剂可以为酸性化合物。在本发明的实施例中，所述酸性化合物可以为盐酸。在本发明的实施例中，沉降所述反应溶液的试剂可以为醇类化合物；在其他的实施例中，沉降所述反应溶液的试剂可以为乙醇。在本发明的实施例中，分离所述反应溶液的方法可以为离心分离。在本发明的实施例中，透析所述反应溶液的溶剂可以为纯水。在本发明的实施例中，透析所述反应溶液的时间可以为1天～2天。在本发明的实施例中，干燥所述反应溶液的方法可以为冷冻干燥。

在本发明中，所述聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物包括具有式III所示结构的嵌段和式IV所示结构的嵌段：

式III中，40≤r≤230；

式IV中，40≤k≤140。

在本发明的实施例中，式III中，50≤r≤200；在其他的实施例中，式III中，100≤r≤150。在本发明的实施例中，式IV中，50≤k≤120；在其他的实施例中，式IV中，80≤k≤100。

在本发明的实施例中，所述聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物的制备方法可以为：

将端氨基化四臂-聚乙二醇和γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐在溶剂中进行聚合反应，得到聚合反应产物，所述端氨基化四臂-聚乙二醇具有式3所示的结构：

式3中，40≤u≤230；

将所述聚合反应产物与酸性溶液进行去保护反应，得到聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶剂为乙酸，所述酸性溶液的溶质为三氟乙酸和氢溴酸。

在本发明的实施例中，将所述端氨基化四臂-聚乙二醇和γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐在溶剂中进行聚合反应，得到聚合反应产物。在本发明的实施例中，端氨基化四臂-聚乙二醇和γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐聚合反应的溶剂为氯仿或N,N-二甲基甲酰胺。在本发明的实施例中，端氨基化四臂-聚乙二醇和γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐聚合反应的溶剂为无水溶剂。在本发明的实施例中，端氨基化四臂-聚乙二醇和γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐进行聚合反应的温度可以为20℃～40℃。在本发明的实施例中，端氨基化四臂-聚乙二醇和γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐进行聚合反应的时间可以为1天～3天。

在本发明的实施例中，式3中，50≤u≤200；在另外的实施例中，式3中，100≤u≤150。在本发明的实施例中，所述端氨基化的四臂-聚乙二醇的数均分子量可以为2000～10000；在其他的实施例中，所述端氨基化的四臂-聚乙二醇的数均分子量可以为4000～8000；在另外的实施例中，所述端氨基化的四臂-聚乙二醇的数均分子量可以为5000～6000。

在本发明的实施例中，所述端氨基化的四臂-聚乙二醇的制备方法可以为：

将Boc-L-苯丙氨酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC^.HCL)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和四臂-聚乙二醇进行反应，得到中间反应物；

将所述中间反应物和酸类化合物进行去保护反应，得到端氨基化的四臂-聚乙二醇。

在本发明的实施例中，可以在二氯甲烷中，将Boc-L-苯丙氨酸、EDC^.HCL、DMAP和四臂-聚乙二醇进行反应，得到中间反应物；在其他的实施例中，可以将Boc-L-苯丙氨酸、EDC^.HCL和DMAP加入到二氯甲烷中，得到混合液；向所述混合液中加入四臂-聚乙二醇进行反应，得到中间反应物。

在本发明的实施例中，Boc-L-苯丙氨酸、EDC_.HCL、DMAP和四臂-聚乙二醇反应的温度为25℃～37℃。在本发明的实施例中，Boc-L-苯丙氨酸、EDC_.HCL、DMAP和四臂-聚乙二醇反应的时间为24小时～48小时。

在本发明的实施例中，所述Boc-L-苯丙氨酸、EDC_.HCL、DMAP和四臂-聚乙二醇的摩尔比为(1.5～2.5):(4～6):(0.15～0.3):1；在其他的实施例中，所述Boc-L-苯丙氨酸、EDC_.HCL、DMAP和四臂-聚乙二醇的摩尔比为2:5:0.2:1。

在本发明的实施例中，Boc-L-苯丙氨酸、EDC_.HCL、DMAP和四臂-聚乙二醇反应完成后，可以将得到的产物依次进行洗涤、干燥、浓缩、沉降、过滤、抽干，得到中间反应物。在本发明的实施例中，所述洗涤的试剂可以为氯化钠水溶液；在其他的实施例中，所述洗涤的试剂可以为饱和的氯化钠水溶液。在本发明的实施例中，干燥所述产物的试剂可以无水硫酸镁。在本发明的实施例中，沉降所述产物的试剂可以为醚类化合物；在其他的实施例中，沉降所述产物的试剂可以为乙醚。在本发明的实施例中，所述抽干的方法可以为减压抽干。

在本发明的实施例中，得到中间反应物后，将所述中间反应物和酸类化合物进行去保护反应，得到端氨基化的四臂-聚乙二醇。在本发明的实施例中，可以将所述中间反应物溶于二氯甲烷中，向所述中间反应物中加入酸类化合物进行去保护反应，得到端氨基化的四臂-聚乙二醇。

在本发明的实施例中，中间产物和酸类化合物去保护反应的温度为30℃～40℃。在本发明的实施例中，中间产物和酸类化合物去保护反应的时间为1小时～3小时。在本发明的实施例中，所述酸类化合物可以为三氟乙酸。在本发明的实施例中，所述中间产物和酸类化合物的摩尔比可以为1:(3～10)。

在本发明的实施例中，中间产物和酸类化合物去保护反应完成后，可以将得到的产物依次进行去除溶剂、溶解、洗涤、干燥、过滤、沉降、再次干燥，得到端氨基化的四臂-聚乙二醇。在本发明的实施例中，去除溶剂的方式可以为真空旋干去除溶剂。在本发明的实施例中，可以采用二氯甲烷溶解去除溶剂后的产物。在本发明的实施例，可以采用碳酸氢钠水溶液洗涤溶解后的产物；在其他的实施例中，可以采用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤溶解后的产物。在本发明的实施例中，干燥洗涤后的产物的试剂可以为无水硫酸钠。在本发明的实施例中，过滤干燥后的产物的方法可以为抽滤。在本发明的实施例中，沉降过滤后的产物的试剂可以醚类化合物；在其他的实施例中，沉降过滤后的产物的试剂可以为乙醚；在另外的实施例中，沉降过滤后的产物的试剂可以为冰乙醚。在本发明的实施例中，沉降过滤后的产物的次数可以为2次～3次。在本发明的实施例中，将沉降后的产物再次干燥的方法可以为真空干燥。

在本发明的实施例中，在将端氨基化四臂-聚乙二醇和γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐进行聚合反应之前，可以将端氨基化四臂-聚乙二醇进行除水处理。在本发明的实施例中，所述除水处理的方式为共沸除水。在本发明的实施例中，所述共沸除水的试剂可以为甲苯；在其他的实施例中，所述共沸除水的试剂可以为无水甲苯。在本发明的实施例中，所述共沸除水的时间可以为2小时～4小时。

在本发明的实施例中，所述γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐的制备方法可以为：

将L-谷氨酸-γ-苄酯和双(三氯甲基)碳酸酯进行聚合反应，得到γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐。

在本发明的实施例中，L-谷氨酸-γ-苄酯和双(三氯甲基)碳酸酯进行聚合反应的温度可以为50℃～60℃。在本发明的实施例中，L-谷氨酸-γ-苄酯和双(三氯甲基)碳酸酯进行聚合反应的时间可以为1小时～4小时。在本发明的实施例中，所述L-谷氨酸-γ-苄酯和双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比可以为1:(1～5)；在其他的实施例中，所述L-谷氨酸-γ-苄酯和双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比可以为1:(2～3)。

在本发明的实施例中，所述端氨基化的四臂-聚乙二醇与γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐的摩尔比可以为1:(60～480)；在其他的实施例中，所述端氨基化的四臂-聚乙二醇与γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐的摩尔比可以为1:(100～400)；在另外的实施例中，所述端氨基化的四臂-聚乙二醇与γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐的摩尔比可以为1:(200～300)。

在本发明的实施例中，得到端氨基化的四臂-聚乙二醇与γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐的聚合反应产物后，将所述聚合反应产物与酸性溶液进行去保护反应，得到聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶剂为乙酸，所述酸性溶液的溶质为三氟乙酸和氢溴酸。在本发明的实施例中，端氨基化的四臂-聚乙二醇与γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐聚合反应产物与酸性溶液去保护反应的温度为20℃～40℃。在本发明的实施例中，端氨基化的四臂-聚乙二醇与γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐聚合反应产物与酸性溶液去保护反应的时间为1小时～3小时。

在本发明的实施例中，所述酸性溶液的质量浓度可以为30％～35％；在其他的实施例中，所述酸性溶液的质量浓度可以为33％。在本发明的实施例中，所述三氟乙酸和氢溴酸的摩尔比可以为(2～5):1；在其他的实施例中，所述三氟乙酸和氢溴酸的摩尔比可以为(3～4):1。在本发明的实施例中，所述端氨基化的四臂-聚乙二醇与γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐聚合反应产物和酸性溶液的质量比可以为1:(5～10)。

在本发明中，所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物包括具有式V所示结构的嵌段和式VI所示结构的嵌段：

式V中，40≤t≤230；

式VI中，40≤L≤140。

在本发明的实施例中，式V中，50≤t≤200；在其他的实施例中，式V中，100≤t≤150。在本发明的实施例中，式VI中，60≤L≤120；在其他的实施例中，式VI中，80≤L≤100。

在本发明的实施例中，所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物的制备方法可以为：

将端氨基化四臂-聚乙二醇和N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐在溶剂中进行聚合反应，得到聚合反应产物，所述端氨基化四臂-聚乙二醇具有式3所示的结构：

式3中，40≤u≤230；

将所述聚合反应产物与酸性溶液进行去保护反应，得到聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶剂为乙酸，所述酸性溶液的溶质为三氟乙酸和氢溴酸。

在本发明的实施例中，端氨基化四臂-聚乙二醇与N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐聚合反应的溶剂为氯仿或N,N-二甲基甲酰胺。在本发明的实施例中，端氨基化四臂-聚乙二醇与N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐聚合反应的溶剂为无水溶剂。在本发明的实施例中，端氨基化四臂-聚乙二醇与N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐聚合反应的温度为25℃～40℃。在本发明的实施例中，端氨基化四臂-聚乙二醇与N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐聚合反应的时间为1小时～3小时。

在本发明的实施例中，所述端氨基化四臂-聚乙二醇的种类、来源与除水处理的方法与上述技术方案所述端氨基化四臂-聚乙二醇的种类、来源与除水处理的方法一致，在此不再赘述。

在本发明的实施例中，所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐的制备为：

将N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行聚合反应，得到N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-内羧酸酐。

在本发明的实施例中，N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行聚合反应的温度为50℃～60℃。在本发明的实施例中，N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行聚合反应的时间为1小时～3小时。在本发明的实施例中，N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比为1:(1～5)。

在本发明的实施例中，所述端氨基化四臂-聚乙二醇与N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐的摩尔比可以为1:(55～500)；在其他的实施例中，端氨基化四臂-聚乙二醇与N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐的摩尔比可以为1:(100～400)；在另外的实施例中，端氨基化四臂-聚乙二醇与N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐的摩尔比可以为1:(200～300)。

在本发明的实施例中，得到端氨基化的四臂-聚乙二醇与N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐的聚合反应产物后，将所述聚合反应产物与酸性溶液进行去保护反应，得到聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶剂为乙酸，所述酸性溶液的溶质为三氟乙酸和氢溴酸。在本发明的实施例中，端氨基化的四臂-聚乙二醇与N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐聚合反应产物与酸性溶液去保护反应的温度为20℃～40℃。在本发明的实施例中，端氨基化的四臂-聚乙二醇与N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐聚合反应产物与酸性溶液去保护反应的时间为1小时～3小时。

在本发明中，所述酸性溶液的种类与上述技术方案所述酸性溶液的种类一致，在此不再赘述。在本发明的实施例中，所述四臂-聚乙二醇与N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐的聚合反应产物和酸性溶液的质量比可以为1:(5～10)。

在本发明的实施例中，水凝胶中的溶剂可以为缓冲溶液、生理盐水或组织培养液。在本发明的实施例中，所述载药颗粒在所述水凝胶中的质量含量为0.2％～1％；在其他的实施例中，所述载药颗粒在所述水凝胶中的质量含量为0.5％～0.8％。在本发明的实施例中，所述改性壳聚糖在所述水凝胶中的质量含量可以为2％～4％；在其他的实施例中，所述改性壳聚糖在所述水凝胶中的质量含量可以为2.5％～3.5％。在本发明的实施例中，所述聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物在所述水凝胶中的质量含量可以为1.6％～3.5％；在其他的实施例中，所述聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物在所述水凝胶中的质量含量可以为2％～3％。在本发明的实施例中，所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物在所述水凝胶中的质量含量可以为1.8％～3.8％；在其他的实施例中，所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物在所述水凝胶中的质量含量可以为2％～3.5％；在另外的实施例中，所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物在所述水凝胶中的质量含量可以为2.5％～3％。

在本发明的实施例中，所述水凝胶的弹性强度在20000秒时其储能模量为6000Pa～12000Pa；在其他的实施例中，所述水凝胶的弹性强度在20000秒时其储能模量为8000Pa～10000Pa。

本发明提供的水凝胶是基于静电作用和席夫碱键交联的水凝胶，通过将物理静电作用和席夫碱键化学交联相结合，使本发明提供的水凝胶强度较高而且稳定性好，能够满足临床注射的要求，而且其中的载药颗粒作为化学交联剂，能够使水凝胶中药物缓慢释放，实现药物在病灶部位的靶向释放和富集，从而提高药物的治疗效果。

本发明提供了一种水凝胶的制备方法，包括：

将载药颗粒、改性壳聚糖、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物、聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物和溶剂混合，得到水凝胶；所述载药颗粒由改性葡聚糖和药物制备得到，所述改性葡聚糖具有式I所示的结构：

式I中，z为50～600；R为-H或具有式1所示结构的基团：

所述改性壳聚糖具有式II所示的结构：

式II中，400≤(m+n)≤600；R₁为-H或具有式2所示结构的基团：

式2中，200≤h≤300；

所述聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物包括式III所示结构的嵌段和式IV所示结构的嵌段：

式III中，40≤r≤230；

式IV中，40≤k≤140；

所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物包括式V所示结构的嵌段和式VI所示结构的嵌段：

式V中，40≤t≤230；

式VI中，40≤L≤140。

在本发明的实施例中，所述载药颗粒、改性壳聚糖、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物和聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物的质量比为(0.2～1):(2～4):(1.6～3.5):(1.8～3.8)；在其他的实施例中，所述载药颗粒、改性壳聚糖、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物和聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物的质量比为(0.4～0.8):(2.5～3.5):(2～3):(2～3.5)；在另外的实施例中，所述载药颗粒、改性壳聚糖、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物和聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物的质量比为(0.5～0.6):(2.8～3.2):(2.2～2.6):(2.5～3)。

在本发明的实施例中，所述水凝胶中溶剂的用量使载药颗粒在水凝胶中的质量含量为0.2％～1％；改性壳聚糖在水凝胶中的质量含量为2％～4％；聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物在水凝胶中的质量含量为1.6％～3.5％；聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物在水凝胶中的质量含量为1.8％～3.8％。在本发明中，所述载药颗粒、改性壳聚糖、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物、聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物和溶剂的种类和来源与上述技术方案所述载药颗粒、改性壳聚糖、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物、聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物和溶剂的种类和来源一致，在此不再赘述。

在本发明的实施例中，所述水凝胶的制备方法可以为：

将载药颗粒、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物和溶剂混合，得到第一溶液；

将改性壳聚糖、聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物和溶剂混合，得到第二溶液；

将所述第一溶液和第二溶液混合静置成胶，得到水凝胶。

在本发明的实施例中，所述第一溶液中载药颗粒的质量浓度为15mg/mL～25mg/mL；在其他的实施例中，所述第一溶液中载药颗粒的质量浓度为18mg/mL～22mg/mL。在本发明的实施例中，所述第一溶液中聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物的质量浓度为60mg/mL～70mg/mL；在其他的实施例中，所述第一溶液中聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物的质量浓度为62mg/mL～66mg/mL。

在本发明的实施例中，所述第二溶液中改性壳聚糖的质量浓度为35mg/mL～45mg/mL；在其他的实施例中，所述第二溶液中改性壳聚糖的质量浓度为38mg/mL～42mg/mL。在本发明的实施例中，所述第二溶液中聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物的质量浓度为70mg/mL～80mg/mL；在其他的实施例中，所述第二溶液中聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物的质量浓度为72mg/mL～76mg/mL。

在本发明的实施例中，所述第一溶液和第二溶液的质量比可以为1:(0.5～1.5)；在其他的实施例中，所述第一溶液和第二溶液的质量比可以为1:(0.8～1.2)；在另外的实施例中，所述第一溶液和第二溶液的质量比可以为1:1。在本发明的实施例中，所述第一溶液和第二溶液混合的方法可以为涡旋混合。

本发明提供的水凝胶制备方法原料易得，成本较低，工艺简单；制备得到的水凝胶具有良好的降解性和生物相容性，本发明提供的方法制备得到的水凝胶内部呈三维多孔结构，具有较好的稳定性和弹性强度，成胶时间较短；而且本发明提供的方法制备得到的水凝胶中药物缓慢释放，使药物在病灶部位的靶向释放和富集，从而提高药物的治疗效果。

测试本发明提供的水凝胶的弹性强度，具体方法为：将载药颗粒、改性壳聚糖、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物、聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物和溶剂在AntonMCR 301流变仪的载物台上混合，37℃下测试混合后的溶液储能模量的动态时间谱；载物台的平板直径为25mm，板间距为0.5mm；测试频率为1HZ，测试应变为10％；测试结果为，本发明提供的水凝胶在20000秒时储能模量达到10⁴Pa，弹性强度较高。

测试本发明提供的水凝胶的成胶时间，具体方法为：将载药颗粒、改性壳聚糖、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物、聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物和溶剂在玻璃试管中混合后倒置上述玻璃试管，玻璃试管中的混合溶液在30秒内不流动的时间为水凝胶的成胶时间；测试结果为，本发明提供的水凝胶的成胶时间为40秒～15分钟。成胶时间短，满足临床注射的要求。

测试本发明提供的水凝胶中药物的释放速度，具体方法为：将本发明提供的水凝胶放置于玻璃试管中，向所述玻璃试管中加入3mL的pH值为7.4的PBS，得到混合物，将所述混合物放置于37℃恒温振荡培养箱中，间隔1天从玻璃试管中取出1mL的混合物，同时向玻璃试管中补加入1mL的PBS；采用ELISA试剂盒对取出的混合物中的药物含量进行检测，从而计算出水凝胶中的药物的释放量；测试结果为，本发明提供的水凝胶中的药物10天的释放量为40％～60％，释放缓慢。

测试本发明提供的水凝胶治疗肿瘤的效果，具体方法为：将本发明提供的水凝胶和肿瘤细胞共培养，培养方法为采用DMEM+10％FBS培养基，置于37℃，在质量浓度为5％的CO₂细胞培养箱中培养96小时后，向所述培养基中加入质量浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL继续培养4小时，得到培养液；去除所述培养液中的上层清液后向得到的下层物质中加入150μL的DMSO，震荡5分钟，使用酶标仪测定其在450nm波长处的吸光度值，计算癌细胞的活性值；测试结果为，本发明提供的水凝胶与癌细胞共培养后癌细胞的活性值为30％～88％，治疗癌细胞效果好。

本发明以下实施例所用到的原料均为市售商品。

实施例1

将2g的葡聚糖和0.66g的高碘酸钠溶解在纯水中，室温、避光、搅拌的条件下进行18小时的反应，将得到的反应产物依次用丙酮沉降，分离沉降产物；再将所述沉降产物溶于水相中透析，将得到的透析产物冷冻干燥后得到改性葡聚糖。

对本发明实施例1制备得到的改性葡聚糖进行核磁共振检测，检测结果如图1所示，图1为本发明实施例1制备得到的改性葡聚糖的核磁共振氢谱图，由图1可知，本发明实施例1制备得到的改性葡聚糖具有式4所示的结构：

式4中，z为280～410，R为-H。

实施例2

按照实施例1所述的方法制备得到改性葡聚糖，与实施例1不同的是，采用1.9g的葡聚糖替换2g的葡聚糖，采用1.25g的高碘酸钠替换0.66g的高碘酸钠。

实施例3

按照实施例1所述的方法制备得到改性葡聚糖，与实施例1不同的是，采用1.5g的葡聚糖替换2g的葡聚糖，采用1.98g的高碘酸钠替换0.66g的高碘酸钠。

实施例4

将0.63g的胆固醇甲酰氯溶于20mL的干燥二氯甲烷中，得到胆固醇甲酰氯溶液；将1.13g的葡聚糖溶解在50mL的无水二甲基亚砜中，向所述葡聚糖溶液中加入0.38mL的三乙胺，得到混合溶液；将所述胆固醇甲酰氯溶液通过恒压漏斗缓慢逐滴加入到所述混合溶液中，在37℃恒温水浴持续搅拌12小时进行反应，得到橘红色反应溶液；将所述反应溶液用二氯甲烷沉降，将沉降后的产物分离，将分离后的产物真空干燥，得到反应产物；

将0.62g的上述反应产物均匀分散于水相中，向所述反应产物中加入0.82g的高碘酸钠进行18小时的氧化反应，将得到的氧化反应产物依次经过透析和冻干，得到改性葡聚糖。

对本发明实施例4制备得到的改性葡聚糖进行核磁共振检测，检测结果如图2所示，图2为本发明实施例4制备得到的改性葡聚糖的核磁共振氢谱图，由图2可知，本发明实施例4制备得到的改性葡聚糖具有式5所示的结构：

式5中，R为：

z为240～360。

实施例5

将128mg的实施例4制备得到的改性葡聚糖溶解于65mL的二甲基亚砜中，在40℃恒温水浴中搅拌12小时，得到混合溶液；将所述混合溶液逐滴加入到150mL的去离子水中，搅拌3小时并同时进行超声分散，将超声分散后的溶液移至透析袋中，在去离子水中进行3天的透析；将透析后的溶液通过0.45微米孔径的滤膜过滤，将过滤后得到的产物冷冻干燥，得到葡聚糖胶束。

实施例6

将5mg的实施例5制备得到的葡聚糖胶束与1mL的质量浓度为0.05％的白介素-2水溶液混合，在35℃的水浴中匀速搅拌12小时，得到混合溶液；将所述混合溶液依次进行超滤、分离和冻干，得到载药颗粒。

将本发明实施例6制备得到的载药颗粒放置于玻璃试管中，向所述玻璃试管中加入3mL的pH值为7.4的PBS，得到混合物，将所述混合物放置于37℃恒温振荡培养箱中，间隔1天从玻璃试管中取出1mL的混合物，同时向玻璃试管中补加入1mL的PBS。采用ELISA试剂盒对取出的混合物中的白介素-2的含量进行检测，从而计算出本发明实施例6制备得到的载药颗粒中的白介素-2的释放量；测试结果如图7所示，图7为本发明实施例6制备的载药颗粒的和实施例22制备得到的水凝胶中的药物在磷酸盐缓冲溶液中释放时间的数据图，其中曲线1为本发明实施例6制备的载药颗粒中白介素-2释放时间的数据图，由曲线1可知，本发明实施例6制备得到的载药颗粒中白介素-2十天释放了80％。

实施例7

按照实施例4所述的方法制备得到改性葡聚糖，与实施例4不同的是，采用0.76g的反应产物替换0.62g的反应产物；采用0.51g的高碘酸钠替换0.82g的高碘酸钠。

实施例8

将220mg的实施例7制备得到的改性葡聚糖溶解于115mL的二甲基亚砜中，在40℃恒温水浴中搅拌12小时，得到混合溶液；将所述混合溶液逐滴加入到240mL的去离子水中，搅拌3小时并同时进行超声分散，将超声分散后的溶液移至透析袋中，在去离子水中进行3天的透析；将透析后的溶液通过0.45微米孔径的滤膜过滤，将过滤后得到的产物冷冻干燥，得到葡聚糖胶束。

实施例9

按照实施例6所述的方法制备得到载药颗粒，与实施例6不同的是，采用实施例8制备得到的葡聚糖胶束替换实施例5制备得到的葡聚糖胶束。

实施例10

按照实施例4所述的方法制备得到改性葡聚糖，与实施例4不同的是，采用0.82g的反应产物替换0.62g的反应产物；采用0.27g的高碘酸钠替换0.82g的高碘酸钠。

实施例11

将138mg的实施例10制备得到的改性葡聚糖溶解于70mL的二甲基亚砜中，在40℃恒温水浴中搅拌12小时，得到混合溶液；将所述混合溶液逐滴加入到150mL的去离子水中，搅拌3小时并同时进行超声分散，将超声分散后的溶液移至透析袋中，在去离子水中进行3天的透析；将透析后的溶液通过0.45微米孔径的滤膜过滤，将过滤后得到的产物冷冻干燥，得到葡聚糖胶束。

实施例12

按照实施例6所述的方法制备得到载药颗粒，与实施例6不同的是，采用实施例11制备得到的葡聚糖胶束替换实施例5制备得到的葡聚糖胶束，采用干扰素-γ替换白介素-2。

将本发明实施例12制备得到的载药颗粒放置于玻璃试管中，向所述玻璃试管中加入3mL的pH值为7.4的PBS，得到混合物，将所述混合物放置于37℃恒温振荡培养箱中，间隔1天从玻璃试管中取出1mL的混合物，同时向玻璃试管中补加1mL的PBS。采用ELISA试剂盒对取出的混合物中的干扰素-γ的含量进行检测，从而计算出本发明实施例12制备得到的载药颗粒中的干扰素-γ的释放量；测试结果如图8所示，图8为本发明实施例12制备的载药颗粒的和实施例24制备得到的水凝胶中的药物在磷酸盐缓冲溶液中释放时间的数据图，其中曲线1为本发明实施例12制备的载药颗粒中干扰素-γ释放时间的数据图，由曲线1可知，本发明实施例12制备得到的载药颗粒中干扰素-γ十天释放了70％。

实施例13

按照实施例6所述的方法制备得到载药颗粒，与实施例6不同的是，采用1mL的质量浓度为0.025％的白介素-2和质量浓度为0.025％的干扰素-γ混合水溶液替换1mL的质量浓度为0.05％的白介素-2水溶液。

实施例14

将3g的壳聚糖加入到质量浓度为20％的氢氧化钠水溶液中，在室温下搅拌2小时后置于-18℃下冷冻12小时，得到中间产物；将所述中间产物室温解冻后，向所述中间产物中加入30mL的异丙醇作为反应介质，再向所述中间产物中加入30mL的环氧丙烷和1.2mL的质量浓度为25％的四甲基氢氧化铵水溶液，在60℃下回流搅拌8小时进行反应；将得到的反应产物用盐酸水溶液调节其pH至7.0，将调节pH值后的产物用乙醇沉降，将得到的沉降产物进行离心分离得到淡黄色固体，再将所述淡黄色固体用纯水溶解后透析2天，将透析后的产物冻干，得到改性壳聚糖。

对本发明实施例14制备得到的改性壳聚糖进行核磁共振检测，检测结果如图3所示，图3为本发明实施例14制备得到的改性壳聚糖的核磁共振氢谱图，由图3可知，本发明实施例14制备得到的改性壳聚糖具有式6所示的结构：

式6中，R₁为-H；

m+n为270～550。

实施例15

按照实施例14所述的方法制备得到改性壳聚糖，与实施例14不同的是，采用55mL的异丙醇替换30mL的异丙醇，采用88mL的环氧丙烷替换30mL的环氧丙烷，采用2mL的四甲基氢氧化铵溶液替换1.2mL的四甲基氢氧化铵溶液。

实施例16

按照实施例14所述的方法制备得到改性壳聚糖，与实施例14不同的是，采用2g的壳聚糖替换3g的壳聚糖，采用40mL的异丙醇替换30mL的异丙醇，采用20mL的环氧丙烷替换30mL的环氧丙烷，采用0.8mL的四甲基氢氧化铵溶液替换1.2mL的四甲基氢氧化铵溶液。

实施例17

将0.6g、数均分子量为10000的端氨基化的四臂-聚乙二醇与20mL的无水甲苯在130℃下共沸2小时除水，然后减压抽干其中的甲苯；将去除水分后的端氨基化的四臂-聚乙二醇和6.3g的γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐溶解于70mL干燥的氯仿中，在30℃油浴、氮气保护条件下搅拌反应3天；将得到的反应产物用乙醚沉降，将沉降后得到的产物溶解于氯仿后再次用乙醚沉降，将沉降后的产物抽滤、减压干燥后，得到中间反应物；将所述中间反应物和30mL的质量浓度为33％的酸性溶液进行去保护反应，得到聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶质为质量比为10:3三氟乙酸和氢溴酸，所述酸性溶液的溶剂为乙酸。

对本发明实施例17制备得到的聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物进行核磁共振检测，检测结果如图4所示，图4为本发明实施例17制备得到的聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物的核磁共振氢谱图，由图4可知，本发明实施例17制备得到的聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物包括式7所示的嵌段和式8所示的嵌段：

式7中，r为227；式8中，k为131。

实施例18

将0.9g、数均分子量为10000的端氨基化的四臂-聚乙二醇与50mL的无水甲苯在130℃下共沸2小时除水，然后减压抽干其中的甲苯；将去除水分后的端氨基化的四臂-聚乙二醇和6.3g的γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐溶解于50mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，在30℃油浴、氮气保护条件下搅拌反应3天；将得到的反应产物用乙醚沉降，将沉降后得到的产物溶解于氯仿后再次用乙醚沉降，将沉降后的产物抽滤、减压干燥后，得到中间反应物；将所述中间反应物和30mL的质量浓度为33％的酸性溶液进行去保护反应，得到聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶质为质量比为10:3三氟乙酸和氢溴酸，所述酸性溶液的溶剂为乙酸。

实施例19

将0.75g、数均分子量为10000的端氨基化的四臂-聚乙二醇与38mL的无水甲苯在130℃下共沸2小时除水，然后减压抽干其中的甲苯；将去除水分后的端氨基化的四臂-聚乙二醇和1.98g的γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐溶解于30mL干燥的氯仿中，在30℃油浴、氮气保护条件下搅拌反应3天；将得到的反应产物用乙醚沉降，将沉降后得到的产物溶解于氯仿后再次用乙醚沉降，将沉降后的产物抽滤、减压干燥后，得到中间反应物；将所述中间反应物和10mL的质量浓度为33％的酸性溶液进行去保护反应，得到聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶质为质量比为10:3三氟乙酸和氢溴酸，所述酸性溶液的溶剂为乙酸。

实施例20

将0.72g、数均分子量为10000的端氨基化的四臂-聚乙二醇与20mL的无水甲苯在130℃下共沸2小时除水，然后减压抽干其中的甲苯；将去除水分的端氨基化的四臂-聚乙二醇和4.42g的N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐溶解于50mL干燥的氯仿中，在30℃油浴、氮气保护条件下搅拌反应3天；将得到的反应产物减压抽干氯仿，将得到的产物溶解于氯仿中用乙醚进行沉降，将得到的沉降产物抽滤，减压干燥后，得到中间反应物；将所述中间反应物和20mL的质量浓度为33％的酸性溶液进行去保护反应，得到聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶质为质量比为10:3三氟乙酸和氢溴酸，所述酸性溶液的溶剂为乙酸。

对本发明实施例20制备得到的聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物进行核磁共振检测，检测结果如图5所示，图5为本发明实施例20制备得到的聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物的核磁共振氢谱图，由图5可知，本发明实施例20制备得到的聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物包括式9所示的嵌段和式10所示的嵌段：

式9中，t为227；式10中，L为113。

实施例21

将0.6g、数均分子量为10000的端氨基化的四臂-聚乙二醇与20mL的无水甲苯在130℃下共沸2小时除水，然后减压抽干其中的甲苯；将去除水分的端氨基化的四臂-聚乙二醇和3.68g的N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐溶解于50mL干燥的氯仿中，在30℃油浴、氮气保护条件下搅拌反应3天；将得到的反应产物减压抽干氯仿，将得到的产物溶解于氯仿中用乙醚进行沉降，将得到的沉降产物抽滤，减压干燥后，得到中间反应物；将所述中间反应物和10mL的质量浓度为33％的酸性溶液进行去保护反应，得到聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶质为质量比为10:3三氟乙酸和氢溴酸，所述酸性溶液的溶剂为乙酸。

实施例22

将1.5g、数均分子量为10000的端氨基化的四臂-聚乙二醇与40mL的无水甲苯在130℃下共沸2小时除水，然后减压抽干其中的甲苯；将去除水分的端氨基化的四臂-聚乙二醇和4.6g的N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐溶解于70mL干燥的氯仿中，在30℃油浴、氮气保护条件下搅拌反应3天；将得到的反应产物减压抽干氯仿，将得到的产物溶解于氯仿中用乙醚进行沉降，将得到的沉降产物抽滤，减压干燥后，得到中间反应物；将所述中间反应物和30mL的质量浓度为33％的酸性溶液进行去保护反应，得到聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶质为质量比为10:3三氟乙酸和氢溴酸，所述酸性溶液的溶剂为乙酸。

实施例23

将100mg实施例6制备得到的载药颗粒和320mg实施例17制备得到的聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物溶解在5mL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，得到第一溶液；将200mg实施例14制备得到的改性壳聚糖和372mg实施例20制备得到的聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物溶解在5mL的PBS中，得第二溶液。分别取0.15mL的第一溶液和0.15mL的第二溶液置于玻璃试管中，涡旋混合静置成胶，得到水凝胶。

测试本发明实施例23制备水凝胶的成胶时间，所述成胶时间为倒置上述玻璃试管，玻璃试管中的第一溶液和第二溶液的混合溶液在30秒内不流动的时间。测试结果为，本发明实施例23制备得到的水凝胶的成胶时间为45秒。

将本发明实施例23制备得到的水凝胶放置于玻璃试管中，向所述玻璃试管中加入3mL的pH值为7.4的PBS，得到混合物，将所述混合物放置于37℃恒温振荡培养箱中，间隔1天从玻璃试管中取出1mL的混合物，同时向玻璃试管中补加1mL的PBS。采用ELISA试剂盒对取出的混合物中的白介素-2的含量进行检测，从而计算出本发明实施例23制备得到的水凝胶中的白介素-2的释放量；测试结果如图7所示，图7中曲线2为本发明实施例23制备的水凝胶中白介素-2释放时间的数据图，由曲线2可知，本发明实施例23制备得到的水凝胶中白介素-2十天释放了60％。

将100μL本发明实施例23中的第一溶液和100μL本发明实施例23中的第二溶液在AntonMCR 301流变仪的载物台上混合，37℃下测试混合后的溶液储能模量的动态时间谱；载物台的平板直径为25mm，板间距为0.5mm；测试频率为1HZ，测试应变为10％；测试结果如图6所示，图6为本发明实施例23制备得到的水凝胶的储能模量动态时间谱图，由图6可知，本发明实施例23制备得到的水凝胶在20000秒时储能模量达到10⁴Pa，弹性强度较高。

将本发明实施例23制备得到的水凝胶分别置于三种肿瘤细胞系中培养，所述三种肿瘤细胞系分别为人肺癌细胞A549细胞系、人宫颈癌Hela细胞系和人乳腺癌MCF-7细胞系，培养方法为采用DMEM+10％FBS培养基，置于37℃，在质量浓度为5％的CO₂细胞培养箱中培养96小时后，向所述培养基中加入质量浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL继续培养4小时，得到培养液；去除所述培养液中的上层清液后向得到的下层物质中加入150μL的DMSO，震荡5分钟，使用酶标仪测定其在450nm波长处的吸光度值，计算癌细胞的活性值；将不含药物的水凝胶作为对照组，按照上述方法将不含药物的水凝胶和三种肿瘤细胞系进行培养，所述不含药物的水凝胶的制备方法为：

按照实施例23所述的方法制备水凝胶，与实施例23不同的是，采用实施例5制备得到的葡聚糖胶束替换实施例6制备得到的载药颗粒，即可制备得到不含药物的水凝胶。

测试结果如图9所示，图9为不含药物的水凝胶、本发明实施例23制备得到的水凝胶、本发明实施例24制备得到的水凝胶、本发明实施例25制备得到的水凝胶分别与癌细胞共培养后癌细胞的活性值，其中1为不含药物的水凝胶与癌细胞共培养后癌细胞的活性值，2为本发明实施例23制备得到的水凝胶与癌细胞共培养后癌细胞的活性值；由图9可知，不含药物的水凝胶与癌细胞共培养后A549癌细胞的活性值为90％，Hela癌细胞的活性值为95％，MCF-7癌细胞的活性值为92％；实施例23制备得到的水凝胶与癌细胞共培养后A549癌细胞的活性值为65％，Hela癌细胞的活性值为88％，MCF-7癌细胞的活性值为70％。

实施例24

按照实施例23所述的方法制备得到水凝胶，与实施例23不同的是，采用实施例12制备得到的载药颗粒替换实施例6制备得到的载药颗粒。

按照实施例23所述的方法，测试本发明实施例24制备得到的水凝胶中干扰素-γ的释放量；测试结果如图8所示，图8中曲线2为本发明实施例24制备的水凝胶中干扰素-γ释放时间的数据图，由曲线2可知，本发明实施例24制备得到的水凝胶中干扰素-γ十天释放了40％。

按照实施例23所述的方法测试本发明实施例24制备得到的水凝胶与癌细胞共培养后癌细胞的活性值；测试结果如图9所示，其中3为本发明实施例24制备得到的水凝胶与癌细胞共培养后癌细胞的活性值，由图9可知，实施例24制备得到的水凝胶与癌细胞共培养后A549癌细胞的活性值为50％，Hela癌细胞的活性值为68％，MCF-7癌细胞的活性值为60％。

实施例25

按照实施例23所述的方法制备得到水凝胶，与实施例23不同的是，采用实施例13制备得到的载药颗粒替换实施例6制备得到的载药颗粒。

按照实施例23所述的方法测试本发明实施例25制备得到的水凝胶与癌细胞共培养后癌细胞的活性值；测试结果如图9所示，其中4为本发明实施例25制备得到的水凝胶与癌细胞共培养后癌细胞的活性值，由图9可知，实施例25制备得到的水凝胶与癌细胞共培养后A549癌细胞的活性值为30％，Hela癌细胞的活性值为44％，MCF-7癌细胞的活性值为42％。

由以上实施例可知，本发明提供了一种水凝胶，由载药颗粒、具有式II所示结构的改性壳聚糖、包括式III和式IV所示结构嵌段的聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物、包括式V和式VI所示结构嵌段的聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物和溶剂制备得到；所述载药颗粒由具有式I所示结构的改性葡聚糖和药物制备得到。本发明提供的水凝胶是基于静电作用和席夫碱键交联的水凝胶，通过将物理静电作用和席夫碱键化学交联相结合，使本发明提供的水凝胶强度较高而且稳定性好，能够满足临床注射的要求，而且其中的载药颗粒作为化学交联剂，能够使水凝胶中药物缓慢释放，实现药物在病灶部位的靶向释放和富集，从而提高药物的治疗效果。本发明还提供了一种水凝胶的制备方法。

Claims (10)

1.一种水凝胶，由载药颗粒、改性壳聚糖、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物、聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物和溶剂制备得到；

所述载药颗粒由改性葡聚糖和药物制备得到，所述改性葡聚糖具有式I所示的结构：

式I中，z为50～600；R为-H或具有式1所示结构的基团：

所述改性壳聚糖具有式II所示的结构：

式II中，400≤(m+n)≤600；R₁为-H或具有式2所示结构的基团：

式2中，200≤h≤300；

所述聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物包括式III所示结构的嵌段和式IV所示结构的嵌段：

式III中，40≤r≤230；

式IV中，40≤k≤140；

所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物包括式V所示结构的嵌段和式VI所示结构的嵌段：

式V中，40≤t≤230；

式VI中，40≤L≤140。

2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述溶剂选自缓冲溶液、生理盐水或组织培养液。

3.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述载药颗粒在所述水凝胶中的质量含量为0.2％～1％。

4.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述改性壳聚糖在所述水凝胶中的质量含量为2％～4％。

5.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物在所述水凝胶中的质量含量为2％～3％。

6.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物在所述水凝胶中的质量含量为1.8％～3.8％。

7.一种水凝胶的制备方法，包括：

将载药颗粒、改性壳聚糖、聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物、聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物和溶剂混合，得到水凝胶；

所述载药颗粒由改性葡聚糖和药物制备得到，所述改性葡聚糖具有式I所示的结构：

式I中，z为50～600；R为-H或具有式1所示结构的基团：

所述改性壳聚糖具有式II所示的结构：

式II中，400≤(m+n)≤600；R₁为-H或具有式2所示结构的基团：

式2中，200≤h≤300；

所述聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物包括式III所示结构的嵌段和式IV所示结构的嵌段：

式III中，40≤r≤230；

式IV中，40≤k≤140；

所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物包括式V所示结构的嵌段和式VI所示结构的嵌段：

式V中，40≤t≤230；

式VI中，40≤L≤140。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述载药颗粒的制备方法为：

将葡聚糖胶束和药物溶液混合，得到混合溶液，所述葡聚糖胶束由具有式I所示结构的改性葡聚糖制备得到；

式I中，z为50～600；R为-H或具有式1所示结构的基团：

将所述混合溶液依次进行过滤和干燥，得到载药颗粒。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物的制备方法为：

将端氨基化四臂-聚乙二醇和γ-苯甲基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐在溶剂中进行聚合反应，得到聚合反应产物，所述端氨基化四臂-聚乙二醇具有式3所示的结构：

式3中，40≤u≤230；

将所述聚合反应产物与酸性溶液进行去保护反应，得到聚-γ-谷氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶剂为乙酸，所述酸性溶液的溶质为三氟乙酸和氢溴酸。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物的制备方法为：

将端氨基化四臂-聚乙二醇与N(ε)-苯甲氧羰基-L-赖氨酸-N-羧酸内酸酐在溶剂中进行聚合反应，得到聚合反应产物，所述端氨基化四臂-聚乙二醇具有式3所示的结构：

式3中，40≤u≤230；

将所述聚合反应产物与酸性溶液进行去保护反应，得到聚-L-赖氨酸星型嵌段共聚物；所述酸性溶液的溶剂为乙酸，所述酸性溶液的溶质为三氟乙酸和氢溴酸。