CN101603953B - 大黄及其复方制剂中多型体的大黄酚与大黄素定量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大黄及其复方制剂中多型体的大黄酚与大黄素定量测定方法。其特征：集甲醇提取、酸水解于一步，删除三氯甲烷等毒害溶剂萃取、蒸干等步骤，使前处理时间由传统法的10～15小时，降低到0.5小时，高效率，低成本，少污染。通过对流动相组分及比例探讨，以乙腈-甲醇-0.1％磷酸(40～45∶20～27∶38～30)取代甲醇-0.1％磷酸(85∶15)为流动相，解决了难以辨认的大黄素包覆杂质峰难题，确保了测定结果的准确性。以大黄酚、大黄素为测定指标，采用同一流动相，同时测定制剂中的总、游离和结合蒽醌中的大黄酚、大黄素。率先使测定指标与制剂功效相结合，提高了质控指标的科学性、合理性。方法简便、快捷、准确，适用于所有含大黄的各种剂型。

Description

大黄及其复方制剂中多型体的大黄酚与大黄素定量测定方法

技术领域

本发明涉及一种大黄及其复方制剂中多型体的大黄酚与大黄素定量测定方法。

背景技术

大黄具有泻热通肠，凉血解毒，逐瘀通经之功效。用于实热便秘，积滞腹痛，泻痢不爽，湿热黄疸，血热吐衄，目赤，咽肿，肠痈腹痛，痈肿疔疮，瘀血经闭，跌扑损伤，外治水火烫伤；上消化道出血。是临床上一味用量大，使用频率高的中药材。文献报道，大黄主含大黄蒽醌类成分，以游离蒽醌、结合蒽醌和总蒽醌等多型体存在。游离蒽醌代表性成分是大黄酚、大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素甲醚等，结合蒽醌则是游离蒽醌与各种糖以不同的连接方式形成的苷类。游离蒽醌具抗菌、消炎作用，而结合蒽醌具泻下作用。科学合理的质量控制方法应是分别控制不同型体的蒽醌含量，质量控制标准才更有意义。但目前不论中国药典还是地标升国标等法定标准收载的数百种含大黄的复方制剂，其质量控制标准存在着较大缺陷。第一，不论功效是泻下通便还是抗菌消炎，其质量标准都是以大黄酚、大黄素计的总蒽醌量。总蒽醌量高，不能反映具消炎作用的游离蒽醌含量高，同理也无法反映具泻下作用的结合蒽醌含量高，甚至出现作为抗菌消炎的制剂结合蒽醌远高于游离蒽醌的情况。总之质量控制的成分与功效不挂钩。第二，质控方法太繁琐、复杂，需用多量毒害溶剂纯化处理，费时长，成本高、效率低、污染环境，危害健康。第三，流动相的耐用性试验不符合规定，部分色谱柱大黄素波峰包覆杂质峰，且很难辨认分离(见图1)，导致测定结果的误判，直接影响制剂安全性与有效性的正确评价。将目前有关大黄的质量控制方法归纳、分析如下：

方法1取样品，剪碎，精密称取一定量，加上一定量的硅藻土，研匀，置索氏提取器中，加乙醇适量，加热回流提取至提取液无色，提取液移至50ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置烧瓶中，水浴蒸至近干，加盐酸-30％乙醇(1∶10)混合溶液15ml，置水浴中加热水解1小时，立即冷却，用三氯甲烷强力振摇提取4次，每次15ml，合并三氯甲烷液，回收三氯甲烷至干，残渣用甲醇溶解，转移至50ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液测定大黄素、大黄酚的总量(中国药典05年版麻仁丸、麻仁润肠丸等含量处理方法)。流动相：甲醇-0.1％磷酸(85∶15)。

方法分析：本测定方法仅硅藻土研磨与索氏提取至无色就要花费时间大约7～8个小时，而且样品与硅藻土研匀后，必须全部定量转移置索氏提取器中，否则，黏附在乳钵和乳锤上的样品，要带来测定误差。研细的样品与硅藻土在提取时，易形成致密层，阻止了溶剂的穿透，易造成提取不完全，进而影响结果的准确性。提取完成后，再取一定量溶液，蒸干、水解、三氯甲烷萃取、再蒸干、定容，仅样品前处理就花费时间约14～15小时，其中同时消费电能与水资源的时间达10小时以上，有机毒害试剂数百毫升。方法繁琐、费时、效率低、成本高、污染环境、危害检验人员健康，方法准确性欠佳。

方法2.取样品，剪碎，精密称取一定量，置烧杯中，加一定量水，温热，搅拌使溶散，加一定量硅藻土，拌匀，置烘箱中烘干，转移置锥形瓶中，并用一定量水洗涤烧杯及玻棒，洗液并入锥形瓶中，置烘箱中烘干，精密加入盐酸-乙醇(1∶25)混合溶液25ml，称定重量，超声处理10分钟。置水浴加热回流2小时，放冷，再称定重量，用盐酸-乙醇(1∶25)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置蒸发皿中，蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定大黄素、大黄酚的总量(中国药典05年版清宁丸含量处理方法)。流动相：甲醇-0.1％磷酸(85∶15)。

方法分析：本方法虽然无毒害试剂萃取，但程序显得仍较繁琐、复杂，费时。如温热，搅拌，硅藻土拌匀，烘箱烘干，转移，再烘干，水解，蒸干，定容等，样品前处理大约需花费2天时间，而且步骤越多，越易出现测定误差。

方法3.取样品适量，精密称定，精密加入等量的硅藻土，研匀，精密称取约4g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置塞锥形瓶中，挥去甲醇，加2.5mol/L硫酸溶液20ml，超声处理(功率250W，频率33kHz)10分钟，置水浴中加热1小时，立即冷却，移置分液漏斗中，加乙醚提取3次，每次25ml，合并乙醚液，用水15ml洗涤，弃去水液，乙醚液通过铺有适量无水硫酸钠的漏斗滤过，用少量乙醚洗涤容器与滤器，滤液低温回收溶剂至干，残渣加甲醇适量使溶解，并转移至25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液测定大黄素、大黄酚的总量(中国药典05年版大黄蛰虫丸、槟榔四消丸含量处理方法)。流动相：甲醇-0.1％磷酸(85∶15)。

方法分析：本方法与方法1类同，不同之处是该方法以回流提取1小时替代了数小时的索氏提取，较方法1节约了时间，但仍需将提取的甲醇溶液蒸干、水解，乙醚萃取，再蒸干，定容等繁琐操作，花费时间约10小时。缺点与方法1相同。

本发明就是针对上述大黄定量测定存在的缺陷，提供一种简便、快捷、准确、无污染、高效、低耗、色谱柱耐用性广、测定指标与功效挂钩的质量控制方法。通过含量测定指标的合理设定，首次使指标性成分与功效靠拢，质量标准更科学、合理、具实用价值。

发明内容

1.发明了集甲醇提取、酸水解于一步，水解结束后，补重、滤过，取一定量水解液，中和、稀释，即可。删除了三氯甲烷等有机溶剂萃取、蒸干等步骤，样品前处理时间由传统方法的约10～15小时，降低到0.5小时。大大提高了检测效率，减少了环境污染，节约了检测成本，方法简便、快捷、准确。

2.针对难以辨认的大黄素包覆杂质峰的问题，通过对流动相组分重组及比例探讨，以乙腈-甲醇-0.1％磷酸(40～45∶20～27∶38～30)取代甲醇-0.1％磷酸(85∶15)为流动相，解决了难以辨认的大黄素包覆杂质峰的难题(见图2)，各波峰分离良好，并适用于目前市售的各种反相色谱柱，确保了测定结果的准确性。

3.以大黄酚、大黄素为测定指标，采用同一流动相，同时测定制剂中的总蒽醌、游离蒽醌和结合蒽醌中的大黄酚、大黄素的量。解决了多年来测定指标难以与功效结合的难题，实现了依据制剂的不同功能主治，测定不同功效成分的愿望，使质量控制更具有现实意义。

本发明解决其技术问题所采用的方案为：

1.色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-0.1％磷酸(40～45∶20～27∶38～30)为流动相；检测波长为254nm。理论板数按大黄酚峰计算不低于3000。

2.对照品溶液制备：精密称取大黄酚和大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含大黄酚10～50μg、大黄素5～25μg的混合溶液，即得。

3.供试品溶液制备：取样品，粉碎，精密称取一定量(约相当大黄酚1～10mg，大黄素0.5～5mg)，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(10∶1)的混合溶液20～50ml，称定重量，如为药材、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等无蜂蜜样品，置80℃的水浴中加热回流20～40分钟；如为蜜丸类样品，需浸泡10小时以上，超声使溶散，再置80℃的水浴中加热回流，放冷，若瓶壁有黏附，超声去除，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1～5ml，置5～10ml量瓶中，加2％的氢氧化钠溶液1～2ml，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为测定总蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液。

再取上述粉碎的样品一定量(约相当大黄酚0.1～1.25mg，大黄素0.05～0.6mg)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10～25ml，称定重量，如为药材、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等无蜂蜜样品，超声处理(功率为160W，频率为50kHz)20～40分钟；如为蜜丸类样品，需浸泡10小时以上，玻棒研磨使样品溶散，用数滴甲醇冲洗玻棒于锥形瓶中，超声处理(功率为160W，频率为50kHz)20～40分钟；放冷，称定重量，用甲醇补足或挥散至原重量，摇匀，滤过，取续滤液作为测定游离蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液。

4.测定法：分别精密吸取对照品溶液与上述二种供试品溶液各10～20μl，注入液相色谱仪，测定。分别计算总蒽醌中大黄酚、大黄素与游离蒽醌中大黄酚、大黄素的量，以总蒽醌中大黄酚、大黄素量减去游离蒽醌中大黄酚、大黄素量，即为结合蒽醌中大黄酚、大黄素的量。

本发明的原理如下：

依据相似相溶的原理，利用游离蒽醌及其蒽醌甙类都易溶于甲醇，用甲醇替代水作为水解溶剂，形成了在均一相系的边提取，边水解，反应完全。不但缩短了提取，水解时间，而且降低了水解温度，最大限度地保存了酚类成分，解决了高温回流，瓶壁结痂，含量测定准确性差的难题。水解后，取一定量水解液，中和、稀释，即可。整个处理程序无理论上的任何损失，提高了测定的重现性和准确性。通过中和，使溶液pH值在弱酸性，维持蒽醌类的分子状态，利于波峰分离。再通过流动相组分的重组，彻底解决了大黄素波峰包覆，难以分离，影响结果准确性的弊端。

本发明的创新点及有益效果如下：

(1)集甲醇提取、酸水解于一步，去除了三氯甲烷等有机溶剂萃取、蒸干等步骤，使样品前处理时间由传统方法的平均10～15小时，降低到0.5小时。大大提高了检测效率，减少了环境污染，节约了检测成本，提高了方法的重现性和准确性。

(2)通过对流动相组分重组及比例探讨，以乙腈-甲醇-0.1％磷酸(40～45∶20～27∶38～30)为流动相，解决了难以辨认的大黄素波峰包覆杂质峰的难题，各波峰分离良好，并适用于目前市售的各种反相色谱柱，保证了测定结果的准确性。

(3)以大黄酚、大黄素为测定指标，采用同一流动相，同时测定制剂中的总蒽醌、游离蒽醌和结合蒽醌中的大黄酚、大黄素的量。不但节约了多型体下的各对照物质与其相应的流动相、测定时间，还为难以获得对照品的中药有效成分苷或苷元类的同时测定提供了研究思路。最为关键的是：率先使测定指标与制剂的功效相结合，进一步提高了质量控制指标的科学性、合理性。并在中药质量控制领域起到了示范作用，推动了质量控制指标向功效靠拢的科学步伐。间接地发挥着监督制备工艺必须按规定操作的作用。

(4)发明的上述创新内容，已在虎杖、决明子、何首乌、大黄、大黄流浸膏以及承担完成的中国药典2010版一部11个大黄系列品种的质量标准起草中得到了成功应用。11个品种名单是：大黄蛰虫丸、槟榔四消丸(水丸)、槟榔四消丸(蜜丸)、六味安消散、麻仁丸、麻仁润肠丸、三黄片、清宁丸、分清五淋丸、黄连上清丸、礞石滚痰丸。11个品种全国涉及633家企业，上万批产品。发明方法与传统的质量控制方法相比，在增加一倍测定指标的情况下，还比原方法节约数吨氯仿等毒害试剂，时间120000小时(按一人工作量计近65年)，其中有80％时间在同时耗费着电能或水资源，更重要的是减少了数吨毒害试剂的环境污染。该发明为社会带来的经济效益和社会效益是非常显著的。

(5)本方法还具有简便、快捷、准确、重现性好、精密度高、易于普及掌握的特点。

(6)本发明方法具有广泛的适用性，适用于各种含大黄酚、大黄素的药材及其水丸、蜜丸、片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、液体制剂等多种剂型。处方组成由几味药材到数十味药材，其中含大黄酚、大黄素的药材不论是以原粉加入，还是以浸膏加入，定量测定都能获得分离良好的色谱图与准确的测定结果。

附图说明

图1六味安消散大黄素包覆杂质峰的HPLC色谱图(原流动相)

图2六味安消散大黄素分离良好的HPLC色谱图(新流动相)

图3-1大黄酚、大黄素对照品HPLC色谱图

图3-2大黄蛰虫丸样品HPLC色谱图

图3-3大黄蛰虫丸空白样品HPLC色谱图

图4-1大黄蛰虫丸耐用性试验HPLC色谱图shimadzu-VP-ODS柱

图4-2大黄蛰虫丸耐用性试验HPLC色谱图ZOBAX SB-C18柱

图4-3大黄蛰虫丸耐用性试验HPLC色谱图Waters symmetry Shield^TM柱

图5-1大黄酚、大黄素对照品HPLC色谱图图

图5-2麻仁润肠丸样品HPLC色谱图

图5-3麻仁润肠丸空白样品HPLC色谱图

图6-1麻仁润肠丸耐用性试验HPLC色谱图shimadzu-VP-ODS柱

图6-2麻仁润肠丸耐用性试验HPLC色谱图Waters symmetry Shield^TM柱

图6-3麻仁润肠丸耐用性试验HPLC色谱图ZOBAX SB-C18柱

图7-1大黄酚、大黄素对照品HPLC色谱图图

图7-2六味安消散样品HPLC色谱图

图7-3六味安消散空白样品HPLC色谱图

图8-1六味安消散耐用性试验HPLC色谱图shimadzu-VP-ODS柱

图8-2六味安消散耐用性试验HPLC色谱图Waters symmetry Shield^TM柱

图8-3六味安消散耐用性试验HPLC色谱图ZOBAX SB-C18柱

图9-1大黄酚、大黄素对照品HPLC色谱图图

图9-2三黄片样品HPLC色谱图

图9-3三黄片空白样品HPLC色谱图

图10-1三黄片耐用性试验HPLC色谱图shimadzu-VP-ODS柱

图10-2三黄片耐用性试验HPLC色谱图Waters symmetry Shield^TM柱

图10-3三黄片耐用性试验HPLC色谱图ZOBAX SB-C18柱

图11-1大黄酚、大黄素对照品HPLC色谱图图

图11-2分清五淋丸样品HPLC色谱图

图11-3分清五淋丸空白样品HPLC色谱图

图12-1分清五淋丸耐用性试验HPLC色谱图shimadzu-VP-ODS柱

图12-2分清五淋丸耐用性试验HPLC色谱图ZOBAX SB-C18柱

图12-3分清五淋丸耐用性试验HPLC色谱图Diamonsil-18

图1中，1为大黄素与杂质的混合色谱峰，2为大黄酚色谱峰。

图2中，1为大黄素色谱峰，2为大黄酚色谱峰，3为图1中大黄素包覆的杂质峰。

图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12中，1为大黄素色谱峰，2为大黄酚色谱峰。

本发明具体实施方式如下：

实例1大黄蛰虫丸中大黄的定量测定

【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-0.1％磷酸(40～45∶20～27∶38～30)为流动相；检测波长为254nm。理论板数按大黄酚峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备 取大黄酚和大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含大黄酚10μg、大黄素5μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备 取本品水蜜丸，研细，取0.5g，精密称定；或取小蜜丸或重量差异项下的大蜜丸，剪碎(直径2mm以下)，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(10∶1)的混合溶液25ml，称定重量，小蜜丸或大蜜丸浸泡10小时以上，超声使溶散，置80℃的水浴中加热回流30分钟，放冷，若瓶壁有黏附，超声去除，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2～3ml，置5～10ml量瓶中，加2％的氢氧化钠溶液1～2ml，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为测定总蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液。

再取水蜜丸粉末0.3～0.5g，精密称定；或剪碎的小蜜丸或大蜜丸0.5～1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，小蜜丸或大蜜丸浸泡10小时以上，用玻棒研磨使样品溶散，用数滴甲醇冲洗玻棒于锥形瓶中，超声处理(功率160W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足或挥散至原重量，摇匀，滤过，取续滤液作为测定游离蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液。

测定法 分别精密吸取对照品溶液与上述两种供试品溶液各10～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。分别计算总蒽醌中大黄酚、大黄素与游离蒽醌中大黄酚、大黄素的量，结果见附表1，专属性试验见图3-1、3-2、3-3，耐用性试验见图4-1、4-2、4-3。

本品含大黄以总蒽醌中的大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)、大黄素(C₁₅H₁₀O₅)总量计，水蜜丸每1g不得少于1.1mg，小蜜丸每1g不得少于0.8mg，大蜜丸每丸不得少于2.4mg；以游离蒽醌中的大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)、大黄素(C₁₅H₁₀O₅)总量计，水蜜丸每1g不得少于0.7mg，小蜜丸每1g不得少于0.5mg，大蜜丸每丸不得少于1.6mg。

实例2麻仁润肠丸中大黄的定量测定

【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-0.1％磷酸(40～45∶20～27∶38～30)为流动相；检测波长为254nm。理论板数按大黄酚峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备 精密称取大黄酚和大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含大黄酚10μg、大黄素5μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备 取重量差异项下的本品，剪碎(直径2mm以下)，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(10∶1)的混合溶液25ml，称定重量，浸泡10小时以上，超声使溶散，置80℃的水浴中加热回流30分钟，放冷，若瓶壁有黏附，超声去除，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2～3ml，置5～10ml量瓶中，加2％的氢氧化钠溶液1～2ml，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为测定总蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液。

取上述剪碎的样品0.5～1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，浸泡10小时以上，用玻棒研磨使样品溶散，用数滴甲醇冲洗玻棒于锥形瓶中，超声处理(功率160W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足或挥散至原重量，摇匀，滤过，取续滤液作为测定游离蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液。

测定法 分别精密吸取对照品溶液与上述两种供试品溶液各10～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。分别计算总蒽醌中大黄酚、大黄素与游离蒽醌中大黄酚、大黄素的量，以总蒽醌中大黄酚、大黄素量减去游离蒽醌中大黄酚、大黄素量，即为结合蒽醌中大黄酚、大黄素的量，结果见附表2，专属性试验见图5-1、5-2、5-3，耐用性试验见图6-1、6-2、6-3。

本品每丸含大黄以总蒽醌中的大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)、大黄素(C₁₅H₁₀O₅)总量计，不得少于4.0mg；以结合蒽醌中的大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)、大黄素(C₁₅H₁₀O₅)总量计，不得少于2.0mg。

实例3六味安消散中大黄的定量测定

【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-0.1％磷酸(40～45∶20～27∶38～30)为流动相；检测波长为254nm。理论板数按大黄酚峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备 取大黄酚和大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含大黄酚18μg、大黄素8μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备 取本品0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(10∶1)混合溶液25ml，称定重量，置80℃的水浴中加热回流30分钟，放冷，若瓶壁有黏附，超声去除，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2～3ml，置5～10ml的量瓶中，加2％的氢氧化钠溶液1～2ml，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为测定总蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液。

再取本品0.5～0.8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟(功率160W，频率50kHz)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为测定游离蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液。

测定法 分别精密吸取对照品溶液与上述两种供试品溶液各10～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。分别计算总蒽醌中大黄酚、大黄素与游离蒽醌中大黄酚、大黄素的量，以总蒽醌中大黄酚、大黄素量减去游离蒽醌中大黄酚、大黄素量，即为结合蒽醌中大黄酚、大黄素的量，结果见附表3，专属性试验见图7-1、7-2、7-3，耐用性试验见图8-1、8-2、8-3。

本品每1g含大黄以总蒽醌中的大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)、大黄素(C₁₅H₁₀O₅)总量计，不得少于1.4mg；以结合蒽醌中的大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)、大黄素(C₁₅H₁₀O₅)总量计，不得少于0.8mg。

实例4三黄片中大黄的定量测定

【含量测定】大黄 照高效液相色谱法(中国药典一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-0.1％磷酸(40～45∶20～27∶38～30)为流动相；检测波长为254nm。理论板数按大黄酚峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备 取大黄酚和大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含大黄酚10μg、大黄素5μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备 取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(10∶1)的溶液25ml，称定重量，置80℃的水浴中加热回流30分钟，放冷，若瓶壁有黏附，超声去除，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml，置10ml的量瓶中，加2％的氢氧化钠溶液0.5ml，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为测定总蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液。

再取本品粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率160W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为测定游离蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液。

测定法 分别精密吸取对照品溶液与上述两种供试品溶液各10μl～20μl，注入液相色谱仪，测定。分别计算总蒽醌中大黄酚、大黄素与游离蒽醌中大黄酚、大黄素的量，以总蒽醌中大黄酚、大黄素量减去游离蒽醌中大黄酚、大黄素量，即为结合蒽醌中大黄酚、大黄素的量，结果见附表4，专属性试验见图9-1、9-2、9-3，耐用性试验见图10-1、10-2、10-3。

本品每片含大黄以总蒽醌中的大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)、大黄素(C₁₅H₁₀O₅)总量计，小片不得少于1.8mg，大片不得少于3.6mg；以结合蒽醌中的大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)、大黄素(C₁₅H₁₀O₅)总量计，小片不得少于1.0mg，大片不得少于2.0mg。

实例5分清五淋丸中大黄的定量测定

【含量测定】照高效液相色谱法(中国药典一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-0.1％磷酸(40～45∶20～27∶38～30)为流动相；检测波长为254nm。理论板数按大黄酚峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备 取大黄酚和大黄素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含大黄酚12μg、大黄素5μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备 取本品适量，粉细(过50目筛)，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(10∶1)的混合溶液25ml，称定重量，置80℃的水浴中加热回流30分钟，放冷，若瓶壁有黏附，超声去除，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2～3ml，置5～10ml量瓶中，加2％的氢氧化钠溶液1～2ml，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为测定总蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液。

再取本品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率160W，频率50kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为测定游离蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液。

测定法 分别精密吸取对照品溶液与上述两种供试品溶液各10～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。分别计算总蒽醌中大黄酚、大黄素与游离蒽醌中大黄酚、大黄素的量，结果见附表5，专属性试验见图11-1、11-2、11-3，耐用性试验见图12-1、12-2、12-3。

本品每1g含大黄以总蒽醌中的大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)、大黄素(C₁₅H₁₀O₅)总量计，不得少于1.2mg，以游离蒽醌中的大黄酚(C₁₅H₁₀O₄)、大黄素(C₁₅H₁₀O₅)总量计，不得少于0.7mg。

表1大黄蛰虫丸中大黄酚、大黄素含量测定结果

注：^*表示结合率、+表示大蜜丸、#表示小蜜丸、其他表示水蜜丸。

表2麻仁润肠丸中大黄酚、大黄素含量测定结果

^*表示结合率。

表3六味安消散中大黄酚、大黄素含量测定结果

^*表示结合率。

表4三黄片中大黄酚、大黄素含量测定结果

^*为结合率，#为薄膜衣片大片，其余均为小片。

表5分清五淋丸中大黄酚、大黄素含量测定结果

注：^*表示结合率

Claims (1)

1.本发明涉及一种大黄及其复方制剂中多型体的大黄酚与大黄素定量测定方法，其特征在于：

(1)色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-甲醇-0.1％磷酸体积比40～45∶20～27∶38～30为流动相；检测波长为254nm；理论板数按大黄酚峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液制备：精密称取大黄酚和大黄素对照品，加甲醇制成每1ml含大黄酚10～50μg、大黄素5～25μg的混合溶液，即得；

(3)供试品溶液制备：取样品，粉碎，精密称取一定量相当大黄酚1～10mg、大黄素0.5～5mg，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸体积比10∶1的混合溶液20～50ml，称定重量，如为药材、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂无蜂蜜样品，置80℃的水浴中加热回流20～40分钟；如为蜜丸类样品，需浸泡10小时以上，超声使溶散，再置80℃的水浴中加热回流，放冷，若瓶壁有黏附，超声去除，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1～5ml，置5～10ml量瓶中，加2％的氢氧化钠溶液1～2ml，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为测定总蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液；

再取上述粉碎的样品一定量相当大黄酚0.1～1.25mg、大黄素0.05～0.6mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10～25ml，称定重量，如为药材、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂无蜂蜜样品，采用功率为160W，频率为50kHz超声处理20～40分钟；如为蜜丸类样品，需浸泡10小时以上，玻棒研磨使样品溶散，用数滴甲醇冲洗玻棒于锥形瓶中，再采用功率为160W，频率为50kHz超声处理20～40分钟；放冷，称定重量，用甲醇补足或挥散至原重量，摇匀，滤过，取续滤液作为测定游离蒽醌中大黄酚、大黄素的供试品溶液；

(4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与上述二种供试品溶液各10～20μl，注入液相色谱仪，测定，分别计算总蒽醌中大黄酚、大黄素与游离蒽醌中大黄酚、大黄素的量，以总蒽醌中大黄酚、大黄素的量减去游离蒽醌中的大黄酚、大黄素量，即为结合蒽醌中大黄酚、大黄素的量。

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