CN115216003B

CN115216003B - 一种星型季锍抗菌聚氨基酸材料及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115216003B
Application number: CN202211026429.9A
Authority: CN
Inventors: 杨华伟; 王晓丹; 栾世方; 许东华; 张旭; 闫秋燕; 王明哲
Original assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Current assignee: Changchun Institute of Applied Chemistry of CAS
Priority date: 2022-08-25
Filing date: 2022-08-25
Publication date: 2023-12-19
Anticipated expiration: 2042-08-25
Also published as: CN115216003A

Abstract

本发明提供了一种星型季锍抗菌聚氨基酸材料及其制备方法和应用。所述星型季锍抗菌聚氨基酸材料具有式Ⅰ所示结构，其以季锍阳离子基团作为主要抗菌基团，具有广谱、高活力、快速杀菌、高选择性等特点，且血液相容性良好，可用于预防及治疗细菌感染问题。所述抗菌材料由含有烷硫基团的α‑氨基酸‑N‑羧基酸酐(NCA)通过开环聚合及后续的一步季锍化反应制备得到。通过控制季锍基团的电荷及亲疏水平衡等参数，可以实现对其生物性能的调控。所述季锍抗菌材料制备方法简单，结构易于调控，抗菌性能优异，并且在高浓度条件下，仍能保持非常优异的血液相容性，具有很高的抗菌选择性。适用于细菌感染预防及治疗领域。

Description

一种星型季锍抗菌聚氨基酸材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医用材料技术领域，尤其涉及一种星型季锍抗菌聚氨基酸材料及其制备方法和应用。

背景技术

合成抗菌聚多肽是一类天然抗菌肽模拟物，不仅分子结构和功能易于调控，而且具有优异的广谱杀菌活性、良好的生物相容性和生物可降解性，同时不易诱导细菌耐药性，被广泛应用于抗感染研究。天然氨基酸及其衍生物为合成聚多肽提供了丰富的单体来源和侧链结构。便捷的α-氨基酸-N-羧基酸酐开环聚合(NCA-ROP)和丰富的化学修饰手段极大地促进了抗菌聚多肽的开发与应用。此外，聚多肽能够自发折叠成有序的二级结构，如α螺旋和β折叠，使其在材料结构、组装行为和生物应用层面有着独特的优势。然而，聚多肽在对细菌表现高杀灭活性的同时，往往伴随着较高的溶血作用，这也是限制聚多肽材料在临床应用的主要原因之一。因此，如何在提高聚多肽活性的同时，最大程度地降低其毒性成为目前抗菌肽药物开发的方向和难点。

申请号为CN 201910289123.4的专利申请公开了一种支化的抗菌聚赖氨酸，其内核为超支化聚乙烯亚胺(PEI)或树枝状聚赖氨酸，链段为聚合度为5～10的聚赖氨酸。该发明所提出的树枝状聚赖氨酸能够弥补上述聚氨基酸材料在应用时存在的抗菌活性较低、毒性大、溶血严重等问题，引起红细胞50％溶血的药物浓度(HC₅₀)大于4000μg/mL。然而该发明中所提出的星型聚赖氨酸内核制备复杂，且所得实施例对革兰氏阴性菌的杀菌效果不理想；另外，申请号为AU 2017051206及AU 2016904472的专利申请公开了一种星型结构的抗菌聚氨基酸，其内核为聚酰胺胺(PAMAM-NH₂)，支链结构为赖氨酸和缬氨酸两种单体无规共聚得到的多肽链段。该发明所提出的星型抗菌肽材料对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性及耐药性菌都具有很好的杀菌效果，而且在最小杀菌浓度(MBC)条件下，材料对H4IIE细胞具有较小毒性。然而，样品在较高浓度条件下，仍然对红细胞存在较大的毒性问题(Nat,Microbiol.,2016,1,16162)。此外，上述两种技术方案中所述的赖氨酸单体在反应过程中需要对氨基进行保护，反应结束后，聚合物需要在强酸性条件下对其进行脱保护。因此，探索制备简单、高效且同时具有高选择性的抗菌聚多肽仍然是当下的研究热点。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种星型季锍抗菌聚氨基酸材料及其制备方法和应用，具有广谱、高活性、快速杀菌的特点，且血液相容性良好。

为达到上述目的，本发明提供了一种星型季锍抗菌聚氨基酸材料，具有式Ⅰ所示结构：

其中，R₁选自-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH₂COOCH₂-、-CH₂CH₂COOCH₂-或-CH₂CH₂CH₂NHCOCH₂-；

R₂选自-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₂CH₃、-CH₂COOH或-CH₂CH₂COOH；

R₃选自碳原子数为1～10的烷基、碳原子数为2～10的烯基、碳原子数为2～10的炔基、环氧烷基、酰胺基烷基、N-烷基酰胺基烷基、N-烯基酰胺基烷基、N-炔基酰胺基烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、烷氧酰基烷基、芳氧酰基烷基、多聚乙二醇基烷基或酰基糖烷基；

n为重复单元。

R₃优选为碘甲烷、碘乙烷、碘丁烷、环氧氯丙烷、溴丙炔、溴乙酰胺、溴化苄、N-丙炔基溴乙酰胺、α-溴甲基对甲苯酰胺、溴乙酸甲酯、对硝基苯基碘乙酸酯、2-(溴甲基)吡啶盐酸盐、3-(溴甲基)吡啶盐酸盐、烯丙基碘、1-碘-2-(2-甲氧基乙氧基)乙烷、溴乙基-2-甲基-1，3-二氧戊环或1-碘-2-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)乙烷失去卤素原子后的残基。

本发明中，n优选为10～50。

本发明提供了上述星型季锍抗菌聚氨基酸材料的制备方法，包括以下步骤：

S1)采用Fuchs-Farthing方法将含有烷硫基的氨基酸进行环化，制备式A所示的氨基酸单体—α-氨基酸-N-羧基酸酐(NCA)；

S2)将上述α-氨基酸-N-羧基酸酐单体在引发剂的作用下进行聚合反应，得到式B所示的含有烷硫基团的聚氨基酸；

S3)将上述含有烷硫基团的聚氨基酸和季锍化试剂进行反应，得到式Ⅰ所示的星型季锍抗菌聚氨基酸；

n为重复单元。

上述制备方法的反应路线如下：

优选的，所述步骤S1)具体为：

将含有烷硫基的氨基酸和三光气在溶剂中进行环化反应。

所述含有烷硫基的氨基酸优选为α-甲硫氨酸单体、α-烷硫氨酸单体或侧链烷硫基取代的α-氨基酸单体。具体可以选自D,L-甲硫氨酸，即D,L-蛋氨酸。

所述氨基酸和三光气的摩尔比优选为1:(1.02～1.5)，更优选为1:(1.1～1.3)。

所述反应的溶剂优选为四氢呋喃。

所述氨基酸在四氢呋喃中的含量优选为2wt％～20wt％，更优选为2％～5％。

所述反应的温度优选为10～50℃，更优选为45～50℃。

所述反应的时间优选为10min～24h。

优选的，所述步骤S2)具体为：

将α-氨基酸-N-羧基酸酐单体溶解于溶剂中，加入引发剂进行聚合反应。

优选的，所述溶剂为四氢呋喃(THF)或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。

所述引发剂优选为聚酰胺胺(G_x-PAMAM，x＝0～6)、乙二胺(EDA)、四甲基乙二胺(TMEDA)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚丙烯亚胺(PPI)、二季戊四醇、三乙胺三胺(TREN)、聚赖氨酸(PL)、壳聚糖(CS)、溶菌酶中的一种或多种。

所述α-氨基酸-N-羧基酸酐单体在溶剂中的浓度优选为0.05～0.6M，更优选为0.1～0.4M，进一步优选为0.2M。

所述α-氨基酸-N-羧基酸酐单体和引发剂的摩尔比优选为5～100:1，更优选为10～50：1，进一步优选为15～30：1。

优选的，所述引发剂溶解于溶剂中加入。所述溶剂可以为四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺。所述引发剂的浓度优选为0.001～0.2M。

所述聚合反应的温度优选为10～30℃。

所述聚合反应的时间优选为20min～20h。

优选的，所得产物利用沉淀剂进行沉淀，离心收集沉淀，干燥后得到含有烷硫基团的聚氨基酸。

所述沉淀剂优选为水、乙醚、石油醚、甲醇中的一种或几种。

反应液与沉淀剂的体积比优选为1:(2～10)。

所述干燥可以为真空烘箱干燥。

上述干燥的温度优选为10～50℃。

所述干燥的时间优选为6～48h。

在本发明的一些具体实施例中，所述含有烷硫基团的聚氨基酸按照以下方法制备：

采用树枝状引发剂G_x-PAMAM(x＝0，1，2)引发D，L-Met-NCA进行聚合，反应方程式如图1所示。引发剂的结构式如图2所示，不同代数的G_x-PAMAM所含有的侧臂数目不同，G₀-PAMAM、G₁-PAMAM和G₂-PAMAM所含有侧臂数目分别为4、8和16。不同代数引发剂引发聚合得到的产物的空间位阻效应、电荷效应等均存在差异，都会对最终产物的生物性能产生影响。同时，多肽类抗菌材料的聚合度对其抗菌性能存在重要的影响，且考虑到天然抗菌肽的聚合度在十几到几十个氨基酸残基时，表现出最好的杀菌性能，优选的，本发明中的聚甲硫氨酸每条链的聚合度为10～50。

优选的，所述步骤S3)具体为：

将含有烷硫基团的聚氨基酸分散到溶剂中，加入季锍化试剂，进行反应。

所述溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺和水的混合溶液。

所述N,N-二甲基甲酰胺和水的体积比优选为1:1。

所述季锍化试剂为R₃X，X为卤素，优选为碘甲烷、碘乙烷、碘丁烷、环氧氯丙烷、溴丙炔、溴乙酰胺、溴化苄、N-丙炔基溴乙酰胺、α-溴甲基对甲苯酰胺、溴乙酸甲酯、对硝基苯基碘乙酸酯、2-(溴甲基)吡啶盐酸盐、3-(溴甲基)吡啶盐酸盐、烯丙基碘、1-碘-2-(2-甲氧基乙氧基)乙烷、溴乙基-2-甲基-1，3-二氧戊环或1-碘-2-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)乙烷。

所述含有烷硫基团的聚氨基酸中的季锍基团和季锍化试剂的摩尔比优选为1:(1～20)，更优选为1:(1～10)。

所述反应的温度优选为10～30℃。

所述反应的时间优选为1～48h。

优选的，反应结束后，将反应液直接转移到透析袋中进行透析处理，冻干后得到最终的季锍聚氨基酸抗菌材料。

优选的，所述透析具体为：

先用0.1M的NaCl水溶液透析一天，再用超纯水透析一天；透析袋的截留分子量(MWCO)根据产物的分子量进行选择。

在本发明的一些具体实施例中，所述步骤S3)具体为：

通过类似于“click”反应快速简单的实现甲硫基的烷基化。

称取含有烷硫基团的聚氨基酸，并将其分散到DMF和超纯水的混合溶剂(DMF:H₂O＝1:1(v/v))中，然后向体系中加入10倍甲硫基含量的季锍化试剂(如碘甲烷(CH₃I))，将反应在室温摇床反应，优选24h。停止反应，反应体系从浑浊变为略微粘稠的无色透明液体。将反应液转移到透析袋中，用0.1M的氯化钠水溶液透析一天，然后再用超纯水透析一天。将透析后的液体冷冻干燥，得到季锍化的聚甲硫氨酸产物。

实验结果表明，本发明提供的季锍抗菌材料的生物性能可以通过引发剂、聚合度等分子参数进行调节，优化的产物能够在保证高活力、快速杀菌的前提下，大大降低材料的毒性问题，实现高选择性杀菌。

本发明提供了上述星型季锍抗菌聚氨基酸材料或上述制备方法制备的星型季锍抗菌聚氨基酸材料作为抗菌材料的应用。

所述抗菌为抗革兰氏阳性菌和/或抗革兰氏阴性菌。

本发明还提供了一种抗菌医用材料，负载有上述星型季锍抗菌聚氨基酸材料或上述制备方法制备的星型季锍抗菌聚氨基酸材料。

与现有技术相比，本发明提供了一种星型季锍抗菌聚氨基酸材料，具有式Ⅰ所示结构。所述材料以季锍阳离子基团作为主要抗菌基团，具有高杀菌活性、低溶血性和高选择性，可解决现有抗菌聚氨基酸材料在使用过程中存在的细胞毒性大、选择性低、对革兰氏阴性菌杀菌速度慢等问题，可用于预防及治疗细菌感染问题。

本发明提供的技术方案获得了以下有益效果：

(1)本发明提供的上述星型季锍抗菌聚氨基酸材料具有广谱、高活力、快速杀菌、高选择性等特点，且血液相容性良好，其单体选择范围广，采用NCA开环技术方法可以精确、方便地对产物的分子量、分子构型及拓扑结构等进行调控；

(2)所述星型季锍抗菌聚氨基酸材料的生物活性可以通过多个方面进行调控，如氨基酸单体的选择、引发剂的选择、烷基化试剂的选择、产物的分子量及分子构型调节等；

(3)所得到的含有季锍基团的星型抗菌材料可以在保证高杀菌活性的同时，大大提高材料的血液相容性，即使是在高浓度条件下(10mg/mL)，材料的溶血率仍然可以满足医疗器械对材料溶血性能的要求(<5％)；

(4)制备方法简单，结构易于调控；使用过程便捷，可以作为抗菌药物直接使用或者负载到医用材料表面进行使用，使用范围广。

附图说明

图1为星型季锍抗菌聚氨基酸材料的合成路线图；

图2为星型引发剂PAMAM(x＝0，1，2)的结构式；

图3为D,L-Met-NCA的制备图片；

图4为D,L-Met-NCA的¹H-NMR谱图；

图5为G₂-PMet-10的¹H-NMR谱图；

图6为实施例1(G2-S-10⁺)的¹H-NMR谱图；

图7为G₂-PMet-25的¹H-NMR谱图；

图8为实施例2(G₂-S-25⁺)的¹H-NMR谱图；

图9为G₂-PMet-50的¹H-NMR谱图；

图10为实施例3(G₂-S-50⁺)的¹H-NMR谱图；

图11为G₀-PMet-25的¹H-NMR谱图；

图12为G₀-S-25⁺的¹H-NMR谱图

图13为G₁-PMet-25的¹H-NMR谱图；

图14为G₁-S-25⁺的¹H-NMR谱图；

图15为本发明中实施例1-7中样品的MIC测试结果；

图16为对比例1-3中样品的MIC测试结果；

图17为实施例1-3中样品对红细胞的溶血实验数据统计分析；

图18为实施例2、4、5中样品对红细胞的溶血实验数据统计分析；

图19为实施例2、6、7中样品对红细胞的溶血实验数据统计分析；

图20为对比例1-3中样品对红细胞的溶血实验数据统计分析；

图21为实施例2、4、5中样品对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的杀菌效率；

图22为实施例2、4、5中样品对大肠杆菌(E.coli)的杀菌效率；

图23为对比例1-3中样品对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的杀菌效率；

图24为对比例1-3中样品对大肠杆菌(E.coli)的杀菌效率。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面结合实施例对本发明提供的星型季锍抗菌聚氨基酸材料及其制备方法进行详细描述。应理解，下面所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，并不代表本发明的全部技术方案。基于本发明中的实施例，本领域中的技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，包括所作的任何修改、技术改进和替换等，均应在本发明的保护范围之内。

以下D，L-甲硫氨酸-N-羧基酸酐(D，L-Met-NCA)按照以下方法制备：

考虑到消旋的聚氨基酸材料具有更好的稳定性，本发明中选择D，L-甲硫氨酸作为初始原料。

称取10.0g(67.0mmol)的D，L-甲硫氨酸和7.2g(24.3mmol)三光气分散到200mL的THF溶剂中。在氮气保护下，将反应于50℃加热搅拌反应15min左右，待反应体系从悬浊液变为淡黄色澄清溶液时停止反应。在40℃旋蒸去除大部分溶剂并向瓶中加入100mL乙醚。超声溶解并过滤去除不溶物，用正己烷沉淀滤液得到黄色油状粗产物。将粗产物采用乙醚/正己烷重结晶三次得到亮白色针状结晶产物。

其制备过程的图片如图3所示。

其¹H-NMR谱图如图4所示。

实施例1

1、聚甲硫氨酸的制备

以G₂-PAMAM为引发剂，引发D,L-Met-NCA开环聚合得到每条链聚合度为10的聚合产物。

称取D,L-Met-NCA单体280.4mg(1.6mmol)溶解在8mL的无水THF溶剂中([M]₀＝0.2M)，并向体系中通氮气15min。然后，通过一次性注射器向体系中加入G₂-PAMAM(溶于1mL无水DMF，0.01mmol)引发剂，并于室温条件下搅拌反应。引发剂加入瞬间即可看到溶液从澄清状态变为乳液状，通过红外光谱(FTIR)监测单体转化情况。当位于1852cm^-1和1780cm^-1代表NCA单体的特征吸收峰消失时，说明单体完全反应，停止反应。随后，取100μL该反应液用含有0.05M LiBr的DMF溶液(400μL)稀释，用于GPC测试；剩余的反应液用超纯水进行沉淀，离心收集所得沉淀，并用超纯水清洗沉淀3次，冷冻干燥收集产物(G₂-PMet-10)。

其¹H-NMR谱图如图5所示。

2、季锍抗菌材料的制备

将聚甲硫氨酸(G₂-PMet-10)分散到DMF和超纯水混合溶剂(DMF:H₂O＝1:1(v/v))中，然后向体系中加入10倍甲硫基含量的碘甲烷(CH₃I)，将反应在室温摇床反应24h。停止反应，反应体系从浑浊变为略微粘稠的无色透明液体。将反应液转移到截留分子量(MWCO)为2000的透析袋中，用0.1M的氯化钠水溶液透析一天，然后再用超纯水透析一天。将透析后的液体冷冻干燥，得到季锍化的聚甲硫氨酸产物(G₂-S-10⁺)。

其¹H-NMR谱图如图6所示。

实施例2

1、聚甲硫氨酸的制备

以G₂-PAMAM为引发剂，引发D,L-Met-NCA开环聚合得到每条链聚合度为25的聚合产物。

称取D,L-Met-NCA单体280.4mg(1.6mmol)溶解在8mL的无水THF溶剂中([M]₀＝0.2M)，并向体系中通氮气15min。然后，通过一次性注射器向体系中加入G₂-PAMAM(溶于0.4mL无水DMF，0.004mmol)引发剂，并于室温条件下搅拌反应。引发剂加入瞬间即可看到溶液从澄清状态变为乳液状，通过红外光谱(FTIR)监测单体转化情况。当位于1852cm^-1和1780cm^-1代表NCA单体的特征吸收峰消失时，说明单体完全反应，停止反应。随后，取100μL该反应液用含有0.05M LiBr的DMF溶液(400μL)稀释，用于GPC测试；剩余的反应液用超纯水进行沉淀，离心收集所得沉淀，并用超纯水清洗沉淀3次，冷冻干燥收集产物(G₂-PMet-25)。

其¹H-NMR谱图如图7所示。

2、季锍抗菌材料的制备

将聚甲硫氨酸(G₂-PMet-25)分散到DMF和超纯水混合溶剂(DMF:H₂O＝1:1(v/v))中，然后向体系中加入10倍甲硫基含量的碘甲烷(CH₃I)，将反应在室温摇床反应24h。停止反应，反应体系从浑浊变为略微粘稠的无色透明液体。将反应液转移到截留分子量(MWCO)为2000的透析袋中，用0.1M的氯化钠水溶液透析一天，然后再用超纯水透析一天。将透析后的液体冷冻干燥，得到季锍化的聚甲硫氨酸产物(G₂-S-25⁺)。

其¹H-NMR谱图如图8所示。

实施例3

1、聚甲硫氨酸的制备

以G₂-PAMAM为引发剂，引发D,L-Met-NCA开环聚合得到每条链聚合度为50的聚合产物。

称取D,L-Met-NCA单体280.4mg(1.6mmol)溶解在8mL的无水THF溶剂中([M]₀＝0.2M)，并向体系中通氮气15min。然后，通过一次性注射器向体系中加入G₂-PAMAM(溶于0.2mL无水DMF，0.002mmol)引发剂，并于室温条件下搅拌反应。引发剂加入瞬间即可看到溶液从澄清状态变为乳液状，通过红外光谱(FTIR)监测单体转化情况。当位于1852cm^-1和1780cm^-1代表NCA单体的特征吸收峰消失时，说明单体完全反应，停止反应。随后，取100μL该反应液用含有0.05M LiBr的DMF溶液(400μL)稀释，用于GPC测试；剩余的反应液用超纯水进行沉淀，离心收集所得沉淀，并用超纯水清洗沉淀3次，冷冻干燥收集产物(G₂-PMet-50)。

其¹H-NMR谱图如图9所示。

2、季锍抗菌材料的制备

将聚甲硫氨酸(G₂-PMet-50)分散到DMF和超纯水混合溶剂(DMF:H₂O＝1:1(v/v))中，然后向体系中加入10倍甲硫基含量的碘甲烷(CH₃I)，将反应在室温摇床反应24h。停止反应，反应体系从浑浊变为略微粘稠的无色透明液体。将反应液转移到截留分子量(MWCO)为2000的透析袋中，用0.1M的氯化钠水溶液透析一天，然后再用超纯水透析一天。将透析后的液体冷冻干燥，得到季锍化的聚甲硫氨酸产物(G₂-S-50⁺)。

其¹H-NMR谱图如图10所示。

实施例4

1、聚甲硫氨酸的制备

以G₀-PAMAM为引发剂，引发D,L-Met-NCA开环聚合得到每条链聚合度为25的聚合产物。

称取D,L-Met-NCA单体280.4mg(1.6mmol)溶解在8mL的无水THF溶剂中([M]₀＝0.2M)，并向体系中通氮气15min。然后，通过一次性注射器向体系中加入G₂-PAMAM(溶于0.8mL无水DMF，0.008mmol)引发剂，并于室温条件下搅拌反应。引发剂加入瞬间即可看到溶液从澄清状态变为乳液状，通过红外光谱(FTIR)监测单体转化情况。当位于1852cm^-1和1780cm^-1代表NCA单体的特征吸收峰消失时，说明单体完全反应，停止反应。随后，取100μL该反应液用含有0.05M LiBr的DMF溶液(400μL)稀释，用于GPC测试；剩余的反应液用超纯水进行沉淀，离心收集所得沉淀，并用超纯水清洗沉淀3次，冷冻干燥收集产物(G₀-PMet-25)。

其¹H-NMR谱图如图11所示。

2、季锍抗菌材料的制备

将聚甲硫氨酸(G₀-PMet-25)分散到DMF和超纯水混合溶剂(DMF:H₂O＝1:1(v/v))中，然后向体系中加入10倍甲硫基含量的碘甲烷(CH₃I)，将反应在室温摇床反应24h。停止反应，反应体系从浑浊变为略微粘稠的无色透明液体。将反应液转移到截留分子量(MWCO)为2000的透析袋中，用0.1M的氯化钠水溶液透析一天，然后再用超纯水透析一天。将透析后的液体冷冻干燥，得到季锍化的聚甲硫氨酸产物(G₀-S-25⁺)。

其¹H-NMR谱图如图12所示。

实施例5

1、聚甲硫氨酸的制备

以G₁-PAMAM为引发剂，引发D,L-Met-NCA开环聚合得到每条链聚合度为50的聚合产物。

称取D,L-Met-NCA单体280.4mg(1.6mmol)溶解在8mL的无水THF溶剂中([M]₀＝0.2M)，并向体系中通氮气15min。然后，通过一次性注射器向体系中加入G₁-PAMAM(溶于0.4mL无水DMF，0.004mmol)引发剂，并于室温条件下搅拌反应。引发剂加入瞬间即可看到溶液从澄清状态变为乳液状，通过红外光谱(FTIR)监测单体转化情况。当位于1852cm^-1和1780cm^-1代表NCA单体的特征吸收峰消失时，说明单体完全反应，停止反应。随后，取100μL该反应液用含有0.05M LiBr的DMF溶液(400μL)稀释，用于GPC测试；剩余的反应液用超纯水进行沉淀，离心收集所得沉淀，并用超纯水清洗沉淀3次，冷冻干燥收集产物(G₁-PMet-25)。

其¹H-NMR谱图如图13所示。

2、季锍抗菌材料的制备

将聚甲硫氨酸(G₁-PMet₂₅)分散到DMF和超纯水混合溶剂(DMF:H₂O＝1:1(v/v))中，然后向体系中加入10倍甲硫基含量的碘甲烷(CH₃I)，将反应在室温摇床反应24h。停止反应，反应体系从浑浊变为略微粘稠的无色透明液体。将反应液转移到截留分子量(MWCO)为2000的透析袋中，用0.1M的氯化钠水溶液透析一天，然后再用超纯水透析一天。将透析后的液体冷冻干燥，得到季锍化的聚甲硫氨酸产物(G₁-S-25⁺)。

其¹H-NMR谱图如图14所示.

实施例6

1、聚甲硫氨酸的制备

称取D,L-Met-NCA单体280.4mg(1.6mmol)溶解在8mL的无水THF溶剂中([M]₀＝0.2M)，并向体系中通氮气15min。然后，通过一次性注射器向体系中加入G₂-PAMAM(溶于0.2mL无水DMF，0.002mmol)引发剂，并于室温条件下搅拌反应。引发剂加入瞬间即可看到溶液从澄清状态变为乳液状，通过红外光谱(FTIR)监测单体转化情况。当位于1852cm^-1和1780cm^-1代表NCA单体的特征吸收峰消失时，说明单体完全反应，停止反应。随后，取100μL该反应液用含有0.05M LiBr的DMF溶液(400μL)稀释，用于GPC测试；剩余的反应液用超纯水进行沉淀，离心收集所得沉淀，并用超纯水清洗沉淀3次，冷冻干燥收集产物(G₂-PMet-25)。

2、季锍抗菌材料的制备

将聚甲硫氨酸(G₂-PMet-25)分散到DMF和超纯水混合溶剂(DMF:H₂O＝1:1(v/v))中，然后向体系中加入10倍甲硫基含量的碘丁烷(C₄H₉I)，将反应在室温摇床反应24h。停止反应，反应体系从浑浊变为略微粘稠的无色透明液体。将反应液转移到截留分子量(MWCO)为2000的透析袋中，用0.1M的氯化钠水溶液透析一天，然后再用超纯水透析一天。将透析后的液体冷冻干燥，得到季锍化的聚甲硫氨酸产物(G₂-S₄-25⁺)。

实施例7

1、聚甲硫氨酸的制备

以G₂-PAMAM为引发剂，引发D,L-Met-NCA开环聚合得到每条链聚合度为25的聚合产物。称取D，L-Met-NCA单体280.4mg(1.6mmol)溶解在8mL的无水THF溶剂中([M]₀＝0.2M)，并向体系中通氮气15min。然后，通过一次性注射器向体系中加入G₂-PAMAM(溶于0.2mL无水DMF，0.002mmol)引发剂，并于室温条件下搅拌反应。引发剂加入瞬间即可看到溶液从澄清状态变为乳液状，通过红外光谱(FTIR)监测单体转化情况。当位于1852cm^-1和1780cm^-1代表NCA单体的特征吸收峰消失时，说明单体完全反应，停止反应。随后，取100μL该反应液用含有0.05M LiBr的DMF溶液(400μL)稀释，用于GPC测试；剩余的反应液用超纯水进行沉淀，离心收集所得沉淀，并用超纯水清洗沉淀3次，冷冻干燥收集产物(G₂-PMet-25)。

2、季锍抗菌材料的制备

将聚甲硫氨酸(G₂-PMet-25)分散到DMF和超纯水混合溶剂(DMF:H₂O＝1:1(v/v))中，然后向体系中加入10倍甲硫基含量的碘代正庚烷(C₈H₁₇I)，将反应在室温摇床反应24h。停止反应，反应体系从浑浊变为略微粘稠的无色透明液体。将反应液转移到截留分子量(MWCO)为2000的透析袋中，用0.1M的氯化钠水溶液透析一天，然后再用超纯水透析一天。将透析后的液体冷冻干燥，得到季锍化的聚甲硫氨酸产物(G₂-S₈-25⁺)。

对比例1

1、赖氨酸单体的制备

N-ε-叔丁氧基羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐(Boc-L-Lys-NCA)与D,L-甲硫氨酸(D，L-Met-NCA)的合成方法类似。具体步骤如下：

称取10.0g(40.6mmol)白色粉末状N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(H-Lys(Boc)-OH)加入到圆底烧瓶中，加入约180mL的四氢呋喃(THF，分子筛预干燥2天)，加热至50℃，开通磁力搅拌使H-Lys(Boc)-OH在溶剂中分散均匀。随后称取4.4g(14.9mmol)三光气溶解于20mL的THF中，并滴加到上述烧瓶中。50℃搅拌反应约10min时，反应体系从悬浊液变澄清，此时停止加热，待体系稍微冷却，旋蒸去除溶剂得到粗产物，粗产物使用乙酸乙酯/正己烷重结晶三次，得到白色细粉状纯产物。

2、含伯胺基团星型抗菌聚氨基酸的制备

以G₂-PAMAM为引发剂，引发L-Lys-NCA开环聚合得到每条链聚合度为25的聚合产物。控制Boc-L-Lys-NCA的加入量为2mmol，首先将NCA单体溶解在10mL的无水THF溶液中([M]₀＝0.2M)，然后将溶解在无水DMF中的引发剂(初级胺的含量为0.08mmol)用注射器一次性加入到单体溶液中，室温搅拌反应。借助红外监测单体转化情况。当位于1852cm^-1和1780cm^-1代表NCA单体的特征吸收峰消失时，说明单体完全反应，停止反应。反应液用冰乙醚沉淀，离心收集，真空干燥后得到Boc保护的聚多肽。称取200mg的Boc保护的聚多肽溶解在4mL的三氟乙酸(TFA)中，室温搅拌反应12h，然后将反应液直接转移至透析袋中，星型聚多肽采用截留分子量MWCO＝8000-12000的透析袋进行透析，样品用超纯水透析三天之后，冷冻干燥得到侧链伯胺阳离子为杀菌基团的聚氨基酸产物(G₂-PK-25⁺)。

对比例2

1、赖氨酸单体和苯丙氨酸的制备

N-ε-叔丁氧基羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐(Boc-L-Lys-NCA)与D,L-甲硫氨酸(D，L-Met-NCA)的方法类似。具体步骤如下：

2、含伯胺基团线性抗菌聚氨基酸的制备

以正己胺为引发剂，引发L-Lys-NCA开环聚合得到每条链聚合度为25的聚合产物。首先将摩尔量为2mmol的NCA单体溶解在10mL的无水THF溶液中([M]₀＝0.2M)，然后将溶解在无水DMF中的引发剂(初级胺含量为0.08mmol)用注射器一次性加入到单体溶液中，室温搅拌反应。借助红外监测单体转化情况。当位于1852cm^-1和1780cm^-1代表NCA单体的特征吸收峰消失时，说明单体完全反应，停止反应。反应液用冰乙醚沉淀，离心收集，真空干燥后得到Boc保护的聚多肽。称取200mg的Boc保护的聚多肽溶解在4mL的三氟乙酸(TFA)中，室温搅拌反应12h，然后将反应液直接转移至透析袋中，星型聚多肽采用截留分子量MWCO＝3500的透析袋进行透析，样品用超纯水透析三天之后，冷冻干燥得到侧链伯胺阳离子为杀菌基团的聚氨基酸产物(LPK-25⁺)。

对比例3

1、赖氨酸单体和苯丙氨酸的制备

N-ε-叔丁氧基羰基-L-赖氨酸N-羧酸酐(Boc-L-Lys-NCA)和D-苯丙氨酸N-羧酸酐(D-Phe-NCA)与D,L-甲硫氨酸(D,L-Met-NCA)的方法类似。具体步骤如下：

Boc-L-Lys-NCA：称取10.0g(40.6mmol)白色粉末状N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(H-Lys(Boc)-OH)加入到圆底烧瓶中，加入约180mL的四氢呋喃(THF，分子筛预干燥2天)，加热至50℃，开通磁力搅拌使H-Lys(Boc)-OH在溶剂中分散均匀。随后称取4.4g(14.9mmol)三光气溶解于20mL的THF中，并滴加到上述烧瓶中。50℃搅拌反应约10min时，反应体系从悬浊液变澄清，此时停止加热，待体系稍微冷却，旋蒸去除溶剂得到粗产物，粗产物使用乙酸乙酯/正己烷重结晶三次，得到白色细粉状纯产物。

D-Phe-NCA：与Boc-L-Lys-NCA的合成方法类似。称取10.0g(60.5mmol)的白色粉末状D-Phe原料分散在THF(180mL)中，加热反应至50℃。然后称取6.60g(22.2mmol)三光气溶解在20mL的THF中，并滴加到上述反应瓶中，50℃加热搅拌大约60min，反应体系从悬浊液变为澄清溶液，说明反应完成。旋蒸去除溶剂得到粗产物，利用乙酸乙酯/正己烷重结晶三次，得到白色细粉末状纯产物。

2、含伯胺基团抗菌聚氨基酸的制备

以G₂-PAMAM为引发剂，引发L-Lys-NCA和D-Phe-NCA开环聚合得到每条链聚合度为25的聚合产物。控制两种单体的总加入量为2mmol，其中赖氨酸与苯丙氨酸的摩尔比为7:3。首先将NCA单体溶解在10mL的无水THF溶液中([M]₀＝0.2M)，然后将溶解在无水DMF中的引发剂(初级胺的含量为0.08mmol)用注射器一次性加入到单体溶液中，室温搅拌反应。借助红外监测单体转化情况。当位于1852cm^-1和1780cm^-1代表NCA单体的特征吸收峰消失时，说明单体完全反应，停止反应。反应液用冰乙醚沉淀，离心收集，真空干燥后得到Boc保护的聚多肽。称取200mg的Boc保护的聚多肽溶解在4mL的三氟乙酸(TFA)中，室温搅拌反应12h，然后将反应液直接转移至透析袋中，星型聚多肽采用截留分子量MWCO＝8000-12000的透析袋进行透析，样品用超纯水透析三天之后，冷冻干燥得到侧链伯胺阳离子为杀菌基团的聚氨基酸产物(G₂-PK₇F₃-25⁺)。

本发明所涉及的相关测试方法详情如下：

1)体外抗菌实验

通过最小抑菌浓度(MIC)进行评定上述样品对革兰氏阳性菌—S.aureus和革兰氏阴性菌—E.coli的杀菌活性。MIC定义为药物抑制细菌生长的最低浓度，随着细菌的增殖，培养液的浊度逐渐增加，细菌的数量与光密度值(OD)成正比，通过检测培养液的OD即可对细菌的生长状态进行评估。具体测试过程如下：在96孔板中加入100μL不同浓度(1μg/mL到1000μg/mL)的聚多肽溶液，再加入100μL浓度为10⁶CFU/mL的处于对数生长期的细菌悬液，将孔板放到37℃培养箱中培养，于不同培养时间点，用酶标仪测试溶液在600nm处的OD值。同时以100μL的PBS缓冲溶液加100μL的10⁶CFU/mL菌液作为对照。

2)杀菌效率实验

通过琼脂板计数实验评价上述样品在溶液中的杀菌效率。取浓度为10⁶CFU/mL的菌液与相同体积且浓度分别为MIC、2×MIC和4×MIC的样品溶液混合，在37℃摇床中(120r/min)培养。不同时间节点时，取10μL混合液滴加到LB琼脂板上，放到培养箱中培养18h-24h后，进行计数并计算细菌活力。同时以10⁶CFU/mL的菌液与相同体积的PBS混合液作为对照，每个样品至少取5个重复点。

3)体外溶血实验

根据GB/T16886《医疗器械生物学评价》中对溶血实验的要求，选择新鲜兔血作为实验红细胞来源。将新鲜兔血在1000r/min条件下离心10min，收集下层红细胞(RBC)，用生理盐水清洗2-3次，并稀释到浓度为5.0vol％的RBC悬液。将实施例1-7和对比例1-3溶解在生理盐水中，配制得到不同浓度的溶液。在1.5mL微量离心管中加入300μL待测样品溶液和300μL的5.0vol％的RBC悬液，将两者混匀后在37℃孵育1h。然后，将离心管在3000r/min下离心5min，并将管中上层液体(100μL×4)转移到96孔板中，使用酶标仪测量其在540nm处的吸光度。300μL生理盐水加300μL的5.0vol％的RBC悬液作阴性对照，300μL超纯水加300μL的5.0vol％的RBC悬液作阳性对照。每个样品平行测试四次，结果取平均值。溶血率按照下式进行计算：

实施例1-7和对比例1-3中材料的最小抑菌浓度测试结果和溶血实验结果如附图15-20所示，表1是对上述结果的汇总分析。

如表1所示，实施例1-7中样品的MIC值与对比例1-3中样品的最小抑菌浓度(MIC)比较接近，说明两种聚氨基酸的抑菌活性相差不大。综合溶血实验结果进行分析，对比例1-3中含有伯胺抗菌基团的聚氨基酸的HC₁₀与其MIC接近，选择性为0.5～2之间，说明其较差的抗菌选择性。相比之下，实施例1-7中的季锍聚氨基酸的HC₁₀要远高于其MIC值，选择性在52～1250之间，具有很高的抗菌选择性。对于不同聚合度的季锍产物(附图17，实施例1-3)，随着聚合度的增加，材料的抗菌性增强，同时溶血率下降；对于不同侧链数目的季锍产物(附图18，实施例2、4、5)，随着引发剂代数(侧链数目)增加，材料的抗菌性能没有明显变化，不过其溶血率呈现下降的趋势，说明其对红细胞的毒性有所下降。对于不同烷基链取代的季锍材料(附图19，实施例2、6、7)，随着侧链烷基链长度增加，材料的溶血率呈现显著上升的趋势，然而其抗菌性能并没有明显变化，说明随着侧链疏水性的增加，材料对红细胞的毒性显著增强。综合来讲，甲基取代的季锍产物性能最好，其选择性要高于其他烷基链取代的季锍产物。

表1实施例1-7及对比例1-3中的样品的MICs、溶血率及选择性

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注：HC10表示引起10％溶血时，样品的浓度，以HC10/MIC作为衡量样品抗菌选择性的标准。

根据MIC及溶血实验的结果表明，甲基取代的季锍产物的性能最好，而且在聚合度为25时，材料具有最优的抗菌和溶血性能。因此，本发明后续进一步探究了实施例2、4、5中样品对典型的革兰氏阳性菌(S.aureus)和革兰氏阴性菌(E.coli)的杀菌效率，并与对比例1-3中的样品进行对比。实验结果如附图21-24所示。

如图21、22所示，实施例2、4、5对两种细菌都具有快速的杀菌特点，其中4倍MIC的实施例2在2min和5min时，对S.aureus和E.coli均达到了90％的杀菌率。相比于革兰氏阳性菌而言，由革兰氏阴性菌引起的感染被认为是一个更严重的医疗保健问题，且针对革兰氏阴性耐药菌，相应的药物开发明显滞后。造成这种局面的主要原因是革兰氏阴性菌存在高度不可渗透的外膜屏障，因此存在额外的防御机制。而本发明所提出的季锍材料不仅具有快速杀革兰氏阳性菌特点，而且还可以在短时间内快速有效地杀死革兰氏阴性菌。其中，4倍MIC浓度的实施例2在5min内和10min内可分别杀死>99％和>99.9％的E.coli。然而，对比例1-3中的材料需要3～6h才能达到与实施例2、4、5中所述材料相同的杀菌效果(图22)，而且其对革兰氏阳性S.aureus的杀菌速率也略低于实施例2、4、5。对于不同侧臂数目的季锍材料，随着侧臂数目的增加，材料的杀菌效率呈现逐渐增强的现象，即杀菌效率：实施例2>实施例4>实施例5。如浓度为MIC的实施例2在5min时可杀死99.3％的E.coli，而在相同条件下，实施例4和实施例5只达到了80.1％和74.1％的杀菌率；对比不同浓度条件对同一样品的杀菌效率的影响，可得出样品的杀菌速率随浓度的增大逐渐增强，如浓度为MIC、2倍MIC和4倍MIC的实施例2，在5min时，分别杀死94.7％、97.8％和99.4％的E.coli。分析对比例1-3中的材料对细菌的杀菌效率时，星型结构的聚多肽材料比线性材料具有更快的杀菌速度。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种星型季锍抗菌聚氨基酸材料，具有式Ⅰ所示结构：

n为重复单元。

2.根据权利要求1所述的星型季锍抗菌聚氨基酸材料，其特征在于，所述R₃选自碘甲烷、碘乙烷、碘丁烷、环氧氯丙烷、溴丙炔、溴乙酰胺、溴化苄、N-丙炔基溴乙酰胺、α-溴甲基对甲苯酰胺、溴乙酸甲酯、对硝基苯基碘乙酸酯、2-(溴甲基)吡啶盐酸盐、3-(溴甲基)吡啶盐酸盐、烯丙基碘、1-碘-2-(2-甲氧基乙氧基)乙烷、溴乙基-2-甲基-1，3-二氧戊环或1-碘-2-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)乙烷失去卤素原子后的残基。

3.权利要求1～2任一项所述的星型季锍抗菌聚氨基酸材料的制备方法，包括以下步骤：

S1)采用Fuchs-Farthing方法将含有烷硫基的氨基酸进行环化，制备式A所示的氨基酸单体—α-氨基酸-N-羧基酸酐；

n为重复单元。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1)具体为：

将含有烷硫基的氨基酸和三光气在溶剂中进行反应；

所述含有烷硫基的氨基酸选自α-甲硫氨酸单体、α-烷硫氨酸单体或侧链烷硫基取代的α-氨基酸单体；

所述氨基酸和三光气的摩尔比为1:(1.02～1.5)；

所述溶剂为四氢呋喃；

所述氨基酸在四氢呋喃中的含量为2wt％～20wt％；

所述反应的温度为10～50℃；

所述反应的时间为10min～24h。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2)具体为：

将α-氨基酸-N-羧基酸酐单体溶解于溶剂中，加入引发剂进行聚合反应；

所述溶剂为四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺；

所述引发剂选自聚酰胺胺、乙二胺、四甲基乙二胺、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、二季戊四醇、三乙胺三胺、聚赖氨酸、壳聚糖、溶菌酶中的一种或多种；

所述α-氨基酸-N-羧基酸酐单体在溶剂中的浓度为0.05～0.6M；

所述α-氨基酸-N-羧基酸酐单体和引发剂的摩尔比为5～100:1；

所述聚合反应的温度为10～30℃；

所述聚合反应的时间为20min～20h。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3)具体为：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺和水的混合溶液；

所述季锍化试剂选自碘甲烷、碘乙烷、碘丁烷、环氧氯丙烷、溴丙炔、溴乙酰胺、溴化苄、N-丙炔基溴乙酰胺、α-溴甲基对甲苯酰胺、溴乙酸甲酯、对硝基苯基碘乙酸酯、2-(溴甲基)吡啶盐酸盐、3-(溴甲基)吡啶盐酸盐、烯丙基碘、1-碘-2-(2-甲氧基乙氧基)乙烷、溴乙基-2-甲基-1，3-二氧戊环或1-碘-2-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃葡萄糖基)乙烷；

所述含有烷硫基团的聚氨基酸中的季锍基团和季锍化试剂的摩尔比为1:(1～20)；

所述反应的温度为10～30℃；

所述反应的时间为1～48h。

8.权利要求1～2任一项所述的星型季锍抗菌聚氨基酸材料作为抗菌材料的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗菌为抗革兰氏阳性菌和/或抗革兰氏阴性菌。

10.一种抗菌医用材料，其特征在于，负载有权利要求1～2任一项所述的星型季锍抗菌聚氨基酸材料。