CN111481647B - 一种复方黄连组合物及其制备工艺 - Google Patents

Abstract

本申请属于医药领域。本申请提供一种新的复方黄连组合物的制备方法，以及由该方法得到的复方黄连组合物、及其制药用途或用其治疗疾病的方法。本申请所述方法包括以下步骤：1)用油浸泡黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄；2)加热使所述油的温度达到约120～150℃，并维持预定的温度约1min～120min；3)过滤并收集滤液。根据本申请的复方黄连组合物具有降低的刺激性、提高的安全性以及提高的药效。本申请还提供一种用于复方黄连组合物的指纹图谱分析方法。

Description

一种复方黄连组合物及其制备工艺

技术领域

本申请属于医药领域。本申请提供一种新的复方黄连组合物的制备方法，以及由该方法得到的复方黄连组合物、及其制药用途或用其治疗疾病的方法。

背景技术

黄连膏始载于南北朝时期的中医外科专著《刘涓子鬼遗方》。黄连膏具有清热解毒、燥湿、止痛等功效。经过一千多年的不断完善，至清代《医宗金鉴》形成了用于中医外科的“经典”黄连膏处方，其中记载的黄连膏处方由黄连、黄柏、姜黄、当归尾、和生地黄五味药材组成。黄连膏是一种油膏形式的复方黄连组合物。在临床上，黄连膏广泛用于治疗鼻炎、湿疹、紫癜、玫瑰糠疹、扁平疣、病毒性角膜炎、银屑病、口腔炎、中耳炎、阴道炎、宫颈糜烂、自身免疫性疾病、痤疮、丹毒、静脉性溃疡、糖尿病足、急性痛风性关节炎、血管瘤、急性肛周湿疹、肛裂、乳头皲裂、乳痈、小儿尿布性皮炎、尖锐湿疣等疾病，并取得了可靠疗效(黄连膏的历史及临床应用考证，陈天朝，河南中医，2010，30(5)：514-516)。通常，采用麻油先煎炸药物以得到油膏、再将所得油膏与蜂蜡融合以制备黄连膏，其中麻油具有生肌、止痛、消肿、缓解皮损等作用；蜂蜡则具有收涩、敛疮、生肌、止痛、调理等功效。《医宗金鉴》记载了黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄五味药材的配伍用量、提取溶剂以及制剂辅料。

王厚伟(复方黄连膏实用制剂工艺研究，中国实用医药，2008，3(12)：144-146)对复方黄连膏制剂工艺进行了研究。但是，该制剂所用处方配伍比例与《医宗金鉴》所表述的黄连膏处方比例存在差异，且其使用的提取溶剂种类以及制剂辅料剂用量均与《医宗金鉴》中所列黄连膏工艺不一致。此外，该研究采用的油炸提取工艺温度过高、提取时间较长。

关志宇等(黄连软膏制备工艺优选，中国实验方剂学杂志，2012，18(17)：36-38)研究了黄连软膏的制备工艺。但是，所述黄连软膏的处方仅包括黄连、黄柏、黄芩，不是《医宗金鉴》中黄连膏所列的五味药材。而且，该黄连软膏的制剂过程没有采用油炸提取工艺。

陈智国(黄连软膏的研究进展，湖北中医药杂质，2018，40(3)：55-57)等虽然考察了常见黄连软膏处方及制备工艺。但既没有明确指出黄连膏中的活性成分，也没有明确指出黄连膏中具体制备方法。本领域仍然渴望进一步优化黄连膏制备方法，进而改变黄连膏中活性成分组成并提高药效。

本领域通常采用武火加热、文火油炸药材至“煠枯”的传统工艺(参见例如《医宗金鉴》)制备黄连膏。通常认为，在满足“煠枯”要求的前提下，较长的油炸时间、较高的温度有利于提取出更多的药效成分。目前有关中药炮制过程中火力温度的描述仅见于《北京市中药饮片炮制规范》(2008年版)，其中指出常用的炮制火候温度(药温)范围参考值为：文火80～120℃；中火120～150℃；武火150～220℃。因此，黄连膏传统制备工艺武火加热，其药油体系温度至少达到150℃以上。而且，本领域虽然对黄连膏进行过很多研究。但关于黄连膏中活性成分种类的研究却很少。就活性成分而言，本领域已知黄连膏含有小檗碱，但未见黄连膏中其他活性成分的报道。可见，本领域仍然缺乏对黄连膏制备方法的深入研究、尤其是缺乏制备工艺对活性成分影响的研究。

发明内容

本申请提供一种新的复方黄连组合物的制备方法，以及由该方法得到的复方黄连组合物、及其制药用途或用其治疗疾病的方法。本申请所述的复方黄连组合物是通过在加热条件下用油(例如植物油或动物油)提取(又称油炸)黄连(HL)、黄柏(HB)、姜黄(JH)、当归尾(DGW)和生地黄(又称生地，SD)五种中药而得到的。

本申请发明人首次发现，复方黄连组合物包含5-羟甲基糠醛(5-HMF)。而且，本申请发明人还发现，根据本申请的复方黄连组合物还包含巴马汀、黄连碱、黄柏碱或阿魏酸中的一种或多种，现有技术并未报道根据传统工艺制备的复方黄连组合物包含上述化合物。进一步地，根据本申请的复方黄连组合物还包含小檗碱、藁本内酯或姜黄素中的一种或多种，而且本申请的复方黄连组合物中的小檗碱、藁本内酯或姜黄素含量高于根据传统工艺制备的复方黄连组合物中的小檗碱、藁本内酯或姜黄素。

在一种优选实施方式中，本申请复方黄连组合物至少包括阿魏酸(EWS)、5-羟甲基糠醛(5-HMF)、小檗碱(XBJ)、巴马汀(BMT)、黄连碱(HLJ)、黄柏碱(HBJ)、藁本内酯(GBNZ)、姜黄素(JHS)等8种成分。

申请人发现，5-HMF是由葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸性等条件下脱水生成的具有呋喃环结构的醛类化合物。5-HMF具有一定的抗氧化、抗过敏、抗高尿酸血症等功效(Ummay M.S.,Chemistry Central Journal,2018,12:35)。但是，5-HMF在高剂量下具有致敏性，对人体皮肤黏膜、眼睛及上呼吸道具有刺激作用，并有致突变、肝肾毒性等副作用。因此，降低5-HMF的含量是有利的。另一方面，提高阿魏酸、小檗碱、巴马汀、黄连碱、黄柏碱、藁本内酯、和姜黄素中的一种或多种的含量也是有利的，因为这些成分具有抗炎、抗菌、抗氧化等药理活性。

本申请发明人发现，通过将所述五种中药材粉碎成不同粒径的颗粒、控制油提取的温度和时间，能够改变黄连膏中活性成分组成并提高药效。与根据传统工艺采用武火加热、文火油炸的提取方法(参见《医宗金鉴》)所得复方黄连组合物相比，本申请方法所得复方黄连组合物具有更低的5-HMF含量，更高的阿魏酸、小檗碱、巴马汀、黄连碱、黄柏碱、藁本内酯和/或姜黄素的含量。特别地，本申请复方黄连组合物中，5-HMF含量低于0.004％(重量)。

在一个方法，本申请提供一种制备复方黄连组合物的方法，包括以下步骤：

1)用油(例如植物油或动物)浸泡黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄；

2)加热使所述油的温度达到约120～150℃，并维持预定的温度约1min～120min(分钟)；

3)过滤并收集滤液。

在一个方面，上述步骤1)可在任选加热的条件下进行，以使所述油保持液体状态。在一个方面，所述黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄包括各种形式的药材黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄，例如植物形式或饮片形式。

在进一步的方面，将所述黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄被切成或粉碎成不同粒径的小块、颗粒或粉末，例如直径小于等于约10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、950μm、900μm、850μm、800μm、750μm、700μm、650μm、600μm、550μm、500μm、450μm、400μm、350μm、300μm、250μm、200μm、150μm、100μm、95μm、90μm、85μm、80μm、75μm、70μm、65μm、60μm、55μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、15μm、10μm、5μm、1μm的颗粒或粉末，在本申请中，术语“颗粒”和“粉末”可互换使用；或者，粉末是指具有较小粒径/直径的颗粒。例如，所述黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄可被粉碎成《药典》规定的粗粉(例如，药材颗粒直径小于或等于850μm±29μm)、中粉(例如，药材颗粒直径小于或等于250μm±9.9μm)和细粉(例如，药材颗粒直径小于或等于180μm±7.6μm)规格的粉末。《药典》规定的粗粉是指粉末全部通过二号筛(筛孔内径平均值850μm±29μm)，且不超过40％的粉末能通过四号筛(筛孔内径平均值250μm±9.9μm)。《药典》规定的中粉是指粉末全部通过四号筛，且不超过60％的粉末能通过五号筛(筛孔内径平均值180μm±7.6μm)。《药典》规定的细粉是指粉末能通过五号筛，且不少于95％的粉末能过六号筛(筛孔内径平均值150μm±6.6μm)。当提及《药典》规定的粗粉、中粉和细粉时，本申请旨在引用相关粒径的上限值，而无意引用相关粒径的下限值。即，这些定义不构成对本申请所述药材颗粒或粉末粒径/直径下限的限定。在一种优选的实施方式中，将生地黄粉碎成直径小于或等于8mm、优选直径小于或等于5mm的颗粒(也称为粗粉或粗颗粒)。在一种优选的实施方式中，将黄连粉碎成直径小于等于1mm的粉末，优选直径小于等于900μm的粉末，更优选直径小于等于850μm的粉末，例如具有《药典》规定的粗粉粒径及更小粒径的粉末。在一种优选的实施方式中，将黄柏粉碎成直径小于等于1mm的粉末，优选直径小于等于900μm的粉末，更优选直径小于等于850μm的粉末，例如具有《药典》规定的粗粉粒径及更小粒径的粉末。在一种优选的实施方式中，将当归尾粉碎成直径小于等于500μm的粉末，优选直径小于等于300μm的粉末，更优选直径小于等于250μm的粉末，例如具有《药典》规定的中粉粒径及更小粒径的粉末。在一种优选的实施方式中，将姜黄粉碎成直径小于等于500μm的粉末，优选直径小于等于300μm的粉末，更优选直径小于等于250μm的粉末，例如具有《药典》规定的中粉粒径及更小粒径的粉末。进一步地，黄连和/或黄柏优选为直径小于等于900μm的粉末(更优选直径小于等于850μm的粉末)；和/或，姜黄和/或当归尾优选为；直径小于等于300μm的粉末(更优选直径小于等于250μm的粉末)；和/或，生地黄优选为直径小于或等于8mm的颗粒(更优选直径小于或等于5mm的颗粒)。

黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄可以以任意重量比使用。黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄的重量比优选为约1：1：1：1～2：3～5；黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄的重量比更优选为约1：1：1：1.7：3.3。

用油浸泡黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄的时间是本领域技术人员根据需要确定的任意时间。所述时间可以是约1-120分钟(min)之间的任意时间，例如约5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min、110min、120min、优选约5-60min。

所述油可以是任何油，例如植物油或动物油，比如芝麻油(又称麻油或香油)、菜籽油、芥花油、茶籽油、椰子油、棕榈油、蓖麻油、玉米油、花生油、橄榄油、葵花籽油、大豆油、猪油、羊油、牛油、雪猪油等，或其两种或更多种的混合物。

所述油可以以相对于黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄的任意量使用。优选地，基于黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄的总重量(克)，使用3-8倍重量(克)量的油，例如4、5、6、7倍。

在一个方面，上述步骤2)中，加热使所述油的温度达到约120～150℃之间的任意温度，例如约120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150℃，或者其间任意两个温度组成的范围。维持预定温度的时间又称为油炸时间，是指达到预定温度后持续的时间。在本领域中，油炸时间可以截止至药材“煠枯”的时间，但并无精确的标准。本申请中，油炸时间可以是约1min～120min，例如约5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、215min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min、40min、45min、50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min、90min、95min、100min、105min、110min、115min、120min，优选约5-90min，更优选约5-30min。

在一个方面，上述步骤3)中，所得滤液(也可称为药油)即为一种根据本申请的复方黄连组合物。任选地，所述过滤是在加热的条件下进行。优选地，将所述滤液(药油)与药学上可接受的载体混合，以制备各种形式的药物组合物。或者，也可以在步骤3)所述过滤之前混合部分或全部药学上可接受的载体。

可以采用本申请方法分别处理黄连、黄柏、姜黄、当归尾或生地黄，也可以采用本申请方法处理黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄中两种或多种的混合物。优选用本申请方法处理黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄五种药材的混合物，更优选所述药材是颗粒或粉末。所述颗粒或粉末可以具有如上所述的粒径。所述药材可以以具有期望粒径的颗粒或粉末形式添加到所述油中，用于浸泡。或者，可以先以原样形式将所述药材添加到所述油中用于浸泡，然后在浸泡过程中或浸泡结束时对所述药材和油的混合物中的药材(例如通过转子或叶片)进行粉碎操作，以得到在油中的粉末或颗粒形式的药材，所述粉末或颗粒具有期望的粒径。

本领域一直缺乏对复方黄连组合物(黄连膏)制备方法的深入研究。而且，由于缺乏标准化的制备工艺，导致黄连膏中所含的活性成分及黄连膏产品质量缺乏一致性标准、难以控制。而且，本领域通常采用传统武火加热、文火油炸药材至“煠枯”的工艺(参见例如《医宗金鉴》)制备黄连膏。申请人发现，已有工艺的温度超过170度，而且，已有工艺所得药油中5-HMF含量等于或大于0.06％(重量)。另一方面，在该工艺所得药油中，往往难以检出巴马汀、黄连碱、黄柏碱、阿魏酸，并且小檗碱、藁本内酯和姜黄素的含量较低。

《中国药典》(2015版)中明确规定了蜂蜜中5-HMF含量不得超过0.004％，而蜂蜜现已广泛运用于食品及化妆品领域，

本申请发明人发现，在根据本申请方法所制备的复方黄连组合物中，5-HMF的含量小于或等于0.004％(重量)。由于5-HMF在高剂量下具有致敏性、致突变等副作用，因而本申请提供的具有降低5-HMF含量的复方黄连组合物具有降低的刺激性、提高的安全性。

另一方面，在根据本申请方法所制备的复方黄连组合物中，小檗碱含量可达0.005-0.025％、优选0.015-0.025％(重量)，比根据已有工艺制得复方黄连组合物中的小檗碱含量高8倍或更高。根据本申请方法所制备的复方黄连组合物还含有巴马汀、黄连碱、黄柏碱。黄连碱是黄连药材中的特征成分(黄连中原小檗型生物碱的分离与鉴定，王欣，中国药房，2012，23(23)：2149-2151)。巴马汀、黄柏碱是黄柏药材中的特征成分。现有研究表明，上述生物碱类化合物具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒及抗内毒素等作用(黄柏化学成分及其药理作用研究进展，李嘉诚，药学实践杂志，2018，36(5)：389-391)。由于具有较高含量的小檗碱以及存在巴马汀、黄连碱和黄柏碱，根据本申请方法所制备的复方黄连组合物具有提高的药效。

本申请发明人还发现，在根据本申请方法所制备的复方黄连组合物中，藁本内酯的含量可达到0.05％或更高(重量)，比根据已有工艺制得复方黄连组合物中的藁本内酯含量(约0.03％左右)高1.7倍或更高。藁本内酯的药理活性主要表现在镇痛消炎、解热、抗氧化、抗菌、抗癌、舒张血管、改善微循环、抗皱、治疗视疲劳、抗抑郁等方面(藁本内酯药理学和药代动力学研究进展，左爱华，中国中药杂志，2012，37(22)：3350-3353)。由于具有较高含量的藁本内酯，根据本申请方法所制备的复方黄连组合物具有提高的药效。

本申请发明人还发现，在根据本申请方法所制备的复方黄连组合物中，姜黄素含量可达到0.050-0.085％或更高(重量)，比根据已有工艺制得复方黄连组合物中的姜黄素含量(约0.002-0.004％)高20倍或更高。姜黄素药理活性丰富，包括抗炎、解痉、抗寄生虫、抗纤维化、抗氧化等多种活性，同时对癌症、糖尿病、代谢性疾病、自身免疫疾病、动脉粥样硬化、关节炎、中风、外周神经炎、肠炎、脑外科等均有疗效。近年来，姜黄素被证明对皮肤伤口愈合具有强大的调节作用，可通过作用于伤口愈合过程中的炎症反应、增生和重构阶段，进而显著缩短皮肤伤口愈合时间，在治疗皮肤疾病方面前景广阔(姜黄素在皮肤外伤修复中的作用机制研究进展，周曙，医学综述，2015，21(16)：2983-2985)。由于具有较高含量的姜黄素，根据本申请方法所制备的复方黄连组合物具有提高的药效。

本申请发明人还发现，在根据本申请方法所制备的复方黄连组合物中，阿魏酸含量可达到0.002-0.003％或更高(重量)，而根据已有工艺制得复方黄连组合物中则未能检出阿魏酸。阿魏酸具有活血止痛、抗血小板聚集、促进血小板解聚、抗血栓、抗氧化、抗自由基、抗菌消炎、抗肿瘤、抗突变、增强免疫等多种药理活性(阿魏酸衍生物及其生物活性，马逢时，药学进展，2008，32(8)：345-350)。魏莉等研究发现，阿魏酸本身具有很好的透皮吸收功能，可作为天然透皮剂进行开发(阿魏酸透皮吸收的实验研究，魏莉，中成药，1998,20(6)1-3)。由于具有较高含量的阿魏酸，根据本申请方法所制备的复方黄连组合物具有提高的药效。

本申请还提供一种用于复方黄连组合物的指纹图谱分析方法。该方法将复方黄连组合物中阿魏酸、5-HMF、小檗碱、巴马汀、黄连碱、黄柏碱、藁本内酯、姜黄素这8种成分中的一种或多种确定为特征性化合物，而且将它们的含量尤其是5-HMF含量也确定为质量控制指标。该方法可以采用HPLC和/或LC-MS进行。该方法能高效快速的检测上述8种特征性化合物中的一种或多种并测定其含量，可作为黄连膏质量控制的重要方法。

本申请复方黄连组合物可用于治疗(例如湿热所致的)皮肤或粘膜疾病，包括但不限于皮肤或粘膜干燥、炎症、溃烂、红肿、疥疮干痒、烧伤、烫伤、湿疹、晒伤、蚊虫叮咬及过敏性疾病等。

除非特别说明，本申请所述百分数、比例、比率、含量或份数是按重量计。本申请所述浓度是重量浓度。

在一种优选的实施方式中，所述药物组合物是膏剂、油膏剂、搽剂、栓剂、滴剂、气雾剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、悬浮液、溶液、分散剂、用于口服或非口服给药的缓释制剂、静脉注射制剂、皮下注射制剂、吸入制剂、透皮制剂、直肠或阴道栓剂等形式。

本申请所述药学上可接受载体是指本领域技术人员熟知的药学上可接受载体，所述的载体用于将所述药物组合物制成上述剂量形式。本申请的药学上可接受载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、助流剂、掩味剂、表面活性剂、防腐剂等。填充剂包括但不限于乳糖、微晶纤维素、淀粉、糖粉、糊精、甘露醇、硫酸钙等。润湿剂与黏合剂包括但不限于羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解剂包括但不限于羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素等。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇、月桂醇硫酸镁等。粘合剂包括但不限于阿拉伯胶、藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸铝镁、麦芽糖糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、预明胶化淀粉、藻酸钠、山梨醇、淀粉、糖浆和黄蓍胶。助流剂包括但不限于胶体二氧化硅、粉状纤维素、三硅酸镁、二氧化硅和滑石粉。掩味剂包括但不限于阿斯巴坦、甜菊苷、果糖、葡萄糖、糖浆、蜂蜜、木糖醇、甘露醇、乳糖、山梨醇、麦芽糖醇、甘草甜素。表面活性剂包括但不限于吐温-80、泊洛沙姆。防腐剂包括但不限于尼泊金酯、苯甲酸钠、山梨酸钾等。所述药学上可接受的载体优选，凡士林、蜂蜡、鲸蜡、虫白蜡、石蜡、羊毛脂、硅酮、羊毛脂、甘油、可可豆脂、香果脂、乌柏脂、椰油酯、山苍子油酯、棕榈油酯、硬脂酸丙二醇酯、高级醇、吐温等，或其一种或多种的混合物。

制备各种含有各种比例活性成分的药物组合物的方法是已知的，或根据本申请的公开内容对于本领域技术人员是显而易见的。如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Martin,E.W.,ed.,Mack Publishing Company,19th ed.(1995)所述。制备所述药物组合物的方法包括掺入适当的药学赋形剂、载体、稀释剂等。以已知的方法制造本申请所述药物组合物，包括常规的混合、溶解或冻干方法。

在本申请所述药物组合物中，活性成分的比例可以变化，可占给定的单位剂型重量的大约0.01％至大约99％。在这种治疗有用的药物组合物制剂中，活性成分的量使得能够获得有效剂量水平。

活性成分的治疗有效量，不仅取决于选择的特定的盐，而且取决于施药方式、待治疗的疾病的性质和患者的年龄和状态，最终取决于在场医师或临床医生的决定。

本申请在另一个方面提供了含有治疗有效量的本申请所获得的复方黄连组合物的药物组合物在制备用于治疗(例如湿热所致的)皮肤或粘膜疾病的药物中的用途，所述疾病可以是皮肤或粘膜干燥、炎症、溃烂、红肿、疥疮干痒、烧伤、烫伤、湿疹、晒伤、蚊虫叮咬及过敏性疾病等。

在还有另一个方面，本申请提供一种治疗治疗(例如湿热所致的)皮肤或粘膜疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本申请所获得的复方黄连组合物的步骤，所述疾病可以是皮肤或粘膜干燥、炎症、溃烂、红肿、疥疮干痒、烧伤、烫伤、湿疹、晒伤、蚊虫叮咬及过敏性疾病等。

在一个方面，本发明还提供复方黄连组合物，用于治疗(例如湿热所致的)皮肤或粘膜疾病的药物中的用途，所述疾病可以是皮肤或粘膜干燥、炎症、溃烂、红肿、疥疮干痒、烧伤、烫伤、湿疹、晒伤、蚊虫叮咬及过敏性疾病等。

本申请使用的术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。

本申请所述温度单位“度”是指摄氏度。

附图说明

图1是本发明实施例提供的HPLC测试方法在284nm检测波长测定5-HMF标准品及传统制剂药油(HLG-KM-YP-M)的液相分析图谱。

图2是本发明实施例提供的HPLC测试方法在316nm检测波长测定阿魏酸(S-EWS)、藁本内酯(S-GBNZ)标准品及传统制剂药油(HLG-KM-YP-M)的液相分析图谱。

图3是本发明实施例提供的HPLC测试方法在345nm检测波长测定小檗碱(S-XBJ)标准品及传统制剂药油(HLG-KM-YP-M)的液相分析图谱。

图4是本发明实施例提供的HPLC测试方法在430nm检测波长测定姜黄素(S-JHS)标准品及传统制剂药油(HLG-KM-YP-M)的液相分析图谱。

图5是本发明实施例提供的两种品牌香油(三添、金龙鱼)油炸前后主成分HPLC分析图谱

图6是本发明实施例提供的传统制剂药油(HLG-KM-YP-M)与当归尾(HLG-DGW)、生地黄(HLG-SD)两味药材单独油炸提取样品在284nm波长下的液相主成分比较示意图。

图7是本发明实施例提供的传统制剂药油(HLG-KM-YP-M)与当归尾(HLG-DGW)药材单独油炸提取样品在316nm波长下阿魏酸(EWS)的检测结果示意图。

图8是本发明实施例提供的传统制剂药油(HLG-KM-YP-M)与黄连(HL)、黄柏(HB)两味药材单独油炸提取样品在345nm波长下小檗碱(XBJ)的检测结果示意图。

图9是本发明实施例提供的传统制剂药油(HLG-KM-YP-M)与姜黄(JH)药材单独油炸提取样品在430nm波长下姜黄素(JHS)的检测结果示意图。

图10优化工艺后样品(HLG-KM-135-1)中5-HMF、藁本内酯(GBNZ)和阿魏酸(EWS)三个指标性成分检测示意图。

图11优化工艺后样品(HLG-KM-135-1)中小檗碱(XBJ)和姜黄素(JHS)的HPLC检测示意图。

图12优化工艺后样品(HLG-KM-135-1)采用LC-MS(LR-ESI)测定的黄柏碱(HBJ)负离子信号图谱。

图13优化工艺后样品(HLG-KM-135-1)采用LC-MS(LR-ESI)测定的阿魏酸(EWS)负离子信号图谱。

图14优化工艺后样品(HLG-KM-135-1)采用LC-MS(LR-ESI)测定的姜黄素(JHS)负离子信号图谱。

图15优化工艺后样品(HLG-KM-135-1)采用LC-MS(HR-ESI)测定的正离子信号总图谱及其5-HMF正离子信号图谱。

图16优化工艺后样品(HLG-KM-135-1)采用LC-MS(HR-ESI)测定的小檗碱(XBJ)正离子信号图谱。

图17优化工艺后样品(HLG-KM-135-1)采用LC-MS(HR-ESI)测定的巴马汀(BMT)正离子信号图谱。

图18优化工艺后样品(HLG-KM-135-1)采用LC-MS(HR-ESI)测定的黄连碱(HLJ)正离子信号图谱。

图19优化工艺后样品(HLG-KM-135-1)采用LC-MS(HR-ESI)测定的黄柏碱(HBJ)正离子信号图谱。

图20优化工艺后样品(HLG-KM-135-1)采用LC-MS(HR-ESI)测定的藁本内酯(GBNZ)正离子信号图谱。

图21优化工艺后样品(HLG-KM-135-1)采用LC-MS(HR-ESI)测定的姜黄素(JHS)正离子信号图谱。

图22传统工艺样品(HLG-KM-YP-M)采用LC-MS(LR-ESI)测定的负离子信号总图及其5-HMF负离子信号图谱。

图23传统工艺样品(HLG-KM-YP-M)采用LC-MS(LR-ESI)测定的姜黄素(JHS)负离子信号图谱。

图24传统工艺样品(HLG-KM-YP-M)采用LC-MS(LR-ESI)测定的正离子信号总图及5-HMF正离子信号图谱。

图25传统工艺样品(HLG-KM-YP-M)采用LC-MS(LR-ESI)测定的小檗碱(XBJ)正离子信号图谱。

图26传统工艺样品(HLG-KM-YP-M)采用LC-MS(LR-ESI)测定的藁本内酯(GBNZ)正离子信号图谱。

图27传统工艺样品(HLG-ZL-YP-M)采用LC-MS(LR-ESI)测定的负离子信号总图及5-HMF负离子信号图谱。

图28传统工艺样品(HLG-ZL-YP-M)采用LC-MS(LR-ESI)测定的姜黄素(JHS)负离子信号图谱。

图29传统工艺样品(HLG-ZL-YP-M)采用LC-MS(LR-ESI)测定的正离子信号总图及5-HMF正离子信号图谱。

图30传统工艺样品(HLG-ZL-YP-M)采用LC-MS(LR-ESI)测定的小檗碱(XBJ)正离子信号图谱。

图31传统工艺样品(HLG-ZL-YP-M)采用LC-MS(LR-ESI)测定的藁本内酯(GBNZ)正离子信号图谱。

图32软膏成品中5-HMF、阿魏酸(EWS)和藁本内酯(GBNZ)三个指标性成分的液相分析结果。

图33软膏成品中小檗碱(XBJ)和姜黄素(JHS)两个指标性成分的液相分析结果。

具体实施方式

下面，本申请将通过实施例展示本申请的有益效果。本领域技术人员会知道，这些实施例是示例性的，而不是限制性的。这些实施例不会以任何方式限制本申请的范围。下述实施例中所述实验操作，如无特殊说明，均为常规操作；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例材料、试剂与仪器如下：

中药饮片来源：

黄连(批号：180603761；产地：四川；生产日期：2018-06-16)、黄柏(批号：180405081；产地：四川；生产日期：2018-04-24)、姜黄(批号：180602711；产地：福建；生产日期：2018-06-12)、生地黄(批号：180402501；产地：河南；生产日期：2018-04-11)、当归尾(批号：180404041；产地：甘肃；生产日期：2018-04-19)五批饮片各1kg，购于康美药业股份有限公司(KM)。上述中药饮片参照《药典》(2015版)标准进行检测，重点考察了特征性化学成分的含量，均超过《药典》规定的最低标准，符合实验要求。

黄连(批号：20180401；产地：四川；生产日期：2018-04-26)、黄柏(批号：20180601；产地：四川；生产日期：2018-06-13)、姜黄(批号：20180701；产地：四川；生产日期：2018-07-23)、生地黄(批号：20180801；产地：河南；生产日期：2018-08-07)、当归尾(批号：171201；产地：甘肃；生产日期：2017-12-04)五批饮片各1kg，购于浙江佐力百草中药饮片有限公司(ZL)。上述中药饮片参照《药典》(2015版)标准进行检测，重点考察了特征性化学成分的含量，均超过《药典》规定的最低标准，符合实验要求。

试剂：石油醚、环己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、四氢呋喃、甲醇、乙醇、乙腈、色谱甲醇、冰醋酸、纯净水、白凡士林、硬脂酸丙二醇酯、石蜡、吐温-80等试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。香油(三添芝麻油，上海三添食品有限公司，生产日期：2018-07-26；金龙鱼芝麻油，嘉里粮油(青岛)有限公司，生产日期：2018-07-17)。蜂蜡：河南普瑞蜂品股份有限公司。

标准品：5-羟甲基糠醛(5-HMF)，购于上海士锋生物科技有限公司；小檗碱(XBJ)、姜黄素(JHS)、阿魏酸(EWS)、藁本内酯(GBNZ)均购于上海鹰谷信息科技有限公司。

仪器：

电子天平：BT 125D，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

离心机：TGL-18C，上海安亭科学仪器厂。

圆周振荡仪：IKA MS 3型。

暗箱三用紫外分析仪：ZF-7，上海嘉鹏科技有限公司。

粉碎机：多功能粉碎机，德清拜杰电器有限公司。

不锈钢标准筛：《药典》规定的二号，四号，五号，六号筛，均购于国药集团化学试剂有限公司。

加热搅拌器：98-1强磁力搅拌器，上海司乐。

温度计：水银棒形温度计，0-300，国药集团化学试剂有限公司。

锥入度计：ZHR-5A锥入度计，天大天发。

高效液相色谱仪(HPLC)：Agilent 1260高效液相系统，DAD检测器。

液相质谱联用仪(LC-MS)：Agilent G6520Q-TOF(LR-ESI，HR-ESI)。

核磁共振仪(NMR)：Bruker 500MHz核磁共振仪。

实施例1：根据现有技术的方法

制备复方黄连组合物的传统工艺通常为：按黄连三钱，当归尾五钱，生地一两，黄柏三钱，姜黄三钱称取药材饮片，置于容器中，加入香油十二两，武火加热升高油温，调整火候持续煎炸药材至枯，捞去渣；趁热加入黄蜡四两，至全溶化，用夏布将油滤净，倾入磁碗内，以柳枝不时搅之，等候冷凝至常温即可。

根据《医宗金鉴》中所列中药比例，结合古籍剂量换算法则，本专利实施例所涉及的复方黄连组合物处方均按：1斤＝16两＝160钱，1斤＝596.8g，1两＝37.3g，1钱＝3.73g换算。

按黄连(11.19g)、黄柏(11.19g)、姜黄(11.19g)、当归尾(18.65g)、生地黄(37.3g)剂量称取KM公司的五味中药饮片。黄连、黄柏、当归尾饮片剪碎成1cm以下小段，姜黄采用研钵碾碎成直径5mm左右粗颗粒，生地黄切成1cm左右小块。将前述五种药材置于不锈钢铁锅内，加入香油(三添)485ml，搅拌均匀后浸泡60min。采用武火迅速加热香油，同时采用温度计测定并记录实时温度，并不断搅拌药材。油温达140-150度时可见大量泡沫产生，此时将武火改用文火维持油炸状态，持续5min后泡沫消失，药材表面呈现起泡现象，泡的大小均一，此时油温达170-190度，黄连、黄柏、姜黄、当归尾药材表面迅速呈现棕黄色，维持油温持续油炸5-10min，药材表面即可出现焦黄色，达到古籍记载的“煠枯”要求，关火冷却到100度，采用双层医用纱布趁热过滤，收集滤液，即获得传统工艺药油样品(HLG-KM-YP)。

按黄连(11.19g)、黄柏(11.19g)、姜黄(11.19g)、当归尾(18.65g)、生地黄(37.3g)剂量称取ZL公司的五味中药饮片。采用上述相同工艺，制备得到ZL公司药油，密封待用(HLG-ZL-YP)。

通过本实施例证实，复方黄连组合物传统提取工艺的油炸提取温度达到170度以上。而且，传统工艺通常以外观“煠枯”为标准决定油炸提取时间。该提取时间的判断受个人因素影响较大，很难实现工业标准化生产。

实施例2：

为了优化复方黄连组合物的制剂工艺，本申请发明人通过本实施例建立复方黄连组合物的质量评价方法。本实施例将药效成分与油溶剂快速分离，从而建立适用于五种中药材的质量评价方法。

采用移液枪各精密移取HLG-KM-YP样品1ml，分别置于12个10ml玻璃试管中，逐个加入石油醚、环己烷、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、异丙醇、四氢呋喃、甲醇、乙醇、乙腈、纯净水溶剂各1ml。采用振荡仪充分混匀，静置30min后观察分层情况。甲醇、乙醇、乙腈、纯净水作溶剂均能实现萃取分层现象，但纯净水体系乳化附着严重，不作为优选萃取溶剂。吸取甲醇、乙醇、乙腈萃取液采用0.22μm滤膜过滤后备用(HLG-KM-YP-M、HLG-KM-YP-E、HLG-KM-YP-A)，构建HPLC分析方法。

小檗碱：精密称定小檗碱标准品1.08mg，色谱甲醇定容到2ml容量瓶，采用0.22μm滤膜过滤后备用(S-XBJ)。

姜黄素：精密称定小檗碱标准品1.14mg，色谱甲醇定容到2ml容量瓶，采用0.22μm滤膜过滤后备用(S-JHS)。

藁本内酯：精密称定藁本内酯标准品1.06mg，色谱甲醇定容到2ml容量瓶，采用0.22μm滤膜过滤后备用(S-GBNZ)。

5-HMF：精密称定5-HMF标准品1.44mg，色谱甲醇定容到2ml容量瓶，采用0.22μm滤膜过滤后备用(S-HMF)。

阿魏酸：精密称定阿魏酸标准品1.21mg，色谱甲醇定容到2ml容量瓶，采用0.22μm滤膜过滤后备用(S-EWS)。

仪器：安捷伦1260型(DAD检测器)HPLC；

色谱柱型号：Agilent ZORBAX SB-C18，5μm，4.6×250mm，柱温：25℃；

流动相：色谱甲醇、水(含0.2％冰醋酸)；

流速：1ml/min

检测波长：284nm，316nm，345nm，430nm

进样量：10μl

表1.具体分析方法

时间(min)	色谱甲醇％	水(0.2％冰醋酸)％
			0	20	80
5	20	80
			10	40	60
15	50	50
			20	50	50
25	75	25
			30	75	25
35	95	5

由于现有文献仅测试过黄连膏(复方黄连组合物油膏剂)中小檗碱含量，还未见构建复方黄连组合物的指纹图谱分析方法，尤其是针对油剂中多种有效成分的测定方法。因此，本专利在建立复方黄连组合物的HPLC分析方法后，对除香油溶剂峰以外含量较大的特征性峰进行了分离纯化，并完成结构鉴定。首次确认了5-HMF是复方黄连组合物中特征性成分之一，分离纯化及鉴定方法如下：

取HLG-KM-YP药油200ml，采用甲醇等比例萃取三次，合并甲醇萃取液，采用旋转蒸发仪浓缩得到甲醇萃取浸膏。采用ODS填料(YMC，ODS-AQ-HG，12nm,S-50μm)，甲醇-水(0:100，10:90，20:90)梯度洗脱，采用HPLC对收集流份进行分析，合并5min左右的主峰，浓缩合并含主峰洗脱液，然后采用凝胶(Sep-LH20)10％甲醇等度洗脱，收集洗脱液；HPLC分析确定已完成主峰的分离纯化，浓缩合并含主峰组分，得淡黄色油状液体(36.8mg)，易溶于水、甲醇，命名HLG-1(纯度>98％)。EI-MS，M+＝126；1H NMR(CD3OD,500MHz)δ：9.52(s,,1H),7.39(d,J＝3.6Hz,1H),6.59(d,J＝3.6Hz,1H),4.62(s,2H)；13C NMR(CD3OD,125MHz)；δ：179.4(C-1),163.1(C-5),153.8(C-2),124.9(C-3),110.9(C-4),57.6(C-6)。上述数据与文献报道一致(朱海林，毛酸浆果实的化学成分研究，中草药，2016，47(5)：732-735)，鉴定HLG-1为5-羟甲基糠醛。

上述HPLC测试方法能同时测定5-HMF(284nm)、小檗碱(345nm)、姜黄素(430nm)、藁本内酯(316nm)、阿魏酸(316nm)五个主要目标化合物含量，高效灵敏，特征性强，可作为复方黄连组合物的质控方法，详细结果如图1～4所示。此外，本专利比较了甲醇、乙醇、乙腈三种萃取溶剂，HLG-KM-YP-M、HLG-KM-YP-E、HLG-KM-YP-A样品中284、316、345、430nm主峰一致，因此优选穿透力强、经济廉价的甲醇作为萃取溶剂。

通过上述方法，本专利对分别来源于KM和ZL两家饮片公司所制得药油的甲醇萃取液中(萃取一次计算)五种目标化合物含量进行了测定，每个样品重复进样3次，取各化合物对应峰面积均值计算含量。由KM和ZL两家饮片公司药材制得药油中5-HMF含量分别为0.063％和0.077％，均超过《药典》规定的低于0.004％的要求；其他药效成分在药油中含量较低，未检出EWS。详细结果如表1所示。

表1.传统工艺药油甲醇萃取液中各有效成分含测结果(n＝3)

此外，该方法能有效区分HLG-KM-YP-M样品中香油溶剂干扰峰，且证实不同品牌香油(三添、金龙鱼)所含干扰主峰基本一致，油炸前后主峰保持不变，未见明显其他特征峰产生，详情如图5所示。特别地，HLG-KM-YP-M样品中未检出阿魏酸、巴马汀、黄连碱、黄柏碱(结果如图22-26所示)。

实施例3：

按黄连(2.8g)、黄柏(2.8g)、姜黄(2.8g)、当归尾(4.66g)、生地黄(9.33g)剂量称取KM公司的五味中药饮片，黄连、黄柏、当归尾饮片剪碎成1cm以下小段，姜黄采用研钵碾碎成直径5mm左右粗颗粒，生地黄切成1cm左右小块，各加入香油(三添)121ml。采用实施例1传统油炸工艺进行提取，趁热过滤，分别得到黄连(HLG-HL)、黄柏(HLG-HB)、姜黄(HLG-JH)、生地黄(HLG-SD)、当归尾(HLG-DGW)药油。采用实例2的液相分析条件检测，测试结果显示5-HMF来源于生地黄、当归尾两味中药材；黄连、黄柏两味药材采用香油单独油炸提取，未能检测到明显的小檗碱(XBJ)及类似生物碱成分，而组方油炸提取样品HLG-KM-YP-M中则可有效检测到XBJ的存在，说明组方配伍可有利于小檗碱的溶出；阿魏酸(EWS)来源于当归尾药材；姜黄素(JHS)则来源于姜黄药材。上述测定结果详见图6～9所示。

实施例4：根据本申请的方法

分别称取KM公司黄连、黄柏、姜黄、当归尾、生地黄中药饮片各200g，采用粉碎机逐个单独粉碎，然后采用不锈钢标准筛(二号(筛孔内径平均值850μm±29μm)，四号(筛孔内径平均值250μm±9.9μm)，五号(筛孔内径平均值180μm±7.6μm)，六号筛(筛孔内径平均值150μm±6.6μm))按《药典》规定的粗粉、中粉、细粉进行过筛处理，依次得到黄连、黄柏、姜黄、生地黄、当归尾四味中药材的粗粉、中粉和细粉样品，以及生地黄药材的直径小于或等于5mm的颗粒。

称取KM公司黄连(2.80g)、黄柏(2.80g)、姜黄(2.80g)、当归尾(4.66g)中药粗粉，生地黄直径小于或等于5mm的颗粒(9.33g)，混合后放入250ml三口烧瓶，加入香油(三添)121ml，放入磁力搅拌子，将三口烧瓶置于盛有硅油的磁力搅拌器上，烧瓶中放入温度传感器，室温下搅拌60min，使药材粗粉与香油充分接触。然后调节升温，分别在油温达80、100、120、135、145、155、165、175℃时，稳定加热20min后趁热抽取药油2ml，采用纱布过滤后收集滤液。然后精密移取过滤后药油各1ml置10ml玻璃试管中，加入1ml甲醇，采用震荡仪充分混合后静置30min，移取甲醇上清液置于1.5ml离心管，加速离心后小心抽取甲醇上清液，采用0.22μm滤膜过滤后依次得到8个温度点的样品，编号HLG-KM-80、HLG-KM-100、HLG-KM-120、HLG-KM-135、HLG-KM-145、HLG-KM-155、HLG-KM-165、HLG-KM-175待用。

采用实施例2中HPLC方法分别对8个样品中5-HMF、XBJ、EWS、JHS、GBNZ的峰面积进行比较分析，每个样品重复进样3次，取各化合物对应峰面积均值：

表2.不同加热提取温度下各指标性成分峰面积变化情况(n＝3)

根据表2统计结果并结合实施例2中标准品测定结果计算，温度达到155℃时，药油中5-HMF含量已达到0.011％(仅萃取一次)，远超《药典》对5-HMF含量的要求(低于0.004％)；油温145℃时药油中5-HMF含量则在0.003％左右(萃取一次)。而传统油炸提取工艺的温度高达170℃以上，5-HMF含量则超规定的10倍以上。此外，XBJ、EWS、JHS、GBNZ四个有效成分在油温达到155度以后，含量均出现了下降趋势。因此，提取温度120-150℃为XBJ、EWS、JHS化合物的最佳提取温度，GBNZ在温度达145℃后溶出度趋于稳定。

综上，本实施例在优先控制5-HMF含量符合《药典》要求基础上，综合考虑XBJ、EWS、JHS、GBNZ溶出度，将120-150℃设定为复方黄连组合物油炸提取的最优温度区间。

实施例5：

(1)称取根据实施例4所述方法制备的KM公司黄连(2.80g)、黄柏(2.80g)、姜黄(2.80g)、当归尾(4.66g)中药粗粉，生地黄粗颗粒(9.33g)，混合后放入250ml三口烧瓶，加入香油(三添)121ml，放入磁力搅拌子，将三口烧瓶置于盛有硅油的磁力搅拌器上，烧瓶中放入温度传感器，室温下搅拌60min，使药材粗粉与香油充分接触。然后调节升温，油温达120℃时，进行计时，分别在稳定加热20、40、60、90、120、180min后趁热抽取药油2ml，采用纱布过滤后收集滤液。然后精密移取过滤后药油各1ml置10ml玻璃试管中，加入1ml甲醇，采用震荡仪充分混合后静置30min，移取甲醇上清液置于1.5ml离心管，加速离心后小心抽取甲醇上清液，采用0.22μm滤膜过滤后依次得到6个时间点的样品，编号HLG-KM-120-20、HLG-KM-120-40、HLG-KM-120-60、HLG-KM-120-90、HLG-KM-120-120、HLG-KM-120-180待用。

采用实施例2中HPLC方法对120℃提取温度下的6个时间点样品进行分析，重点考察5-HMF、XBJ、EWS、JHS、GBNZ的峰面积变化情况，测试结果如表3所示。

表3.提取温度120度时各时间点指标性成分峰面积变化情况(n＝3)

表3数据显示，提取温度120℃，提取时间40-90min，可有效控制5-HMF的大量产生，同时最大程度的保证XBJ、EWS、JHS、GBNZ的溶出。

(2)同样称取根据实施例4所述方法制备的KM公司黄连(2.80g)、黄柏(2.80g)、姜黄(2.80g)、当归尾(4.66g)中药粗粉，生地黄粗颗粒(9.33g)，混合后放入250ml三口烧瓶，加入香油(三添)121ml，放入磁力搅拌子，将三口烧瓶置于盛有硅油的磁力搅拌器上，烧瓶中放入温度传感器，室温下搅拌60min，使药材粗粉与香油充分接触。然后调节升温，油温达135℃时，进行计时，分别在稳定加热20、40、60、90、120、180min后趁热抽取药油2ml，采用纱布过滤后收集滤液。并按(1)各时间点处理方法处理样品，依次得到HLG-KM-135-20、HLG-KM-135-40、HLG-KM-135-60、HLG-KM-135-90、HLG-KM-135-120、HLG-KM-135-180待用。

采用实施例2中HPLC方法对135℃时6个时间点样品进行分析，其5-HMF、小檗碱、阿魏酸、姜黄素、藁本内酯的峰面积变化情况如表4所示。

表4.提取温度135℃时各时间点指标性成分峰面积变化情况(n＝3)

表4数据显示，提取温度135℃，提取时间20-40min，可有效控制5-HMF的大量产生，同时保证XBJ、EWS、JHS、GBNZ的最优溶出度。

(3)称取根据实施例4所述方法制备的KM公司黄连(2.80g)、黄柏(2.80g)、姜黄(2.80g)、当归尾(4.66g)中药粗粉，生地黄粗颗粒(9.33g)混合后放入250ml三口烧瓶，加入香油(三添)121ml，放入磁力搅拌子，将三口烧瓶置于盛有硅油的磁力搅拌器上，烧瓶中放入温度传感器，室温下搅拌60min，使药材粗粉与香油充分接触。然后调节升温，油温达145℃时，进行计时，分别在稳定加热20、40、60、90、120、180min后趁热抽取药油2ml，采用纱布过滤后收集滤液。并按(1)、(2)处理方法处理样品，依次得到HLG-KM-145-20、HLG-KM-145-40、HLG-KM-145-60、HLG-KM-145-90、HLG-KM-145-120、HLG-KM-145-180样品待用。

采用实施例2中HPLC方法对145℃时6个时间点样品进行分析，其5-HMF、XBJ、EWS、JHS、GBNZ的峰面积变化情况如表5所示。

表5.提取温度145度时各时间点指标性成分峰面积变化情况(n＝3)

表5数据显示，提取温度145℃，提取时间20min时5-HMF含量已达0.009％；EWS含量则随加热时间延长不断减少，明显低于120和135℃的最佳溶出度；JHS、XBJ、GBNZ含量与120和135℃加热条件比较则有一定升高。

实施例6：

为比较5-HMF、XBJ、EWS、JHS、GBNZ五种有效成分与药材粒径之间相关性，优选针对五种化合物含量变化均较为显著的工艺条件(145℃，提取时间30min)下进行比较。

称取根据实施例4所述方法制备的KM公司黄连(1.40g)、黄柏(1.40g)、姜黄(1.40g)、当归尾(2.33g)中药粗粉，生地黄粗颗粒(4.66g)，混合后放入250ml三口烧瓶，加入香油(三添)61ml，放入磁力搅拌子，将三口烧瓶置于盛有硅油的磁力搅拌器上，烧瓶中放入温度传感器，室温下搅拌60min，使药材粗粉与香油充分接触。然后调节升温，油温达145℃时，进行计时，稳定加热30min后趁热过滤收集滤液，得药油。精密移取药油1ml，加入1ml甲醇，采用震荡仪充分混合后静置30min，移取甲醇上清液置于1.5ml离心管，加速离心后小心抽取甲醇上清液，采用0.22μm滤膜过滤后得粗粉样品，编号HLG-KM-145-C。

称取根据实施例4所述方法制备的KM公司黄连(1.40g)、黄柏(1.40g)、姜黄(1.40g)、当归尾(2.33g)中药中粉，生地黄粗颗粒(4.66g)，混合后放入250ml三口烧瓶，加入香油(三添)61ml，采用上述同样方法处理，得到过滤后得中粉样品，编号HLG-KM-145-Z。

称取根据实施例4所述方法制备的KM公司黄连(1.40g)、黄柏(1.40g)、姜黄(1.40g)、当归尾(2.33g)中药细粉，生地黄粗颗粒(4.66g)，混合后放入250ml三口烧瓶，加入香油(三添)61ml，采用上述同样方法处理，得到过滤后得细粉样品，编号HLG-KM-145-X。

上述样品采用实施例2中HPLC方法对样品中5-HMF、XBJ、EWS、JHS、GBNZ的峰面积变化情况进行分析，结果如表6所示。

表6.复方黄连组合物不同粒径药材药油中5种主成分分析结果(n＝3)

表6数据显示，五种中药饮片粉碎粒径越小越有利于有效成分溶出，但相比之下，粗粉跟中粉有效化合物含量差异明显，中粉跟细粉差异不明显。由于5-HMF主要来源于SD和DGW两味药材，EWS、GBNZ来源于DGW，出于减少5-HMF产生，增加EWS、GBNZ溶出率，优选SD粗颗粒、DGW中粉作为原料；XBJ含量随粒径变化不大，从有利于生产、提高效率原则出发，黄连、黄柏采用粗粉即可；JHS含量受药材粗、中粉粒径影响明显，从经济高效原则考虑优选姜黄中粉。因此，结合实施例测定结果，本专利对五味中药原料粒径设定为：黄连、黄柏采用粗粉，当归尾、姜黄用中粉，生地黄采用粗颗粒。

实施例7

称取根据实施例4所述方法制备的KM公司黄连(1.40g)、黄柏(1.40g)粗粉，姜黄(1.40g)、当归尾(2.33g)中药中粉，生地黄粗颗粒(4.66g)，混合后放入250ml三口烧瓶，加入香油(三添)61ml，放入磁力搅拌子，将三口烧瓶置于盛有硅油的磁力搅拌器上，烧瓶中放入温度传感器，室温下搅拌60min，使药材粗粉与香油充分接触。然后调节升温，油温达135℃时，进行计时，稳定加热20min后趁热过滤收集滤液，得药油(HLG-KM-135)。精密移取药油1ml，加入1ml甲醇，采用震荡仪充分混合后静置30min，移取甲醇上清液置于1.5ml离心管，加速离心后小心抽取甲醇上清液，采用0.22μm滤膜过滤后得测试样品，编号HLG-KM-135-1。余下药油加入1ml甲醇，二次萃取，同样方法处理得测试样品，编号HLG-KM-135-2。余下药油再次加入1ml甲醇，第三次萃取，同样方法处理得测试样品，编号HLG-KM-135-3。

称取根据实施例4所述方法制备的ZL公司黄连(1.40g)、黄柏(1.40g)粗粉，姜黄(1.40g)、当归尾(2.33g)中药中粉，生地黄粗颗粒(4.66g)，混合后放入250ml三口烧瓶，加入香油(三添)61ml，采用上述同样提取及样品萃取，获得HLG-ZL-135-1，HLG-ZL-135-2，HLG-ZL-135-3测试样品。

上述样品采用实施例2中HPLC方法对样品中5-HMF、XBJ、EWS、JHS、GBNZ的含量进行测定，比较不同批次药材各有效成分的提取效率，同时考察本专利优化工艺的通用性，测试结果如表7所示，HLG-KM-135-1指纹图谱测试结果如图10～11所示。

表7.两家饮片公司来源的复方黄连组合物中五种有效成分含量测定结果(n＝3)

结果显示，采用135℃、油炸提取20min，KM和ZL两家饮片公司获得的药油，其5-HMF含量分别为0.0039％和0.0025％(累计3次萃取结果)，均达到《药典》规定的5-HMF含量要求。此外，采用黄连、黄柏粗粉，当归尾、姜黄素中粉，生地黄粗颗粒，混合后油炸提取，能显著增加XBJ、EWS、JHS和GBNZ提取效率，其第一次萃取液中相应化合物的峰面积依次为2523.9、878.8、28060.6、3186.7；而实施例6同样来源于KM公司的黄连、黄柏、当归尾、姜黄素细粉和生地黄粗颗粒组方提取药油中，第一次萃取液中XBJ、EWS、JHS和GBNZ峰面积则为2333.2、537.4、22923.6、3438.8。由此可见优化药材粒径，控制提取温度和时间，能显著XBJ、EWS、JHS和GBNZ的溶出率，尤其是JHS和EWS含量增加优势明显。该工艺大大提升了药材的利用率，同时实现了节能环保的目的。

实施例8

采用LC-MS对最优工艺获得的样品HLG-KM-135-1以及传统工艺获得的HLG-KM-YP-M、HLG-ZL-YP-M主成分进行分析，其流动相设定及方法参照实施例2。结果显示，HLG-KM-135-1样品可快速检测到5-HMF、EWS、JHS、XBJ、GBNZ、黄柏碱、巴马汀、黄连碱8个有效成分；HLG-KM-YP-M和HLG-ZL-YP-M样品只能确认5-HMF、JHS、XBJ、GBNZ 4个主要有效成分信号。HLG-KM-135-1样品具体检测结果如下：ESI-LR负离子信号能快速检测到EWS(M-H-＝193)、黄柏碱(M-H-＝341，2M-H-＝683)、JHS(M-H-＝367)信号，具体测试结果如图12～14所示；ESI-HR正离子信号则可以高效测定鉴别复方黄连组合物中7个有效成分，分别为5-HMF(M+H+＝127.0383)、XBJ(M+＝336.1227)、巴马汀(M+＝352.1523)、黄连碱(M+＝320.0914)、黄柏碱(M+＝342.1716)、GBNZ(M+H+＝191.1071)、JHS(M+H+＝369.1333)，测试结果如图15～21所示。HLG-KM-YP-M样品检测结果如下：ESI-LR负离子信号能检测到5-HMF(M-H-＝125)、JHS(M-H-＝367)信号(如图22-23所示)；ESI-LR正离子信号能检测到5-HMF(M+H+＝127)、XBJ(M+＝336)、GBNZ(M+H+＝191)信号(如图24-26所示)。HLG-ZL-YP-M样品检测结果如下：ESI-LR负离子信号能检测到5-HMF(M-H-＝125)、JHS(M-H-＝367)信号(如图27-28所示)；ESI-LR正离子信号能检测到5-HMF(M+H+＝127)、XBJ(M+＝336)、GBNZ(M+H+＝191)信号(如图29-31所示)。HLG-KM-YP-M和HLG-ZL-YP-M样品中均未检测到EWS(M-H-＝193)、巴马汀(M+＝352.1523)、黄连碱(M+＝320.0914)、黄柏碱(M+＝342.1716)成分。

综上，本专利优化工艺能最大限度的保留并提升复方黄连组合物中主要有效成分含量。本专利建立的HPLC分析方法能高效快速的分析鉴定药油中特征性化合物，采用LC-MS技术可同时检测到8个有效成分，可作为黄连膏质控的重要方法。

实施例9

精密吸取HLG-KM-135药油2ml五份，分别置于5ml塑料离心管中。按药油重量的20％、30％、50％、60％加入蜂蜡，80度水浴加热至蜂蜡与药油充分溶解，至震荡仪上混合均匀，冷却至室温。所得药膏的稠度均符合要求。

取含20％、30％、50％、60％蜂蜡的药膏各500mg左右，至于5ml塑料离心管，加入1ml甲醇，80度加热溶解，震荡均匀，测试甲醇溶液pH值，四份样品pH值均在7左右，符合软膏剂pH值小于8的要求。

上述药膏色泽金黄、质地均匀，涂抹于手臂或大腿内侧柔软皮肤上，24h内均未见发红、起疹、出现水泡现象，无明显刺激作用。

此外，取含50％蜂蜡的药膏1g,加入1ml甲醇，80℃加热溶解，震荡均匀，冷却至室温后吸取上层甲醇溶液，采用0.22μm滤膜过滤后得待测样品，编号HLG-KM-ZJ。该样品经HPLC测试，能快速检测到5-HMF、XBJ、EWS、JHS和GBNZ五个指标性成分，质控方便，可操作性强(测试结果如图32～33所示)，从而证实本专利提供的HPLC方法同样适用于多种剂型成品的质控。

按药油重量的40％加入蜂蜡-白凡士林混合物。采用其中蜂蜡分别占蜂蜡-白凡士林混合物1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％重量的多种蜂蜡-白凡士林混合物，进行行实验。80度水浴加热至蜂蜡-白凡士林混合物与药油充分溶解，至震荡仪上混合均匀，冷却至室温。所得药膏的稠度均符合要求。

按药油重量的60％加入蜂蜡-白凡士林混合物。采用其中蜂蜡分别占蜂蜡-白凡士林混合物1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％重量的多种蜂蜡-白凡士林混合物，进行行实验。80度水浴加热至蜂蜡-白凡士林混合物与药油充分溶解，至震荡仪上混合均匀，冷却至室温。所得药膏的稠度均符合要求。

按药油重量的80％加入蜂蜡-白凡士林混合物。采用其中蜂蜡分别占蜂蜡-白凡士林混合物1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％重量的多种蜂蜡-白凡士林混合物，进行行实验。80度水浴加热至蜂蜡-白凡士林混合物与药油充分溶解，至震荡仪上混合均匀，冷却至室温。所得药膏的稠度均符合要求。

按药油重量的100％加入蜂蜡-白凡士林混合物。采用其中蜂蜡分别占蜂蜡-白凡士林混合物1％、5％、10％、20％、30％、40％或50％重量的多种蜂蜡-白凡士林混合物，进行行实验。80度水浴加热至蜂蜡-白凡士林混合物与药油充分溶解，至震荡仪上混合均匀，冷却至室温。所得药膏的稠度均符合要求。

实施例10

称取HLG-KM-135药油1.0g，吐温-80 2.0g，纯净水3.0g。将吐温-80和水充分混匀(水相)，水浴加热至80℃，同时水浴加热药油至80℃(油相)。将油相趁热缓慢加入水相中，边加入边搅拌，直至冷却至室温，即可制的O/W型乳剂，该乳剂进行灌装即可制得复方黄连组合物气雾剂。

等同物

前述实施例仅用于阐述本发明，而不应看作是对本发明的范围的任何限制。显然，可以对上述本发明具体实施方案和实施例中所述的内容做出的许多修饰和变化，而并不会背离本发明的原理。所有这样的修饰和变化均被本申请所涵盖。

Claims (12)

1.一种制备复方黄连组合物的方法，包括以下步骤：

1)用油浸泡黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄；

2)加热使所述油的温度达到120～150℃，并维持预定的温度1min～60min；

3)过滤并收集滤液；

其中，所述生地黄为直径3-10mm的颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)所述黄连、黄柏、姜黄、当归尾和生地黄是饮片。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中步骤2)中，加热使所述油的温度达到130～145℃。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中维持预定的温度5-30min。

5.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：

4)将步骤3)所得滤液与药学上可接受的载体混合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述药学上可接受的载体是凡士林、蜂蜡、鲸蜡、虫白蜡、石蜡、羊毛脂、硅酮、甘油、可可豆脂、香果脂、乌柏脂、椰油酯、山苍子油酯、棕榈油酯、硬脂酸丙二醇酯、高级醇、吐温，或其两种或更多种的混合物。

7.一种复方黄连组合物，其是根据权利要求1-6中任一项所述方法制备的。

8.根据权利要求7所述的复方黄连组合物，其含有小于或等于0.004％重量的5-羟甲基糠醛。

9.根据权利要求7或8所述的复方黄连组合物，其还含有巴马汀、黄连碱、黄柏碱或阿魏酸中的一种或多种。

10.根据权利要求7或8所述的复方黄连组合物，其进一步含有小檗碱、藁本内酯或姜黄素中的一种或多种。

11.一种药物组合物，包含根据权利要求7-10中任一项所述的复方黄连组合物，以及任选的药学上可接受的载体。

12.根据权利要求7-10中任一项所述的复方黄连组合物、或者根据权利要求11的药物组合物在制备用于治疗湿热所致的皮肤或粘膜疾病的药物中的用途。

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