CN111455104B - 寨卡病毒基因片段的荧光检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种寨卡病毒（ZIKV）基因片段荧光检测试剂盒及其制备方法。本发明通过测试反应体系中荧光分子的荧光信号，实现了对于ZIKV基因片段的特异性和灵敏度的检测。对于ZIKV基因片段检测，第一试剂、第二试剂中的H1、H2和aDNA为针对ZIKV基因片段设计的核苷酸序列不同的DNA链。本发明公开的检测试剂盒制备简单、检测灵敏度高、特异性好，在ZIKV病毒检测等领域有广泛的应用前景。

Description

寨卡病毒基因片段的荧光检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物检测和光谱学检测领域，涉及一种寨卡病毒(ZIKV)基因片段荧光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
寨卡病毒(ZIKV)是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒。寨卡病毒病典型的症状包括急性起病的低热、斑丘疹、关节疼痛(主要累及手、足小关节)、结膜炎等。这种疾病通常轻度症状持续时间从几天到一个星期后自愈。病疾严重时，需要住院治疗，因此本病致死是罕见的。研究表明，新生儿小头畸形、格林-巴利综合征(吉兰-巴雷综合征)可能与寨卡病毒感染有关。
然而目前并没有有效的ZIKV疫苗，所以通过早期诊断对于寨卡病毒进行有效的防范与控制就显得十分重要。目前，有诸多可用于病毒检测的方法，包括病毒分离鉴定、血清学诊断、病毒核酸的快速检测方法(RT-PCR、RRT-PCR和LAMP等)以及核酸扩增检测等。这些检测方法多数比较复杂、步骤繁琐，且需要大而昂贵的热循环仪。而核酸扩增检测是一种依赖核酸序列的等温扩增技术，以特定的ZIKV病毒基因片段序列为检测目标，对人体的唾液、尿液或血清样本中的核酸进行体外定量检测。
近些年来，通过结合新技术和新方法发展了大量的信号放大检测低浓度DNA的方法，这些方法通过增加标记探针的数量或增强标记物的信号强度提高检测的灵敏度，而无需对靶分子进行直接扩增，因而在病毒的检测方面具有广阔的发展前景。
发明内容
发明目的：本发明立足于ZIKV病毒快速简便测定的重大需求，结合荧光技术与信号放大技术，设计并提出一种具有特异性选择或识别功能的锁状DNA(LLD)，其由发夹DNA(H1)与辅助DNA(aDNA)序列杂交形成，LLD具有靶标循环扩增能力，可特异性识别ZIKV病毒基因，借助燃料发夹DNA链(H2)，以触发修饰荧光分子的aDNA从连接在金纳米粒子(AuNPs)表面的LLD上脱离而产生更多游离的荧光团。构建高灵敏检测ZIKV的荧光传感器，建立传感体系，实现痕量ZIKV基因的高灵敏、特异性检测，为病毒基因扩增检测提供了一个更加通用的平台。因此，本发明所要解决技术问题是提供了一种寨卡病毒(ZIKV)基因片段荧光检测试剂盒。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种寨卡病毒(ZIKV)基因片段荧光检测试剂盒的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供了一种寨卡病毒(ZIKV)基因片段荧光检测试剂盒的检测方法。
技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本发明采用以下技术方案：一种寨卡病毒基因片段荧光检测试剂盒，所述寨卡病毒基因片段荧光检测试剂盒包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂为检测探针，所述第二试剂为燃料发夹型DNA单链H2，所述检测探针为连接在金纳米粒子表面的锁状结构DNA，所述锁状结构DNA为发夹型DNA单链H1与辅助核酸链aDNA混合并退火形成。
在一些实施方式中，所述发夹型DNA单链H1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述燃料发夹型DNA单链H2的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述辅助核酸链aDNA的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。
在一些实施方式中，所述金纳米粒子粒径为15～100nM。作为优选地，所述金纳米粒子粒径为15nM。
在一些实施方式中，所述第一试剂浓度为1～100nM，作为进一步优选地，所述第一试剂浓度为2.3nM。具体地，在合成第一试剂的过程中，金纳米粒子(AuNP)的量为50μL，2.3nM，LLD是10μL，5μM，经离心提纯后定容到50μL即得。
本发明内容还包括所述的寨卡病毒基因片段荧光检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1)第一试剂的制备：
S1、根据ZIKV病毒基因序列设计并合成对应的发夹型DNA单链H1，再根据发夹型DNA单链H1设计并合成对应的修饰有荧光分子辅助核酸链aDNA；
S2、将发夹型DNA单链H1与荧光分子辅助核酸链aDNA混合并退火形成锁状结构DNA，记为LLD；
S3、取LLD、AuNPs和PBS混合，并加入NaCl溶液，摇匀过夜得混合液；
S4、离心提纯去除上清液，得到终产物AuNP-LLD检测探针即为第一试剂；
2)第二试剂的制备：根据发夹型DNA单链H1设计并合成燃料发夹DNA单链H2即为第二试剂。
在一些实施方式中，所述步骤S2中的发夹型DNA单链H1与荧光分子辅助核酸链aDNA的物质的量比为1∶1。
在一些实施方式中，所述步骤S3中的LLD、AuNPs物质的量比为≥100∶1。
在一些实施方式中，所述燃料发夹型DNA单链H2，以触发修饰荧光分子的aDNA从连接在金纳米粒子(AuNPs)表面的LLD结构上脱离而产生更多游离的荧光团。
在一些实施方式中，所述的发夹型DNA单链H1、辅助核酸链aDNA、发夹型DNA单链H2为人工合成。
在一些实施方式中，具有特异性识别功能的锁状DNA(LLD)，由发夹DNA(H1)与辅助DNA(aDNA)序列杂交形成，LLD结构可特异性识别ZIKV病毒基因，借助燃料发夹DNA链(H2)，以触发修饰荧光分子的aDNA从连接在金纳米粒子(AuNPs)表面的LLD上脱离而产生更多游离的荧光团。
本发明通过设计合理的核酸杂交体系，可实现目标DNA的循环使用及染料分子信号放大，进一步提高检测限。
在一些实施方式中，所述的锁状结构DNA(LLD)由发夹型DNA单链H1与辅助DNA(aDNA)序列杂交形成，发夹DNA(H1)的5′端修饰巯基，辅助DNA(aDNA)的5′端及3′端均修饰荧光分子，所述染料分子为本领域常规的标记染料(荧光染料分子FAM)，荧光染料分子包含但不仅限于FAM。
在一些实施方式中，所述金纳米颗粒胶体规格为15nmAuNPs，浓度为2.3nM。
在一些实施方式中，第一试剂中的发夹型DNA单链H1和aDNA为针对ZIKV基因片段设计的核苷酸序列不同的DNA链，H1的5′端修饰巯基，H1和aDNA的部分核苷酸序列互补杂交形成锁状结构(LLD)；第二试剂H2为根据H1设计的燃料发夹DNA。第一试剂中加入ZIKV与第二试剂燃料发夹DNA单链H2，ZIKV打开发夹型结构形成H1-ZIKV双链，借助燃料发夹DNA单链H2，以触发修饰荧光分子的aDNA从连接在金纳米粒子(AuNPs)表面的LLD上脱离，并循环出ZIKV。
在一些优选实施方式中，第二试剂的浓度不同，燃料发夹DNA链(H2)的浓度为5-40μM，最佳浓度为20μM；当H2浓度过低时，仍有部分修饰荧光分子aDNA连接在金纳米粒子(AuNPs)表面被猝灭，不能准确检测ZIKV病毒基因。
在一些优选实施方式中，所述第一试剂的制备具体包括以下步骤：
1.1、通常为了使得发夹型DNA单链H1能一直保留发夹型结构，我们会在进一步实验时将发夹型DNA单链H1置于摇匀仪中95℃退火5min以使其始终保持发夹型结构；
1.2、将5μL 10μM发夹型DNA单链H1与5μL 10μM aDNA混合并退火(95℃，5min)形成锁状结构DNA(记为LLD)；
1.3、取5μL 10μM LLD与50μL 2.3nM AuNPs和5μL 1×PBS混合，并以30分钟为间隔分4次将10μL 2M NaCl溶液缓慢添加到上述混合物中，25℃摇匀过夜；
1.4、离心提纯(9000rpm，20min)3次去除上清液，用0.1×PBS定容至50μL，得到终产物AuNP-LLD检测探针，即第一试剂。
本发明所述的寨卡病毒(ZIKV)基因片段荧光检测试剂盒的检测方法，具体为分别加入不同浓度ZIKV基因片段的缓冲液，得到不同浓度基因片段对应的荧光信号强度，以ZIKV基因片段浓度的对数为横坐标，以荧光信号强度为纵坐标做出工作曲线。最后，通过加入待测样品溶液共培养后，最后测试得到荧光信号，对照工作曲线计算得出待测样品中ZIKV基因片段的浓度。
具体地，所述的ZIKV基因片段荧光检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
I.在第一试剂AuNP-LLD检测探针中加入第二试剂H2与待检测样品共同培养；
II.对I产物实施荧光检测，对照工作曲线，读出样品中ZIKV基因片段浓度。
其中，所述步骤I的培养条件为摇匀仪中设置参数25℃，300rpm，150min，第二试剂用量为5μL 20μM H2，待检测样品用量为5μL。
作为进一步优选，步骤I中所述加入H2浓度范围为5-40μM，加入H2的最佳浓度为20μM，体积为5μL，培养条件为25℃，振荡培养150min。
作为进一步优选，步骤II所述荧光检测为检测aDNA上标记的荧光分子的荧光信号。
其中，本发明的该试剂盒的检测浓度范围为0.9fM-100pM。
本发明的检测原理：具有特异性识别功能的锁状DNA(LLD)，由发夹DNA(H1)与辅助DNA(aDNA)序列杂交形成，LLD结构可特异性识别ZIKV病毒基因，借助燃料发夹DNA链(H2)，以触发修饰荧光分子的aDNA从连接在金纳米粒子(AuNPs)表面的LLD上脱离而产生更多游离的荧光团。最后，检测荧光信号，通过检测从LLD结构上脱离的修饰荧光分子的aDNA的荧光信号，实现对于ZIKV基因片段的特异性、高灵敏检测。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：本发明结合核酸信号放大技术，运用巧妙设计的锁状结构(LLD)将加入的ZIKV病毒基因片段进行循环使用，并应用杂交链式链置换反应实现染料分子信号放大，进一步提高检测灵敏度，该传感器检测限可达到0.90fM。同时对各种病毒基因片段检测具有的普适性。本发明通过测试溶液中荧光分子的荧光信号，实现了对于ZIKV病毒基因片段的特异性、灵敏度检测。对于ZIKV基因片段检测，第一试剂、第二试剂中的H1、aDNA和H2为针对ZIKV基因片段设计的核苷酸序列不同的DNA链。本发明公开的检测试剂盒制备简单、检测灵敏度高、特异性好，在ZIKV病毒检测等领域有广泛的应用前景。
附图说明
图1是寨卡病毒(ZIKV)基因片段荧光检测试剂盒工作原理图；
图2是实施例1靶标循环扩增策略检测ZIKV病毒的作用机制的验证实验；
图3是实施例1检测ZIKV病毒的作用机制的荧光验证实验；图3A是试剂盒验证检测ZIKV病毒作用机制的荧光谱图；图3B是图3A中荧光谱线520nm位移处峰值统计；
图4是实施例1荧光检测试剂盒ZIKV基因片段H2浓度优化实验；图4A是试剂盒验证检测ZIKV基因片段H2浓度优化的荧光谱图；图4B是图4A中荧光谱线520nm位移处峰值统计；
图5是实施例2荧光检测试剂盒检测ZIKV基因片段的最佳时间；图5A是试剂盒验证检测ZIKV基因片段最佳时间的荧光谱图；图5B是图5A中荧光谱线520nm位移处峰值统计；
图6是实施例2荧光检测试剂盒中AuNP-LLD探针的稳定性实验；
图7是实施例2荧光检测试剂盒在血清溶液中ZIKV基因片段检测的工作曲线；图7A是试剂盒检测不同浓度ZIKV基因片段对应的荧光谱图；图7B是图7A中荧光谱线520nm位移处峰值统计；
图8是实施例2荧光检测试剂盒ZIKV基因片段特异性检测；图8A是试剂盒检测ZIKV基因片段、单碱基错配序列、双碱基错配序列缓冲液样品的荧光谱图；图8B是图8A中荧光谱线520nm位移处峰值统计。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制。
本发明所使用的6种DNA链片段均为人工合成得到，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。H1，H2下划线部分为发夹茎部互补部分，H1与aDNA中加粗部分与阴影加粗部分为形成LLD的互补部分；ZIKV-1mis，ZIKV-2mis中加粗部分为错配碱基。
对应的H1、H2、aDNA碱基序列为：
Figure BDA0002443974650000061
ZIKV基因片段序列为：5′-AGC ATA TTG ACG TGG GAA AGA C-3′
因片段特异性实验对应的单碱基错配序列(ZIKV-1mis)，双碱基错配序列(ZIKV-2mis)碱基序列为：
单碱基错配序列(ZIKV-1mis)：5′-AGC ATA TTG ACG TGG GAA GGA C-3′；
双碱基错配序列(ZIKV-2mis)：5′-AGC ATA TTG ACA TGG GAA GGA C-3′；
ZIKV以下实施例中金纳米颗粒规格皆为：2.3nM AuNPs(15nm)。
实施例1寨卡病毒(ZIKV)基因片段的荧光试剂盒的制备
1、发夹型DNA单链H1、aDNA、H2的设计与合成：
根据ZIKV病毒基因序列设计并合成对应的发夹型DNA单链H1，该发夹型DNA单链H15′端部分序列与ZIKV基因片段互补，且同时具备发夹型结构；形成发夹结构能实现并提高ZIKV检测特异性。
进一步地，为了能确保H1与aDNA高产率形成锁状结构LLD，根据发夹型DNA单链H1设计并合成了aDNA；因此，ZIKV存在时能与H1部分序列互补，使得LLD部分打开。H1部分碱基序列结合aDNA，部分碱基序列结合ZIKV；
再进一步地，为了H2存在时能高效互补H1并把aDNA和ZIKV置换下来，设计并合成了燃料发夹DNA单链H2。
2、寨卡病毒(ZIKV)基因片段的荧光试剂盒的制备
(1)将发夹型DNA单链H1和燃料发夹DNA单链H2分别置于摇匀仪中95℃退火5min以使其分别始终保持发夹型结构；
(2)将5μL 10μM发夹型结构H1与5μL 10μM aDNA混合并退火(95℃，5min)形成锁状结构DNA(记为LLD)；
(3)向PCR管中加入50μL 2.3nM AuNPs(15nm)、LLD和5μL 0.1×PBS，并于25℃温度下300rpm培育12h得到混合液1；
(4)向步骤(3)得到的混合液1进行加盐老化得到混合物1：以30分钟为间隔分4次将10μL的2M NaCl溶液缓慢添加到上述混合物1中，最终NaCl浓度为0.3M，然后在25℃300rpm的条件下摇振12h得到混合液2；
(5)将步骤(4)得到的混合液2通过离心(9000rpm，20min)3次去除未连接到AuNP上的少数DNA，离心后抽取上清液，而后用0.1×PBS的定容溶液为50μL，即为第一试剂浓度为2.3nM。
第二试剂：根据序列合成燃料发夹DNA单链H2，其浓度可以为5～40μM。
实施例2工作曲线的建立及灵敏度计算
在实施例1制备的试剂盒的50μL、2.3nM第一试剂与5μL，20μM第二试剂混合后分别加入5μL浓度为1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM的人工合成的ZIKV基因片段，并放置于摇匀仪中设置参数25℃，300rpm，150min后取出样品进行荧光检测，测试得到荧光强度，根据荧光强度和ZIKV浓度对数的关系获得ZIKV检测的校准曲线。图7A为不同ZIKV浓度下所得的荧光光谱图，图7B为其谱线在520nm位移处所对应的荧光峰强度。荧光测试条件：FAM，激发波长：495nm，检测范围：505-700nm，缝隙宽度为5nm。通过对荧光强度与ZIKV浓度对数关系的拟合，得到：
工作曲线：F＝38.6×Log CZIKV+620(R2＝0.989)，通过计算得到检测限为0.90fM。
实施例3特异性验证
在实施例1制备的试剂盒的50μL、2.3nM的第一试剂与5μL，20μM的第二试剂混合后分别加入5μL 1 pM ZIKV、5μL 100pM单碱基错配序列(ZIKV-1mis)、5μL 100pM双碱基错配序列(ZIKV-2mis)和5μL blank(PBS缓冲液)，测得荧光信号强度，来研究传感检测策略的特异性。见图8，图8A为不同实验条件下所得荧光光谱图，图8B为其谱线在520nm位移处所对应的荧光峰强度，可以看出，加入1pM ZIKV时荧光强度明显强于其他实验条件，显示出所制备的探针可以较好的区分靶标分子与错配。
实施例4回收率验证实验
分别向正常人血清(购买自Biosharp)中加入3个不同浓度的人工合成的ZIKV基因片段配制得到3个待检测样品，分别选择了ZIKV浓度为40pM，0.7pM，60fM，取实施例1制备的试剂盒的50μL、2.3nM的第一试剂与5μL，20μM第二试剂混合后分别加入以上的3个待测检测样品，对该3个待检测样品进行回收率验证实验。
实验结果如表1。
表1 ZIKV检测回收率验证
Figure BDA0002443974650000081
从表1中可以看出三组回收率在96.42-105.7％，RSD＜11.32％，即可说明该检测试剂盒在检测复杂样品中检测ZIKV基因片段具有良好的重现性。
实施例5稳定性实验
对实施例1制备的第一试剂AuNP-LLD探针持续监测了其一周的荧光强度，F0即为AuNP-LLD探针离心后检测的初始荧光信号，F即为AuNP-LLD探针在H2帮助下检测ZIKV病毒序列后采集的荧光信号，测试得到荧光强度谱线，通过数据整合参见图6可看出所构建的AuNP-LLD探针在96h内保持稳定，随着储存时间的延长，F0逐渐增强，F稍有下降。
实施例6寨卡病毒(ZIKV)基因片段的荧光试剂盒的应用
取实施例1制备的试剂盒的50μL 2.3nM第一试剂与5μL 20μM第二试剂燃料发夹DNA单链H2混合并加入5μL待测样品(ZIKV基因片段)，25℃300rpm，150min摇匀；对产物实施荧光检测，对照实施例2建立的工作曲线，即可读出样品中ZIKV基因片段浓度。
用聚丙烯凝胶对aDNA、ZIKV基因片段、H1、H2、H1与aDNA、H1+aDNA+H2(blank)、H1+aDNA+ZIKV、H1+aDNA+ZIKV+H2、H2+ZIKV各个试剂进行跑胶，在10％的胶，80V的电压环境下，运行120分钟的电泳获得PAGE胶图，参见图2，从图2可以看出，泳道1-4分别代表单个aDNA，ZIKV基因片段(T)，H1和H2的电泳条条带，与泳道1和3中的条带相比，泳道5中显示的具有较低迁移率的条带指示H1和aDNA的杂交，即LLD的高产率形成。泳道6包含H1，aDNA和H2的混合物，其中条带显示的位置与泳道4和泳道5的位置相似，表明H1+aDNA(LLD)和H2之间没有明显的反应。泳道7代表H1，aDNA和T的混合物(即H1+aDNA+T)，泳道5中相对于H1+aDNA的迁移率差异表明H1+aDNA与T1之间有效杂交。泳道8中的条带是通过混合H1，aDNA，ZIKV和H2(即H1+aDNA+T+H2)生成的，其中从上到下的三个不同的条带分别属于H1+H2，H1+aDNA+T和H2。泳道8底部的模糊宽条带包含游离H2，释放的T和aDNA。泳道9显示了H2和T的混合物的条带(即，H2+T)，H2的透明条带说明了H2和T之间没有杂交。应该注意的是，为了获得单个DNA的清晰图案将较高浓度的aDNA，T，H1和H2注入第1-4泳道，而引发aDNA释放和T循环的H2发夹称为燃料DNA。这些结果证实了LLD的形成，以及与T的进一步特异性杂交，以及H2介导的aDNA的有效释放和T的循环。
在上述实施例1构建的50μL、2.3nM第一试剂AuNP-LLD探针中分别加入5μL 10μM的ZIKV基因片段+5μL 10μM H2、5μL 0.1×PBS+5μL 10μM的ZIKV基因片段、5μL 0.1×PBS+5μL10μM H2、10μL 0.1×PBS在并放置于摇匀仪中设置参数25℃，300rpm，150min后取出样品进行荧光检测，测试得到荧光强度。参见图3，AuNP-LLD探针由于荧光被淬灭，荧光信号强度弱；当AuNP-LLD探针与ZIKV共培养时，荧光信号获得部分恢复，说明ZIKV打开LLD，并使得部分aDNA从AuNP上脱落而游离在溶液中；当AuNP-LLD探针与ZIKV和H2共培养时，荧光信号获得显著增强，表明大量aDNA从AuNP上脱落而游离在溶液中；而当AuNP-LLD探针与H2共培养且不存在ZIKV时，荧光信号弱与AuNP-LLD探针差别不大，说明AuNP-LLD探针与H2几乎不反应，只当存在ZIKV时H2才起作用，检测体系有很好的特异性。
在上述实施例1构建的50μL、2.3nM第一试剂AuNP-LLD探针中分别加入5μL 10μM的ZIKV基因片段以及5μL 0μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM H2，并放置于摇匀仪中设置参数25℃，300rpm，150min后取出样品进行荧光检测，测试得到荧光强度，参见图4，在加入0-20μMH2时，随着H2浓度的增加，荧光信号进一步增强；当H1∶H2比例达到1∶2，荧光强度达到饱和状态，随着H2的浓度的增强，荧光信号不再随着H1∶H2比例的变化而变化。即可说明20μM H2被确定为最佳燃料DNA浓度，即H1∶H2的最佳比例为1∶2。
实施例7寨卡病毒基因片段的荧光试剂盒的检测应用
取实施例1制备的试剂盒的第一试剂AuNP-LLD探针50μL与5μL 20μM第二试剂混合并加入5μL待测样品(ZIKV基因片段)，25℃300rpm，150min摇匀；对产物实施荧光检测，对照实施例2构建的工作曲线，读出样品中ZIKV基因片段浓度。
具体地，在实施例1制备的试剂盒的50μL、2.3nM第一试剂AuNP-LLD探针中分别加入5μL 10μM的ZIKV基因片段以及5μL 20μM H2，并放置于摇匀仪中设置参数25℃，300rpm，分别在0min、10min、30min、45min、60min、90min、120min、150min、180min、240min后取出样品进行荧光检测，测试得到荧光强度谱线，参见图5，在H1∶H2最佳比例为1∶2时，AuNP-LLD探针与ZIKV基因和H2共培养，通过检测培养了0-240min不同时段后试剂的的荧光信号，观察到在0-150min内，荧光强度逐渐增强，并在共培养150min时荧光信号达到最大饱和值，表明150min是最佳的ZIKV基因检测时间。
序列表
<110> 南京邮电大学
<120> 寨卡病毒基因片段的荧光检测试剂盒及其制备方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> ZIKV基因片段(Artificial Sequence)
<400> 1
agcatattga cgtgggaaag ac 22
<210> 2
<211> 53
<212> DNA
<213> H1(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgtctttcc cacgtcaata tgctccatgt atattagcat attgtatgcg tct 53
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> aDNA(Artificial Sequence)
<400> 3
agacgcatac gacgtgggac g 21
<210> 4
<211> 53
<212> DNA
<213> aDNA(Artificial Sequence)
<400> 4
aatatgctaa tatacatgga gcatattgac gtgggaaatg ctccatgtat att 53
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 单碱基错配ZIKV-1 mis(Artificial Sequence)
<400> 5
agcatattga cgtgggaagg ac 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 单碱基错配ZIKV-2 mis(Artificial Sequence)
<400> 6
agcatattga catgggaagg ac 22

Claims (5)

1.一种寨卡病毒基因片段荧光检测试剂盒，其特征在于，所述寨卡病毒基因片段荧光检测试剂盒包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂为检测探针，所述第二试剂为燃料发夹型DNA单链H2，所述检测探针为表面连接有锁状结构DNA的金纳米粒子，所述锁状结构DNA为发夹型DNA单链H1与辅助核酸链aDNA混合并退火形成，所述发夹型DNA单链H1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述燃料发夹型DNA单链H2的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，所述辅助核酸链aDNA的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，所述金纳米粒子粒径为15~100 nm，所述第一试剂浓度为1~100nM。
2.根据权利要求1所述的寨卡病毒基因片段荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）第一试剂的制备：
S1、根据ZIKV病毒基因序列设计并合成对应的发夹型DNA单链H1，再根据发夹型DNA单链H1设计并合成对应的修饰有荧光分子辅助核酸链aDNA；
S2、将发夹型DNA单链H1与荧光分子辅助核酸链aDNA混合并退火形成锁状结构DNA，记为LLD；
S3、取LLD、AuNPs和PBS混合，并加入NaCl溶液，摇匀过夜得混合液；
S4、混合液离心提纯去除上清液，得到终产物AuNP-LLD检测探针即为第一试剂；
2）第二试剂的制备：根据发夹型DNA单链H1设计并合成燃料发夹DNA单链H2即为第二试剂。
3.根据权利要求2所述的寨卡病毒基因片段荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中的发夹型DNA单链H1与荧光分子辅助核酸链aDNA的物质的量比为1:1。
4.根据权利要求2所述的寨卡病毒基因片段荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中的LLD、AuNPs物质的量比为≥100:1。
5.根据权利要求2所述的寨卡病毒基因片段荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述燃料发夹DNA单链H2浓度为5~40 μM。
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基于纳米材料荧光淬灭作用的microRNA检测新方法研究;屠蕴秋;《中国优秀硕士论文库 医药卫生科技辑》;20140228;A006-129 *
基于纳米金的新型荧光法检测DNA;张弘;《中国优秀硕士论文库 医药卫生科技辑》;20120430;E059-108 *
基于金纳米粒子的催化发夹DNA组装检测microRNA;成永强等;《河北大学学报(自然科学版)》;20181231(第02期);第149页第2段，第149最后一段至第150页第1段 *
基于金纳米颗粒和发夹型核酸探针电化学检测DNA甲基化酶;苏婧;《中国优秀硕士论文库 医药卫生科技辑》;20130228;E059-87 *

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