CN111458449A - 一种熊胆汁的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种熊胆汁的检测方法,它是采用薄层色谱法检测,步骤如下:1)制备供试品溶液:取熊胆汁,加缓冲盐溶液溶解,过滤,取续滤液作为供试品溶液;2)对照品溶液:取熊胆粉、牛胆粉、羊胆粉和猪胆粉对照药材,分别加乙醇溶解,得对照品溶液,3)薄层色谱检测:将供试品溶液和对照品溶液在薄层板上点样,以异戊醇‑冰醋酸‑水为展开剂展开,显色,检视,对比即可。
Description
技术领域
本发明涉及一种熊胆汁的检测方法。
背景技术
薄层色谱法是将供试品溶液点于薄层板上,在展开容器内用展开剂展开,所得色谱图与适宜的标准物质按同法所得的色谱图对比,用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。其利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同,使在溶剂流过吸附剂的过程中,连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附,从而使供试品所含成分分离。薄层色谱法具有设备简单、操作简便、分离速度快、灵敏度和分辨率较高等优点,被许多国家药典用于药物中杂质的检查、药物分析等方面,且是目前药典中收载最多的鉴别与有关物质检查方法之一,是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术。
熊胆为熊科动物黑熊(Selenarctos thibatanus G.Cuvier)或棕熊(Ursusarctos Linnaeus)的干燥胆,其胆汁是传统的名贵中药,具有清热、平肝、明目的功能;用于治疗惊风抽搐,目赤肿痛,咽口曛肿痛。因熊胆资源日益减少.黑熊和棕熊已列人国家二级保护动物,熊胆汁的获得途径有限,产量不高,已难以满足市场的需求,所以伪劣品越来越多,造假者将牛羊猪胆汁掺人熊胆中使之难以鉴别。目前,卫生部颁布的新药转正标准11,标准编号WS3-09(B-09)-96(Z)的各项规定,已能准确地检验出掺人熊胆中的牛、羊、猪胆,但该方法要用两种不同的薄层色谱方法才能鉴别出熊胆中是否掺人有牛、羊或猪胆,方法复杂,耗时耗力。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种熊胆汁的检测方法,其特征在于:它是采用薄层色谱法检测,步骤如下:
(1)制备供试品溶液:取熊胆汁,加缓冲盐溶液溶解,过滤,取续滤液作为供试品溶液;
(2)对照品溶液:取熊胆粉、牛胆粉、羊胆粉和猪胆粉对照药材,分别加乙醇溶解,得对照品溶液,
(3)薄层色谱检测:将供试品溶液和对照品溶液在薄层板上点样,以异戊醇-冰醋酸-水为展开剂展开,显色,检视,对比即可。
进一步地,步骤(1)中,所述熊胆汁与缓冲盐溶液的质量体积比为0.1-0.3g:2mL,优选0.2g:2mL。
进一步地,步骤(1)中,所述缓冲盐溶液为含磷酸二氢钠和庚烷磺酸钠的甲醇水溶液,其中,磷酸二氢钠、庚烷磺酸钠、甲醇和水的质量体积比为3~6g:1~3g:600mL:400mL,优选4.68g:2g:600mL:400mL。
进一步地,步骤(2)中,所述对照品溶液中每1mL含各对照药材3~8mg,优选5mg。
进一步地,步骤(3)中,所述显色的方法为:
取展开后的薄层板,晾干,喷以硫酸乙醇溶液,再加热至斑点显色清晰。
更进一步地,所述薄层板为硅胶G薄层板。
更进一步地,所述硫酸乙醇溶液浓度为8%~12%,优选10%。
更进一步地,所述加热温度为100~110℃,优选105℃。
进一步地,步骤(3)中,所述异戊醇-冰醋酸-水的体积比为16~20:4~6:2~4,优选18:5:3。
进一步地,步骤(3)中,所述检视的色谱图中,供试品在熊胆粉对照药材色谱相同位置上,显相同颜色的荧光斑点,在牛胆粉、羊胆粉、猪胆粉对照药材色谱相同位置上,不显相同颜色的荧光主斑点,即为熊胆汁。
本发明还提供了一种熊胆汁的检测方法,它包括如下步骤:
a、按照前述薄层色谱法检测;
b、取熊胆汁,按照比重瓶法测定相对密度;用pH计测定pH值;
c、取熊胆汁,加水混匀,用苯酚-硫酸法定性测定糖;用显微镜观察异性有机物。
进一步地,步骤b所述比重瓶法测定是《中国药典》2015年版四部“通则0601相对密度测定法”中的“比重瓶法”测定。
进一步地,步骤b所述用pH计测定是按照《中国药典》2015年版四部“通则0631pH值测定法”测定。
进一步地,步骤c所述苯酚-硫酸法定性测定糖的方法为:熊胆汁加10倍量v/v水,2~5滴1g/50mL的α-萘酚乙醇溶液,混匀,60℃水浴加热5min,再加入2.5倍量v/v的硫酸显色.
进一步地,步骤c所述显微镜观察方法为:熊胆汁加20倍量v/v水,离心或过滤,取不溶物在显微镜下观察。
更进一步地,所述熊胆汁在熊胆粉对照药材色谱相同位置上,显相同颜色的荧光斑点,在牛胆粉、羊胆粉和猪胆粉对照药材色谱相同位置上,不显相同颜色的荧光主斑点;相对密度不低于1.01;pH值为7.0~8.0;苯酚-硫酸法测定时液面交接处不显紫色环;显微镜观察无植物组织、动物组织或淀粉。
本发明的有益效果:本发明提供了一种熊胆汁的薄层色谱检测方法,展开效果好,特征斑点清晰易于分辨,能够有效地同时从牛胆汁、羊胆汁和猪胆汁中鉴别出熊胆汁,方法简单,易于推广,同时测定了熊胆汁的相对密度、pH值、糖和异性有机物,能更加准确的控制熊胆汁的质量。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1提取方法考察;
图2不同点样量的考察;
图3展开条件的耐用性考察(4℃);
图4展开条件的耐用性考察(30℃);
图5展开条件的耐用性考察
图6展开条件的耐用性考察;。
图7预制硅胶G板;
图8自制硅胶G板;
图9熊胆汁薄层检查;
具体实施方式
1、仪器
RJ-TGL-16C型高速离心机(无锡瑞江分析仪器有限公司);
UPH-I-10T优普超纯水器(成都超纯科技有限公司);RE2000B旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);
DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱(上海将任实验设备有限公司);ZF-90多功能暗箱式紫外透射仪(上海宝山顾村电光仪器厂);
PS-80超声波清洗机(深圳市洁康洗净电器有限公司);PHS-3C pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司);
FA1204C电子天平(上海越平科学仪器有限公司);定量点样毛细管(1μl、2μl、5μl);
SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);
HHS-8S电子恒温不锈钢水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂);
2、试药
熊胆粉对照药材(批号:121525-201202)、羊胆粉对照药材(批号:121524-201202)、牛胆粉对照药材(批号:121095-201203)、猪胆粉对照药材(批号:121273-201502),均购买于中国食品药品检定研究院。Fisher色谱甲醇(色谱纯);水(UP水,自制);甲醇、氢氧化钠、乙酸乙酯、盐酸、乙醇、异辛烷、乙醚、冰醋酸、正丁醇、1-萘酚、硫酸等为分析纯,均购买于成都市科龙化工试剂厂;硅胶G预制板,购买于青岛海洋化工厂分厂。
实施例1本发明检测方法
(1)制备供试品溶液:取熊胆汁0.2g,精密称定,置2mL量瓶中,加缓冲盐溶液(即称取磷酸二氢钠4.68g和庚烷磺酸钠2.0g溶于400mL水中,再加入600mL甲醇,摇匀即可)至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
(2)对照品溶液:取熊胆粉、牛胆粉、羊胆粉和猪胆粉对照药材,分别加乙醇溶解,制成每1mL含5mg的对照药材溶液;
(3)薄层色谱检测:吸取供试品溶液和对照品溶液各5~10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以异戊醇-冰醋酸-水(18:5:3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,在紫外光(365nm)下检视。供试品熊胆汁色谱中,在与熊胆粉对照药材色谱相同位置上,显相同颜色的荧光斑点,在牛胆粉、羊胆粉、猪胆粉对照药材色谱相同位置上,不得显相同颜色的荧光主斑点。
实施例2本发明检测方法
(1)制备供试品溶液:取熊胆汁0.2g,精密称定,置2mL量瓶中,加缓冲盐溶液(即称取磷酸二氢钠4.68g和庚烷磺酸钠2.0g溶于400mL水中,再加入600mL甲醇,摇匀即可)至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得;
(2)对照品溶液:取熊胆粉、牛胆粉、羊胆粉和猪胆粉对照药材,分别加乙醇溶解,制成每1mL含5mg的对照药材溶液;
(3)薄层色谱检测:吸取供试品溶液和对照品溶液各5~10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以异戊醇-冰醋酸-水(18:5:3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,在紫外光(365nm)下检视。供试品熊胆汁色谱中,在与熊胆粉对照药材色谱相同位置上,显相同颜色的荧光斑点,在牛胆粉、羊胆粉、猪胆粉对照药材色谱相同位置上,不得显相同颜色的荧光主斑点。
(4)按照《中国药典》2015年版四部“通则0601相对密度测定法”中的“比重瓶法”测定。
取洁净、干燥并精密称定重量的比重瓶,装满熊胆汁(温度应低于20℃或各品种项下规定的温度)后,插入中心有毛细孔的瓶塞,用滤纸将从塞孔溢出的液体擦干,置20℃(或各品种项下规定的温度)恒温水浴中,放置30分钟,随着供试液温度的上升,过多的液体将不断从塞孔溢出,随时用滤纸将瓶塞顶端擦干,待液体不再由塞孔溢出,迅即将比重瓶自水浴中取出,再用滤纸将比重瓶的外面擦净,精密称定,减去比重瓶的重量,求得供试品的重量后,将供试品倾去,洗净比重瓶,装满新沸过的冷水,再照上法测得同一温度时水的重量,按下式计算,即得;
熊胆汁的相对密度不低于1.01。
(5)按照《中国药典》2015年版四部“通则0631pH值测定法”测定;将熊胆汁摇匀,分装在3个50mL的烧杯中,用pH计测定其pH值。熊胆汁pH值为7.0~8.0。
(6)取熊胆汁0.2mL,加水2mL,滴加α-萘酚乙醇溶液(1→50)数滴(3滴),摇匀,置60℃水浴中加热5分钟,沿管壁缓缓加入硫酸约0.5mL,两液接界面不得显紫红色环。
(7)取熊胆汁0.1mL,加水2mL,离心或滤取不溶物,置显微镜下观察,不得有植物组织、动物组织或淀粉。
以下用实验例来说明本发明的有益效果。
实验例1薄层色谱条件筛选
(1)熊胆汁供试品溶液提取方法的选择
参考“中华人民共和国卫生部熊胆粉标准[(96)卫药标字Z-13号]”和“云南省食品药品监督管理局熊胆粉(冻干)标准(云YPBZ0205-2014)”,设置如下三种供试品溶液的制备。比较不同方法下的薄层色谱图,见图1。
方法一:取熊胆汁0.2g,精密称定,置2mL量瓶中,加缓冲盐溶液(即称取磷酸二氢钠4.68g和庚烷磺酸钠2.0g溶于400mL水中,再加入600mL甲醇,摇匀即可)至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
方法二:取熊胆汁0.2mL,精密量取,于1.5mL离心管中,加入800l乙腈溶液,静置1min后涡旋震荡30s,15000r/min离心10min,吸取上清液300μL,重复上述操作,吸取上清液(300μL),用甲醇定容到1.5mL,液体经0.22μm有机滤膜过滤后进样。
方法三:取熊胆汁0.1mL,精密量取,于1.5mL离心管中,精密加入乙醇900μl,混旋2min,高速(13000r/min)离心10min,取上清,即得。
从图1可见,各个提取方法之间并无明显的区别,但方法一更加简单、方便,因此选用方法一作为提取方法。
(2)不同点样量的选择
取供试品1μL、2μL、5μL、6μL、10μL和对照品溶液点于同一硅胶G板上。结果见图2。
由图2可见,样品点样量1μL~10μL均良好,为了确保检查项的限度,样品点样量相应偏大较好,故确定为样品点样量5μL~10μL。
(3)薄层色谱展开条件(不同温度)的耐用性考察
比较在4℃(冰箱冷藏室)和30℃(水浴控温)展开比较。结果见图3~图4。
从图3~图4可知,在4℃和30℃的不同温度条件下,展开情况均较好,说明此展开条件的耐用性较好。
(4)薄层色谱展开条件(不同湿度)的耐用性考察
比较在相对湿度32%(配制硫酸:水=68:100的溶液)和相对湿度72%(配制硫酸:水=27.5:100的溶液),分别将上述2种不同浓度的硫酸溶液倒入小烧杯中,放入展开缸内。薄层点样后,将薄层板放入展开缸内,密闭1小时,再倒入展开剂展开。结果见图5~图6。
从图5~图6可知,在32%和72%的不同湿度条件下,展开情况均较好,说明此展开条件的耐用性较好。
(5)不同薄层板的考察
用自制硅胶G板与预制硅胶G板的比较。结果见图7~图8。
从图7~图8可知,展开系统在自制版和预制板不同的薄层板条件下,展开情况均较好。
(6)检查项薄层色谱条件的确定
取[方法一]项下的供试品溶液。另取熊胆粉对照药材、牛胆粉对照药材、羊胆粉对照药材、猪胆粉对照药材适量,分别加乙醇制成每1mL含5mg的对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验,吸取上述五种溶液各5~10μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以异戊醇-冰醋酸-水(18:5:3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,在紫外光(365nm)下检视。供试品色谱中,在与熊胆粉对照药材色谱相同位置上,显相同颜色的荧光斑点,在牛胆粉、羊胆粉和猪胆粉对照药材色谱相同位置上,不得显相同颜色的荧光主斑点。结果见图9。
综上,本发明提供了一种熊胆汁的薄层色谱检测方法,展开效果好,特征斑点清晰易于分辨,能够有效地同时从牛胆汁、羊胆汁和猪胆汁中鉴别出熊胆汁,方法简单,易于推广。
Claims (10)
1.一种熊胆汁的检测方法,其特征在于:它是采用薄层色谱法检测,步骤如下:
(1)制备供试品溶液:取熊胆汁,加缓冲盐溶液溶解,过滤,取续滤液作为供试品溶液;
(2)对照品溶液:取熊胆粉、牛胆粉、羊胆粉和猪胆粉对照药材,分别加乙醇溶解,得对照品溶液;
(3)薄层色谱检测:将供试品溶液和对照品溶液在薄层板上点样,以异戊醇-冰醋酸-水为展开剂展开,显色,检视,对比即可。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤(1)中,所述熊胆汁与缓冲盐溶液的质量体积比为0.1-0.3g:2mL,优选0.2g:2mL;所述缓冲盐溶液为含磷酸二氢钠和庚烷磺酸钠的甲醇水溶液,其中,磷酸二氢钠、庚烷磺酸钠、甲醇和水的质量体积比为3~6g:1~3g:600mL:400mL,优选4.68g:2g:600mL:400mL。
3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤(2)中,所述对照品溶液中每1mL含各对照药材3~8mg,优选5mg。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤(3)中,所述异戊醇-冰醋酸-水的体积比为16~20:4~6:2~4,优选18:5:3;所述显色的方法为:
取展开后的薄层板,晾干,喷以硫酸乙醇溶液,再加热至斑点显色清晰。
5.根据权利要求1或4所述的检测方法,其特征在于:所述薄层板为硅胶G薄层板。
6.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于:所述硫酸乙醇溶液浓度为8%~12%,优选10%;所述加热温度为100~110℃,优选105℃。
7.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于:步骤(3)中,所述检视的色谱图中,供试品在熊胆粉对照药材色谱相同位置上,显相同颜色的荧光斑点,在牛胆粉、羊胆粉和猪胆粉对照药材色谱相同位置上,不显相同颜色的荧光主斑点,即为熊胆汁。
8.一种熊胆汁的检测方法,其特征在于:它包括如下步骤:
a、按照权利要求1~7的方法检测;
b、取熊胆汁,按照比重瓶法测定相对密度;用pH计测定pH值;
c、取熊胆汁,加水混匀,用苯酚-硫酸法定性测定糖;用显微镜观察异性有机物。
9.根据权利要求8所述的检测方法,其特征在于:步骤c所述苯酚-硫酸法定性测定糖的方法为:熊胆汁加10倍量v/v水,2~5滴1g/50mL的α-萘酚乙醇溶液,混匀,60℃水浴加热5min,再加入2.5倍量v/v的硫酸显色;所述显微镜观察方法为:熊胆汁加20倍量水,离心或过滤,取不溶物在显微镜下观察。
10.根据权利要求8~9任意一项所述的检测方法,其特征在于:所述熊胆汁在熊胆粉对照药材色谱相同位置上,显相同颜色的荧光斑点,在牛胆粉、羊胆粉和猪胆粉对照药材色谱相同位置上,不显相同颜色的荧光主斑点;相对密度不低于1.01;pH值为7.0~8.0;苯酚-硫酸法测定时液面交接处不显紫色环;显微镜观察无植物组织、动物组织或淀粉。
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