CN109485770B - 亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物的制备方法，以将单体D型或者L型亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，以二硫代苯甲酸‑4‑氰基戊酸为链转移剂，偶氮二异丁腈为引发剂进行可逆加成‑断裂链转移聚合；本发明的聚合物表现出优异的抗菌性能，能够明显的破坏细菌膜结构引起细菌的死亡；溶血实验和体外平滑肌细胞相容性实验表明其保持显著的生物相容性。

Description

亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物的制备方法
本申请是母案申请“亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物及制备方法和在抗菌中的应用”的分案申请，母案申请的申请号为2016110011213，申请日为2016年11月14日。
技术领域
本发明属于生物医用高分子材料领域，涉及新型仿抗菌肽聚合物的设计合成方法，具体涉及一种阳离子手性氨基酸甲基丙烯酸酯聚合物的制备及其抗菌应用。
背景技术
目前，抗生素耐药菌的出现已经给公共健康卫生带来了极大的威胁，细菌的粘附、增殖和形成的生物膜会导致患者感染并引发一系列并发症甚至危及患者生命。尽管可替代的新型抗菌聚合物的研究已经取得一定进展，但是其在生物医用和临床应用上仍然存在极大的挑战。可替代的新型抗菌聚合物不仅要具有高效的抗菌性能，同时不能影响到机体组织正常的生理作用，简单来说即能够选择性的杀灭细菌而对正常的哺乳动物细胞无毒性。因此，兼具高效抗菌活性与选择性的抗菌聚合物仍然有待研究。
发明内容
本发明的目的是制备一种基于手性氨基酸的阳离子型聚甲基丙烯酸酯聚合物，并研究其在抗菌方面的应用，以克服现有抗菌聚合物抗菌活性较弱、生物相容性较差的缺点。
本发明采用了以下技术方案：
L-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物，即P(L-Leu-HEMA)，以单体D-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，分子式示意结构如下：
Figure BDA0001832311510000011
n为聚合度，聚合物的数均分子量为10-23kDa，分子量分布系数为1.10-1.25。
上述均聚物的制备方法，将单体L-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，以二硫代苯甲酸-4-氰基戊酸为链转移剂，偶氮二异丁腈为引发剂进行RAFT聚合，单体L-亮氨酸甲基丙烯酸酯、链转移剂和引发剂的投料摩尔比为(45—60)：1：0.2，优选(50—60)：1：0.2。
在上述技术方案中，在惰性气体(氮气、氦气或者氩气)保护下进行，反应温度为60—80摄氏度，反应时间为6-10小时，溶剂N，N-二甲基甲酰胺提供反应氛围和环境。
在上述技术方案中，单体L-亮氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步骤进行制备：将L-亮氨酸和甲基丙烯酸羟乙酯以4-二甲氨基吡啶为催化剂，N,N’-二环己基碳二亚胺为脱水缩合剂，以二氯甲烷为溶剂在冰水浴中反应30-60分钟，再于室温20—25摄氏度下搅拌反应24-48小时，其中L-亮氨酸、4-二甲氨基吡啶、N,N’-二环己基碳二亚胺和甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，L-亮氨酸为叔丁氧羰基保护的L-亮氨酸。
在上述技术方案中，制备的均聚物在三氟乙酸作用下进行脱保护，优选将均聚物溶于二氯甲烷中，在三氟乙酸作用下，于20—25摄氏度下进行脱保护反应2—4小时，纯化后溶解透析，冷冻干燥即可。
由于采用三氟乙酸作用，脱保护反应后的聚合物中带有三氟乙酸集团，由于Leu的等电点为pH 6.01，Lys的等电点为pH 9.60，调节pH为7.2时，leu的-NH3 +发生去质子化，生成-NH2，如下化学式所示：
Figure BDA0001832311510000021
D-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物，即P(D-Leu-HEMA)，以单体D-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，分子式示意结构如下，n为聚合度，聚合物的数均分子量为10-23kDa，分子量分布系数为1.10-1.25。
Figure BDA0001832311510000031
上述均聚物的制备方法，将单体D-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，以二硫代苯甲酸-4-氰基戊酸为链转移剂，偶氮二异丁腈为引发剂进行RAFT聚合，单体D-亮氨酸甲基丙烯酸酯、链转移剂和引发剂的投料摩尔比为(45—60)：1：0.2，优选(50—60)：1：0.2。
在上述技术方案中，在惰性气体(氮气、氦气或者氩气)保护下进行，反应温度为60—80摄氏度，反应时间为6-10小时，溶剂N，N-二甲基甲酰胺提供反应氛围和环境。
在上述技术方案中，单体D-亮氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步骤进行制备：将D-亮氨酸和甲基丙烯酸羟乙酯以4-二甲氨基吡啶为催化剂，N,N’-二环己基碳二亚胺为脱水缩合剂，以二氯甲烷为溶剂在冰水浴中反应30-60分钟，再于室温20—25摄氏度下搅拌反应24-48小时，其中D-亮氨酸、4-二甲氨基吡啶、N,N’-二环己基碳二亚胺和甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，D-亮氨酸为叔丁氧羰基保护的D-亮氨酸。
在上述技术方案中，制备的均聚物在三氟乙酸作用下进行脱保护，优选将均聚物溶于二氯甲烷中，在三氟乙酸作用下，于20—25摄氏度下进行脱保护反应2—4小时，纯化后溶解透析，冷冻干燥即可。
由于采用三氟乙酸作用，脱保护反应后的聚合物中带有三氟乙酸集团，由于Leu的等电点为pH 6.01，Lys的等电点为pH 9.60，调节pH为7.2时，leu的-NH3 +发生去质子化，生成-NH2，如下化学式所示：
Figure BDA0001832311510000041
L-赖氨酸甲基丙烯酸酯均聚物，即P(L-Lys-HEMA)，以单体L-赖氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，分子式示意结构如下，n为聚合度，聚合物的数均分子量为10-23kDa，分子量分布系数为1.10-1.25。
Figure BDA0001832311510000042
上述均聚物的制备方法，将单体L-赖氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，以二硫代苯甲酸-4-氰基戊酸为链转移剂，偶氮二异丁腈为引发剂进行RAFT聚合，单体L-赖氨酸甲基丙烯酸酯、链转移剂和引发剂的投料摩尔比为(45—60)：1：0.2，优选(50—60)：1：0.2。
在上述技术方案中，在惰性气体(氮气、氦气或者氩气)保护下进行，反应温度为60—80摄氏度，反应时间为6-10小时，溶剂N，N-二甲基甲酰胺提供反应氛围和环境。
在上述技术方案中，单体L-赖氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步骤进行制备：将L-赖氨酸和甲基丙烯酸羟乙酯以4-二甲氨基吡啶为催化剂，N,N’-二环己基碳二亚胺为脱水缩合剂，以二氯甲烷为溶剂在冰水浴中反应30-60分钟，再于室温20—25摄氏度下搅拌反应24-48小时，其中L-赖氨酸、4-二甲氨基吡啶、N,N’-二环己基碳二亚胺和甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，L-赖氨酸为叔丁氧羰基保护的L-赖氨酸。
在上述技术方案中，制备的均聚物在三氟乙酸作用下进行脱保护，优选将均聚物溶于二氯甲烷中，在三氟乙酸作用下，于20—25摄氏度下进行脱保护反应2—4小时，纯化后溶解透析，冷冻干燥即可。
由于采用三氟乙酸作用，脱保护反应后的聚合物中带有三氟乙酸集团，调节pH为7.2，lys不受影响，如下化学式所示：
Figure BDA0001832311510000051
D-赖氨酸甲基丙烯酸酯均聚物，即P(D-Leu-HEMA)，以单体D-赖氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，分子式示意结构如下，n为聚合度，聚合物的数均分子量为10-23kDa，分子量分布系数为1.10-1.25。
Figure BDA0001832311510000052
上述均聚物的制备方法，将单体D-赖氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，以二硫代苯甲酸-4-氰基戊酸为链转移剂，偶氮二异丁腈为引发剂进行RAFT聚合，单体D-赖氨酸甲基丙烯酸酯、链转移剂和引发剂的投料摩尔比为(45—60)：1：0.2，优选(50—60)：1：0.2。
在上述技术方案中，在惰性气体(氮气、氦气或者氩气)保护下进行，反应温度为60—80摄氏度，反应时间为6-10小时，溶剂N，N-二甲基甲酰胺提供反应氛围和环境。
在上述技术方案中，单体D-赖氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步骤进行制备：将D-赖氨酸和甲基丙烯酸羟乙酯以4-二甲氨基吡啶为催化剂，N,N’-二环己基碳二亚胺为脱水缩合剂，以二氯甲烷为溶剂在冰水浴中反应30-60分钟，再于室温20—25摄氏度下搅拌反应24-48小时，其中D-赖氨酸、4-二甲氨基吡啶、N,N’-二环己基碳二亚胺和甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，D-赖氨酸为叔丁氧羰基保护的D-赖氨酸。
在上述技术方案中，制备的均聚物在三氟乙酸作用下进行脱保护，优选将均聚物溶于二氯甲烷中，在三氟乙酸作用下，于20—25摄氏度下进行脱保护反应2—4小时，纯化后溶解透析，冷冻干燥即可。
由于采用三氟乙酸作用，脱保护反应后的聚合物中带有三氟乙酸集团，调节pH为7.2，lys不受影响，如下化学式所示：
Figure BDA0001832311510000061
D-阳离子手性氨基酸甲基丙烯酸酯共聚物，以单体D-赖氨酸甲基丙烯酸酯和D-亮氨酸甲基丙烯酸酯进行嵌段共聚制备，分子式示意结构如下，n，m为各自单体的聚合度，m/n为(0.8—1.2)，优选两种单体的聚合度一致m＝n，聚合物的数均分子量为10-23kDa，分子量分布系数为1.10-1.25。
Figure BDA0001832311510000071
上述共聚物的制备方法，按照下述步骤进行制备：
步骤1.将第一D型氨基酸单体进行均聚，以二硫代苯甲酸-4-氰基戊酸为链转移剂，偶氮二异丁腈为引发剂进行RAFT聚合以得到D构型氨基酸单体聚合物，所述第一D型氨基酸单体、链转移剂和引发剂的投料摩尔比为(45—60)：1：0.2，优选(50—60)：1：0.2；
步骤2，步骤1制备的D构型氨基酸单体聚合物大分子链转移剂，偶氮二异丁腈为引发剂，加入第二D型氨基酸单体进行RAFT聚合以得到D-赖氨酸甲基丙烯酸酯和D-亮氨酸甲基丙烯酸酯嵌段共聚物，第二D型氨基酸单体、大分子链转移剂和引发剂的投料摩尔比为(80—100)：1：0.2，优选(85—90)：1：0.2。
在上述技术方案中，在步骤1中，在惰性气体(氮气、氦气或者氩气)保护下进行，反应温度为60—80摄氏度，反应时间为6-10小时，溶剂N，N-二甲基甲酰胺提供反应氛围和环境。
在上述技术方案中，在步骤2中，在惰性气体(氮气、氦气或者氩气)保护下进行，反应温度为60—80摄氏度，反应时间为6-10小时，溶剂N，N-二甲基甲酰胺提供反应氛围和环境。
在上述技术方案中，单体D-赖氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步骤进行制备：将D-赖氨酸和甲基丙烯酸羟乙酯以4-二甲氨基吡啶为催化剂，N,N’-二环己基碳二亚胺为脱水缩合剂，以二氯甲烷为溶剂在冰水浴中反应30-60分钟，再于室温20—25摄氏度下搅拌反应24-48小时，其中D-赖氨酸、4-二甲氨基吡啶、N,N’-二环己基碳二亚胺和甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，D-赖氨酸为叔丁氧羰基保护的D-赖氨酸。
在上述技术方案中，单体D-亮氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步骤进行制备：将D-亮氨酸和甲基丙烯酸羟乙酯以4-二甲氨基吡啶为催化剂，N,N’-二环己基碳二亚胺为脱水缩合剂，以二氯甲烷为溶剂在冰水浴中反应30-60分钟，再于室温20—25摄氏度下搅拌反应24-48小时，其中D-亮氨酸、4-二甲氨基吡啶、N,N’-二环己基碳二亚胺和甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，D-亮氨酸为叔丁氧羰基保护的D-亮氨酸。
在上述技术方案中，制备的共聚物在三氟乙酸作用下进行脱保护，优选将共聚物溶于二氯甲烷中，在三氟乙酸作用下，于20—25摄氏度下进行脱保护反应2—4小时，纯化后溶解透析，冷冻干燥即可。
由于采用三氟乙酸作用，脱保护反应后的聚合物中带有三氟乙酸集团，由于Leu的等电点为pH 6.01，Lys的等电点为pH 9.60，调节pH为7.2时，leu的-NH3 +发生去质子化，生成-NH2，调节pH为7.2，lys不受影响，如下化学式所示：
Figure BDA0001832311510000081
L-阳离子手性氨基酸甲基丙烯酸酯共聚物，以单体L-赖氨酸甲基丙烯酸酯和L-亮氨酸甲基丙烯酸酯进行嵌段共聚制备，分子式示意结构如下，n，m为各自单体的聚合度，m/n为(0.8—1.2)，优选两种单体的聚合度一致m＝n，聚合物的数均分子量为10-23kDa，分子量分布系数为1.10-1.25。
Figure BDA0001832311510000091
上述共聚物的制备方法，按照下述步骤进行制备：
步骤1.将第一L型氨基酸单体进行均聚，以二硫代苯甲酸-4-氰基戊酸为链转移剂，偶氮二异丁腈为引发剂进行RAFT聚合以得到D构型氨基酸单体聚合物，所述第一L型氨基酸单体、链转移剂和引发剂的投料摩尔比为(45—60)：1：0.2，优选(50—60)：1：0.2；
步骤2，步骤1制备的L构型氨基酸单体聚合物大分子链转移剂，偶氮二异丁腈为引发剂，加入第二L型氨基酸单体进行RAFT聚合以得到L-赖氨酸甲基丙烯酸酯和L-亮氨酸甲基丙烯酸酯嵌段共聚物，第二L型氨基酸单体、大分子链转移剂和引发剂的投料摩尔比为(80—100)：1：0.2，优选(85—90)：1：0.2。
在上述技术方案中，在步骤1中，在惰性气体(氮气、氦气或者氩气)保护下进行，反应温度为60—80摄氏度，反应时间为6-10小时，溶剂N，N-二甲基甲酰胺提供反应氛围和环境。
在上述技术方案中，在步骤2中，在惰性气体(氮气、氦气或者氩气)保护下进行，反应温度为60—80摄氏度，反应时间为6-10小时，溶剂N，N-二甲基甲酰胺提供反应氛围和环境。
在上述技术方案中，单体L-赖氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步骤进行制备：将L-赖氨酸和甲基丙烯酸羟乙酯以4-二甲氨基吡啶为催化剂，N,N’-二环己基碳二亚胺为脱水缩合剂，以二氯甲烷为溶剂在冰水浴中反应30-60分钟，再于室温20—25摄氏度下搅拌反应24-48小时，其中L-赖氨酸、4-二甲氨基吡啶、N,N’-二环己基碳二亚胺和甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，L-赖氨酸为叔丁氧羰基保护的L-赖氨酸。
在上述技术方案中，单体L-亮氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步骤进行制备：将L-亮氨酸和甲基丙烯酸羟乙酯以4-二甲氨基吡啶为催化剂，N,N’-二环己基碳二亚胺为脱水缩合剂，以二氯甲烷为溶剂在冰水浴中反应30-60分钟，再于室温20—25摄氏度下搅拌反应24-48小时，其中L-亮氨酸、4-二甲氨基吡啶、N,N’-二环己基碳二亚胺和甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，L-亮氨酸为叔丁氧羰基保护的L-亮氨酸。
在上述技术方案中，制备的共聚物在三氟乙酸作用下进行脱保护，优选将共聚物溶于二氯甲烷中，在三氟乙酸作用下，于20—25摄氏度下进行脱保护反应2—4小时，纯化后溶解透析，冷冻干燥即可。
由于采用三氟乙酸作用，脱保护反应后的聚合物中带有三氟乙酸集团，由于Leu的等电点为pH 6.01，Lys的等电点为pH 9.60，调节pH为7.2时，leu的-NH3 +发生去质子化，生成-NH2，调节pH为7.2，lys不受影响，如下化学式所示：
Figure BDA0001832311510000101
本发明提供一种调控共聚物整体构型的方法，即采用D构型和L构型的单体进行共聚，通过D型/L型单体的投料比例，变更两者之间的摩尔比，以使共聚物表现为D型或者L型，即可控活性聚合在调控亮氨酸—赖氨酸甲基丙烯酸酯共聚物手性中的应用。
利用可逆加成-断裂链转移聚合方法通过D型/L型单体的投料比例，变更两者之间的摩尔比，以使共聚物表现为D型或者L型，即通过D型和L型单体的投料比例，变更共聚物中D型单体和L型单体之间的摩尔比，以使共聚物整体表现为D型或者L型。
就上述四种单体而言，均聚得到的聚合物表现出与相应单体一致的D和L构型，两个L型单体共聚得到的共聚物表现为L型，两个D型单体共聚得到的共聚物表现为D型，共聚物采用D型和L型单体进行共聚，调整D型单体和L型单体的相对数量，即可实现共聚物整体构型表现的可调控。
在本发明技术方案中，采用活性聚合可实现添加物料(即单体摩尔比例)的控制，反应条件温和，合成单体产率为70％-85％，聚合反应转化率为50％-90％，均聚物和共聚物的分子量可控且分布系数较窄。
本发明公布了基于手性氨基酸甲基丙烯酸酯聚合物及其制备方法和抗菌应用。圆二色光谱表征结果证明上述制得L构型和D构型聚合物具有相反的二级螺旋结构。微稀释法抗菌实验研究表明，上述所得透析冻干后基于手性氨基酸的甲基丙烯酸酯聚合物的最低抑菌浓度(MIC)为100～1000μg·mL-1，表现出优异的抗菌性能，场发射扫描电镜结果图直观的展现出本发明制得的抗菌聚合物能够明显的破坏细菌膜结构引起细菌的死亡；溶血实验和体外平滑肌细胞相容性实验表明，本发明制备的阳离子手性氨基酸甲基丙烯酸酯抗菌聚合物在抗菌所需浓度下仍可以保持显著的生物相容性，其中溶血率低于10％，平滑肌细胞活性可达到80％以上。
附图说明
图1是本发明中可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)的聚合机理示意图。
图2是本发明中单体D-Leu(Boc)-HEMA在CDCl3中的1H-NMR谱图。
图3是本发明中单体D-Lys(Boc)-HEMA在CDCl3中的1H-NMR谱图。
图4是本发明中未脱保护的P(D-Leu(Boc)-HEMA)均聚物(1)，P(D-Lys(Boc)-HEMA)均聚物(2)和P(D-Leu(Boc)-HEMA)-b-P(D-Lys(Boc)-HEMA)嵌段共聚物(3)在CDCl3中的1H-NMR谱图。
图5是本发明中脱保护后P(D-Leu-HEMA)均聚物(1)，P(D-Lys-HEMA)均聚物均聚物(2)和P(D-Leu-HEMA)-b-P(D-Lys-HEMA)嵌段共聚物均聚物(3)在D2O中的1H-NMR谱图。
图6是本发明中均聚物和共聚物的圆二色谱表征结果图。
图7是本发明中聚合物抗菌实验的扫描电镜照片。
图8是本发明中聚合物针对大肠杆菌的抗菌实验效果曲线图(1)。
图9是本发明中聚合物针对金黄色葡萄球菌的抗菌实验效果曲线图(1)。
图10是本发明聚合物P(L-Leu-HEMA)的体外生物相容性表征图。
图11是本发明聚合物P(D-Leu-HEMA)的体外生物相容性表征图。
图12是本发明聚合物P(D-Leu-HEMA-b-D-Lys-HEMA)的体外生物相容性表征图。
图13是本发明聚合物P(L-Leu-HEMA-b-L-Lys-HEMA)的体外生物相容性表征图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例使用的实验原料和仪器分别如下表所示：
(1)实验原料
Figure BDA0001832311510000121
Figure BDA0001832311510000131
(2)实验仪器
Figure BDA0001832311510000132
在本发明实施例中使用可逆加成-断裂链转移聚合，RAFT聚合是一种活性/可控自由基聚合，适用含有双键官能团的单体。RAFT聚合中，传统引发剂受热分解成初级自由基I·，并引发单体聚合成增长自由基Pn ·，增长自由基与链转移剂中的C＝S键进行可逆加成形成中间体休眠种，休眠种中S-R键断裂，形成新的活性种自由基Rn ·，再引发单体聚合，反应机理如下图1所示。与传统自由基聚合不同，RAFT聚合链转移为可逆过程，中间体休眠种和生长链自由基之间进行可逆加成和可逆断裂的平衡反应，从而确保所有的链以同等几率生长，形成窄分布的聚合物，体系中自由基浓度维持在一个相对恒定的较低水平，抑制体系中自由基的双基终止反应，使得聚合活性可控。在本发明中使用引发剂引发第一单体，在以第一单体和链转移剂进行活性聚合，在加入第二单体时，补充引发剂以引发第二单体，以活性聚合得到的第一单体均聚物为大分子链转移剂进行第二单体的活性聚合。
实施例1—制备单体D-亮氨酸甲基丙烯酸羟乙酯、L-亮氨酸甲基丙烯酸羟乙酯、D-赖氨酸甲基丙烯酸羟乙酯和L-赖氨酸甲基丙烯酸羟乙酯
首先向干燥的双颈圆底烧瓶中加入溶于22mL干燥二氯甲烷的手性氨基酸单体5g(分别为D-亮氨酸、L-亮氨酸、D-赖氨酸和L-赖氨酸，为确保反应中官能团的活性，选择叔丁氧羰基Boc保护的上述四种氨基酸，在反应之后利用三氟乙酸脱去Boc保护基)，在磁力搅拌下通氮气净化，随后加入溶于1.5mL干燥二氯甲烷的催化剂DMAP 0.24g,将反应瓶置于冰水浴中，逐滴缓慢加入溶于20mL干燥二氯甲烷的脱水缩合剂DCC 4.53g,并在氮气保护下在20min内加入2.86g HEMA。在冰水浴下反应30min，随后氮气氛围下在室温20—25摄氏度下继续反应36h。反应结束后抽滤除去白色沉淀，得到的有机混合溶液用70mL蒸馏水和100mL二氯甲烷萃取四次，得到的有机层进一步依次用60mL0.1mol/L盐酸溶液萃取两次，60mL饱和碳酸氢钠溶液和60mL饱和氯化钠溶液洗涤两次。最后用无水硫酸钠干燥，搅拌过夜，过滤后，旋蒸除去溶剂。
利用核磁共振对制备的四种单体进行表征，结果如附图2和3所示，鉴于四种单体的化学组成分为两种(即亮氨酸甲基丙烯酸羟乙酯和赖氨酸甲基丙烯酸羟乙酯)，化学构型分为D和L，同一个化学组成的不同构型的核磁谱图基本一致，如两张附图所示可知，核磁共振的化学位移对应化学式中标记的不同化学环境的氢原子，恰恰证明四种单体成功制备。
实施例2—以实施例1制备的四种单体为原料，使用可逆加成-断裂链转移聚合制备四种均聚物
采用RAFT聚合方法制备阳离子手性氨基酸甲基丙烯酸羟乙酯均聚物：在带有磁力搅拌子的25mL Schlenk瓶中，加入1.5g实施例1制得的单体、CPADB 24.4mg、AIBN 2.86mg和1.5g无水DMF溶剂，经过三次冻-抽-融循环除去反应体系中的杂质气体后，置于70℃的油浴锅中，在氮气保护下反应10小时。反应完成后，暴露在空气中并置于冰水浴中快速冷却终止反应，再用丙酮/正己烷反复沉淀5次。将得到的产物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h，得到每种均聚物的样品。冰水浴条件下，按照每1g样品加入20mL二氯甲烷与10mL三氟乙酸的比例，加入到反应瓶中，然后在室温反应3h，旋蒸以脱除溶剂。将所得产物滴加入无水乙醚，反复沉淀三次。将得到的产物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h。将纯化后的产物溶于去离子水中，透析72h除去残留的杂质，冷冻干燥后得到纯净的海绵状固体样品。
利用核磁共振对制备的四种均聚物进行表征，结果如附图4和5所示，同理基于亮氨酸甲基丙烯酸羟乙酯和赖氨酸甲基丙烯酸羟乙酯的两种聚合物存在化学构型的不同(D型和L型)，同一个化学组成的不同构型的核磁谱图基本一致，如两张附图所示可知，核磁共振的化学位移对应化学式中标记的不同化学环境的氢原子，恰恰证明四种均聚物成功制备，且在脱保护之后整体聚合物不产生变化。
实施例3—制备D-阳离子手性氨基酸甲基丙烯酸羟乙酯共聚物
(1)采用实施例2的方法首先制备D—亮氨酸的均聚物：在带有磁力搅拌子的25mLSchlenk瓶中，加入1.5g实施例1制备的单体D—亮氨酸甲基丙烯酸羟乙酯、CPADB 24.4mg、AIBN 2.86mg和1.5g无水DMF溶剂，经过三次冻-抽-融循环除去反应体系中的杂质气体后，置于70℃的油浴锅中，在氮气保护下反应10小时，待反应基本结束后，不进行暴露空气的终止反应，而是保持D—亮氨酸均聚物末端的活性基团(CPADB)作为加入第二单体进行反应的大分子链转移剂；
(2)在反应容器中，加入3g相同构型的赖氨酸甲基丙烯酸酯单体(即D—赖氨酸甲基丙烯酸羟乙酯)，AIBN 2.15mg和和3g无水DMF溶剂，与之前制备的大分子链转移剂0.96g进行反应，经过三次冻-抽-融循环除去反应体系中的杂质气体后，置于70℃的油浴锅中，在氮气保护下反应6小时，经多次沉淀纯化后将得到的产物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h；
(3)在冰水浴条件下，按照每1g样品(即上述步骤2得到的样品)加入20mL二氯甲烷与10mL三氟乙酸的比例，加入到反应瓶中，然后在室温反应3h，旋蒸以脱除溶剂。将所得产物滴加入无水乙醚，反复沉淀三次。将得到的产物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h。将纯化后的产物溶于去离子水中，透析72h除去残留的杂质，冷冻干燥后得到纯净的海绵状固体样品。得到D构型的阳离子手性氨基酸甲基丙烯酸羟乙酯共聚物。
利用核磁共振对制备的D构型的阳离子手性氨基酸甲基丙烯酸羟乙酯共聚物进行表征，如附图4和5所示，核磁共振的化学位移对应化学式中标记的不同化学环境的氢原子，恰恰证明共聚物成功制备，且在脱保护之后整体聚合物不产生变化。
实施例4—制备L-阳离子手性氨基酸甲基丙烯酸酯共聚物
(1)采用实施例2的方法首先制备L—亮氨酸的均聚物：在带有磁力搅拌子的25mLSchlenk瓶中，加入1.5g实施例1制备的单体L—亮氨酸甲基丙烯酸羟乙酯、CPADB 24.4mg、AIBN 2.86mg和1.5g无水DMF溶剂，经过三次冻-抽-融循环除去反应体系中的杂质气体后，置于70℃的油浴锅中，在氮气保护下反应10小时，待反应基本结束后，不进行暴露空气的终止反应，而是保持L—亮氨酸均聚物末端的活性基团(CPADB)作为加入第二单体进行反应的大分子链转移剂；
(2)在反应容器中，加入3g相同构型的赖氨酸甲基丙烯酸酯单体(即L—赖氨酸甲基丙烯酸羟乙酯)，AIBN 2.15mg和和3g无水DMF溶剂，与之前制备的大分子链转移剂0.96g进行反应，经过三次冻-抽-融循环除去反应体系中的杂质气体后，置于70℃的油浴锅中，在氮气保护下反应6小时，经多次沉淀纯化后将得到的产物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h；
(3)在冰水浴条件下，按照每1g样品(即上述步骤2得到的样品)加入20mL二氯甲烷与10mL三氟乙酸的比例，加入到反应瓶中，然后在室温反应3h，旋蒸以脱除溶剂。将所得产物滴加入无水乙醚，反复沉淀三次。将得到的产物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h。将纯化后的产物溶于去离子水中，透析72h除去残留的杂质，冷冻干燥后得到纯净的海绵状固体样品。得到L构型的阳离子手性氨基酸甲基丙烯酸羟乙酯共聚物。
利用核磁共振对制备的共聚物进行表征，与实施例3制备的D构型的阳离子手性氨基酸甲基丙烯酸羟乙酯共聚物相比，仅仅在构型存在不同(L型)，氢原子的化学环境基本一致，即D型和L型的化学位移基本一致，结果如附图4和5所示，核磁共振的化学位移对应化学式中标记的不同化学环境的氢原子，恰恰证明共聚物成功制备，且在脱保护之后整体聚合物不产生变化。
实施例5—制备D-赖氨酸/L-亮氨酸甲基丙烯酸酯共聚物
(1)采用实施例2的方法首先制备L—亮氨酸的均聚物：在带有磁力搅拌子的25mLSchlenk瓶中，加入1.5g实施例1制备的单体L—亮氨酸甲基丙烯酸羟乙酯、CPADB 24.4mg、AIBN 2.86mg和1.5g无水DMF溶剂，经过三次冻-抽-融循环除去反应体系中的杂质气体后，置于70℃的油浴锅中，在氮气保护下反应10小时，待反应基本结束后，不进行暴露空气的终止反应，而是保持L—亮氨酸均聚物末端的活性基团(CPADB)作为加入第二单体进行反应的大分子链转移剂；
(2)在反应容器中，加入3g不同构型的赖氨酸甲基丙烯酸酯单体(即D—赖氨酸甲基丙烯酸羟乙酯)，AIBN 2.15mg和和3g无水DMF溶剂，与之前制备的大分子链转移剂0.96g进行反应，经过三次冻-抽-融循环除去反应体系中的杂质气体后，置于70℃的油浴锅中，在氮气保护下反应6小时，经多次沉淀纯化后将得到的产物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h；
(3)在冰水浴条件下，按照每1g样品(即上述步骤2得到的样品)加入20mL二氯甲烷与10mL三氟乙酸的比例，加入到反应瓶中，然后在室温反应3h，旋蒸以脱除溶剂。将所得产物滴加入无水乙醚，反复沉淀三次。将得到的产物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h。将纯化后的产物溶于去离子水中，透析72h除去残留的杂质，冷冻干燥后得到纯净的海绵状固体样品，得到D-赖氨酸/L-亮氨酸甲基丙烯酸酯共聚物。
实施例6—制备D-亮氨酸/L-赖氨酸甲基丙烯酸酯共聚物
(1)采用实施例2的方法首先制备D—亮氨酸的均聚物：在带有磁力搅拌子的25mLSchlenk瓶中，加入1.5g实施例1制备的单体D—亮氨酸甲基丙烯酸羟乙酯、CPADB 24.4mg、AIBN 2.86mg和1.5g无水DMF溶剂，经过三次冻-抽-融循环除去反应体系中的杂质气体后，置于70℃的油浴锅中，在氮气保护下反应10小时，待反应基本结束后，不进行暴露空气的终止反应，而是保持D—亮氨酸均聚物末端的活性基团(CPADB)作为加入第二单体进行反应的大分子链转移剂；
(2)在反应容器中，加入3g不同构型的赖氨酸甲基丙烯酸酯单体(即L—赖氨酸甲基丙烯酸羟乙酯)，AIBN 2.15mg和和3g无水DMF溶剂，与之前制备的大分子链转移剂0.96g进行反应，经过三次冻-抽-融循环除去反应体系中的杂质气体后，置于70℃的油浴锅中，在氮气保护下反应6小时，经多次沉淀纯化后将得到的产物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h；
(3)在冰水浴条件下，按照每1g样品(即上述步骤2得到的样品)加入20mL二氯甲烷与10mL三氟乙酸的比例，加入到反应瓶中，然后在室温反应3h，旋蒸以脱除溶剂。将所得产物滴加入无水乙醚，反复沉淀三次。将得到的产物置于30℃的真空干燥箱中干燥8h。将纯化后的产物溶于去离子水中，透析72h除去残留的杂质，冷冻干燥后得到纯净的海绵状固体样品。得到D-亮氨酸/L-赖氨酸甲基丙烯酸酯共聚物。
由四种单体均聚得到的聚合物表现出与相应单体一致的D和L构型，两个L型单体共聚得到的共聚物表现为L型，两个D型单体共聚得到的共聚物表现为D型，实施例5和6制备的共聚物采用D型和L型单体进行共聚，可通过D型/L型单体的投料比例，变更两者之间的摩尔比，以使共聚物表现为D型或者L型，即利用可逆加成-断裂链转移聚合方法通过D型和L型单体的投料比例，变更共聚物中D型单体和L型单体之间的摩尔比，以使共聚物整体表现为D型或者L型。
实施例7—均聚物、共聚物性质测试
如图6所示，将制备的D构型和L构型聚合物进行圆二色谱测试，在相同的波长范围内出现向上的波峰和向下的波谷，向上波峰对应的聚合物为L构型，向下波谷对应的聚合物为D构型，表现出完全相反的螺旋构象。
微稀释法抗菌实验参考文献：P.Li,C.C.Zhou,S.Rayatpisheh,K.Ye,Y.F.Poon,P.T.Hammond,H.W.Duan,M.B.Chan-Park,Adv.Mater.,2012,24,4130-4137；体外人主动脉平滑肌细胞相容性实验参考文献：S.E.Exley,L.C.Paslay,G.S.Sahukhal,B.A.Abel,T.D.Brown,C.L.McCormick,S.Heinhorst,V.Koul,V.Choudhary,M.O.Elasri,S.E.Morgan,Biomacromolecules,2015,16,3845-3852；溶血实验参考文献：A.Pascual,J.P.K.Tan,A.Yuen,J.M.W.Chan,D.J.Coady,D.Mecerreyes,J.L.Hedrick,Y.Y.Yang,H.Sardon,Biomacromolecules,2015,16,1169-1178。
选择金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌代表，大肠杆菌为革兰氏阴性菌代表，首先将细菌菌株过夜培养达到生长中期，用PBS缓冲液稀释到每毫升3×108个菌落形成单位(CFU)，其次将高分子溶液(制备的聚合物的水溶液)用无菌液体培养基二倍稀释，取100μL稀释好的细菌悬液，加入到96孔板中100μL的高分子溶液中，得到抗菌聚合物的最终浓度为2-4096μg·mL-1。随后将96孔板置于37℃培养18h，使用酶标仪测试微孔在600nm处的吸光度值。将200μL不含抗菌聚合物的细菌细胞培养液作为阳性对照组，200μL纯的培养液为阴性对照组。每次实验均设置4-6个平行样品。同时设置一系列浓度聚合物溶液的对照组以排除聚合物溶液对实验组吸光度值的影响。随后，用2.5％体积百分数的戊二醛磷酸盐缓冲液将经过100μL致死剂量的聚合物溶液培养接触3h的细菌在室温下(20—25摄氏度)固定4h，并用PBS缓冲液漂洗两次，然后经过梯度浓度的乙醇溶液依次脱水15min，在1000rpm下离心10min，将其均匀涂布在硅片上，自然风干，喷金50s，在场发射扫描电子显微镜下观察细菌表面破坏形貌。
如附图7所示，从场发射扫描电镜结果图直观的展现出本发明制得的抗菌聚合物能够明显的破坏细菌膜结构引起细菌的死亡，且依据上述实施例制备的聚合物表现出与基本一致的性能。如附图8和9所示，P(D-Leu-HEMA)均聚物、P(D-Lys-HEMA)均聚物和P(D-Leu-HEMA)-b-P(D-Lys-HEMA)嵌段共聚物表现出优异的抗菌性能，实验结果表明，P(D-Leu-HEMA)均聚物的最低抑菌浓度(MIC)为798～820μg·mL-1，P(D-Lys-HEMA)均聚物的MIC为100～120μg·mL-1，P(D-Leu-HEMA)-b-P(D-Lys-HEMA)嵌段共聚物的MIC为180～200μg·mL-1(针对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出基本一致的情况)；换用基于L型氨基酸的均聚物和共聚物，表现与上述实施例基本一致的抗菌性能，略低于D型氨基酸的均聚物和共聚物。采用D型和L型单体进行共聚的共聚物，通过调整D型/L型单体的投料比例，共聚物表现为D型或者L型，同样具有与相应构型一致的抗菌性能，低于各自构型的抗菌性能。
如附图10—13所示，溶血实验和体外人主动脉平滑肌细胞相容性实验表明，本发明制备的聚合物在抗菌所需浓度下仍可以保持显著的生物相容性，其中溶血率低于10％，平滑肌细胞活性可达到80％以上。
依据本发明内容进行上述聚合物的制备，聚合物均表现出与实施例基本一致的性能。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物的制备方法，其特征在于，亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物为D-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物；D-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物的制备方法中，将单体D-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚而成，以二硫代苯甲酸-4-氰基戊酸为链转移剂，偶氮二异丁腈为引发剂进行RAFT聚合，单体D-亮氨酸甲基丙烯酸酯、链转移剂和引发剂的投料摩尔比为(45—60)：1：0.2，制备的均聚物在三氟乙酸作用下进行脱保护；单体D-亮氨酸甲基丙烯酸酯按照下述步骤进行制备：将D-亮氨酸和甲基丙烯酸羟乙酯以4-二甲氨基吡啶为催化剂，N,N’-二环己基碳二亚胺为脱水缩合剂，以二氯甲烷为溶剂在冰水浴中反应30-60分钟，再于室温20—25摄氏度下搅拌反应24-48小时，其中D-亮氨酸、4-二甲氨基吡啶、N,N’-二环己基碳二亚胺和甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为5：(0.2—0.25)：(4—5)：(2—3)，D-亮氨酸为叔丁氧羰基保护的D-亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物的制备方法，其特征在于，在D-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物的制备方法中，单体D-亮氨酸甲基丙烯酸酯、链转移剂和引发剂的投料摩尔比为(50—60)：1：0.2。
3.根据权利要求1所述的亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物的制备方法，其特征在于，在D-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物的制备方法中，在惰性气体保护下进行，反应温度为60—80摄氏度，反应时间为6-10小时，溶剂N，N-二甲基甲酰胺提供反应氛围和环境。
4.根据权利要求1所述的亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物的制备方法，其特征在于，在D-亮氨酸甲基丙烯酸酯均聚物的制备方法中，制备的均聚物在三氟乙酸作用下进行脱保护，将均聚物溶于二氯甲烷中，在三氟乙酸作用下，于20—25摄氏度下进行脱保护反应2—4小时，纯化后溶解透析，冷冻干燥即可。
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