CN111434340B - 一种温敏凝胶剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种温敏凝胶剂及其制备方法，以具有抗抑郁活性的芍药内酯苷载入海藻酸锌纳米凝胶粒中，作为药物释放储库，通过海藻酸与泊洛沙姆分子链段间的相互作用，构建芍药内酯苷‑海藻酸锌温敏自组装凝胶。本发明方法制备的控释芍药内酯苷抗抑郁的温敏凝胶，采用经鼻给药的方式，使凝胶在体温下能够粘附在鼻粘膜表面持续释放药物。芍药内酯苷经嗅区直接入脑，不受血脑屏障限制，可以快速起效治疗抑郁症。药效学实验证明芍药内酯苷温敏自组装凝胶制剂在快速起效抗抑郁方面比其他药物或剂型具有优越性。提高了药物的传递吸收效率并缩短了起效时间，为芍药内酯苷治疗抑郁症提供了更合适有效的新剂型，扩大了其应用范围。

Description

一种温敏凝胶剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种经鼻给药快速起效的凝胶剂及其制备方法，特别涉及一种经鼻给药的抗抑郁的温敏凝胶剂及其制备方法。
背景技术
抑郁症是由多因素引发以情绪低落为主的精神性疾病，严重者有自杀轻生的念头。世界卫生组织(WHO)估计到2020年抑郁症将成为导致残疾和非正常死亡的重要病种。抑郁症严重摧残着患者的精神和身体，给家庭及社会带来沉重的负担。
较早用于临床的抗抑郁药物是单胺氧化酶抑制剂(MAOI)和三环类抗抑郁药(TCA)，其后用于临床的是选择性血清素再摄取抑制剂(SSRI)，最具代表性的就是氟西汀和帕罗西汀，目前仍是临床的主流用药。近年上市的血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)，也已成为临床常用药，如代表药物文拉法辛。同时作用于血清素、去甲肾上腺素和多巴胺再摄取的抑制剂(TRIs)逐渐成为近年来抗抑郁药物的研发热点。尽管许多抗抑郁药物能够显著改善抑郁症状，但仍有30％左右的患者服药后未达到预期的治疗效果。抗抑郁药物易产生副作用，使得患者的顺应性较差。最重要的是，目前临床常用的SSRI和SNRI类抗抑郁药物起效较慢，从开始服用到显效，大约需要3-4周时间，这无法满足临床上患者需要尽快恢复精神健康的要求。
2000年以来，寻找快速起效的抗抑郁药物，成为新药研发的热点。氯胺酮及其改构化合物，是关键候选药物。氯胺酮是一种非选择性N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，常作为全身麻醉药用于临床。近年来研究发现，氯胺酮具有快速起效的抗抑郁作用，且作用持久。但氯胺酮长期应用，仍然会带来各种严重的副作用，如肝毒性、溃疡性膀胱炎、神经认知功能缺陷甚至成瘾等。
白芍和赤芍的抗抑郁作用，被研究者广泛报道，指出其抗抑郁成分，是芍药总苷。但芍药总苷是多种化学成分的混合物，需要进一步的深入研究。天津中医药大学崔元璐研究员课题组前期研究结果表明，白芍中的有效成分芍药苷和芍药内酯苷，都具有抗抑郁与抗炎活性，但二者比较，芍药内酯苷的抗抑郁效果更好，这是由于芍药内酯苷相对于芍药苷，具有更强的抗应激作用。国内同行的研究结果，验证了这个结论。北京欧纳尔生物工程技术有限公司在芍药及其有效成分抗抑郁方面，获得了多项国际与国内专利的授权，同样指出了芍药内酯苷具有抗抑郁活性。
目前临床上用于抗抑郁的药物起效作用慢，副作用大，不能很好地应用于抑郁症的治疗。因此，迫切需要研究者加速开发疗效更好的抗抑郁药物或新剂型。
发明内容
本发明的目的是针对现有抗抑郁药物及其制备方法存在的技术问题，提供一种经鼻给药快速起效的抗抑郁的芍药内酯苷的温敏凝胶剂及其制备方法，本发明的凝胶剂以构建的芍药内酯苷纳米凝胶为药物储库，控制抗抑郁药物芍药内酯苷的释放；并且参与芍药内酯苷纳米凝胶构建的锌离子，本身也具有抗抑郁的活性；而且再将芍药内酯苷纳米凝胶组装到温敏凝胶之中，不仅提高了药物经鼻给药的粘膜粘附性，而且还使得芍药内酯苷的抗抑郁作用快速发挥，同时控制药物释放，增加药物的吸收和利用。
为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种芍药内酯苷抗抑郁的温敏凝胶的制备方法，包括：1)首先制备芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶；2)在0-20℃条件下将芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶与温敏凝胶基质混合，制得芍药内酯苷-温敏凝胶储备液；3)在30℃以上，芍药内酯苷-温敏凝胶储备液形成芍药内酯苷抗抑郁温敏凝胶。
其中，步骤1)中所述芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶按照如下顺序进行的制备而成：
1A)将芍药内酯苷加入到氯化锌-乙醇溶液中，并涡旋混匀，配制成芍药内酯苷-氯化锌溶液；
1B)将液体石蜡、吐温80和司盘80混匀，制得石蜡-吐温-司盘混合液；
1C)在搅拌状态下，将海藻酸钠-水溶液加入到石蜡-吐温-司盘混合液，搅拌均匀，制得石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液；
1D)将芍药内酯苷-氯化锌溶液加入到石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液中，搅拌均匀后进行离心、洗涤处理，离心、洗涤处理后的水相进行冷冻干燥，制得所述的芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶。
特别是，步骤1A)中所述芍药内酯苷的质量与所述氯化锌-乙醇溶液的体积之比为(0.1-4):100；步骤1B)中所述石蜡-吐温-司盘混合液的HLB值为7-8。
尤其是，步骤1A)中所述芍药内酯苷的质量与所述氯化锌-乙醇溶液的体积之比为(0.1-4):100，优选为(0.3-0.8)：100，进一步优选为0.5:100，即每100ml氯化锌-乙醇溶液中加入芍药内酯苷的质量为0.1-4g，优选为0.3-0.8个，进一步优选为0.5g；步骤1B)中所述液体石蜡与司盘80的体积之比为(100-150)：1，优选为120-145:1；所述司盘80与吐温80的体积之比为(1-3)：1，优选为2-3:1，进一步优选为2.33:1。
特别是，所述液体石蜡、司盘80的比例约为142.86：1，液体石蜡、吐温80的比例约为333.33:1。
特别是，步骤1A)中所述氯化锌-乙醇溶液的质量体积浓度为(0.1-0.2)％(m/v)，优选为0.1％，即每100ml乙醇中氯化锌的质量为0.1-0.2g，优选为0.1g。
将氯化锌加入到乙醇溶液中，搅拌混匀，制成质量体积浓度为(0.1-0.2)％的氯化锌-乙醇溶液，即每100ml乙醇溶液中加入氯化锌的质量为0.1-0.2g。
本发明中，所述搅拌均匀，采用涡旋混匀。
尤其是，所述乙醇溶液的体积浓度为60-80％，优选为70％。
特别是，步骤1B)中所述石蜡-吐温-司盘混合液的HLB值优选为7.5。
尤其是，在30-50℃条件下将所述液体石蜡、吐温80和司盘80混匀，并进行搅拌15-45min。
特别是，步骤1C)中所述海藻酸钠-水溶液与所述石蜡-吐温-司盘混合液的体积之比为(20-40)：100，优选为(24-33)：100；步骤1D)中所述芍药内酯苷-氯化锌溶液与石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液的体积之比为(5-10)：100。
尤其是，步骤1C)中所述海藻酸钠-水溶液与所述石蜡-吐温-司盘混合液的配比优选为(29.7-30):100；步骤1D)中所述芍药内酯苷-氯化锌溶液与石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液的配比优选为(7.63-8):100。
特别是，步骤1C)中所述海藻酸钠-水溶液的质量体积浓度为(0.25-0.75)％(m/v)，优选为0.5％，即每100ml水中海藻酸钠的质量为0.25-0.75g，优选为0.5g。
尤其是，将海藻酸钠在30-60℃条件下，加入到水中，搅拌混匀，制成质量体积浓度为(0.25-0.75)％的海藻酸钠-水溶液，即每100ml水中加入海藻酸钠的质量为0.25-0.75g。
特别是，步骤1C)中将所述海藻酸钠-水溶液滴加到所述石蜡-吐温-司盘混合液中，滴加速度为0.65-0.85ml/min，优选为0.75ml/min。
尤其是，在滴加过程中，进行搅拌，搅拌速率为900-1100rpm。
特别是，还包括在所述海藻酸钠-水溶液滴加结束后，再继续搅拌50-70min。
尤其是，所述石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液中海藻酸钠的含量为17-30％，优选为20.4-25.4％，进一步优选为22.9％。
特别是，步骤1D)中将所述芍药内酯苷-氯化锌溶液滴加到所述石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液中，滴加速度为0.1-0.3ml/min，优选为0.25ml/min。
尤其是，在滴加过程中，进行搅拌，搅拌速率为900-1100rpm。
特别是，还包括在所述芍药内酯苷-氯化锌溶液滴加结束后，再继续搅拌50-70min。
将芍药内酯苷-氯化锌溶液加入到石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液搅拌均匀后进行离心，使水相和油相分离，弃去油相得到水相。冷冻干燥后，得到芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶体系(即芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶)。
其中，步骤2)所述芍药内酯苷-温敏凝胶储备液按照如下步骤制备而成：
2a)将芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶加入到生理盐水中，搅拌均匀，制成芍药内酯苷纳米凝胶-生理盐水溶液；
2b)在搅拌状态下，将芍药内酯苷纳米凝胶-生理盐水溶液与泊洛沙姆407、泊洛沙姆188混合均匀，然后静止放置至少12h，制得所述的芍药内酯苷-温敏凝胶储备液。
其中，步骤2)中所述温敏凝胶基质包括生理盐水、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188。
特别是，步骤2)所述芍药内酯苷-温敏凝胶储备液按照如下步骤制备而成：
2A)按照如下重量份配比准备原料，其中，所述芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶、生理盐水、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188的重量份配比(10-20)：(60-80)：(14-20)：(0-4)；
2B)将芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶加入到生理盐水中，搅拌均匀，制成芍药内酯苷纳米凝胶-生理盐水溶液；
2C)在搅拌状态下，将芍药内酯苷纳米凝胶-生理盐水溶液与泊洛沙姆407、泊洛沙姆188混合均匀，然后静止放置至少12h，制得所述芍药内酯苷-温敏凝胶储备液。
特别是，步骤2A)中所述芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶、生理盐水、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188的重量份配比优选为12:68:18:2。
尤其是，所述芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶、生理盐水、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188的重量份配比优选为(10-20)：(60-80)：(16-18)：(2-4)。
尤其是，所述芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶、生理盐水、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188的重量份配比优选为12:74:14:0。
尤其是，所述芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶、生理盐水、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188的重量份配比优选为12:68:20:0。
特别是，步骤2C)中所述的芍药内酯苷-温敏凝胶储备液中芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶的质量百分比为(10-20)％，优选为12％。
特别是，步骤2C)中，在0-4℃的条件下，将芍药内酯苷纳米凝胶-生理盐水溶液与泊洛沙姆407、泊洛沙姆188混合均匀。
尤其是，步骤2B)、2C)中所述搅拌的速率为900-1100rpm；步骤2C)中搅拌时间为8-12h
特别是，步骤2C)中静置放置时间优选为12-36h。
本发明另一方面提供一种按照上述方法制备而成的芍药内酯苷抗抑郁的温敏凝胶。
其中，步骤(1)所述芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶按照如下步骤制备而成：
(1A)在30-60℃条件下制备质量浓度为0.25-0.75％的海藻酸钠水溶液；
(1B)用体积浓度为60％-80％的乙醇溶液配制氯化锌溶液,浓度为0.1-0.2％(m/v)，并涡旋混匀；
(1C)将芍药内酯苷按照0.1-4％(m/v)加入(1B)，并涡旋混匀；
(1D)在30-50℃条件下将液体石蜡、吐温80和司盘80混匀，液体石蜡和司盘80的比例(v/v)为100:1-150:1，司盘80和吐温80的比例(v/v)为1-3:1，并使混合溶液的HLB值为7-8，并进行搅拌15-45min；
(1E)控制机器搅拌转速为900-1100rpm，以0.65-0.85ml/min的滴加速度加入到(1A)中制备的海藻酸钠水溶液，滴加完毕后持续搅拌50-70min；
(1F)以0.10-0.30ml/min的滴加速度向(1E)中加入(1C)，滴加完毕后持续搅拌50-70min；
(1G)将(1F)中所获得的混悬液离心，使水相和油相分离，弃去油相得到水相。冷冻干燥后，得到芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶体系。
优选地，步骤(1A)中所述海藻酸钠水溶液的浓度为0.5％(m/v)。
优选地，步骤(1B)中所述的乙醇溶液的浓度为70％(v/v)；所述的氯化锌的浓度为0.1％(m/v)。
优选地，步骤(1C)中所述的芍药内酯苷的浓度为0.5％(m/v)。
优选地，步骤(1D)中所述的液体石蜡、司盘80的比例约为142.86：1，液体石蜡、吐温80的比例约为333.33:1；司盘80与吐温80的体积之比为2.33：1。
优选地，步骤(1D)中所述的混合溶液的HLB值为7-8，优选为7.5；搅拌时间为30min。
优选地，步骤(1E)中所述的转速为1000rpm，滴加速度为0.75ml/min，持续搅拌时间为60min；搅拌温度为40℃。
优选地，步骤(1F)中所述的滴加速度为0.25ml/min，持续搅拌时间为60min。
特别是，步骤(2)所述芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶按照如下顺序进行的步骤制备成芍药内酯苷温敏凝胶：
(2A)以总处方重量计，在一定比例的常温生理盐水中加入分数比例(m/m)为10％-20％的芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶，并进行3-5小时的搅拌；
(2B)在冰浴条件下加入泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)，在总处方量一定的条件下，形成质量分数比例为14:0-20:0的温度敏感体系，并持续搅拌8-12小时；
(2C)在4℃条件下，放置12-36小时，形成芍药内酯苷-海藻酸锌温敏自组装凝胶体系。
优选地，步骤(2A)中所述的加入比例为12％(m/v)的芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶。
优选地，步骤(2B)中所述的加入P407和P188的比例约为18:2。
优选地，步骤(2C)中所述，在4℃条件下，放置24小时。
优选地，步骤2A)中所述的芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶的质量与生理盐水的体积之比为10-20％，优选为12％(m/v)的芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶。
优选地，步骤2B)中所述的加入P407和P188的质量与总处方之比为，总处方：泊洛沙姆407：泊洛沙姆188的质量比例为100：(0-20)：(0-4)，优选为100：18：2；
优选地，步骤2C)中所述，在4℃条件下，放置24小时。
针对由极端环境应激引起的抑郁障碍，亟需快速起效的抗抑郁治疗的医学需求，提出了经鼻给药温敏自组装凝胶剂的解决方案。选取具有抗抑郁活性的有效成分芍药内酯苷用于抑郁障碍的快速起效治疗。将芍药内酯苷载入海藻酸锌纳米凝胶粒中，作为药物释放储库。通过海藻酸与泊洛沙姆分子链段间的相互作用，构建芍药内酯苷-海藻酸锌温敏自组装凝胶。采用经鼻给药的方式，使凝胶在体温下能够粘附在鼻粘膜表面持续释放药物。芍药内酯苷经嗅区直接入脑，不受血脑屏障限制，可以快速起效治疗极端环境应激引起的抑郁障碍。通过药效学实验分析，证明温敏自组装凝胶体系在快速起效抗抑郁方面比其他药物或剂型的优越性。
本发明的抗抑郁的温敏凝胶剂及其制备方法具有以下优点：
1、本发明制备的经鼻给药的芍药内酯苷抗抑郁温敏凝胶剂芍药内酯苷经嗅区直接入脑，不受血脑屏障限制，可以快速起效治疗抑郁症。
2、本发明中将海藻酸盐纳米凝胶与泊洛沙姆溶液共同构建成温敏自组装凝胶体系，海藻酸盐纳米凝胶中的海藻酸分子与泊洛沙姆分子之间通过氢键相互作用，参与温敏凝胶体系的构建，泊洛沙姆与海藻酸分子之间氢键的作用，使载入的纳米凝胶粒中海藻酸的网状分子结构变得疏松，有利于药物的快速释放，迅速起到抗抑郁的效果。
3、本发明的温敏凝胶剂的制备方法简单，制备工艺步骤简短，工艺条件温和、易于操作控制，适宜大规模推广应用。
4、本发明方法制备的温敏凝胶剂载药量大，载药率高；温敏凝胶剂给药量小，起效迅速，提高了凝胶剂治疗的效率；而且制备的温敏凝胶剂释药速率缓慢，总释药率高，缓释效果明显，通过扩散在嗅区慢慢释放到大脑中，从而达到治疗疾病的目的；并且本发明方法制备的温敏凝胶剂还具有黏附作用，更有利于缓释，提高药物的治疗效果。
附图说明
图1为差示扫描量热分析图，其中Albiflorin：芍药内酯苷；Sodium alginate：海藻酸钠；Mixture：氯化锌、海藻酸钠和芍药内酯苷原料药的三者混合物；Albiflorinnanogel：芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶；Blank nanogel：空白海藻酸锌纳米凝胶；
图2为傅里叶变换红外光谱图，其中Albiflorin:芍药内脂苷；Sodium alginate:海藻酸钠；Mixture:芍药内脂苷、海藻酸钠、氯化锌物理混合物；Blank nanogel:空白海藻酸锌纳米凝胶；Albiflorin nanogel:芍药内脂苷-海藻酸锌纳米凝胶；
图3为芍药内酯苷-海藻酸锌纳米温敏凝胶24h累计释放百分比图，cumulativerelease rate:累计释放率；
图4为大鼠给药后1％糖水偏好变化图，其中#P<0.05vs Control；**P<0.01，*P<0.05vs CUMS；
图5为大鼠开放场实验行为学参数比较图，其中(a)大鼠直立次数；(b)大鼠活动总距离；(c)大鼠活动时间与休息时间。(注：##P<0.01，#P<0.05vs Control；**P<0.01，*P<0.05vs CUMS)；
图6为大鼠海马组织CA1区H&E染色结果(标尺为100μm，放大倍数为20倍)。图6A为正常对照组；图6B为模型组；图6C为阳性药组(Fluo)；图6D为芍药内酯苷灌胃组；图6E为芍药内酯苷尾静脉注射组；图6F为芍药内酯苷海藻酸锌温敏凝胶低剂量组；图6G为芍药内酯苷海藻酸锌温敏凝胶中剂量组；图6H为芍药内酯苷海藻酸锌温敏凝胶高剂量组。
图7为大鼠海马组织CA3区H&E染色结果(标尺为100μm，放大倍数为20倍)。图7A为正常对照组；图7B为模型组；图7C为阳性药组(Fluo)；图7D为芍药内酯苷灌胃组；图7E为芍药内酯苷尾静脉注射组；图7F为芍药内酯苷海藻酸锌温敏凝胶低剂量组；图7G为芍药内酯苷海藻酸锌温敏凝胶中剂量组；图7H为芍药内酯苷海藻酸锌温敏凝胶高剂量组。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1制备芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶
1、配制海藻酸钠-水溶液
在30-60℃条件下，将海藻酸钠与水混合均匀，制成质量-体积浓度为0.50％(m/v，通常为0.25-0.75％)的海藻酸钠-水溶液；
2、配制氯化锌-乙醇溶液
将氯化锌与体积百分比浓度为70％(通常为60-80％)的乙醇溶液混合，并涡旋混匀，配制成浓度为0.1％(m/v，通常为0.1-0.2％)的氯化锌-乙醇溶液；
3、配制芍药内酯苷-氯化锌溶液
将芍药内酯苷加入到氯化锌-乙醇溶液中，并涡旋混匀，其中，芍药内酯苷的质量与氯化锌-乙醇溶液的体积之比为0.5：100(通常为(0.1-4)：100，优选为0.3-0.8:100)，即100ml氯化锌-乙醇溶液中加入芍药内酯苷0.5g(通常为0.1-4g，优选为0.3-0.8g)，配制成芍药内酯苷-氯化锌溶液；
除了芍药内酯苷的质量与氯化锌-乙醇溶液的体积之比为0.5：100之外，还制备体积之比为0.3:100、0.8:100的芍药内酯苷-氯化锌溶液。
4、制备石蜡-吐温-司盘混合液(制备反相微乳法的油相)
在30-50℃条件下，将液体石蜡、吐温80和司盘80混匀，液体石蜡和司盘80的体积之比为120：1(通常为(100-150):1，优选为120-145:1)；司盘80和吐温80的体积之比2.33：1(通常为(1-3):1，优选为2-3:1)，并使混合溶液的HLB值为7.5(通常为7-8)，并搅拌15-45min，混匀，制得石蜡-吐温-司盘混合液；制备的石蜡-吐温-司盘混合液为油相，预先将石蜡油与表面活性剂混合，可减小微乳液滴的直径。
在500mL三颈瓶中分别加入液体石蜡(150mL)、Span80(1.05mL)和Tween80(0.45mL)，调节水浴温度至40℃，打开搅拌机，调整转速至500rpm充分搅拌，分散30min后作为油相(石蜡-吐温-司盘混合液，151.5ml)，其中，液体石蜡和司盘80的体积之比为142.86：1；液体石蜡、吐温80的比例约为333.33:1；司盘80和吐温80的体积之比2.33：1。
5、制备石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液(制备反向微乳法的水相)
在搅拌转速为900-1100rpm的条件下，以0.75ml/min(通常为0.65-0.85ml/min)的滴加速度在石蜡-吐温-司盘混合液中加入海藻酸钠-水溶液，滴加完毕后，搅拌50-70min，混匀，制得石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液；目的是形成反向微乳体系的水相，预先将海藻酸钠水溶液与表面活性剂混合，可有助于减小微乳液滴的直径，其中石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液中海藻酸钠的含量为22.9％(通常为17-30％，优选为20.4-25.4％)；海藻酸钠-水溶液与石蜡-吐温-司盘混合液的体积之比为29.7:100(通常为20-40：100，优选为24-33：100，进一步优选为29.7-30：100)。
以0.75ml/min的滴加速度将45ml海藻酸钠-水溶液滴加到151.5ml的石蜡-吐温-司盘混合液中，滴加完毕后，搅拌60min，混匀，制得石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液(196.5ml)，海藻酸钠-水溶液与石蜡-吐温-司盘混合液的体积之比为29.7:100；石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液中海藻酸钠的含量为22.9％。
6、制备纳米凝胶
以0.25ml/min(通常为0.10-0.30ml/min)的滴加速度向石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液中加入芍药内酯苷-氯化锌溶液，边滴加边搅拌，搅拌速率为900-1100rpm，滴加完毕后持续搅拌50-70min，混匀，制得载有芍药内酯苷的海藻酸锌纳米凝胶的混悬液；其中，芍药内酯苷-氯化锌溶液与石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液的体积之比为8：100(通常为(10-5)：100，优选为(7-8)：100)。
以0.25ml/min的滴加速度向石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液(196.5ml)中加入芍药内酯苷-氯化锌溶液(15ml)，滴加完毕后持续搅拌60min，混匀，制得载有芍药内酯苷的海藻酸锌纳米凝胶的混悬液，芍药内酯苷-氯化锌溶液与石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液的体积之比为7.63：100。
对载有芍药内酯苷的海藻酸锌纳米凝胶混悬液，进行离心处理(3800rpm、10min)，用注射器收集下层纳米凝胶，使水相和油相分离，即使得含有水的芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶与石蜡-吐温-司盘混合液分离，弃去油相得到水相；水相进行冷冻干燥，得到芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶。
将收集的纳米凝胶置于培养皿中，维持液面高度适度，使用液氮进行速冻，然后置-80℃保存，次日置于冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶。
实施例2制备芍药内酯苷-海藻酸盐温敏凝胶
1、制备芍药内酯苷纳米凝胶-生理盐水溶液
按照总处方(即芍药内酯苷温敏凝胶的总处方：生理盐水、芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188(68:12:18:2))比例计算，将芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶加入到生理盐水中，搅拌均匀，制成芍药内酯苷纳米凝胶-生理盐水溶液，其中芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶的质量与总处方的质量之比例为12％(m/m，通常为10-20％)，即芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶的质量与芍药内酯苷温敏凝胶的总质量之比为12:100(通常为10-20:100)；生理盐水与总处方的质量之比为68％(m/m，通常为60-80％)；
2.制备芍药内酯苷-泊洛沙姆混合体系
在冰浴(0-4℃)下，边搅拌边向芍药内酯苷纳米凝胶-生理盐水溶液中加入泊洛沙姆407(P407)、泊洛沙姆188(P188)，搅拌均匀，形成的芍药内酯苷温敏凝胶储备液，芍药内酯苷纳米凝胶、生理盐水、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188的质量之比为12：68：18：2(通常为(10-20)：(60-80)：(14-20)：(0-4))的温度敏感体系，并持续搅拌8-12小时，制得芍药内酯苷-泊洛沙姆混合体系，其中P407与P188的质量之比为18:2(通常为(16-18)：2)；
3、制备温敏凝胶
在4℃条件下，将芍药内酯苷-泊洛沙姆混合体系静止、放置12-36小时，形成芍药内酯苷-海藻酸锌温敏凝胶储备液，使用时，将芍药内酯苷-海藻酸锌温敏凝胶储备液于30℃以上温度使用，即得本发明的芍药内酯苷抗抑郁的温敏凝胶。
试验例1芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶的载药率
根据课题组前期工作基础，选用0.1％ZnCl2和投药量为0.3％、0.5％和0.8％的芍药内酯苷，根据最终结果，选用经济效益比较好的0.1％ZnCl2和芍药内酯苷投药量0.5％的处方(表1)。
表1不同处方载药率比较
Figure BDA0002362680150000101
试验例2芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶的表征分析
1、粒径及Zeta-电位测试
取适量空白海藻酸锌纳米凝胶悬液和芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶悬液，采用纳米粒度仪测定纳米凝胶的粒径、粒径分布情况及表面Zeta-电位，室温下重复3次实验，结果取平均值，如表2所示。
表2海藻酸锌纳米凝胶的粒径和Zeta-电位(Means±SD)
Figure BDA0002362680150000102
Figure BDA0002362680150000111
2、差示扫描量热分析(DSC)
称取干燥恒重的芍药内酯苷原料药、实施例1制备的芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶、空白海藻酸锌纳米凝胶、海藻酸钠原料药以及氯化锌、海藻酸钠和芍药内酯苷原料药的三者混合物分别密闭于铝盘中，以空白铝盘作为对照，在恒定氮气流下(20mL/min)，调节升温速度为10℃/min，升温范围为30-350℃，分别记录各样品的升温曲线，如图1。
由图1可知：芍药内酯苷在220℃到320℃之间有一个较宽的吸热峰。海藻酸钠在200℃到250℃之间有一个较宽较高的放热峰，该过程海藻酸钠骨架断裂，相邻羟基以水分子的形式脱去，转化为较为稳定中间产物。海藻酸钠和芍药内酯苷原料药的二者混合物也在接近250℃出现了比较小的特征峰，推测可能是海藻酸钠的峰受到了芍药内酯苷的吸热峰的的影响而变低。芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶在接近250℃也出现了比较小的特征峰，提示为未参与构建的海藻酸钠的放热峰，空白纳米粒比较平稳。
3、傅立叶变换红外光谱分析(FT-IR)
将芍药内脂苷，海藻酸钠以及芍药内脂苷、海藻酸钠及氯化锌三者物理混合物，空白海藻酸锌纳米凝胶，实施例1制备的芍药内脂苷-海藻酸锌纳米凝胶分别进行溴化钾压片。将药物与溴化钾1:20的比例于石英研钵中充分研匀，粒径在2μm以下，制成溴化钾窗片，在傅立叶变换红外光谱仪上测定其红外吸收光谱，设定波数范围为4000-400cm-1，测定结果如图2。
由图2可知：芍药内脂苷，海藻酸钠，芍药内脂苷、海藻酸钠及氯化锌物理混合物，空白海藻酸锌纳米凝胶，芍药内脂苷-海藻酸锌纳米凝胶的红外光谱如图2所示。3400cm-1处是芍药内脂苷分子中-OH相互作用形成分子间氢键的伸缩振动峰，2976cm-1是-CH2-亚甲基中C-H键的伸缩振动特征峰(υCH)，1754cm-1和1713cm-1分别是环外酯基伸缩振动峰和环内酯基伸缩振动峰，1279cm-1和1074cm-1是C-O-C的反对称伸缩振动(υas C-O-C)和对称伸缩振动峰(υs C-O-C)，715cm-1是苯环中C-H的弯曲振动峰；海藻酸钠在3413cm-1处为O-H伸缩振动特征峰(υOH)，1617cm-1和1419cm-1处分别为-COOH的伸缩振动(υcoo-)和不对称伸缩振动峰(υascoo-)，在1028cm-1处为C-O伸缩振动峰(υC-O)；物理混合物中可以看出芍药内脂苷的特征吸收峰；3448cm-1、3420cm-1处为纳米凝胶中-OH的伸缩振动峰(υOH)，当海藻酸钠与锌离子发生离子凝胶化作用形成纳米凝胶后，纳米凝胶上-OH吸收峰变宽，分析可能是由于锌离子与海藻酸钠分子上羟基相互作用的结果，或是纳米凝胶中形成了分子间氢键。2924cm-1和2854cm-1是纳米凝胶中-CH2-亚甲基反对称和对称伸缩振动吸收峰。纳米凝胶形成后，海藻酸钠在1419cm-1处的吸收峰发生红移，变为1459cm-1，说明在形成纳米凝胶的过程中-COOH与锌离子发生相互作用，并且在1736cm-1处出现了新的吸收峰。芍药内脂苷被载入纳米凝胶后，其主要特征吸收峰消失，与空白纳米凝胶相比，芍药内脂苷-海藻酸锌纳米凝胶中未见新的吸收峰产生，说明未形成新的化学键。
试验例3芍药内酯苷-海藻酸锌温敏组装纳米凝胶体外释放
按实施例2的方法制备3g芍药内酯苷-海藻酸锌温敏凝胶样本，测定芍药内酯苷-海藻酸锌温敏凝胶体外释放，测试结果如图3。
测试方法：芍药内酯苷-海藻酸锌温敏组装纳米凝胶(3g处方)吸取2ml温敏凝胶溶液打进透析袋，使其悬浮于40mL PBS(pH6.4)释放介质中。芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶以及芍药内酯苷-海藻酸锌温敏组装纳米凝胶放入温度为37℃转速为55rpm的摇床上，于0.25、0.5、0.75，1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96h取出1mL介质，再补充等体积释放介质。
由图3可知：芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶在和泊洛沙姆构建成温敏组装芍药内酯苷-海藻酸锌纳米凝胶之后，释药速率缓慢，前4h累计释药率达到50％。直到12h，芍药内酯苷累计释放量接近100％。在构建成温敏组装凝胶之后，相对于纳米凝胶，缓释效果明显，通过扩散或其他途径在嗅区慢慢释放到大脑中，从而达到治疗疾病的目的。据文献报道，泊洛沙姆本身有缓释的作用。因此，组装之后药物缓释效果明显，而且同时具有黏附作用，更有利于缓释。
试验例4芍药内酯苷的温敏自组装凝胶经鼻给药抗抑郁的药效学研究
1、实验动物分组
健康SD大鼠(雄性，180-220g)，160只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司提供(动物合格证号：SCXK(京)2016-0011)。每组各20只，实验分组如下：
(1)空白对照组(Control)：经鼻腔给予等量生理盐水；
(2)模型组(CUMS)：除了接受刺激外，还有通过鼻腔给予等量生理盐水；
(3)阳性对照组(Fluo)：除了接受刺激外，按每10mg/kg，1mL/100g体重给药量灌胃给予盐酸氟西汀；
(4)芍药内酯苷灌胃给药组(Albiflorin i.g，)：除了接受刺激外，按7mg/kg，1mL/100g体重给药量灌胃给予芍药内酯苷。
(5)芍药内酯苷尾静脉注射组(Albiflorin i.v，)：除了接受刺激外，按1.75mg/kg，0.1mL/100g体重给药量尾静脉注射给予芍药内酯苷；
(6)芍药内酯苷温敏凝胶低剂量组：除了接受刺激外，通过鼻腔按照0.175mg/kg给予芍药内酯苷温敏凝胶；
(7)芍药内酯苷温敏凝胶低剂量组：除了接受刺激外，通过鼻腔按照0.35mg/kg给予芍药内酯苷温敏凝胶；
(8)芍药内酯苷温敏凝胶低剂量组：除了接受刺激外，通过鼻腔按照0.7mg/kg给予芍药内酯苷温敏凝胶。
大鼠适应性喂养一周，自由饮水和禁食，并且进行1％糖水偏好实验训练(第一个24h两瓶1％的糖水，第二个24h一瓶糖水一瓶纯水)。在造模过程中的第5、12、19、26、34、42天分别称量大鼠体重，在第2、9、16、23、32、39天分别进行1％的糖水实验。第34天和41对全部大鼠进行行为活动测试(直立次数、活动总距离、活动时间和休息时间),第35天开始给药。
第二次行为学测试后，大鼠麻醉，腹主动脉取血，收集一部分大鼠海马及全脑，-80℃保存，另一部分浸泡在福尔马林溶液中进行切片。
2、大鼠慢性温和不可预知性应激(CUMS)方案
正常对照组，正常进食进水(糖水偏好实验前禁水24h除外)，不接受任何刺激。其它各组接受30多天的慢性温和不可预知性应激刺激。每组动物每天随机给予一种刺激，每种应激刺激应用不超过5次，具体操作方法如下：A:光刺激(强光频闪刺激10min)；B:冰水游泳(4℃，5min)；C:震荡(5min)；D:禁食(24h)；E:昼夜颠倒(白天遮光12h，晚上照明12h)；F:禁水(24h)；G:夹尾(5min)。
3、CUMS大鼠体重和1％糖水偏好
在第1天实验前以及实验的第5天、第12天、第19天、第26天、第42天时分别称定大鼠体重，记录各组大鼠的体重变化。
对所有实验大鼠的体重进行统计分析，结果如表1所示，与正常对照组(control组)比较，实验第12、19、26和34天接受CUMS刺激的大鼠体重显著降低(P<0.05或P<0.01)，说明CUMS抑郁模型复制成功。在给药一周后，与CUMS组比较，阳性药组(Fluo，氟西汀，10mg/kg)、芍药内酯苷灌胃组(7mg/kg)、芍药内酯苷尾静脉注射组(1.75mg/kg)、芍药内酯苷温敏凝胶组(0.175mg/kg、0.35mg/kg、0.7mg/kg)均见显著性差异(P<0.01)。与其他给药组比较，芍药内酯苷经鼻给药组有显著性变化，且明显优于其他给药组。
表1慢应激抑郁症大鼠体重变化表(
Figure BDA0002362680150000141
n＝8)
Figure BDA0002362680150000142
注：##P<0.01，#P<0.05vs Control；**P<0.01，*P<0.05vs CUMS
在实验的第2天、第9天、第16天、第23天、第32天、第39天时分别测定每组大鼠1％糖水偏好，记录各组大鼠1％糖水偏好变化。然后对给药后糖水数据进行分析如图4。
如图4所示，CUMS组糖水与空白对照组之间存在显著性差异。在给药后，氟西汀组、芍药内酯苷灌胃组、芍药内酯苷尾静脉注射组、芍药内酯苷温敏凝胶组(0.175mg/kg、0.35mg/kg)与CUMS组均存在显著性差异，且基本持平，在经鼻给药剂量远远小于氟西汀组、芍药内酯苷灌胃组、芍药内酯苷尾静脉注射组的状态下，能与其持平，证明了经鼻给予芍药内酯苷温敏凝胶的优势。芍药内酯苷温敏凝胶组(0.7mg/kg)与CUMS组无显著性差异，推测可能是由于实验误差导致。
3、CUMS大鼠行为学测试
给药完成后，将各组大鼠在置于50×50×40cm行为观察箱中央，使用动物行为视频分析系统记录5min内小鼠的自主活动行为，分析后4min内小鼠移动总距离(m)、直立次数和活动总时间(s)。
测试结果如图5，与空白对照组相比较，CUMS组大鼠在连续应激38天后表现出显著的抑郁样症状(直立次数、活动总距离和活动时间均明显减少，休息时间增多(P<0.01))，说明大鼠抑郁症模型复制成功。与CUMS组比较，盐酸氟西汀组(10mg/kg)、芍药内酯苷灌胃组(7mg/kg)、芍药内酯苷尾静脉注射组(1.75mg/kg)和低、中、高剂量芍药内酯苷温敏凝胶组，大鼠行为学表现均有不同程度的改善(P<0.01或P<0.05)。其中，经鼻腔给予高剂量的芍药内酯苷温敏凝胶组(0.7mg/kg)较给予大剂量的芍药内酯苷灌胃组(7mg/kg)和芍药内酯苷尾静脉注射组(1.75mg/kg)的效果更好，明显提高抑郁症模型大鼠的活动时间，减少休息时间。另外，芍药内酯苷灌胃组(7mg/kg)和芍药内酯苷尾静脉注射组(1.75mg/kg)改善大鼠行为学的效果相近。提示不同的给药途径以及不同的给药剂型会影响芍药内酯苷的药理作用。上述结果说明经鼻腔给予芍药内酯苷温敏凝胶的高剂量组(0.7mg/kg)对影响大鼠行为学表现具有更好的效果。
4、大鼠脑组织病理切片H&E染色
病理切片H&E染色具体操作
(一)常规脱水：
70％乙醇：过夜；85％乙醇：1h；95％乙醇：1h；100％乙醇：1h；二甲苯：12min。
(二)浸蜡：2h。
(三)包埋与切片：石蜡包埋后切成4μm厚的薄片；
(四)烤片：将切片后的薄片在59℃下烤3h；
(五)脱蜡上水
1)二甲苯I、II：各20min；2)无水乙醇I、II：各2min；3)95％乙醇：2min；4)80％乙醇：2min；5)蒸馏水：5min/次，数次；
(六)H&E染色：
1)苏木素：25min；2)蒸馏水：5min，数次；3)盐酸乙醇：1s；4)蒸馏水：5min，数次；5)氨水：2min；6)蒸馏水：5min，数次；7)伊红：30s；
(七)脱水
80％乙醇：2s；95％乙醇I、II：各2s；无水乙醇I、II：各2min；二甲苯：10min；
(八)封片中性树胶封片
(九)用光学显微镜观察受检组织病理变化(100×)，选取代表性视野照相记录。
测试结果如图6A-6H、图7A-7H所示，正常对照组海马组织CA1区和CA3区神经元细胞排列的比较整齐、紧凑。与正常对照组相比，模型组海马组织CA1区和CA3区神经元细胞排列松散、细胞之间间隙较大，散乱排列。在海马CA1区中，阳性药、芍药内酯苷以及芍药内酯苷-海藻酸锌温敏组装纳米凝胶给药组神经元细胞在不同程度上接近空白对照组，排列较模型组整齐，改变比较明显，差异较模型组大。在海马CA3区中，阳性药、芍药内酯苷以及芍药内酯苷-海藻酸锌温敏组装纳米凝胶给药组神经元细胞在不同程度上较模型组有所改善，细胞排列较模型组有序，细胞间隙有所减小。说明芍药内酯苷、氟西汀在抵抗神经元凋亡，调控神经元再生方面有一定的作用。

Claims (8)

1.一种温敏凝胶剂的制备方法，其特征是，包括：
1）按照如下顺序进行的步骤制备芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶；
1A）将芍药内酯苷加入到氯化锌-乙醇溶液中，并涡旋混匀，配制成芍药内酯苷-氯化锌溶液；
1B）将液体石蜡、吐温80和司盘80混匀，制得石蜡-吐温-司盘混合液；
1C）在搅拌状态下，将海藻酸钠-水溶液加入到石蜡-吐温-司盘混合液，搅拌均匀，制得石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液；
1D）将芍药内酯苷-氯化锌溶液加入到石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液中，搅拌均匀后进行离心处理，离心处理后的水相进行冷冻干燥，制得所述的芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶；
2）在0-20 ℃条件下将芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶与温敏凝胶基质混合，制得芍药内酯苷-温敏凝胶储备液；
3）在30 ℃以上，芍药内酯苷-温敏凝胶储备液形成芍药内酯苷抗抑郁温敏凝胶剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤1A）中所述芍药内酯苷的质量与所述氯化锌-乙醇溶液的体积之比为（0.1-4）:100，即每100ml氯化锌-乙醇溶液中加入芍药内酯苷的质量为0.1-4g；步骤1B）中所述石蜡-吐温-司盘混合液的HLB值为7-8。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是，步骤1C）中所述海藻酸钠-水溶液与所述石蜡-吐温-司盘混合液的体积之比为（20-40）：100；步骤1D）中所述芍药内酯苷-氯化锌溶液与石蜡-吐温-司盘-海藻酸钠混合液的体积之比为（5-10）：100。
4.如权利要求3所述的方法，其特征是，所述海藻酸钠-水溶液与所述石蜡-吐温-司盘混合液的体积之比为（24-33）：100。
5.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征是，步骤2）中所述温敏凝胶基质包括生理盐水、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188。
6.如权利要求5所述的方法，其特征是，步骤2）所述芍药内酯苷-温敏凝胶储备液按照如下步骤制备而成：
2A）按照如下重量份配比准备原料，其中，所述芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶、生理盐水、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188的重量份配比（10-20）：（60-80）：（14-20）：（0-4）；
2B）将芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶加入到生理盐水中，搅拌均匀，制成芍药内酯苷纳米凝胶-生理盐水溶液；
2C）在搅拌状态下，将芍药内酯苷纳米凝胶-生理盐水溶液与泊洛沙姆407、泊洛沙姆188混合均匀，然后静止放置至少12h，制得所述芍药内酯苷-温敏凝胶储备液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征是，步骤2A）中所述芍药内酯苷-海藻酸盐纳米凝胶、生理盐水、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188的重量份配比为12:68:18:2。
8.一种温敏凝胶剂，其特征是，按照如权利要求1-6任一所述方法制备而成。
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