CN111499728A - 一种快速制备人玻璃粘连蛋白的方法及应用 - Google Patents

一种快速制备人玻璃粘连蛋白的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物领域，具体涉及一种快速制备人玻璃粘连蛋白的方法及应用。本发明公开了一种玻璃粘连蛋白的制备方法，依次包括如下步骤：S1：细菌培养；S2：得到包涵体；S3：亲和层析；S4：清洗杂蛋白后柱上复性；S5：清洗细菌内毒素；S6：洗脱步骤，得到玻璃粘连蛋白。通过在柱上对目标蛋白进行复性与去内毒素，大大的提高了制备高活性玻璃粘连蛋白的效率，提高了玻璃粘性蛋白的产量，且得到的玻璃粘连蛋白含有的内毒素含量低，符合临床上的生产和使用标准。此外，制备得到的玻璃粘连蛋白可用于包被细胞培养材料，用于促进细胞的生长和定向分化。

Description

一种快速制备人玻璃粘连蛋白的方法及应用
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种快速制备人玻璃粘连蛋白的方法及应用。
背景技术
玻璃粘连蛋白(vitronectin，VTN)是一种存在于血浆和各种组织中丰富的黏附性糖蛋白。与纤连蛋白相同，VTN是血浆中主要的细胞粘附蛋白之一，在血管生成、止血、血栓形成、伤口修复、以及先天免疫，特别是与补体调节、白细胞募集或细菌趋向性等方面起到重要的调节作用。VTN可以与细胞表面受体(如整合素αvβ1、αvβ3、αvβ5)相结合，促进细胞的黏附与伸展；可以与细胞表面糖胺聚糖结合，从而抑制终末细胞裂解补体系统的膜损伤作用。而丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN)(如纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1)与VTN的结合可以抑制VTN与细胞的结合。目前VTN及其衍生物(人血来源或重组蛋白)作为细胞基质，在体外细胞培养中有着广泛的应用。
人糖基化形式的VTN(含459氨基酸)的分子质量为75到78kDa，有单链形式和带有二硫键的双链(65kDa和10到12kDa)形式。成熟的VTN在功能上由几个部分组成，它们在蛋白序列上的独特结合域之间相互作用，主要集中在蛋白的氨基端(N端)和羧基端(C端)。从N端开始，有“生长调节素-B”(SMB)域的Arg-Gly-Asp(RGD)粘附位点，其可与特定的细胞表面受体相互作用。后面相邻的是酸性抗原决定基(由于硫酸盐化作用和磷酸化位点)结合位点的高分子量激肽原(High MW Kininogen)，在C端附近是一个12kDa富含精氨酸的区域，当VTN在体内与凝血酶-抗凝血酶III复合物结合时或在体外用尿素处理变性时，此区域能与肝素结合。
商业化人血来源的全长VTN蛋白与哺乳动物细胞蛋白表达系统提纯的VTN重组蛋白价格昂贵，不利于VTN的规模化应用。而细菌蛋白表达系统提纯的VTN重组蛋白也已证明其可以做为细胞基质成功应用于体外细胞的培养，如人多能干细胞(hPSC)包括人胚胎干细胞(hESC)，人诱导多能干细胞(hiPSC)的培养等。目前已有的研究均报道了该蛋白表达要复杂的透析复性过程才有生物学活性，但复性的方法繁杂，且复性率低，内毒素污染等问题局限了该蛋白的量产与其在临床级细胞生产中的应用。
现有文献报道利用大肠杆菌表达的重组人VTN，表达形式均为包涵体。例如文献1：全长VTN在大肠杆菌中的表达、生产及特性研究；文献2：低内毒素重组人VTN的表达、纯化及生物活性分析；文献3：基于重组蛋白VTN作为多能干细胞向肝样细胞分化的基质的设计。但现有的这些技术存在或多或少的问题。
文献1中利用全长人VTN基因序列进行表达，但所用的原核表达载体是pGEX-2T，该质粒需要诱导剂IPTG才能正常诱导表达。而且用LB培养基进行表达，这就导致不仅需要添加诱导剂的繁琐操作，而且影响蛋白表达产量；另外该文献提供透析复性蛋白，这过程中不仅容易造成细菌内毒素的增加，而且复性率较低。文献2中通过大肠杆菌表达的VTN后，对蛋白进行内毒素去除，选择多种内毒素去除剂，其中选择1％lgepal CA-630加入到8M尿素中洗涤蛋白效果最好，内毒素≤10EU/mg；但使用该纯化方法去除柱上内毒素后，用1M氯化钠溶液洗脱下的蛋白并没有活性，还需要进行透析复性，复性过程中很容易造成内毒素再次升高。因此，该方法不能有效控制蛋白复性后活性蛋白内毒素的含量。文献3中是将小鼠的IgG Fc结构融合到VTN基因序列中进行设计，利用Rosetta-gamiB(大肠杆菌的一种)进行表达，目的是有利于protein A层析柱纯化；蛋白同样通过透析复性，不能确保活性蛋白内毒素含量是否处于较低水平。复性后的蛋白培养hPSC虽贴壁生长良好，能正常分化成肝细胞，但缺少重组人VTN与商品化细胞基质对hPSC高密度和低密度培养比较数据，无法了解表达蛋白活性水平。
发明内容
为了解决当前VTN纯化操作繁琐，复性率低、内毒素含量高、成本高等问题，本发明经过多次条件优化，提供一套快速、简便、高效地VTN制备方法。本发明提供的制备方法可获得较高纯度的VTN(每升菌种可纯化制备出30～40mg具有活性的VTN)；内毒素含量低(≤10EU/mg)；无任何动物源成分；可支持hiPSC和其他细胞的生长及分化，因此，非常有利于大规模制备临床级细胞产品。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种玻璃粘连蛋白的制备方法，依次包括如下步骤：
S1：细菌培养；
S2：得到包涵体；
S3：亲和层析；
S4：清洗杂蛋白后柱上复性；
S5：清洗细菌内毒素；
S6：洗脱步骤，得到玻璃粘连蛋白。
优选的，在S2中，将S1培养得到的细菌通过超声破碎，得到包涵体。
优选的，所述细菌为大肠杆菌。更优选的，所述大肠杆菌为能表达玻璃粘连蛋白的BL21菌株。
优选的，在S3中，包括：
S31：用水洗肝素琼脂糖柱后用变性剂缓冲液对肝素琼脂糖柱进行平衡，肝素琼脂糖柱平衡好后备用；
S32：将包涵体用变性缓冲液溶解后，离心去沉淀，得到上清液；
S33：将上清液与肝素琼脂糖凝胶混合得到混合液，将混合液过S31中的已平衡的肝素琼脂糖柱，得到流穿样品。
优选的，在S4中，包括：
S41：用变性剂缓冲液洗去未结合的玻璃粘连蛋白和其他杂蛋白，洗至OD280nm≤0.02mg/ml为止；
S42：再柱上梯度洗去变性剂，使得玻璃粘连蛋白复性。
更优选的，在S41中，所述变性剂缓冲液包含氯化钠；优选的，所述氯化钠的浓度为25-200mM。
更优选的，在S42中，设置4～5个洗涤梯度依次去除变性剂，每个梯度设置10～15个柱体积，过柱流速为2ml/min。
柱上梯度洗去变性剂，可以使蛋白恢复到天然空间结构，但该步骤需要小分子的参与。复性过程需要缓慢进行，梯度洗去变性剂，复性液作用时间不能太短，否则影响复性效率，复性时间也不易过长，导致时间成本增加，降低生产效率，增加内毒素污染风险。因此，适合的流速非常关键，流速控制在0.5ml/min、1.0ml/min、1.5ml/min、2.0ml/min、2.5ml/min和3.0ml/min，优选2.0ml/min。复性液(磷酸盐缓冲液，pH7.5-8.0)需要添加氧化还原剂，如氧化型和还原型谷胱甘肽，另外根据需要添加甘油、变性剂、EDTA、PEG8000和精氨酸等。
只要能对目标蛋白进行可逆变性，具体变性剂没有限定。本发明中使用的变性剂包括：尿素、盐酸胍等试剂。
氧化还原剂包括：谷胱甘肽、二硫苏糖醇(DTT)等，优选DTT，浓度可以选择0.1mM、0.5mM、0.8mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM。这些浓度均有利于蛋白恢复结构，具体浓度根据蛋白特征进行优化和筛选，本发明优选5mM。
因此，要想确保蛋白高效复性，每个小分子的添加浓度和作用时间非常重要，它们之间相互配合得当才能有利于蛋白的复性。
优选的，在S5中，包括：使用去污剂柱上去除细菌内毒素；所述去污剂选自C7BzO、Triton X-114、lgepal CA-630、异丙醇、1,2-己二醇、ASB-14或CHAPS中的一种或任意组合。
优选的，采用氯化钠溶液进行洗脱，实时监测OD280nm值变化，当浓度小于0.3mg/ml时，停止收样。
优选的，在S2和S3之间还包括如下步骤：
将上述获得的包涵体用包涵体清洗液Ⅰ和包涵体清洗液Ⅱ分别清洗一次；所述包涵体清洗液Ⅰ包括Tris-Hcl(pH8.5)10mM-50mM，NaCl450-650mM，Urea120g-240g，EDTA5mM-10mM，DTT5mM-10mM，CA-6300.1％-1％；包涵体清洗液Ⅱ包括Tris-Hcl(pH8.5)10mM-50mM，NaCl50-100mM，Urea120g-240g，EDTA5mM-10mM，DTT5mM-10mM。
本发明第二个方面公开了了根据上述的方法得到的玻璃粘连蛋白。
本发明第三个方面公开了一种大规模培养细胞的方法，使用上述的玻璃粘连蛋白包被细胞培养材料；优选的，所述细胞为hPSC(人多能干细胞)和神经前体细胞。
蛋白原核表达技术已经非常成熟，但原核表达常常以包涵体形式出现，即表达的蛋白没有活性。要想使蛋白具有生物学活性，则需要对蛋白进行复性，通常复性方法有溶液稀释法和透析法。溶液稀释法是将高浓度蛋白稀释成低浓度，如0.1-0.5mg/ml时，蛋白自动恢复至天然折叠状态，均有生物学活性，但大多数情况下，该方法并不容易形成天然折叠状态。因此，通常采用透析法，即先用变性剂对包涵体进行溶解，然后再通过透析法，去除变性剂，使蛋白自动恢复天然折叠结构，但该方法复性率较低，用时较长，操作复杂等因素并不利于大规模生产。
本发明与文献1不同的是，采用自诱导原核表达载体在TB培养基中进行表达，这可以简化操作程序，降低成本，并确保蛋白表达的产量；同时，柱上复性操作简单，复性率高。与文献2不同的是，我们方法是柱上洗去内毒素后，继续柱上复性蛋白，直接洗脱下的蛋白内毒素很低(≤10EU/mg)，而且蛋白有生物学活性。与文献3不同的是，与matrigel基质相比，我们表达的重组人VTN有很高的活性，低内毒素含量，在低密度培养hiPSC时，可生长出更多单克隆细胞；此外，我们制备的重组人VTN无任何动物源成分，适用于临床级细胞的生产和应用。
本发明的关键创新点在于：1)通过原核大量表达包涵体形式的人VTN，并通过柱上复性的办法快速获得具有天然活性的人VTN；2)利用VTN含有的肝素识别位点，选取特异亲和肝素琼脂糖柱，可以获得纯度较高的目标蛋白。3)能替代市售价格昂贵的层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、Matrigel等细胞基质，降低生产成本，利于大规模制备临床级细胞产品。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
第一，本方法可在短期内制备上百毫克级别蛋白，且只需要3-4升培养菌体。关键点就是柱上复性方法提高复性效率，大大提高了产量。
第二，本方法的在制备过程中，柱上即可对细菌内毒素进行去除，内毒素≤10EU/mg，完全符合临床上的生产和使用。
第三，本方法制备的VTN活性高，可以支持hiPSC的生长和定向分化，完全可以替代市售Matrigel、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白等细胞基质，且成本较低。
第四，本方法制备的VTN培养hiPSC生长后，很容易用Accutase，TrypLE等细胞消化液消化成单细胞，而且用EDTA消化液非常容易脱落基质。
附图说明
图1为本发明实施例中VTN构建的原核表达质粒图谱。
图2为本发明实施例中的制备工艺流程图。
图3为本发明实施例中SDS-PAGE电泳图检测利用肝素琼脂糖凝胶柱纯化VTN蛋白前后比较图。
图4为本发明实施例中柱上复性后内毒素方法与常规复性后内毒素含量比较柱状图。
图5为本发明实施例中制备的VTN与其他市售的VTN、Matrigel分别用高密度和低密度培养hiPSC的生长情况图。
图6为本发明实施例中制备的VTN与其他市售的VTN、Matrigel分别用高密度和低密度培养hiPSC，得到的单克隆hiPSC克隆团数量统计柱状图结果。
图7为本发明实施例中制备的VTN培养分别用1×Accutase、1×TrypLE和0.5mMEDTA消化hiPSC完全脱落基质时间统计图。
图8为本发明实施例中制备的VTN支持神经前体细胞生长得到的细胞形态图。
图9为本发明实施例中神经前体细胞扩增统计图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例公开了一种制备玻璃粘连蛋白的方法，制备流程如图2所示，包括以下步骤：
1、接种：接种阳性克隆菌株
将筛选的BL21阳性克隆菌株接种TB培养基中，并加入250ml摇瓶中，同时加入氨苄青霉素(终浓度100μg/ml)，37℃，250rpm，培养过夜。次日将过夜培养的菌液，按照一定比例接种到2L的培养瓶中，每瓶培养500mL菌液，分别在培养基中加入氨苄青霉素，在37℃，250rpm条件下，培养10-12h(构建的原核表达载体能自身诱导蛋白的表达，无需加诱导剂)。
所述BL21阳性克隆菌株成功的连接了能表达玻璃粘连蛋白的质粒pET3a-rhVIN-NC，所述质粒的图谱如图1所示。
2、收菌：收集表达后的菌体
将培养过夜的菌液，以4℃，3000g，10min的条件离心，丢弃上清保留沉淀，用100-200ml的20mM PB缓冲液重悬菌体，充分混匀清洗残留的培养基，再以上述条件离心，丢弃上清，菌体沉淀用于下一步实验。
3、超声破碎细菌
将上述获得的菌体沉淀物用50ml的磷酸盐缓冲液重悬菌体，置于100ml的烧杯中充分混匀。将含有菌液的烧杯置于冰水混合物中，使用超声破碎仪破碎细菌。超声结束后，以4℃，12000g，20min的条件离心，丢弃上清液，保留沉淀(沉淀为包涵体，含有玻璃粘连蛋白)。
4、清洗包涵体
将上述获得的包涵体沉淀物用包涵体清洗液Ⅰ和包涵体清洗液Ⅱ分别清洗一次，以4℃，12000g，20min的条件离心，丢弃上清液；再用包涵体清洗液Ⅱ清洗一次包涵体，相同条件离心，丢弃上清液。
5、亲和层析
具体操作为：先用水洗肝素琼脂糖柱，然后用变性剂缓冲液，变性剂可以为尿素、盐酸胍等，对肝素琼脂糖柱进行彻底平衡。用变性剂缓冲液溶解包涵体沉淀物，边溶解边搅拌，使之彻底充分溶解，然后用4℃，12000g，20min的条件离心，弃去沉淀，保留上清液。
将获得上清液与肝素琼脂糖凝胶混合一起，搅拌混匀。室温下，搅拌混合2h，使蛋白与肝素琼脂糖凝充分结合，然后重新上柱，并将流穿样品流出。
6、清洗杂蛋白并柱上复性
亲和层析完毕后，用变性剂缓冲液洗去未结合的VTN和其他杂蛋白，洗至OD280nm≤0.02mg/ml为止。此时用梯度降低变性缓冲液浓度方法去除变性剂，梯度可以设置4～5个洗涤梯度分别去除变性剂，每个梯度10～15个柱体积，流速为2ml/min。
7、清洗细菌内毒素
该方法是利用去污剂去除细菌内毒素，使最后洗脱下来的蛋白内毒素含量较低，减少对细胞的毒性作用。去污剂可以用C7BzO、Triton X-114、lgepal CA-630，异丙醇、1,2-己二醇、ASB-14、CHAPS等，正常洗10个柱体积即可，每个梯度洗完后，最后用低内毒素的磷酸盐缓冲液清洗5-10个柱体积。
8、玻璃粘连蛋白洗脱
将柱上复性好并已去除内毒素的VTN进行洗脱，用高浓度氯化钠溶液进行洗脱。实时监测OD280nm值变化，当浓度小于0.3mg/ml时，停止收样。检测收集后对蛋白样品浓度，用磷酸盐缓冲液调整浓度为0.5mg/ml，并用0.22μm滤膜过滤除菌。
9、上文所述缓冲液试剂成分如下：
9.1 20mM PB缓冲液(1L体积，pH＝7.4)，过0.22μM滤膜除菌
组分 质量
NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 0.456g
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 2.3g
H<sub>2</sub>O(低内毒素超纯水) 定容到1L
9.2包涵体清洗液
Figure BDA0002456101970000071
9.3变性剂缓冲液
组分 变性剂缓冲液
Tris-Hcl(pH8.5) 10mM-50mM
NaCl 50-100mM
Urea 240g-480g
EDTA 5mM-10mM
DTT 5mM-10mM
CA-630 /
9.4柱上复性缓冲液
Figure BDA0002456101970000072
Figure BDA0002456101970000081
9.5细菌内毒素清洗液
组分 细菌内毒素清洗液
Tris-Hcl(pH8.5) 10mM-50mM
NaCl 50-100mM
CA-630 0.1％-1％
9.6去除去污剂缓冲液
组分 细菌内毒素清洗液
Tris-Hcl(pH8.5) 10mM-50mM
NaCl 50-100mM
9.7洗脱液
组分 质量或体积
NaCl 58.44g
H<sub>2</sub>O(低内毒素超纯水) 定容到1L
9.8肝素琼脂糖凝胶填料保存液
组分 质量或体积
乙酸钠 0.82g
乙醇 40ml
H<sub>2</sub>O(超纯水) 定容到200ml
将最终制备得到的VTN进行检测和称量，发现每升的培养菌液中能纯化出30-40mg具有活性的VTN。
实施例2
本实施例公开了清洗杂蛋白步骤的试验结果，不同浓度的氯化钠盐溶液对蛋白洗脱有不同的影响。选择合适浓度的氯化钠盐溶液需要根据蛋白与层析柱结合强弱来决定，确保洗脱的目标蛋白纯度最高。
变性剂缓冲液中氯化钠溶液的浓度可以选择25mM、50mM、75Mm、100mM、150mM、200mM。本实施例中变性剂缓冲液中氯化钠浓度为75mM。采用SDS-PAGE电泳图检测利用肝素琼脂糖凝胶柱纯化VTN蛋白前后比较图，得到的VTN蛋白纯度>95％，结果见图3。
实施例3
本实施例研究不同的复性方法对内毒素含量的影响。
常规透析复性方法是通过配制不同浓度的变性剂缓冲液，依次降低变性剂终浓度，最后去除变性剂的透析复性过程。其具体操作方法如下：
1)将获得未复性的目标蛋白用变性剂缓冲液稀释至合适的浓度，如0.1-1mg/ml。然后装入低分子量透析袋中(如7000MW规格透析袋)，两端用夹子加紧，避免漏液。
2)配制透析液：一般配成6组10mM-50mM Tris-Hcl(pH7.5-8.5)缓冲液，并加入Nacl溶液(如100mM)，氧化还原系统(如氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽)，每组含有不同浓度的变性剂(如6M、4M、2M、1M、0.5M和0M)成分。
3)透析时，将透析袋中未复性蛋白溶液依次由高浓度变性剂逐渐透析到低浓度透析液的复性过程，每组透析时间8小时以上，4℃中进行，且透析液体积至少是蛋白溶液体积的10倍以上。该复性方法最少需要3天时间才可以完成，其过程耗时长、操作繁琐且细菌内毒素含量很容易增加等问题不利于低内毒素含量的蛋白生产。
具体的，本实施例中，常规透析复性方法如下：(1)将获得未复性的目标蛋白用变性剂缓冲液稀释至0.5mg/ml，然后装入7000MW规格透析袋中。(2)配制透析液：配成30mMTris-Hcl(pH7.5-8.5)缓冲液，并加入100mM NaCl溶液，氧化还原系统(氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽)，每组含有不同浓度的变性剂(6M、4M、2M、1M、0.5M和0M)成分。将得到的玻璃粘性蛋白送权威检测机构用动态显色法检测结果测其内毒素含量，试验重复三遍，试验结果如图4中常规复性1、常规复性2和常规复性3所示。柱上复性方法是配制不同浓度的变性剂缓冲液，原则是由高浓度变性剂逐渐过渡到低浓度变性剂缓冲液中，最后去除变性剂的复性过程。该方法全部柱上进行，室温条件即可，其操作时间短，生产效率高。复性结束后，需选择合适的去污剂，确保蛋白中内毒素不仅能去除干净，而且要符合国际标准，对蛋白没有明显破坏，有利于后期细胞的培养和临床级应用。本发明选择柱上去除内毒素的办法，去内毒素通常选择C7BzO、Triton X 114、lgepal CA-630，异丙醇、1,2-己二醇、ASB-14、CHAPS等。本发明优选lgepal CA-630进行洗内毒素，浓度范围没有限定，只要把内毒素去除干净即可。如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.2％、1.5％、2％。本发明中优选1％。
具体的，本实施例中的柱上复性方法如实施例1所示，采用浓度为1％的lgepalCA-630去内毒素，将得到的玻璃粘性蛋白送权威检测机构用动态显色法检测结果测其内毒素含量，试验重复三遍，试验结果如图4中柱上复性1、柱上复性2和柱上复性3所示。从图4可以看出，与柱上复性相比，常规透析复性的蛋白内毒素含量高100-150倍。
实施例4
本实施例研究用实施例1所述方法制备得到的玻璃粘连蛋白包被细胞培养材料对hiPSC细胞生长的影响。
具体试验步骤如下：
分别用实施例1制备的vitronectin和Matrigel(Corning，354263)包被6孔板(6孔板包被可以为0.1μg/cm2、0.2μg/cm2、0.5μg/cm2、0.75μg/cm2、1.0μg/cm2、1.5μg/cm2、2.0μg/cm2，本实施例为1μg/cm2)，以低密度接种并培养hiPSC。
结果显示hiPSC在vitronectin上生长良好，无分化现象，细胞核型正常，单克隆按照1000个细胞每孔进行接种，培养7天，最多可以生长200-300个单克隆细胞团，比商品化Matrigel高出1倍，见图5和图6。图5中还设置了一种市面上生产的vitronectin作为阳性对照组。
说明实施例1的制备方法不仅操作简单，产量高，而且得到的vitronectin具有纯度高、成本低、内毒素含量低和非常适合hiPSC的生长等优点，有利于大规模蛋白生产及细胞工艺放大使用。
此外，本实施例还进一步研究了不同培养基质(分为三组Matrigel、vitronectin和Laminin)的条件下，采用不同的消化酶消化hiPSC，细胞脱落下来的时间统计图。图中每组从左到右消化酶分别为Accutase、TrypLE和EDTA，结果如图7所示。
实施例5
本实施例还公开了使用实施例1得到的玻璃粘连蛋白包被细胞培养材料对神经前体细胞生长的影响。
1、细胞培养具体实施步骤如下：
(1)铺板：用Matrigel(0.013mg/cm2)、Laminin(0.5μg/cm2)和VTN(0.5μg/cm2)进行铺板，此实验中用的是6孔板。
(2)实验前，将包被的6孔板置于37℃培养箱中预热不少于20min。
(3)对神经前体细胞计数，使其细胞密度为4.5×10^5cells/mL。
(4)细胞接种前，吸弃包被的基质，用移液管吸2mL细胞悬液，滴加于6孔板中。置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中，十字摇匀6孔板三次进行培养。
(5)每天更换神经前体维持培养基，2mL/孔。培养5天。
2、神经前体细胞培养5天，收集细胞并统计细胞数实施步骤如下：
(1)吸弃培养上清，用1×DPBS洗一遍。
(2)吸弃1×DPBS，加入1mL/孔accutase，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中消化10min。
(3)将细胞悬液转移至1.5mL离心管内，瞬时离心10sec，弃上清，用1mL1×DPBS重悬细胞，并用Vi-cell细胞计数仪计数。
(4)记录细胞活力(Viability)、细胞数(Final cell#)，并根据初始接种细胞量(Initial cell#)，求出扩增倍数(Expansion fold)。具体结果见图8和图9所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种玻璃粘连蛋白的制备方法，其特征在于，依次包括如下步骤：
S1：细菌培养；
S2：得到包涵体；
S3：亲和层析；
S4：清洗杂蛋白后柱上复性；
S5：清洗细菌内毒素；
S6：洗脱步骤，得到玻璃粘连蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S2中，将S1培养得到的细菌通过超声破碎，得到包涵体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S3中，包括：
S31：用水洗肝素琼脂糖柱后用变性剂缓冲液对肝素琼脂糖柱进行平衡，肝素琼脂糖柱平衡好后备用；
S32：将包涵体用变性缓冲液溶解后，离心去沉淀，得到上清液；
S33：将上清液与肝素琼脂糖凝胶混合得到混合液，将混合液过S31中的已平衡的肝素琼脂糖柱，得到流穿样品。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S4中，包括：
S41：用变性剂缓冲液洗去未结合的玻璃粘连蛋白和其他杂蛋白，洗至OD280nm≤0.02mg/ml为止；
S42：再柱上梯度洗去变性剂，使得玻璃粘连蛋白复性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在S41中，所述变性剂缓冲液包含氯化钠；优选的，所述氯化钠的浓度为25-200mM。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在S42中，设置4～5个洗涤梯度依次去除变性剂，每个梯度设置10～15个柱体积，过柱流速为2ml/min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S5中，包括：使用去污剂柱上去除细菌内毒素；所述去污剂选自C7BzO、Triton X-114、lgepal CA-630、异丙醇、1,2-己二醇、ASB-14或CHAPS中的一种或任意组合。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用氯化钠溶液进行洗脱，实时监测OD280nm值变化，当浓度小于0.3mg/ml时，停止收样。
9.据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S2和S3之间还包括如下步骤：
将上述获得的包涵体用包涵体清洗液Ⅰ和包涵体清洗液Ⅱ分别清洗一次；所述包涵体清洗液Ⅰ包括Tris-Hcl(pH8.5)10mM-50mM，NaCl450-650mM，Urea120g-240g，EDTA5mM-10mM，DTT5mM-10mM，CA-6300.1％-1％；包涵体清洗液Ⅱ包括Tris-Hcl(pH8.5)10mM-50mM，NaCl50-100mM，Urea120g-240g，EDTA5mM-10mM，DTT5mM-10mM。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法得到的玻璃粘连蛋白。
11.一种大规模培养细胞的方法，其特征在于，使用权利要求10所述的玻璃粘连蛋白包被细胞培养材料；优选的，所述细胞为人多能干细胞和神经前体细胞。
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