CN102858176A - 镇痛化合物、组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及减少对其有需要的对象的疼痛的化合物、组合物和方法，包括给予本文所述的化合物和组合物。

Description

镇痛化合物、组合物及其应用

相关申请的交叉参考

本申请在35U.S.C.§119(e)的规定下对2010年3月10日提交的美国临时申请61/312,482号和2010年8月31日提交的61/378,781号享有优先权，在此将这些申请的全部内容引入作为参考。

发明背景

疼痛被定义为不悦的感官和情感体验。但是，疼痛可提供信息并且具有作用。例如，伤害性疼痛通常指示创伤(例如，组织损伤)，并且这种疼痛一般导致动物或人的逃避或保护行为，从而免除其自身或防止其自身进一步暴露于伤害。但是，炎症、细胞和神经元损伤以及源自创伤或疾病的其他过程可导致慢性病理疼痛状态和敏感性增强——被称为痛觉增敏，其中疼痛的感知被放大。在这种情况下，需要治疗疼痛和痛觉增敏的新化合物、新方法和新发明。

在一些情况下，如外科手术，可能需要伤害性疼痛的减少或消除，并可应用施予镇痛。已知多种化合物和药物有效减轻伤害性疼痛，并且一些为诸如阿片样物质(opioids)的镇痛剂。

手术后，源自手术的疼痛，例如如切口位置处或附近的疼痛是常见的。在这种情况下，需要减轻疼痛，因此需要治疗手术后和切口疼痛的新化合物、新方法和新发明。

给予阿片样物质治疗疼痛众所周知，并且是常用的药物治疗。不幸的是，对阿片样物质的抗性(快速耐受性)和阿片样物质引起的痛觉增敏可通常在治疗过程中产生。在这种患者中，需要逐渐升高的阿片样物质剂量以提供可接受的疼痛减轻水平。给予这些升高剂量却可造成不利副作用，暗含阿片样物质相关的安全问题。阿片样物质给予相关的副作用可包括呼吸抑制、便秘、恶心和呕吐。安全问题包括产生依赖性的可能性、治疗停止后遭受撤退反应(停药withdrawal)和滥用的可能性。快速耐受性是重复给予药物如麻醉性镇痛剂导致该药物效力的迅速出现和显著降低的现象。在阿片样物质引起的痛觉增敏中，延长给予阿片样物质还导致疼痛反而增加或对被认为与原创伤或伤害无关的刺激的过敏性。阿片样物质引起的快速耐受性和阿片样物质引起的痛觉增敏已被很好地记录于伤害感受动物模型和人临床试验中。这些现象显示对于疼痛治疗巨大的临床挑战，因此需要治疗疼痛和/或减轻痛觉增敏和抗性的新化合物、新方法和新发明。

活性氧物质(ROS)和活性氮物质(RNS)是高活性小分子，其包含，例如，氧离子和自由基如过氧基、羟基和其他物质如过氧亚硝酸根(OONO^-)。过氧亚硝酸根是超氧基(O₂ ^-)与一氧化氮(^.NO)之间相互作用的产物。在细胞中，ROS和RNS作为正常代谢的副产物正常形成，但其也对多种疾病的发病机理具有重要影响，包括影响肺、中枢神经系统和骨骼肌的疾病。此外，在压力时间期间(如，例如，缺氧)，ROS和/或RNS水平可显著增加，其可导致细胞组分损伤。

过氧亚硝酸根的活性已在阿片制剂引起的抗伤害(疼痛)抗性(快速耐受性)的产生中得到暗示(Muscoli et al.，2007，J Clin Invest 117:3530-3539)。在2007，Muscoli提出，过氧亚硝酸根形成是麻醉性镇痛剂快速耐受性产生的的关键途径。之前在减少过氧亚硝酸根的损害效应方面的尝试集中在类黄酮和更简单的酚类，其中一些已被证明在给予动物和人类时无效或有毒(Olmos et al.，2007，Med Res Rev27:1-64；Choi et al.，2002，Phytother Res 16:232-235)。因此，共同需要减少活性氧/氮物质如过氧亚硝酸根的水平或活性的新化合物、新方法和新发明。

因此，需要保持或延长阿片样物质的镇痛而无需阿片样物质剂量增加的化合物、组合物和方法。类似地，需要对于阿片样物质治疗剂量节省的化合物、组合物和方法。本发明满足这些需求。

发明概述

本发明包括根据式I所示的化合物或其盐

其中：

R¹和R²独立地是氢或烷基，或R¹和R²一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；和

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基。

在一个实施方式中，R¹和R²是CH₃。在另一实施方式中，根据式I所示的化合物选自(S)-2-(2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(R)-2-(2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(R)-2-(2-羟基-4-甲氧基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(4-氟-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(3,5-二氯-2-羟基-4-甲基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(5-叔丁基-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(2-羟基-4-甲氧基羰基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(5-乙磺酰基-2-羟基-苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(4-氯-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(2-羟基-5-甲氧基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(S)-2-(2-羟基-5-氯苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(S)-2-(2-羟基-5-氯苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(S)-2-(2-羟基-5-甲基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(S)-2-(2-羟基-5-甲基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(S)-2-(2-羟基-4-甲氧基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(S)-2-(2-羟基-4-甲氧基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(S)-2-(4-氯-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(S)-2-(2-羟基-5-硝基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(S)-2-(2-羟基-5-硝基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(S)-2-(5-乙磺酰基-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(S)-2-(5-乙磺酰基-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(R)-2-(2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸甲酯、(S)-2-(2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(R)-2-(4-氯-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸甲酯、(S)-2-(4-氯-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(R)-2-(4-氯-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸和(R)-2-(2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、其混合物和其盐。

本发明还包括制备根据式I所示的化合物或其盐的方法。该方法包括：使根据式A所示的化合物：

与根据式C所示的化合物：

发生反应，得到根据式D所示的化合物：

该方法进一步包括使根据式D所示的化合物去保护，得到根据式I所示的化合物或其盐；

其中

R¹和R²独立地是氢或烷基，或R¹和R²一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基；

Z是Cl、Br或I；和

P是硫羟基保护基。

本发明进一步包括制备根据式I所示的化合物的方法。该方法包括使根据式A所示的化合物或其盐:

与根据式B所示的化合物：

发生反应，得到根据式I所示的化合物或其盐；

其中

R¹和R²独立地是氢或烷基，或R¹和R²一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基；和

Z是Cl、Br或I。

本发明进一步包括在需要的对象中减少实现疼痛减轻所需的麻醉性镇痛剂剂量的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的至少一种根据式I所示的化合物或其盐的步骤，

其中：

R¹和R²独立地是氢或烷基，或R¹和R²一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；和

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基。

由此减少实现所述对象疼痛减轻所需的所述麻醉性镇痛剂剂量。

在一个实施方式中，以治疗性给药方案或预处理给药方案给予化合物。在另一实施方式中，对象是人。

本发明进一步包括在需要的对象中延长麻醉性镇痛剂的作用或镇痛效力持续时间的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的至少一种根据式I所示的化合物或其盐的步骤，

其中：

R¹和R²独立地是氢或烷基，或R¹和R²一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；和

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基。

由此麻醉性镇痛剂在对象中的作用或镇痛效力的持续时间得以延长。

在一个实施方式中，以治疗性给药方案或预处理给药方案给予化合物。在另一实施方式中，对象是人。

本发明进一步包括在需要的对象中防止快速耐受性的方法，所述方法包括给予对象治疗有效量的至少一种根据式I所示的化合物或其盐的步骤，

其中：

R¹和R²独立地是氢或烷基，或合起来是根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基，由此对象的快速耐受性得到防止。

在一个实施方式中，以治疗性给药方案或预处理给药方案给予化合物。在另一实施方式中，对象是人。

本发明进一步包括在需要的对象中减少活性氧物质和活性氮物质的活性水平的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的至少一种根据式I所示的化合物或其盐的步骤，

其中：

R¹和R²独立地是氢或烷基，或R¹和R²一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；和

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基。

由此活性氧物质和活性氮物质在对象中的活性水平被减少。

在一个实施方式中，活性氧物质是过氧亚硝酸根(peroxynitrite)。在另一实施方式中，对象呈现选自以下至少一种疾病的症状：中风、心肌梗塞、慢性心力衰竭、循环性休克、慢性炎性疾病、癌症、神经生成性疾病、睡眠呼吸暂停、糖尿病、麻醉性镇痛剂快速耐受性、胰腺炎疼痛、成瘾行为和高血压。在还有另一实施方式中，以治疗性给药方案或预处理给药方案给予化合物。在还有另一实施方式中，活性氧物质的活性水平通过减少活性氧物质生成而减少。在还有另一实施方式中，对象是人。

附图简述

下文对本发明优选实施方式的详细描述将在结合附图阅读时得到更好的理解。为示例本发明的目的，附图中显示了当前优选的实施方式。但应当理解的是，本发明不限于附图中所示的实施方式的确切安排和手段。在附图中：

图1描述了示例实验的结果，证明在大鼠甩尾模型(rat tail flick model)中化合物2剂量依赖性地保持芬太尼镇痛。

图2描述了示例实验的结果，证明在哈格里夫斯(Hargreaves)热痛觉增敏模型中化合物2剂量依赖性地保持芬太尼镇痛。

图3描述了示例实验的结果，证明化合物2保持芬太尼镇痛，允许较小剂量的芬太尼造成大鼠完全或显著镇痛，如哈格里夫斯热端点所测。在芬太尼前15min给予载体或化合物2(25mg/kg，IV)。多剂量的芬太尼在所示时间被给予两组。

图4描述了示例实验的结果，证明单剂量的化合物2甚至在三剂量芬太尼后仍保持芬太尼镇痛并阻止痛觉增敏。

图5描述了示例实验的结果，证明单剂量的化合物2甚至在四剂量芬太尼后仍保持芬太尼镇痛并抑制痛觉增敏产生。

图6描述了示例实验的结果，证明化合物2通过减少抗性和抑制痛觉增敏而保持芬太尼镇痛。

图7描述了示例实验的结果，证明化合物2减弱已形成的阿片样物质引起的抗性/痛觉增敏。

图8描述了示例实验的结果，证明化合物2抑制辣椒素介导的痛觉增敏。

图9，包括图9A和图9B，描述了示例实验的结果，证明化合物2抑制切口手术后痛觉增敏的产生。

图10，包括图10A和图10B，描述了示例实验的结果，证明化合物2逆转切口手术后的痛觉增敏。

图11描述了示例实验的结果，证明化合物2抑制SIN-1引起的痛觉增敏，SIN-1是已知的过氧亚硝酸根生成者。

图12是通过晶体X射线衍射图谱分析测定的(S)-2-(2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸氢氯化物(化合物1)结构的说明。

图13是通过晶体X射线衍射图谱分析测定的(S)-2-(5-乙磺酰基-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯(化合物32)结构的说明。

图14是通过晶体X射线衍射图谱分析测定的(R)-2-(4-氟-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸(化合物6)结构的说明。

图15是通过晶体X射线衍射图谱分析测定的(S)-2-(5-乙磺酰基-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯(化合物32)晶体堆叠结构的说明。

图16是示例单先占剂量(single preemptive dose)的化合物2-25mg/kg静脉内——对芬太尼引起的毒性的效果的图(每6小时25μg/kg静脉内芬太尼的剂量)。

图17是示例先占性给药的化合物2-25mg/kg静脉内——对芬太尼镇痛的效果的图(每6小时25μg/kg静脉内芬太尼的剂量)。

图18，包括图18A和图18B，示例了先占性给药的25mg/kg化合物2（静脉内）对FCA引起的热痛觉增敏和触觉异常性疼痛的效果。

图19，包括图19A和图19B，示例了在FCA后24-72小时用药时3-100mg/kg化合物2口服对FCA触觉异常性疼痛的效果。

图20，包括图20A和图20B，示例在先占性用药或FCA后24小时用药时10和30mg/kg化合物2口服对FCA引起的浮肿的效果。

图21，包括图21A和图21B，示例了在治疗性用药时10和30mg/kg化合物2口服对角叉菜聚糖引起的热痛觉增敏和浮肿的效果。

图22，包括图22A和图22B，示例在先占性用药时10和30mg/kg化合物2口服对角叉菜聚糖引起的热痛觉增敏和浮肿的效果。

图23是示例10或50mg/kg化合物2口服对脊神经结扎引起的触觉异常性疼痛的效果的图。

图24是示例50mg/kg化合物2口服对脊神经结扎引起的触觉异常性疼痛的效果的图。

图25是示例给予单剂量(第1天)30mg/kg化合物2口服对脊神经结扎引起的触觉异常性疼痛的效果的图。

图26是示例重复QD给予(第1-5天)30mg/kg化合物2口服对脊神经结扎引起的触觉异常性疼痛的效果的图。

图27是示例30、100和300mg/kg化合物2口服对在共济失调加速旋转分析(accelerating rotarod assay)中的跌倒潜伏期(等待时间)的效果的条形图。

发明详述

本发明涉及减少对其有需要的对象的疼痛的化合物、组合物和方法。在一个实施方式中，本发明是根据式I所示的化合物：

在另一实施方式中，本发明涉及包含根据式I所示化合物的组合物。在另一实施方式中，本发明是给予本发明的化合物和/或组合物以提供镇痛的方法。在各种实施方式中，本发明涉及减少或消除对其有需要的对象的切口疼痛的化合物、组合物和方法。本发明还提供减少或消除对其有需要的对象的痛觉增敏的方法。本发明还一方面是本文公开的化合物和/或组合物可被给予对象以减少、防止或逆转对给予药物如麻醉性镇痛剂作出响应而出现的痛觉增敏。

一方面，本发明是导致麻醉性镇痛剂如例如芬太尼或吗啡的作用持续时间增加的化合物和/或组合物。另一方面，本发明是导致麻醉性镇痛剂如芬太尼或吗啡的作用持续时间增加的方法。

在另一实施方式中，本发明是减少麻醉性镇痛剂如例如芬太尼或吗啡的有效剂量的化合物和/或组合物。还有另一实施方式中，本发明是导致麻醉性镇痛剂如芬太尼或吗啡的有效剂量减少的方法。有效剂量减少的意思是，在联合本发明的化合物、组合物或方法给予时，较低剂量的麻醉性镇痛剂足以实现与单独给予镇痛剂时相比同等水平的镇痛。

快速耐受性是重复给予药物如麻醉性镇痛剂造成该药物的效力迅速出现和显著降低的现象。本发明进一步方面是本文所述化合物和/或组合物可被给予对象以减少、防止或逆转对给予药物如麻醉性镇痛剂作出响应而出现的快速耐受性。

已知麻醉性镇痛剂造成呼吸抑制。本发明的化合物、组合物和方法可用于防止丧失正常呼吸或在丧失发生后恢复正常呼吸。丧失正常呼吸的一个非限制性实例是呼吸抑制。呼吸抑制导致通气不足，其进一步造成缺氧。缺氧主要的最初临床表现是困倦或白天过度嗜睡。因此，导致呼吸系统动力减少和由此产生的缺氧的药物其可用性有时受到限制，这是因为恐惧危及生命的呼吸抑制和/或负面影响生活质量的白天过度嗜睡。

多种疾病具有丧失正常呼吸或呼吸抑制作为疾病的原发性或继发性特征，这些疾病可用本发明的化合物、组合物和方法进行治疗。原发性正常呼吸丧失的实例包括：呼吸暂停(中枢、混合和阻塞性)和先天性中枢通气不足综合征。继发性正常呼吸丧失可源自某些药物(例如，麻醉剂、镇静剂、抗焦虑剂、催眠剂、酒精和阿片样物质镇痛剂)、慢性心肺疾病(例如，心力衰竭、慢性支气管炎、气肿和濒临呼吸衰竭)、体重过度(例如，肥胖-通气不足综合征)和/或影响神经系统的因素(例如，中风、肿瘤、创伤、辐射损伤、ALS)。

一般，需要镇痛或麻醉的患者可接受一种剂或多种剂的组合，以产生部分或完全无意识状态，从而允许医疗程序如手术进行。用于镇痛和麻醉的多种剂(例如，阿片样物质镇痛剂、巴比妥酸盐类、苯二氮

类、吸入性麻醉剂、丙泊酚(propofol))的常见不利作用是呼吸抑制。阿片样物质镇痛剂的实例包括吗啡、可待因、芬太尼、丁丙诺啡、度冷丁、美沙酮、舒芬太尼(sufentanil)、阿芬太尼(alfentanil)及类似物。巴比妥酸盐类的实例包括阿洛巴比妥、苯烯比妥(alphenal)、异戊巴比妥、阿普比妥、巴比沙隆(barbexaclone)、巴比妥、溴烯比妥(brallobarbital)、仲丁比妥、布他比妥(butalbital)、丁巴比妥、丁溴比妥(butallylonal)、丁烯巴比妥、环巴比妥、赛克罗帕(cyclopal)、依沙比妥(ethallobarbital)、非巴氨酯(febarbamate)、庚巴比妥、己巴比妥(hexethal)、海索比妥(hexobarbital)、普罗米那(mephobarbital)、美沙比妥(metharbital)、美索比妥(methohexital)、甲苯比妥、那可比妥(narcobarbital)、尼阿比妥(nealbarbital)、戊巴比妥(pentobarbital)、苯巴比妥(phenobarbital)、异丙巴比妥(probarbital)、溴丙巴比妥(propallylonal)、丙羟巴比妥(proxibarbal)、丙羟巴比妥(proxibarbital)、reposal、仲丁巴比妥(secbutabarbital)、司可巴比妥(secobarbital)、溴烯丙另戊巴比妥、他布酮(talbutal)、硫烯比妥(thialbarbital)、硫戊巴比妥(thiamylal)、硫巴比妥、硫仲丁比妥、戊硫代巴比妥(thiopental)、哇洛凡(valofane)、戊烯巴比妥(vinbarbital)和乙烯比妥(vinylbital)。苯二氮

类的实例包括咪达唑仑、氯硝西泮、地西泮(diazepam)、阿普唑仑及类似物。吸入性麻醉剂的实例包括氟烷、安氟醚(enflurane)、异氟醚(isoflurane)、七氟醚(sevoflurane)、地氟醚(desflurane)、及类似物。不仅呼吸抑制作用可在给予剂后很快发生，而且麻醉剂和/或镇痛剂的效应可在术后持续数小时或数天。本发明的化合物、组合物和方法可用于减少、防止或逆转药物引起的呼吸抑制。

在本发明的一个实施方式中，本文公开的化合物和/或组合物减少ROS或RNS(如，仅作为实例，过氧亚硝酸根)的水平或抑制其活性。在另一实施方式中，本发明包括减少ROS和RNS如过氧亚硝酸根的水平或抑制其活性的化合物和/或组合物，其导致麻醉性镇痛剂，如，作为非限制性实例，芬太尼和吗啡的作用持续时间增加。在另一实施方式中，本发明包括减少ROS和RNS，如，作为非限制性实例，过氧亚硝酸根的水平或抑制其活性的化合物和/或组合物，其有助于减少麻醉性镇痛剂，如，作为非限制性实例，芬太尼和吗啡的有效剂量。还有另一实施方式中，本发明是减少ROS和RNS，如，作为非限制性实例，过氧亚硝酸根的水平或活性的方法，其导致麻醉性镇痛剂，如，作为非限制性实例，芬太尼或吗啡的有效剂量减少。

本发明的化合物、组合物和方法的治疗性应用包括但不限于抗击ROS和RNS，如，作为非限制性实例，过氧亚硝酸根的影响。可能的疾病目标非常广泛，包括但不限于；中风、心肌梗塞、慢性心力衰竭、循环性休克、慢性炎性疾病、癌症、神经生成性疾病、睡眠呼吸暂停、糖尿病、麻醉性镇痛剂快速耐受性、胰腺炎疼痛、成瘾行为和高血压(也参见Pacher 2007，Physiol Rev 87：315-424)。

虽然不希望受任何具体示例约束，本发明化合物、组合物和方法的若干应用包括：延长麻醉性镇痛剂对于疼痛减轻的治疗潜力和效力，减少麻醉性镇痛剂的副作用，和提高麻醉剂和其他镇痛剂的安全性，提高正经历缺氧的患者的肌肉强度(参见Clanton，2007，J Appl Physiol 102：2379-2388)和恢复呼吸控制化学受体正常发挥功能的能力(Zakynthinos et al.，2007，Am J Respir Crit Care Med 175：62-68)。另外的实例还包括：增强肌肉强度，用于某些类型的神经肌疾病如杜氏肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy)(Williams et al.，2007，Am JPhysiol HeartCirc Physiol 293：H 1969-H 1977；Tidball and Wehling-Hendricks，2007，J Appl Physiol102：1677-1686；Whitehead et al.，2008，JPhysiol 7：2003-2014)、亨廷顿病(Perez-DeLa Cruz et al.，2009，Behav Brain Res 199：210-217)和帕金森病(Pinnen et al.，2009，J Med Chem 52：559–563)。

在一个非限制性实施方式中，本发明的化合物、组合物和方法被用作抗氧化治疗，包括例如，治疗精神疾病、代谢疾病和成瘾的抗氧化治疗。抗氧化治疗已被提出用于多种精神疾病和代谢疾病(Bhardwaj et al.，2009，Gastroenterology 136：149-159；Ng et al.，2008，Int J Neuropsychopharmacol 11：851-76)。例如，N-乙酰半胱氨酸—抗氧化剂，也已被提出用于成瘾行为/神经系统损伤，包括甲基苯丙胺(Imam et al.，2001，Ann NY Acad Sci 939：366-380)、可卡因或海洛因成瘾(Madayag et al.，2007，J Neuroscience 27：13968-13976；LaRowe et al.，2007，AmJ Psychiatry 164：1115-1117；Zhou and Kalicas，2008，Biol Psychiatry 63：338-340；Mardikian et al.，2007，Prog Neuro-psychopharmacol Biol Psychiatry 31：389-394)。

在本发明另一方面，麻醉性镇痛剂的镇痛减轻效果得到保持，并且脱离其危险的和不适的副作用。例如，对于中度至重度疼痛的治疗，麻醉性镇痛剂(例如，吗啡)仍然是多种适应症治疗的主体。应用麻醉性镇痛剂的主要缺陷包括多种副作用，包括呼吸抑制、便秘、镇静作用和尿潴留。因此，在一个实施方式中，本发明的化合物、组合物和方法延长麻醉性镇痛剂的镇痛效果。在另一实施方式中，本发明的化合物、组合物和方法钝化与麻醉性镇痛剂应用关联的呼吸抑制。还有另一实施方式中，本发明的化合物、组合物和方法延长麻醉性镇痛剂的镇痛效果和钝化与麻醉性镇痛剂应用关联的呼吸抑制。在本发明的各个实施方式中，实现同等镇痛水平所需的麻醉性镇痛剂量减少提供了较少或较不严重的副作用，如呼吸抑制、便秘、镇静作用和尿潴留。类似地，减少实现足够的疼痛减轻所需的麻醉剂量还可减少患者对阿片样物质产生依赖或遭受阿片样物质在治疗停止时停药的可能性，从而减少麻醉剂滥用的可能性。

本发明的治疗方法还包括给予本发明的化合物和/或组合物以稳定对象的呼吸节奏，和给予本发明的化合物和/或组合物以增加对象的每分钟通气量。在一实施方式中，本发明的方法包括给予本发明的化合物和/或组合物以稳定对象的呼吸节奏。在另一实施方式中，本发明的方法包括给予本发明的化合物和/或组合物以增加对象的每分钟通气量。一方面，对象的每分钟通气量以孤束核中的脑干呼吸控制中心水平增加。

本发明的化合物

本发明的化合物包括具有根据式I所示结构的化合物。

在式I中，R¹和R²可以独立地是氢或烷基。或者，R¹和R²可一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6。

R³可以在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基。

R⁴可以是氢、烷基、取代烷基或酰基。

W可以是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基。

如本文所用，术语“烷基”，其本身或作为另一取代基的部分意为饱和直链烃、支链烃或环烃，其碳原子数根据符号C_x-C_y指定，其中1≤x<y≤10。根据该符号，(C₁-C₆)烷基意为饱和直链烃、支链烃或环烃基团，具有1至6个碳原子。烷基实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、环己基和环丙基甲基。

如本文所用，术语“酰基”指连接羰基的烷基。酰基可由式-C(O)烷基表示。酰基实例包括但不限于乙酰基、新戊酰基、丙酰基和异丁酰基。

单独或组合其他术语应用的术语“烯基”意为——除非另外表述—稳定的单不饱和或双不饱和直链、支链或环烃基团，其碳原子数根据符号C_x-C_y指定，其中1≤x<y≤10。根据该符号，(C₁-C₆)烯基意为单或双不饱和直链烃、支链烃或环烃基团，具有1至6个碳原子。烯基实例包括但不限于乙烯基、丙烯基(烯丙基)、丁烯基、异戊烯基、丁二烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、环戊烯基、环戊二烯基以及高级(higher)同系物和异构体。烯基可根据符号CH₂=CHCH₂-表示。

单独或组合其他术语应用的术语“烷氧基”指具有结构“烷基-O-“的基团。实例包括但不限于甲氧基(CH₃O-)、乙氧基(CH₃CH₂O-)、1-丙氧基(CH₃CH₂CH₂O-)和异丙氧基(CH₃(CHO-)CH₃)。优选的实施方式包括(C₁-C₃)烷氧基，特别是乙氧基和甲氧基。

本文所用的术语“烷氧基羰基”指结合羰基的烷氧基，所述烷氧基羰基具有结构“烷氧基-C(O)-“。

本文所用的术语“羧基”(carboxy或carboxyl)指–CO₂H基团。

本文所用的术语“羧基烷基”指具有式“-C(O)O-烷基”的化合物。

单独或组合其他术语应用的术语“芳基”意为碳环芳香族体系，其含有一个或多个环(一般一个、两个或三个环)，其中所述环可以以悬挂(pendent)方式连接在一起，如联苯基，或可稠合，如在萘中。实例包括但不限于苯基、蒽基和萘基。

本文限定的术语“杂环”或“杂环的”指单环、双环或三环环体系，含有至少一个杂原子。单环环体系由下列示例：含有杂原子的任何3-或4-元环，该杂原子独立地选自氧、氮和硫；或含有一个、两个、三或四个杂原子的5-、6-或7-元环，其中杂原子独立地选自氮、氧和硫。5-元环具有0-2个双键，6-和7-元环具有0-3个双键。单环环体系的代表性实例包括但不限于氮杂环丁烷基、吖庚因基、氮杂环丙烷基、二吖庚因基、1,3-二氧戊环基、二

烷基、二噻烷基、呋喃基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑基、异噻唑啉基、异噻唑烷基、异

唑基、异唑啉基、异

唑烷基、N-甲基哌嗪基、吗啉基、

二唑基、

二唑啉基、

二唑烷基、唑基、唑啉基、

唑烷基、哌嗪基、哌啶基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四嗪基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻二唑啉基、噻二唑烷基、噻唑基、噻唑啉基、噻唑烷基、噻吩基、硫代吗啉基、1,1-二氧硫代吗啉基、硫代吡喃基、三嗪基、三唑基和三噻烷基。

术语“杂芳基”具体指具有芳香族特性的单环和多环杂环。单环杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、唑基、吡唑基、异噻唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,3,4-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-

二唑基、1,3,4-噻二唑基和1,3,4-

二唑基。

多环杂芳基的实例包括但不限于吲哚基、吲哚啉基、喹啉基、四氢喹啉基、异喹啉基、1,2,3,4-四氢异喹啉基、噌啉基、喹啉基、喹唑啉基、酞嗪基、1,8-萘啶基、1,4-苯并二

烷基、香豆素、二氢香豆素、苯并呋喃基、2,3-二氢苯并呋喃基、1,2-苯并异

唑基、苯并噻吩基、苯并

唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、苯并咪唑基、苯并三唑基、噻吨基、咔唑基、咔啉基、吖啶基、吡咯双烷基(pyrrolizidinyl)和喹嗪基。

术语“卤素”意为——除非另外表述—氟、氯、溴或碘原子。

术语“(C_x-C_y)全氟烷基”，其中x<y，意为具有最少x个碳原子和最多y个碳原子的烷基，其中所有氢原子均被氟原子取代。实例包括但不限于三氟甲基和五氟乙基。

互变异构

“互变异构体”是通过互变异构互相转化的结构不同的异构体。“互变异构”是异构形式，包括质子迁移，伴以键序改变，通常是单键与相邻双键互变。在互变异构可能的情况下，(例如在溶液中)，可达到互变异构体的化学平衡。一个公知的互变异构实例是在酮与其相应的烯醇之间。根据式I所示的化合物也可进行互变异构，并可以形式1、形式2或以其混合物存在。

为了本发明的目的，所有化合物将均仅以一个互变异构体构型绘制。但应理解的是，给定化合物的两种互变异构体形式均被考虑在内，并均在本发明的范围内。因此，本文公开的任何化合物的任何讨论均应被理解为包括该化合物的两种互变异构体形式，除非另外指明。

酸加成盐

根据式1所示的化合物含有碱性氮，该碱性氮可被足够强的质子酸质子化。虽然可采用任何足够强的质子酸，但优选药学可接受的酸，使得药学可接受的酸加成盐形成，同时药物组合物是期望的。药学可接受的酸指不是有毒的或以其他形式生物学不可取的酸。药学可接受的酸加成盐可用药学可接受的无机酸形成，该药学可接受的无机酸包括但不限于氢氯酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、硝酸、磷酸及类似物。

药学可接受的酸加成盐还可用药学可接受的有机酸形成。药学可接受的有机酸实例包括但不限于乙酸、三氟乙酸、己二酸、抗坏血酸、天门冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、丁酸、樟脑酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、二葡萄糖酸、乙磺酸、谷氨酸、乙醇酸、甘油磷酸、半硫酸、己酸、甲酸、延胡索酸、2-羟基乙磺酸(羟乙磺酸)、乳酸、羟基马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、均三甲基苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、烟酸、2-萘磺酸、草酸、双羟萘酸、果胶酯酸、苯基乙酸、3-苯基丙酸、新戊酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、对甲苯磺酸、十一烷酸及类似物。

制备方法

本发明的化合物可按照下列通用方案制备。例如，根据方案1，本发明的化合物可通过使根据式A所示的化合物与氨基烷基硫醇B发生反应而制备，其中Z是离去基团。其生成根据式I所示的产物化合物。

方案1

或者，受保护的氨基烷基硫醇C可与式A化合物发生反应，其中Z是离去基团，P是硫羟基保护基，从而得到相应的加合物D。随后的S-去保护生成根据式I所示的化合物。适当的硫羟基保护基在Wuts，et al.Greene’s Protective Groups inOrganic Synthesis，第四版，New York，John Wiley & Sons，2007中被鉴定，在此将其全部内容引入作为参考。优选的硫羟基保护基包括三苯基甲基——也被称为“三苯甲基”或“Tr”；和4-甲氧基苄基。

方案2

在某些实施方式中，根据式A所示的化合物可以根据式E所示的取代苯酚开始而制备，如方案3所示。取决于R³的性质，根据式E所示的化合物可商业获得或容易根据有机化学的已知方法制备。

在方案3中，取代苯酚E可经硝化产生相应的邻硝基苯酚F。然后该物质可被还原以提供邻氨基苯酚G。随后氨基苯酚G可与乙基黄原酸钾(钾(carbodithiolatooxy)乙烷)发生反应，生成环化的2-巯基苯并

唑H。2-巯基苯并

唑H与氯化剂如亚硫酰氯的反应提供所需的2-氯苯并

唑J。

方案3

在某些实施方式中，可通过应用相应于高级(advanced)中间体F或G的商业获得的化合物而避免硝化和/或还原步骤。

药物组合物和治疗

本发明还包括药物组合物(“组合物”)及其应用方法。这些药物组合物可包含“活性成分”(一种或多种本发明的化合物或其药学可接受的盐)，组合一种或多种药学可接受的剂。本文提出的组合物可单独或组合其他化合物应用，产生加成的、互补的或协同的效果。

在一实施方式中，可用于实践本发明的药物组合物可被给予以递送1ng/kg/天至100mg/kg/天之间的剂量。在另一实施方式中，可用于实践本发明的药物组合物可被给予以递送1ng/kg/天至500mg/kg/天之间的剂量。

在某些实施方式中，本发明组合物可包含一种或多种药学可接受的载体。可用的药学可接受的载体包括但不限于甘油、水、盐水、乙醇和其他药学可接受的盐溶液，如磷酸盐和有机酸盐。这些和其他药学可接受的载体的实例被述及于Remington’s Pharmaceutical Sciences(1991，Mack Publication Co.，New Jersey)中。

药物组合物可以以无菌注射水质或油质悬浮液或溶液的形式制备、封装或出售。该悬浮液或溶液可根据已知技术制备，并且除活性成分外可包含其他成分，如本文所述的抗氧化剂、分散剂、润湿剂或悬浮剂。这种无菌注射制剂可用无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂—例如如水或1,3-丁二醇—制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格(Ringer’s)溶液、等渗氯化钠溶液和固定油如合成单或双甘油酯。

本发明方法可用的药物组合物可以以适于静脉内、皮下、舌下、口服、直肠、阴道、胃肠外、局部、肺部、鼻内、颊部、眼部或其他给予途径的制剂被给予、制备、封装和/或出售。其他考虑的制剂包括投射的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫学的制剂。

本发明的组合物可通过多种途径给予，包括但不限于静脉内、皮下、舌下、口服、直肠、阴道、胃肠外、局部、肺部、鼻内、颊部或眼部给予途径。给予途径(一种或多种)对于技术人员而言将是显而易见的，并将取决于任何数量的因素，包括所治疗疾病的类型和严重程度、所治疗兽医学或人类患者的类型和年龄及类似因素。

本发明方法可用的药物组合物可以以静脉内和皮下液体制剂、口服和舌下固体制剂、眼药、栓剂、气溶胶、局部或其他类似制剂被全身给予。除化合物如硫酸肝素或其生物学等同形式外，这种药物组合物可含有药学可接受的载体和已知增强和促进药物给予的其他成分。其他可能的制剂，如纳米颗粒、脂质体、重新密封的红细胞和基于免疫学的系统，也可用于给予根据本发明方法所述的化合物。

应用本文所述任何方法确定的化合物以及这种化合物的组合可被配制和给予对象，以治疗呼吸的紊乱控制。

这种药物组合物可由活性成分单独组成，其形式适于给予对象，或药物组合物可包含至少一种活性成分和一种或多种药学可接受的载体、一种或多种其他成分或这些组分的一些组合。如他处所述，活性成分可以以生理学或药学可接受的盐的形式——如联合生理学或药学可接受的阳离子或阴离子，如本领域公知——存在于药物组合物中。

局部给予药物的障碍是表皮角质层。角质层是高抗层，由蛋白质、胆固醇、鞘脂、游离脂肪酸和多种其他脂质组成，并且包括角质化细胞和活细胞。限制化合物穿过角质层的渗透率(通量)的其中一个因素是可加载或施用于皮肤表面上的活性物质量。皮肤每单位面积施用的活性物质量越大，皮肤表面与皮肤下层之间的浓度梯度越大，并且进而，活性物质穿过皮肤的扩散力越大。因此，含有较大浓度活性物质的制剂比具有较小浓度的制剂更可能导致活性物质穿过皮肤渗透，并且更有甚者，速率更加一致，所有其他事项均等同。

本文所述药物组合物制剂可通过在药理学领域中任何已知或今后发展的方法制备。总体上，该制备方法包括步骤：使活性成分联合载体或一种或多种其他辅助成分，然后，如必要或需要，将产物成形或封装为所需的单剂量或多剂量单位。

虽然本文提供的对药物组合物的描述在原理上涉及适于对人伦理给予的药物组合物，但技术人员要理解的是，这种组合物一般适于给予所有种类的对象。

众所周知对适于给予人的药物组合物进行修改，以使该组合物适于给予多种动物，并且普通技术兽医行业药理学家仅用普通—如有——实验就可设计和进行这种修改。考虑的本发明药物组合物所给予的对象包括但不限于人和其他灵长类、哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，如牛、猪、马、绵羊、猫和狗。

本发明方法可用的药物组合物可以以适于静脉内、皮下、舌下、口服、直肠、阴道、胃肠外、局部、肺部、鼻内、颊部、眼部、鞘内或其他给予途径的制剂来制备、封装或出售。其他考虑的制剂包括投射的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫学的制剂。

本发明的药物组合物可以作为单个单位剂量或多个单个单位剂量大批量制备、封装或出售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量活性成分的药物组合物的离散数量。活性成分的量一般等于将给予对象的活性成分剂量或这种剂量的便利分数如，例如，这种剂量的一半或三分之一。

本发明药物组合物中活性成分、药学可接受的载体和任何附加成分的相对量将取决于所治疗对象的身份、大小和状况和进一步取决于组合物的给予途径而改变。作为实例，组合物可包含0.1%至100%(w/w)之间的活性成分。

本发明药物组合物的受控或持续释放制剂可利用常规技术制成。适于局部给予的制剂包括但不限于液体或半液体制剂，如搽剂、洗液、水包油或油包水乳液，如乳膏、油膏或糊剂、和溶液或悬浮液。可局部给予的制剂可例如包含约1%至约10%(w/w)的活性成分，尽管活性成分的浓度可高至溶剂中活性成分的溶解性限值。局部给予制剂可进一步包含一种或多种本文所述的附加成分。

可应用渗透增强剂。这些物质增加药物穿过皮肤的渗透率。本领域一般的增强剂包括乙醇、甘油单月桂酸酯、PGML(聚乙二醇单月桂酸酯)、二甲基亚砜及类似物。其他增强剂包括油酸、油醇、乙氧基二甘醇、月桂氮

酮、烷基羧酸、极性脂质或N-甲基-2-吡咯烷酮。

用于局部递送本发明一些组合物的一种可接受的载体可包含脂质体。脂质体组合物及其应用在本领域已知(例如，参见Constanza，美国专利号6,323,219)。

所要制备的活性化合物的来源将一般取决于化合物的具体形式。小有机分子和肽基或寡聚片段可化学合成，并以适于药物应用的纯形式提供。天然提取物产物可根据本领域已知的技术得到纯化。化合物的重组来源对于本领域普通技术人员而言也是可用的。

在可选的实施方式中，局部活性药物组合物可任选地组合其他成分，如佐剂、抗氧化剂、螯合剂、表面活性剂、起泡剂、润湿剂、乳化剂、增粘剂、缓冲剂、防腐剂及类似物。在另一实施方式中，渗透剂或渗透增强剂被包含在组合物内，并且相对于缺少渗透增强剂的组合物有效提高活性成分经皮渗透进入和穿过角质层。本领域技术人员已知各种渗透增强剂，包括油酸、油醇、乙氧基二甘醇、月桂氮酮、烷基羧酸、二甲基亚砜、极性脂质或N-甲基-2-吡咯烷酮。另一方面，组合物可进一步包含水溶助长剂，其用于增加角质层结构的紊乱，因此使穿越角质层的运输增加。本领域技术人员已知各种水溶助长剂，如异丙基醇、丙二醇或二甲苯磺酸钠。

局部活性药物组合物应以引起所需改变的有效量施用。如本文所用“有效量”应意为足以覆盖皮肤表面需要改变的区域的量。活性化合物应以按重量体积计占组合物的约0.0001%至约15%的量存在。更优选地，其应以占组合物的约0.0005%至约5%的量存在；最优选地，其应以占组合物的约0.001%至约1%的量存在。这种化合物可以是合成或天然获得。

液体衍生物和直接由生物来源制成的天然提取物可以约1至约99%的浓度(w/v)用于本发明的组合物。天然提取物部分和蛋白酶抑制剂可具有不同的优选范围，组合物的约0.01%至约20%，更优选地，组合物的约1%至约10%。当然，本发明活性剂的混合物可组合和一起用于同一制剂或顺序用于不同制剂。

本发明的组合物可包含占组合物总重量约0.005%至2.0%的防腐剂。防腐剂用于在水凝胶情况下防止腐败，这是因为患者对其重复使用，此时其暴露于环境污染物，例如，暴露于空气或患者皮肤，包括接触施用本发明组合物如治疗性凝胶或乳膏所用的手指。根据本发明可用的防腐剂的实例包括但不限于选自苄醇、山梨酸、对羟苯甲酸酯、咪脲(imidurea)及其组合。特别优选的防腐剂是约0.5%至2.0%苄醇和0.05%至0.5%山梨酸的组合。

组合物优选包含抗氧化剂和螯合剂，其抑制水凝胶制剂中本发明所用化合物的降解。对于一些化合物优选的抗氧化剂是BHT、BHA、α-生育酚和抗坏血酸，其优选范围为按重量计占组合物总重量约0.01%至0.3%，更优选BHT范围为0.03%至0.1%。优选地，螯合剂以按重量计占组合物总重量的0.01%至0.5%的量存在。特别优选的螯合剂包括依地酸盐(例如，依地酸二钠)和柠檬酸，其重量范围为按重量计占组合物总重量的约0.01%至0.20%，更优选地范围为0.02%至0.10%。螯合剂可用于螯合组合物中可不利于制剂保质期的金属离子。虽然BHT和依地酸二钠对于一些化合物分别是特别优选的抗氧化剂和螯合剂，但其他适当和等效的抗氧化剂和螯合剂可由此进行替代，如本领域技术人员所知。也可应用受控释放的制备物，应用这种制备物的方法本领域技术人员已知。

在一些情况下，所用剂型可被提供用于缓慢或受控释放一种或多种活性成分，这是利用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层涂层、微粒、脂质体或微球或其组合，以提供所需的释放性能。本领域普通技术人员已知的适当受控释放制剂—包括本文所述那些，可容易经选择用于本发明的药物组合物。因此，适于口服给予的单个单位剂型，如适于受控释放的片剂、胶囊、明胶胶囊和囊片被包括在本发明内。

多数受控释放的药物产物具有共同的目标——改善药物治疗，超越其非受控相似物所实现的药物治疗改善。理想地，在医学治疗中应用最佳设计的受控释放制备物的特征在于用最少时间量、最少药物物质治愈或控制病症。受控释放制剂的优势包括药物活性延长、用药频率降低和患者依从性增加。此外，受控释放制剂可用于影响作用发作时间或其他特征，如药物血液水平，因此可影响副作用的出现。

多数受控释放制剂被设计以最初释放迅速产生所需治疗性效果的药物量，逐渐和连续释放其他药物量以长期保持该治疗效果水平。为在体内保持该恒定药物水平，药物必须以替代被代谢和排出体外的药物量的速率从剂型释放。

活性成分的受控释放可受多种诱导因素刺激，例如pH、温度、酶、水或其他生理状况或化合物。在本发明背景下术语“受控释放组分”在此被定义为促进活性成分受控释放的一种或多种化合物，包括但不限于聚合物、聚合物基质、凝胶、渗透膜、脂质体或微球或其组合。

液体悬浮液可用常规方法制备，以实现活性成分悬浮于水质或油质载体中。水质载体包括，例如，水和等渗盐水。油质载体包括，例如，杏仁油、油酯、乙醇、植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、分馏植物油和矿物油如液体石蜡。液体悬浮液可进一步包含一种或多种附加成分，包括但不限于，悬浮剂、分散剂或润湿剂、乳化剂、缓和剂、防腐剂、缓冲剂、盐、调味剂、着色剂和甜味剂。油质悬浮液可进一步包含增稠剂。已知的悬浮剂包括但不限于，山梨醇糖浆、氢化食用脂肪、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、黄蓍胶、阿拉伯胶和纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素。已知的分散剂或润湿剂包括但不限于，天然存在的磷脂如卵磷脂、氧化烯与脂肪酸、与长链脂肪族醇、与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯或与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯(分别例如，聚氧乙烯硬脂酸酯、十七碳氧乙烯十六醇、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯和聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)的缩合产物。已知的乳化剂包括但不限于，卵磷脂和阿拉伯胶。已知的防腐剂包括但不限于，甲基、乙基或正丙基-对羟基苯甲酸酯、抗坏血酸和山梨酸。已知的甜味剂包括，例如，甘油、丙二醇、山梨醇、蔗糖和糖精。油质悬浮液的已知增稠剂包括，例如，蜂蜡、硬石蜡和十六烷醇。

活性成分在水质或油质溶剂中的液体溶液可以与液体悬浮液基本相同的方式制备，主要区别为活性成分溶解而非悬浮于溶剂中。本发明药物组合物的液体溶液可包含关于液体悬浮液所述的各组分，要理解的是，悬浮剂将不一定有助于活性成分溶于溶剂中。水质溶剂包括，例如，水和等渗盐水。油质溶剂包括，例如，杏仁油、油酯、乙醇、植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、分馏植物油和矿物油如液体石蜡。

本发明药物制剂的粉末状和颗粒状制剂可用已知方法制备。这种制剂可直接给予对象，例如，用于形成片剂，填充胶囊或通过向其添加水质或油质载体而制备水质或油质悬浮液或溶液。这些制剂均可进一步包含分散剂或润湿剂、悬浮剂和防腐剂中的一种或多种。附加的赋形剂如填充剂和甜味剂、调味剂或着色剂也可包含在这些制剂中。

本发明的药物组合物还可以以水包油乳液或油包水乳液的形式制备、封装或出售。油相可以是植物油，如橄榄油或花生油、矿物油如液体石蜡或这些油的组合。这种组合物可进一步包含一种或多种乳化剂，如天然存在的胶，如阿拉伯胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，如大豆磷脂或卵磷脂；衍生自脂肪酸和己糖醇酐组合的酯或偏酯，如山梨糖醇酐单油酸酯；和这种偏酯与氧乙烯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。这些乳液还可包含其他成分，包括，例如，甜味剂或调味剂。

如本文所用，“油质”液体是包含含碳液体分子并且显示出比水更低极性特征的液体。

适于口服给予的本发明药物组合物制剂可以以离散固体剂量单位的形式制备、封装或出售，包括但不限于，片剂、硬或软胶囊、扁囊剂、含片或锭剂，分别含有预定量的活性成分。其他适于口服给予的制剂包括但不限于，粉末状或颗粒状制剂、水质或油质悬浮液、水质或油质溶液、糊剂、凝胶、齿糊剂、漱口剂、涂层、口腔洗剂或乳液。术语口腔洗剂和漱口剂在此可互换使用。

本发明的药物组合物可以以适于口服或颊部给予的制剂制备、封装或出售。这种制剂可包括但不限于，凝胶、液体、悬浮液、糊剂、齿糊剂、漱口剂或口腔洗剂和涂层。例如，本发明的口腔洗剂可包含本发明的化合物约1.4%、葡萄糖酸氯己定(0.12%)、乙醇(11.2%)、糖精钠(0.15%)、FD&C蓝1号(0.001%)、薄荷油(0.5%)、甘油(10.0%)、吐温60(0.3%)和水直至100%。在另一实施方式中，本发明的齿糊剂可包含本发明的化合物约5.5%、在水中70%的山梨醇(25.0%)、糖精钠(0.15%)、月桂基硫酸钠(1.75%)、6%分散液的卡波泊尔934(15%)、留兰香油(1.0%)、在水中50%的氢氧化钠(0.76%)、二元磷酸钙二水合物(45%)和水直至100%。本文所述制剂的实例不是详尽性的，要理解的是，本发明包括对这些和本文未述及的其他制剂另外的修改，但其对于本领域技术人员而言是已知的。

包含活性成分的片剂可例如通过将活性成分任选地与一种或多种附加成分一起压缩或模塑而制成。压缩片剂可通过在适当装置中压缩自由流动形式如粉末或颗粒状制剂的活性成分而制备，该活性成分任选地与粘合剂、润滑剂、赋形剂、表面活性剂和分散剂中的一种或多种混合。模塑片剂可通过在适当装置中模塑活性成分、药学可接受的载体和至少足以润湿混合物的液体的混合物而制备。用于制备片剂的药学可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、粒化剂和崩解剂、粘合剂以及润滑剂。已知的分散剂包括但不限于，马铃薯淀粉和羟基乙酸淀粉钠。已知的表面活性剂包括但不限于月桂基硫酸钠。已知的稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、乳糖、微晶纤维素、磷酸钙、磷酸氢钙和磷酸钠。已知的粒化剂和崩解剂包括但不限于玉米淀粉和海藻酸。已知的粘合剂包括但不限于明胶、阿拉伯胶、预胶化玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮和羟基丙基甲基纤维素。已知的润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、硅胶和滑石。

片剂可不进行涂覆或其可用已知方法涂覆以实现在对象胃肠道中延迟崩解，从而提供活性成分持续释放和吸收。作为实例，诸如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯的物质可用于涂覆片剂。进一步作为实例，片剂可用美国专利号4,256,108；4,160,452；和4,265,874所述的方法涂覆，形成渗透性受控释放片剂。片剂可进一步包含甜味剂、调味剂、着色剂、防腐剂或这些剂的一些组合，从而提供药学美观和适口的制剂。

包含活性成分的硬胶囊可用生理可降解的组合物如明胶制备。这种硬胶囊包含活性成分，并可进一步包含其他成分，包括，例如，惰性固体稀释剂，如碳酸钙、磷酸钙或高岭土。

包含活性成分的软明胶胶囊可用生理可降解的组合物如明胶制备。这种软胶囊包含活性成分，该活性成分可与水或油介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

适于口服给予的本发明药物组合物的液体制剂可以以液体形式或以意图在应用前用水或另一适当的载体重构的干燥产物形式制备、封装和出售。

本发明的药物组合物可以以适于直肠给予的制剂制备、封装或出售。这种组合物可以是如下形式：例如，栓剂、保留灌肠制剂和直肠或结肠灌注溶液。

栓剂制剂可通过组合活性成分与非刺激性、药学可接受的赋形剂而制备，该非刺激性、药学可接受的赋形剂在普通室温(即，约20℃)下是固体，并在对象直肠温度(即，健康人约37℃)下是液体。适当的药学可接受的赋形剂包括但不限于，可可油、聚乙二醇和多种甘油酯。栓剂制剂可进一步包含各种其他成分，包括但不限于，抗氧化剂和防腐剂。

用于直肠或结肠灌注的保留灌肠制剂或溶液可通过组合活性成分与药学可接受的液体载体而制备。如本领域公知，灌肠制剂可利用适于对象直肠解剖结构的递送装置给予，并可被封装在其中。灌肠制剂可进一步包含各种其他成分，包括但不限于，抗氧化剂和防腐剂。

用化学组合物浸渗或涂覆材料的方法在本领域是已知的，包括但不限于将化学组合物沉积或粘合到表面上的方法、在合成材料过程中将化学组合物掺入材料结构(即，如用生理可降解的物质)的方法和将水质或油质溶液或悬浮液吸收到吸收材料中的方法—有或无随后的干燥。

如本文所用，药物组合物的“胃肠外给予”包括任何如下特征的给予途径：物理破开对象组织和通过组织开口给予药物组合物。因此胃肠外给予包括但不限于，通过注射组合物、通过经手术切口施用组合物、通过经组织渗透性非手术伤口施用组合物及类似手段给予药物组合物。具体地，胃肠外给予被考虑包括但不限于静脉内、皮下、腹膜内、肌内、胸骨内注射和肾透析输注技术。

适于胃肠外给予的药物组合物制剂包含活性成分，该活性成分组合药学可接受的载体，如无菌水或无菌等渗盐水。这种制剂可以以适于丸剂给予或连续给予的形式制备、封装或出售。注射制剂可以以单位剂型制备、封装或出售，如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。胃肠外给予的制剂包括但不限于悬浮液、溶液、油质或水质载体中的乳液、糊剂和可植入的持续释放或可生物降解的制剂。这种制剂可进一步包含一种或多种附加成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在胃肠外给予的制剂的一个实施方式中，活性成分以干燥(即，粉末或颗粒)形式提供，用于用适当的载体(例如，无菌无热原水)重构，然后胃肠外给予重构组合物。

药物组合物可以以无菌注射水质或油质悬浮液或溶液的形式制备、封装或出售。这种悬浮液或溶液可根据已知技术制备，除活性成分外可包含附加成分，如本文所述的抗氧化剂、分散剂、润湿剂或悬浮剂。这种无菌注射制剂可用无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂如例如水或1,3-丁二醇制备。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于，林格溶液、等渗氯化钠溶液和固定油，如合成单或双甘油酯。其他可用的可肠胃外给予的制剂包括包含在脂质体制剂中为微晶形式或作为可生物降解的聚合物系统的组分的活性成分的制剂。用于持续释放或灌输的组合物可包含药学可接受的聚合物或疏水性物质，如乳液、离子交换树脂、难溶性聚合物或难溶性盐。

本发明的药物组合物可以以适于颊部给予的制剂制备、封装或出售。这种制剂可例如是用常规方法制成的片剂或锭剂形式，并且可例如含有约0.1至约20%(w/w)的活性成分，平衡(余量，balance)包含口服可溶或可降解的组合物和任选地一种或多种本文所述的附加成分。或者，适于颊部给予的制剂可包含含有活性成分的粉末或者气溶胶化或原子化的溶液或悬浮液。这种粉末状、气溶胶化或气溶胶化制剂在分散时优选具有范围为约0.1至约200纳米的平均颗粒或液滴尺寸，并可进一步包含一种或多种本文所述的附加成分。

如本文所用，“附加成分”包括但不限于以下一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；粒化剂和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理可降解的组合物如明胶；水质载体和溶剂；油质载体和溶剂；悬浮剂；分散剂或润湿剂；乳化剂、缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药学可接受的聚合物或疏水性物质。本发明的药物组合物可包含的其他“附加成分”在本领域已知，并被述及于，例如Genaro,ed.(1985,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA)，在此将其引入作为参考。

典型地，可给予对象—优选人——的本发明化合物的剂量将取决于任何数量的因素而不同，包括但不限于，所治疗的动物类型和疾病状态类型、对象年龄和给予途径。

化合物可以每日几次的频率被给予对象，或其可以较低频率给予，如一日一次、一周一次、每两周一次、一月一次，或甚至更低频率，如数月一次或甚至一年一次或更低。用药频率对于技术人员而言将是显而易见的，并且将取决于任何数量的因素，如，但不限于，所治疗疾病的类型和严重程度、对象类型和年龄等。

定义：

除非另外限定，本文所用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域普通技术人员的常规理解具有相同含义。虽然任何类似或等同于本文所述的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但对优选的方法和材料进行了描述。

如本文所用，下文术语的含义均与本章节具有关联。

本文用冠词“一（a）”和“一（an）”指代一个或多于一个(即，至少一个)冠词的语法对象。作为实例，“元素”意为一个元素或多于一个的元素。

术语“约”将得到本领域普通技术人员的理解，并将在其所使用的上下文中在一定程度上而有所不同。

如本文所用，术语“调节”意指生物状态的任何变化，即，增加、减少及类似状态。

如本文所用，“治疗有效量”是治疗性组合物足以为组合物所给予的对象提供有益效果的量。

如本文所用，术语“抑制”、“减少”、“防止”或“减轻”以及这些术语的变型包括任何可测的减少，包括完全或基本完全的抑制。

如本文所用，除非明确表明仅指选择或选择是互斥的，术语“或”意为“和/或”，但本公开支持仅指代选择以及“和/或”的定义。

如本文所用，术语“治疗”(treat或treatment)指减轻(即，“减少”)和/或消除征兆/症状或征兆/症状来源。作为几个非限制性实例，疾病可通过减轻疾病征兆/症状而得到治疗。疾病征兆/症状也可通过共同消除疾病征兆/症状而得到治疗。

如本文所用，短语“治疗性给药方案”意为在对象患有如本文他处所述的疾病时以包括用药、用药计时和用药频率的方式将本发明的化合物给予对象，从而在对象内产生有益的效果，如对象疾病或疾病症状得到治疗。

如本文所用，短语“预处理给药方案”意为在对象患有如本文他处所述的疾病前以包括用药、用药计时和用药频率的方式将本发明的化合物给予对象，从而在对象内产生有益的效果，如对象疾病或疾病症状得到治疗。

如本文所用，术语“对象”指哺乳动物，包括狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠和小鼠以及人。优选对象是人。

如本文所用，“有效剂量减少”意为，与单独给予镇痛剂时相比，在联合本发明的组合物或方法给予时，随时间较低总剂量的麻醉性镇痛剂足以实现同等水平的镇痛。

贯穿本公开，本发明各方面可以以范围的形式呈现。应当理解的是，范围形式的描述仅意图方便和简练，不应被解释为对本发明范围的硬性限制。因此，范围描述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，范围描述如1至6应被认为已经具体公开了子范围如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等；以及在该范围内的单个数和部分数，例如，1、2、3、4、5、5.5和6。这种应用无关范围的宽度。

考虑本说明书讨论的任何实施方式可对本发明任何方法或组合物实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。

实验实施例

现参考下列实施例对本发明进行描述。这些实施例提供的目的仅为示例，本发明决不应被解释为限于这些实施例，而应被解释为包括由于本文提供的教导而显而易见的任何和全部改变。

认为无需进一步描述，本领域普通技术人员可运用前文描述和下文示例性实施例，制成和应用本发明的化合物和实践要求保护的方法。下文工作实施例因此具体指出了本发明的优选实施方式，而不以任何方式被解释为限制其余公开内容。

现描述材料和方法。

本发明的示例性化合物在表1中显示。表1还确定了用于制备本发明的示例性化合物的苯并唑和用于制备这些苯并

唑的起始材料。商业可获得的化合物不包括在该结构下的化合物编号。

表1

苯并

唑形成方法：

化合物3：

用NaNO₂(5.61g，81.30mmol)的水(13mL)溶液在-5℃下处理3-甲氧基苯酚(10g，80.55mmol)的丙酸(80mL)溶液。在-5℃下搅拌1h后，添加硝酸(6.7mL，161.10mmol)。将浆液在-5℃下搅拌1h，然后在室温下搅拌16h。然后在室温下以滴加方式添加水(80mL)。将生成的固体过滤，用50%丙酸水溶液洗涤，干燥，以得到7.47g(55%)5-甲氧基-2-硝基-苯酚。

随后，在乙酸乙酯/乙醇(100mL，1：1v/v)混合物中制备5-甲氧基-2-硝基苯酚(7.47g)与10%Pd/C(1.87g)的混合物。在室温下将生成的浆液在H₂气氛下搅拌3.5h。随后将氢洗出反应烧瓶，并通过硅藻土(Celite)过滤反应混合物。用另外的溶剂洗涤硅藻土垫，然后在真空下去除生成的滤液中的挥发物，以得到2-氨基-5-甲氧基苯酚(6.03g，98%)。

下一步，将乙醇(80mL)中的2-氨基-5-甲氧基苯酚(3c)(6.03g，43.33mmol)与乙基黄原酸钾(6.95g，73.33mmol)的混合物加热回流18h。随后冷却反应，并在真空下去除溶剂。将剩余物移至乙酸乙酯(150mL)，用4N HCl、水和盐水连续洗涤。随后在Na₂SO₄上干燥有机溶液。过滤去除干燥助剂后，蒸发溶剂，以得到6.23g(79%)6-甲氧基苯并

唑-2-硫醇。

最后，将6-甲氧基苯并

唑-2-硫醇(5.16g，28.48mmol)、亚硫酰氯(28mL)与催化量的DMF(60μL)的混合物在室温下搅拌4h。在真空下去除挥发物。将甲苯(30mL)添加至剩余物，并蒸发混合物。将该程序再重复两次，以得到粗制化合物3，即，2-氯-6-甲氧基苯并

唑。

化合物5：

除起始材料是5-氟-2-硝基苯酚并且不进行硝化外，化合物5是根据关于化合物3所述的一般程序制备的。

化合物7：

除起始材料是6-氨基-2,4-氯-3-甲基-苯酚并且不进行硝化或还原外，化合物7是根据关于化合物3所述的程序制备的。

化合物9：

除起始材料是2-氨基-4-叔丁基苯酚并且不进行硝化或还原外，化合物9是根据关于化合物3所述的程序制备的。

化合物11：

除外起始材料是4-氨基-3-羟基苯甲酸甲酯并且不进行硝化或还原，化合物11是根据关于化合物3所述的程序制备的。

化合物13：

除起始材料是2-氨基-4-乙磺酰基苯酚并且不进行硝化或还原外，化合物13是根据关于化合物3所述的程序制备的。

化合物15：

除起始材料是2-氨基-5-氯苯酚并且不进行硝化或还原外，化合物15是根据关于化合物3所述的程序制备的。

化合物17：

除起始材料是4-甲氧基-2-硝基苯酚并且不进行硝化外，化合物17是根据关于化合物3所述的程序制备的。

化合物19：

将乙基黄原酸钾(13.4g，84.0mmol)与4-氯-2-氨基苯酚(10g，69.6mmol)混合物溶于纯乙醇(200mL)。在回流下搅拌混合物过夜。冷却后，在减压下蒸发溶剂，并将剩余物溶于水(200mL)，和用HOAc处理以调节pH至5。形成固体，将其过滤和干燥，以得到5-氯-2-巯基苯并

唑(12.8g，产率99.1%)。

随后，将5-氯-2-巯基苯并

唑(3.1g，16.7mmol)溶于亚硫酰氯(30mL，413mmol)。添加DMF(1.5mL)，并将反应混合物在65℃下加热45min。在减压下去除溶剂，并向剩余物添加甲苯(2×60mL)，然后每次进行蒸发以去除过量的SOCl₂(共沸物)。将生成的粗产物溶于乙酸乙酯(100mL)，用水(100mL)洗涤，并在Na₂SO₄上干燥。蒸发乙酸乙酯得到2,5-二氯苯并

唑，化合物19，如红色油(3.2g)。

化合物22：

将乙基黄原酸钾(16.0g，0.1mol)与2-氨基-4-甲基苯酚(12.3g，0.1mol)的混合物溶于纯乙醇(150mL)。在回流下搅拌混合物过夜。冷却后，在减压下蒸发反应溶剂。将生成的剩余物溶于水(200mL)，并用HOAc处理至pH达到5。将生成的固体过滤和干燥，以提供5-甲基-2-巯基苯并

唑(16.0g，96%产率)。随后，将5-甲基-2-巯基苯并

唑(6.2g，38mmol)溶于亚硫酰氯(36.9mL)，并添加2.79mL DMF。然后将反应混合物在室温下搅拌30min。在减压下去除溶剂，并向剩余物添加甲苯(2×60mL)，然后每次进行蒸发以通过共沸物去除过量的SOCl₂。将生成的粗产物溶于乙酸乙酯(100mL)，用水(100mL)洗涤，和在Na₂SO₄上干燥。蒸发乙酸乙酯得到粗制物22，将其通过硅胶-凝胶柱层析(洗脱液：石油醚)纯化，提供纯2-氯-5-甲基苯并唑，化合物22，(3.5g，58%)。

化合物25：

向0℃的3-甲氧基苯酚(11.1g，0.09mmol)的丙酸(90mL)溶液滴加NaNO₂(6.3g，0.09mmol，在5mL水中)。将混合物在0℃下搅拌1小时。然后滴加浓硝酸(12mL)，并将混合物在0℃下搅拌1小时和在室温下搅拌2小时，随后添加水(30mL)，并收集生成的沉淀，将其用50%丙酸洗涤，得到2-硝基-5-甲氧基苯酚，如黄色固体(5.8g，40%产率)。

随后，制备粗制2-硝基-5-甲氧基苯酚(5.0g，29.6mmol)的MeOH(150mL)溶液，然后向其添加Pd/C(1.0g)。将混合物置于H₂气氛下约2-3小时。这段时间后，通过过滤去除催化剂，并浓缩滤液，以得到2-氨基-5-甲氧基苯酚(4.0g，97%产率)。

下一步，将乙基黄原酸钾(4.6g，28.8mmol)与粗制2-氨基-5-甲氧基苯酚(4.0g，28.8mmol)的混合物溶于乙醇(150mL)。将混合物在80℃下加热过夜。冷却后，在减压下蒸发溶剂。将生成的剩余物溶于水，并用1N HCl处理至pH 5，生成沉淀，收集该沉淀。通过用石油醚/乙酸乙酯(3：1v/v)层析纯化由此收集的固体，以提供2-巯基-6-甲氧基苯并唑(4.0g，产率77%)。

最后，将纯2-巯基-6-甲氧基苯并

唑(4.0g，22.2mmol)溶于亚硫酰氯(15mL)。将DMF(1mL)添加至溶液，并将反应混合物在室温下搅拌10min。在减压下去除溶剂。将粗产物溶于乙酸乙酯，用水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，和浓缩，以得到粗制2-氯-6-甲氧基苯并唑，通过用石油醚/乙酸乙酯(3：1v/v)层析将其纯化，以提供2-氯-6-甲氧基苯并

唑，化合物25，(3.7g，产率92%)。

化合物29：

将2-氨基-4-硝基苯酚(12.5g，71mmol)与乙基黄原酸钾(13g，81mmol)的混合物溶于乙醇(200mL)。在回流下将反应加热过夜。冷却后，在减压下蒸发反应混合物中的溶剂。将生成的剩余物溶于水，并用2N HCl调节至pH 2-3，导致红色固体形成。将红色固体过滤，得到2-巯基-5-硝基苯并

唑(10.6g，76%)。

随后，将前述制备的粗制2-巯基-5-硝基苯并唑(10g，51mmol)溶于亚硫酰氯(100mL)。添加DMF(60μL)，并将反应混合物在65℃下加热45min。冷却后，在减压下去除溶剂，并向剩余物添加甲苯两次(2×20mL)，每次随后在真空下蒸发以通过共沸物去除挥发物。将生成的粗产物溶于乙酸乙酯(400mL)，用盐水(200mL)洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤，和浓缩，以得到化合物29，2-氯-5-硝基苯并

唑，如(8.2g，粗制)。

制备根据本发明的化合物：

纯化条件：

在具体描述时，通过用含有0.05%三氟乙酸或0.05%氨水(NH₄OH)的水-乙腈梯度进行的反相层析洗脱而纯化本发明的化合物。因此，以三氟乙酸盐或游离碱得到化合物。

在具体描述时，应用采用乙酸乙酯/石油醚梯度的正相HPLC纯化酯。

在描述时，通过溶解在甲醇中然后添加乙醚以引起沉淀/结晶而分离化合物。

化合物1：

向D-(-)-青霉胺(6.2g，41.5mmol)与DIPEA(14mL，78.5mmol)在150mLMeOH/THF(1：2v/v)中的溶液以滴加方式添加2-氯苯并唑(7.4g，48.0mmol)。搅拌反应过夜。然后在真空下浓缩混合物，以提供浅黄色油，将其用150mL浓HCl处理，生成白色固体。将该产物过滤，用丙酮(2×50mL)和Et₂O(3×50mL)洗涤，生成(S)-2-(2-羟基苯基亚氨基)-噻唑烷-5,5-二甲基-4-羧酸氢氯化物，为白色固体(7.0g，产率56%)。

化合物2：

向搅拌的L-青霉胺(28.5g，0.19mol)和2-氯苯并

唑(35.4g，0.23mol)在400mL MeOH/THF(3：1(v/v))中的溶液在室温下以滴加方式添加N，N-二异丙基乙胺(“DIPEA”)(66.1mL，0.38mol)。搅拌反应过夜。然后在减压下浓缩混合物，以提供浅黄色油，其在用浓HCl(300mL)处理时形成白色晶体。将白色固体过滤，用丙酮(3×50mL)然后Et₂O(5×50mL)洗涤。将生成的白色固体从MeOH/DCM中再次结晶，用DCM(3×50mL)与Et₂O(2×50mL)洗涤，生成化合物2(以其HCl盐)，(R)-2-(2-羟基苯基亚氨基)-噻唑烷-5,5-二甲基-4-羧酸氢氯化物，为白色固体(40.8g，71%)。¹H NMR(DMSO-d₆,ppm):δ=13.2(br s(ex),0.3H),12.1(br s(ex),0.6H),10.5(br s,1.4H),7.25(m,2H),7.07(d,1H),6.88(t,1H),4.65(br s,1H),1.72(s,3H),1.51(s,3H).ESI-MS:267.1(M⁺+H)。HPLC纯度：95%。

化合物4：

将化合物3(5.2g，28.32mmol)、(+)-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(6)(9.34g，25.70mmol)与DIPEA(6.4mL，38.68mmol)在THF(25mL)与甲醇(40mL)中的溶液在室温下搅拌3h，然后在40℃下搅拌14h。随后在真空下去除挥发物。将生成的剩余物悬浮于水(60mL)中，并用5%KHSO₄溶液酸化至pH 3。用CH₂Cl₂(60mL)萃取生成的悬浮液。将有机相用水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤，和在真空下去除溶剂。通过快速柱层析利用从CH₂Cl₂/MeOH(99：1)至CH₂Cl₂/EtOH(9：1)的梯度洗脱纯化剩余物，得到(R)-2-(6-甲氧基苯并

唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸(6.40g，49%)。400MHz 1H-NMR(DMSO-d₆,ppm):13.1-12.7(1H,br s)8.23(1H,d,J=8.6Hz)7.38-7.19(15H,m)7.14(1H,d,J=8.6Hz)7.08(1H,d,J=2.1Hz)6.74(1H,dd,J=8.6,2.1Hz)4.13-4.06(1H,m)3.75(3H,s)2.75(1H,dd,J=12.2,9.5Hz)2.55-2.50(1H,m).ESI-MS(m/z):511[M+H]⁺。

随后，制备(R)-2-(6-甲氧基苯并

唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸(4.0g，7.83mmol)的CH₂Cl₂(35mL)溶液。将Et3SiH(4.2mL，25.8mmol)添加至该溶液，然后添加TFA(6.0mL，78.3mmol)。将反应混合物在氩气、0℃下搅拌30min。在真空下去除挥发物，并通过快速柱层析利用从CH₂Cl₂/MeOH(99：1)至CH₂Cl₂/EtOH(1：2)的梯度洗脱来纯化剩余物，得到化合物4(1.2g，57%)，为游离氨基酸。

将生成的游离氨基酸(680mg，2.53mmol)溶于THF(5.0ml)，并添加1.1当量的Et₂O(1.4ml，2.78mmol)中的2M HCl。在真空下去除挥发物，以得到化合物4，为其HCl盐。400MHz 1H-NMR(DMSO-d6,ppm)10.8-9.2(2H,brs)7.08(1H,d,J=8.6Hz)6.39(1H,d,J=2.7Hz)6.36(1H,dd,J=8.6,2.7Hz)4.82-4.76(1H,m)3.67(3H,s)3.63(1H,dd,J=11.0,9.0Hz)3.51(1H,dd,J=11.0,5.7Hz).ESI-MS(m/z):269[M+H]⁺。

化合物6：

将化合物5(4.24g，24.71mmol)、(+)-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(8.16g，22.45mmol)与DIPEA(5.6mL，33.67mmol)在THF(20mL)与甲醇(35mL)中的溶液在室温下搅拌24h。在真空下去除挥发物。将剩余物悬浮于水，并用5%KHSO₄溶液酸化至pH 3。用CH₂Cl₂(2×100mL)萃取生成的悬浮液。将有机相用水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤，并在真空下去除溶剂。通过快速柱层析利用从CH₂Cl₂/MeOH(99：1)至CH₂Cl₂/EtOH(9：1)的梯度洗脱来纯化剩余物，得到(R)-2-(6-氟苯并

唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸(7.80g，70%)。400MHz ¹H-NMR(DMSO-d₆,ppm):8.46(1H,d,J=8.6Hz)7.40(1H,dd,J=8.4,2.4Hz)7.35-7.20(16H,m)6.99(1H,ddd,J=10.2,8.4,2.4Hz)4.14-4.06(1H,m)2.76(1H,dd,J=12.5,9.6Hz)2.53(1H,dd,J=12.5,4.4Hz).ESI-MS(m/z):499[M+H]⁺。

根据关于制备化合物4所述的一般程序，从(R)-2-(6-氟苯并

唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸制备化合物6，为其HCl盐，产率83%。400MHz ¹H-NMR(DMSO-d₆,ppm):12.3-10.8(3H,br s)7.27(1H,dd,J=8.7,6.4Hz)6.87(1H,dd,J=10.4,2.0Hz)6.72(1H,ddd,J=8.7,8.7,2.5Hz)4.98-4.90(1H,m)3.95-3.83(1H,m)3.68(1H,dd,J=8.2,3.5Hz).ESI-MS(m/z):257[M+H]⁺。熔点：109-111°C。

化合物8：

根据关于制备化合物4和6所述的一般程序，从化合物7制备(R)-2-(5,7-二氯-6-甲基苯并唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸。400MHz¹H-NMR(DMSO-d₆,ppm):13.5-12.5(1H,br s)8.85(1H,d,J=8.2Hz)7.36(1H,s)7.34-7.20(15H,m)4.11-4.03(1H,m)2.76(1H,dd,J=12.6,9.9Hz)2.54(1H,dd,J=12.6Hz).ESI-MS(m/z):563,565,567[M+H]⁺。

根据关于化合物4和6所述的一般程序，从(R)-2-(5,7-二氯-6-甲基苯并

唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸制备化合物8，为其HCl盐，产率50%。400MHz1H-NMR(DMSO-d₆,ppm):11.4-9.7(2H,br s)7.36(1H,s)4.96(1H,dd,J=8.5,3.4Hz)3.93-3.83(1H,m)3.70(1H,dd,J=11.4,3.4Hz)2.40(3H,s).ESI-MS(m/z):321,323,325[M+H]⁺。熔点：205-207°C。

化合物10：

根据关于化合物4和6所述的程序，从化合物9制备(R)-2-(5-叔丁基苯并

唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸。400MHz¹H-NMR(DMSO-d₆,ppm):13.2-12.6(1H,br s)8.33(1H,d,J=8.6Hz)7.36-7.21(17H,m)7.04(1H,dd,J=8.4,2.0Hz)4.15-4.08(1H,m)2.78(1H,dd,J=9.8,12.5Hz)2.54(1H,dd,J=12.5,4.6Hz)1.30(9H,s).ESI-MS(m/z):537[M+H]⁺。

应用关于化合物4和6所述的一般程序，从(R)-2-(5-叔丁基苯并

唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸制备化合物10，为其HCl盐，产率70%。400MHz¹H-NMR(DMSO-d₆,ppm):12.0-11.6(1H,br s)10.5-9.9(2H,br s)7.27(1H,dd,J=8.6,2.5Hz)7.22(1H,d,J=2.5Hz)6.98(1H,d,J=8.6Hz)5.08-4.84(1H,m)3.99-3.85(1H,m)3.75-3.65(1H,m)1.24(9H,s).ESI-MS(m/z):295[M+H]⁺。

化合物12：

根据关于化合物4和6所述的程序，从化合物11制备(R)-2-(1-羧基-2-三苯甲基磺酰基-乙基氨基)-苯并

唑-6-羧酸甲酯。400MHz¹H-NMR(DMSO-d₆,ppm):13.3-12.8(1H,br s)8.89(1H,d,J=8.4Hz)7.90(1H,d,J=1.4Hz)7.83(1H,dd,J=8.4,1.4Hz)7.36-7.18(16H,m)4.19-4.11(1H,m)3.84(3H,s)2.79(1H,dd,J=12.6,9.8Hz)2.56(1H,dd,J=12.6,9.8Hz).ESI-MS(m/z):539M+H]⁺。

根据关于化合物4和6所述的程序，从(R)-2-(1-羧基-2-三苯甲基磺酰基-乙基氨基)-苯并

唑-6-羧酸甲酯制备化合物12，为其HCl盐，产率75%。400MHz1H-NMR(DMSO-d₆,ppm)11.9-10.2(3H,br s)7.62-7.57(1H,m)7.49-7.42(2H,m)4.96(1H,dd,J=8.8,3.5Hz)3.92-3.83(1H,m)3.84(3H,s)3.68(1H,dd,J=11.5,3.5Hz).ESI-MS(m/z):297[M+H]⁺。熔点：118-120°C。

化合物14：

根据关于制备化合物4和6所述的一般程序，从化合物13制备(R)-2-(6-乙磺酰基苯并

唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸。400MHz¹H-NMR(DMSO-d₆,ppm):8.69-8.59(1H,m)7.67(1H,d,J=1.8Hz)7.63(1H,d,J=8.2Hz)7.55(1H,dd,J=8.2,1.8Hz)7.37-7.18(15H,m)4.13-4.05(1H,m)3.28(2H,q,J=7.4Hz,与水重叠)2.76(1H,dd,J=12.2,9.2Hz)2.59(1H,dd,J=12.2,4.2Hz)1.09(3H,t,J=7.4Hz).ESI-MS(m/z):573[M+H]⁺。

如关于化合物4和6所述，从(R)-2-(6-乙磺酰基-苯并

唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸制备化合物14，为其HCl盐，产率33%。400MHz 1H-NMR(DMSO-d₆,ppm):12.4-11.5(2H,br s)7.81-7.71(1H,m)7.69-7.59(1H,m)7.15(1H,d,J=8.4Hz)4.94-4.87(1H,m)3.87-3.76(1H,m)3.68-3.60(1H,m)3.17(2H,q,J=7.2Hz)1.06(3H,t,J=7.2Hz).ESI-MS(m/z):331[M+H]⁺。

化合物16：

根据关于制备化合物4和6所述的一般程序，从化合物15制备(R)-2-(6-氯苯并

唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸。400MHz¹H-NMR(DMSO-d₆,ppm):8.50(1H,d,J=8.4Hz)7.39(1H,d,J=8.4Hz)7.33-7.19(16H,m)7.03(1H,dd,J=8.4,2.1Hz)4.13-4.06(1H,m)2.74(1H,dd,J=12.4,9.3Hz)2.55(1H,dd,J=12.4,4.6Hz).ESI-MS(m/z):515,517[M+H]⁺。

根据关于化合物4和6所述的一般程序，从(R)-2-(6-氯苯并

唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸制备化合物16，产率42%。400MHz¹H-NMR(DMSO-d₆,ppm):12.0-10.4(3H,br s)7.46-7.37(1H,m)7.26-7.17(1H,m)7.02(1H,d,J=8.6Hz)4.94(1H,dd,J=8.4,3.5Hz)3.91-3.80(1H,m)3.66(1H,dd,J=11.5,3.5Hz).ESI-MS(m/z):273,275[M+H]⁺。

化合物18：

根据关于制备化合物4和6所述的一般程序，从化合物17制备(R)-2-(5-甲氧基苯并

唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸。200MHz ¹H-NMR(DMSO-d₆,ppm):8.36(1H,d,J=8.6Hz)7.38-7.18(16H,m)6.86(1H,d,J=2.6Hz)6.57(1H,dd,J=8.8,2.6Hz)4.17-4.02(1H,m)3.73(3H,s)2.75(1H,dd,J=12.2,9.9Hz)2.57-2.50(1H,m,与DMSO重叠).ESI-MS(m/z):511[M+H]⁺。

应用关于制备化合物4和6所述的一般程序，从(R)-2-(5-甲氧基苯并唑-2-基氨基)-3-三苯甲基磺酰基-丙酸制备化合物18，为其HCl盐，产率48%。400MHz1H-NMR(DMSO-d₆,ppm):12.2-9.5(3H,m)6.92(1H,d,J=8.8Hz)6.90-6.86(1H,m)6.83-6.76(1H,m)4.96-4.89(1H,m)3.90-3.83(1H,m)3.67(3H,s)3.68-3.63(1H,m).ESI-MS(m/z):269[M+H]⁺。

化合物20：

将化合物19(1.5g，8.3mmol)和(S)-甲基2-氨基-3-巯基-3-甲基丁酸酯(1.7g，8.5mmol)溶于15mL DMF。随后，添加DIPEA(2.9mL)。将反应混合物在室温下搅拌3h。将反应用乙酸乙酯(200mL)稀释，用水(100mL)、饱和NH₄Cl溶液(100mL)和盐水溶液(50mL)洗涤。将有机相在Na₂SO₄上干燥，过滤和浓缩，以得到黑色油，然后将其通过硅胶-凝胶柱层析(洗脱液：i-PrOH/PE=1：20)纯化，得到浅黄色固体。将固体从乙酸乙酯和庚烷重结晶，得到化合物20(725mg，产率27%，纯度：99%)。¹H NMR(CDCl₃,500MHz):δ6.96(d,J=8.4Hz,1H),6.95(s,1H),6.96(d,J=7.5Hz,1H),4.43(s,1H),3.82(s,3H),1.73(s,3H),1.47(s,3H).¹³C NMR(CDCl₃,125MHz):δ167.3,160.3,146.1,123.1,122.1,118.6,50.6,26.3,23.7.ESI-MS(m/z):315.0[M+1]⁺。

化合物21：

将化合物19(1.65g，8.8mmol)与D-青霉胺(1.40g，9.4mmol)溶于10mL DMF。随后，添加DIPEA(2.5mL)。将生成的混合物在室温下搅拌2小时。然后将反应用水(200mL)稀释和用乙酸乙酯(2×150mL)洗涤。浓缩水相，并通过用含有0.05%TFA的H₂O/CH₃CN梯度进行洗脱的制备型HPLC纯化剩余物，以得到(S)-2-(2-羟基-5-氯苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸，为白色固体TFA盐(1.2g，产率45%，纯度：100%)。¹H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ7.37(s,1H),7.21(d,J=8.0Hz,1H),6.97(d,J=8.4Hz,1H),4.61(brs,1H),1.70(s,3H),1.49(s,3H);¹³C NMR(DMSO-d6,100MHz):δ168.6,150.5,128.3,125.3,122.1,115.5,113.3,72.2,57.4,28.5,24.7;ESI-MS(m/z):301.0[M+1]⁺。

化合物23：

将化合物22(668mg，4.0mmol)和(S)-甲基2-氨基-3-巯基-3-甲基丁酸酯氢氯化物(960mg，4.8mmol)溶于10mL DMF。随后，添加DIPEA(8.0mL)。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应用乙酸乙酯(200mL)稀释和用水(100mL)洗涤。将有机相在Na₂SO₄上干燥，过滤，和在真空下浓缩。通过硅胶-凝胶柱层析(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚：1：3-1：1)纯化剩余物，得到化合物23。

通过用含有0.05%TFA的H₂O/CH₃CN梯度洗脱进行的制备型HPLC进一步纯化粗产物，得到(S)-2-(2-羟基-5-甲基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯TFA盐(600mg，产率51%)。¹H NMR(CDCl₃,500MHz):δ6.92(d,J=7.5Hz,1H),6.71(s,1H),6.56(d,J=7.0Hz,1H),4.58(s,1H),3.84(s,3H),2.20(s,3H),1.73(s,3H),1.50(s,3H);¹³C NMR(CDCl₃,125MHz):δ174.3,166.6,151.4,140.8,125.3,121.7,120.6,118.1,71.4,57.5,53.1,28.5,25.2,21.2;ESI-MS(m/z):295.1[M+1]⁺。

化合物24：

将化合物22(1.0g，6.0mmol)和(S)-青霉胺(983mg，6.6mmol)溶于5mL DMF。随后，添加DIPEA(155mL，12mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。浓缩混合物，并通过用含有0.05%TFA的H₂O/CH₃CN梯度洗脱进行的制备型HPLC纯化生成的剩余物。将生成的产物从MeOH和二乙醚重结晶，得到化合物24，为盐。¹H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ6.99(d,J=6.0Hz,1H),6.61(s,1H),6.54(d,J=7.5Hz,1H),4.39(s,1H),2.18(s,3H),1.63(s,3H),1.40(s,3H);¹³C NMR(DMSO-d6,125MHz):δ170.8,160.5,148.5,134.2,127.5,121.9,119.6,118.1,77.0,58.7,28.1,25.5,20.4;ESI-MS(m/z):281.1[M+1]⁺。

化合物26：

将化合物25(870mg，4.7mmol)与D-青霉胺(710mg，4.7mmol)溶于DMSO(20mL)，并添加NaOH(430mg，10.7mmol)。将反应在室温下搅拌3h。然后将混合物用6N HCl(1.5mL)酸化至pH 3-4，然后通过用乙腈/蒸馏水(具有0.05%TFA)洗脱进行的快速层析来纯化，得到化合物26，为盐(1.0g，74%，纯度：97%)。¹H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ6.97(d,J=8.0Hz,1H),6.37(s,1H),6.34(d,J=8.5Hz,1H),4.38(s,1H),3.66(s,3H),1.63(s,3H),1.40(s,3H);¹³C NMR(DMSO-d6,125MHz):δ170.5,157.8,151.0,124.1,122.3,104.5,103.0,76.2,58.7,55.1,27.7,25.5;ESI-MS(m/z):297.1[M+1]⁺。

化合物27：

制备化合物26(800mg，2.7mmol)的MeOH(30mL)溶液。然后以滴加方式添加SOCl₂(0.8mL)。将混合物在室温下搅拌过夜。在减压下浓缩生成的溶液，得到标题化合物，白色固体化合物27，为其HCl盐(930mg，99%，纯度：95%)。¹H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ11.7(brs,1H),10.5(brs,1H),7.12(d,J=8.0Hz,1H),6.37(brs,1H),6.46(brs,1H),4.74(brs,1H),3.77(s,3H),3.72(s,3H),1.70(s,3H),1.43(s,3H);¹³C NMR(DMSO-d6,125MHz):δ167.6,160.2,153.3,127.5,104.8,102.2,70.7,57.0,55.2,52.6,24.2;ESI-MS(m/z):311.1[M+1]⁺。

化合物28：

将化合物15(693mg，3.7mmol)与D-青霉胺(550mg，3.7mmol)溶于4mLDMF。随后添加DIPEA(960mg，7.5mmol)。将反应在室温下搅拌3h。浓缩生成的混合物，并通过用含有0.05%TFA的H₂O/CH₃CN梯度洗脱进行的制备型HPLC纯化粗产物，得到化合物28，为粉色固体(652mg，产率58%)。¹H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ7.17(brs,1H),6.81-6.75(m,2H),4.37(s,1H),1.62(s,3H),1.39(s,3H);¹³C NMR(DMSO-d6,125MHz):δ170.7,159.4,149.4,127.2,122.4,118.7,116.5,28.3,25.5;ESI-MS(m/z):301.1[M+1]⁺。

化合物30：

向化合物29(1.0g，5.0mmol)的DMF(30mL)溶液添加D-青霉胺甲酯(1.6g，10.0mmol)与Na₂CO₃(2.5g，19.8mmol)。将反应在室温下搅拌30min。将生成的混合物用乙酸乙酯(150mL)稀释，并将生成的有机相用NH₄Cl溶液、盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤和在真空下浓缩。通过用含有0.05%TFA的H₂O/CH₃CN梯度洗脱进行的制备型HPLC纯化生成的粗产物，得到(R)-2-(2-羟基-5-硝基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯(850mg，50%)。¹H NMR(CDCl₃,500MHz):δ8.06(s,1H),7.98(d,J=9.0Hz,1H),7.01(d,J=9.0Hz,1H),4.64(s,1H),3.93(s,3H),1.81(s,3H),1.50(s,3H);¹³C NMR(MeOD,125MHz):δ173.6,168.7,159.5,141.6,126.9,125.2,123.8,117.7,73.0,59.6,53.5,29.3,25.1;ESI-MS(m/z):326.1[M+1]⁺。

化合物31：

将化合物29(1.84g，9.3mmol)与D-青霉胺(1.4g，9.3mmol)溶于DMF(5mL)。随后添加DIPEA(2mL)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应用乙酸乙酯(200mL)稀释，并将固体滤去。将生成的有机相用水洗涤，并合并和浓缩生成的水相。通过用含有0.05%TFA的H₂O/CH₃CN梯度洗脱进行的制备型HPLC纯化生成的剩余物。得到化合物31，为白色固体(1.28g，产率45%，纯度：100%)。¹H NMR(DMSO-d6,500MHz):δ8.24(brs,1H),8.05(d,J=9.0Hz,1H),7.09(d,J=9.0Hz,1H),4.59(s,1H),1.70(s,3H),1.49(s,3H);¹³C NMR(MeOD,125MHz):δ169.3,158.3,139.8,124.5,121.7,118.4,116.9,115.5,72.7,57.8,28.9,25.3;ESI-MS(m/z):312.0[M+1]⁺。

化合物32：

将化合物13(800mg，3.2mmol)与D-青霉胺甲酯(1.0g，6.1mmol)溶于DMF(20mL)。随后添加Na₂CO₃(500mg，4.7mmol)。将反应在0℃下搅拌2h。然后将混合物用乙酸乙酯(100mL)稀释，随后用NH₄Cl(100mL)水溶液洗涤，然后用盐水(50mL)洗涤。将有机相干燥(NaSO₄)和浓缩。通过硅胶凝胶层析(洗脱液：乙酸乙酯/石油醚：1：1(v/v))纯化生成的粗产物，并将终产物从乙酸乙酯/石油醚重结晶，得到化合物32，为白色固体(550mg，40%，99%纯度)。¹H NMR(CDCl₃,500MHz):δ7.53-7.52(m,2H),7.98(d,J=8.5Hz,1H),4.44(s,1H),3.84(s,3H),3.08(q,J=7.5Hz,2H),1.75(s,3H),1.48(s,3H),1.26(t,J=7.5Hz,3H);¹³C NMR(MeOD,125MHz):δ171.6,164.0,155.4,129.6,126.0,122.7,117.3,52.7,51.6,49.0,29.3,25.9,7.8;ESI-MS(m/z):373.0[M+1]⁺。

化合物33：

将化合物13(2.0g，8.1mmol)与D-青霉胺(1.22g，8.1mmol)溶于DMF(20mL)，并添加DIPEA(3.3g，32.6mmol)。将反应在0℃下搅拌15min。然后浓缩混合物，并通过用含有0.05%TFA的H₂O/CH₃CN梯度洗脱进行的制备型HPLC纯化生成的粗产物，得到化合物33，为白色固体(380mg，30%)。¹H NMR(D₂O,500MHz):δ7.82(s,1H),7.76(d,J=9.0Hz,1H),7.19(d,J=9.0Hz,1H),3.26(q,J=7.5Hz,2H),1.70(s,3H),1.51(s,3H),1.49(t,J=7.5Hz,3H);¹³C NMR(MeOD,125MHz):δ158.4,134.4,128.3,118.3,73.6,59.5,51.4,29.0,26.3,7.7;ESI-MS(m/z):359.0[M+1]⁺。

化合物34：

根据用于制备化合物2的程序，从2-氯苯并

唑和L-半胱氨酸甲酯制备化合物34。

化合物35：

根据关于化合物20所述的程序，从2-氯苯并

唑和D-青霉胺甲酯制备化合物35。

化合物36：

根据关于化合物20所述的程序，从2,6-二氯苯并

唑(化合物15)和L-半胱氨酸甲酯制备化合物36。

化合物37：

根据关于化合物20所述的程序，从2,6-二氯苯并唑(化合物15)和D-青霉胺甲酯制备化合物37。

化合物38：

根据关于化合物21所述的程序，从2,6-二氯苯并

唑(化合物15)和L-半胱氨酸制备化合物38。

化合物39：

根据关于化合物27所述的程序，从化合物2制备化合物39。

化合物6的晶体结构数据

分数原子坐标&U(ISO)

原子	x/a	y/b	z/c	U(iso)
					S(1)	0.0619(5)	0.89329(18)	0.62592(5)	0.0443(10)
F(14)	-0.0622(11)	0.4166(4)	0.46571(10)	0.070(3)
					O(16)	-0.3230(12)	1.0220(5)	0.79075(13)	0.055(3)
O(17)	-0.4006(12)	1.1860(5)	0.73194(14)	0.056(3)
					O(13)	0.1024(13)	0.3833(5)	0.63281(14)	0.068(3)

N(6)	-0.2559(14)	0.6449(5)	0.64916(13)	0.037(3)
					C(5)	0.0061(17)	1.0476(7)	0.66746(17)	0.043(4)
N(3)	-0.2344(14)	0.8374(5)	0.70441(14)	0.037(3)
					C(2)	-0.1638(15)	0.7796(7)	0.66208(17)	0.033(3)
C(15)	-0.2837(18)	1.0732(7)	0.7486(2)	0.041(4)
					C(4)	-0.0713(16)	0.9757(6)	0.71660(18)	0.035(4)
C(12)	-0.3366(17)	0.6534(7)	0.56100(19)	0.050(4)
					C(10)	-0.113(2)	0.4730(8)	0.5110(2)	0.054(5)
C(7)	-0.2030(17)	0.5848(7)	0.60091(18)	0.040(4)
					C(11)	-0.2924(18)	0.5958(8)	0.51475(19)	0.048(5)
C(8)	-0.0280(18)	0.4573(6)	0.5958(2)	0.043(4)
					C(9)	0.0169(17)	0.3990(7)	0.54902(19)	0.051(5)
H(5A)	0.22988	1.100461	0.665826	0.056664
					H(5B)	-0.16939	1.129391	0.655266	0.056664
H(6)	-0.42047	0.595765	0.66908	0.061308
					H(9)	0.136361	0.311578	0.542664	0.084648
H(11)	-0.384011	0.641693	0.486906	0.068208
					H(12)	-0.459431	0.740398	0.566439	0.078816
H(13)	0.153817	0.41732	0.666581	0.143532
					H(3)	-0.337489	0.773729	0.731041	0.059208
H(4)	0.131722	0.957573	0.738132	0.04524

表格的温度因子：exp[-2π^2U]，U=U(iso)或

1/3SUM(i)SUM(j){U(ij)*astar(i).astar(j).a(i).a(j).cos(ij)}

各向异性热参数

原子	U11	U22	U33	U12	U13	U23
							S(1)	0.0558(13)	0.0428(10)	0.0342(8)	-.0013(10)	0.0127(8)	-.0013(8)
F(14)	0.104(4)	0.072(3)	0.0354(18)	-.006(3)	0.011(2)	-.0258(18)
							O(16)	0.079(4)	0.059(3)	0.026(2)	0.017(3)	0.012(2)	0.005(2)
O(17)	0.078(4)	0.049(3)	0.041(2)	0.025(3)	0.014(3)	0.004(2)
							O(13)	0.120(5)	0.044(3)	0.041(2)	0.027(3)	-.016(3)	-.001(2)
N(6)	0.051(4)	0.034(3)	0.027(2)	-.004(3)	0.009(2)	-.002(2)
							C(5)	0.047(5)	0.044(4)	0.038(3)	0.008(4)	0.017(4)	-.001(3)
N(3)	0.049(4)	0.036(3)	0.027(3)	0.009(3)	0.006(3)	-.001(2)
							C(2)	0.037(5)	0.040(4)	0.023(3)	-.003(3)	0.006(3)	0.003(3)
C(15)	0.041(5)	0.041(4)	0.040(4)	-.011(4)	0.004(3)	-.013(3)
							C(4)	0.038(5)	0.037(4)	0.031(3)	-.001(4)	0.004(3)	-.003(3)
C(12)	0.066(6)	0.050(4)	0.033(3)	0.001(4)	0.005(3)	-.001(3)
							C(10)	0.084(7)	0.055(4)	0.022(3)	-.010(5)	0.003(4)	-.009(3)
C(7)	0.055(5)	0.034(4)	0.030(3)	-.013(4)	-.001(3)	-.001(3)
							C(11)	0.057(5)	0.048(4)	0.038(3)	-.003(5)	0.001(3)	-.003(3)
C(8)	0.057(6)	0.030(4)	0.041(3)	-.005(4)	0.002(4)	-.004(3)
							C(9)	0.071(6)	0.037(4)	0.044(4)	-.002(5)	0.004(4)	-.020(3)

T=exp[2π**2(U11.h**2.astar**2+U22.k**2.bstar**2+U33.l**2.cstar**2+2U12.h.k.astar.bstar+2U13.h.l.astar.cstar+2U23.k.l.bstar.cstar)]

分子内键长

最小键长=0.80A：最大键长=1.80A

S(1)-C(2)	1.735(6)	F(14)-C(10)	1.369(7)
				O(16)-C(15)	1.264(7)	O(17)-C(15)	1.226(8)
O(13)-C(8)	1.346(7)	N(6)-C(2)	1.327(8)
				N(6)-C(7)	1.458(6)	C(5)-C(4)	1.542(7)
N(3)-C(2)	1.317(7)	N(3)-C(4)	1.473(8)
				C(15)-C(4)	1.551(9)	C(12)-C(7)	1.391(8)
C(12)-C(11)	1.393(8)	C(10)-C(11)	1.356(11)
				C(10)-C(9)	1.367(9)	C(7)-C(8)	1.384(9)
C(8)-C(9)	1.410(8)	O(16)-H(6)	1.70(4)
				O(16)-H(13)	1.68(4)	O(17)-H(3)	1.72(5)
O(13)-H(13)	1.00(4)	N(6)-H(6)	1.00(5)
				C(5)-H(5A)	1.08(7)	C(5)-H(5B)	1.11(7)
N(3)-H(3)	1.03(5)	C(4)-H(4)	1.07(6)
				C(12)-H(12)	0.96(7)	C(11)-H(11)	0.95(6)
C(9)-H(9)	0.97(7)

分子内键角(H省略)

最小键长=0.80A：最大键长=1.80A

C(2)-N(6)-C(7)	122.6(5)	C(2)-N(3)-C(4)	115.3(5)
				S(1)-C(2)-N(6)	123.8(4)	S(1)-C(2)-N(3)	114.1(5)
N(6)-C(2)-N(3)	122.1(5)	O(16)-C(15)-O(17)	126.5(6)
				O(16)-C(15)-C(4)	113.5(5)	O(17)-C(15)-C(4)	120.0(5)
C(5)-C(4)-N(3)	105.0(4)	C(5)-C(4)-C(15)	113.2(5)
				N(3)-C(4)-C(15)	109.0(5)	C(7)-C(12)-C(11)	120.3(6)
F(14)-C(10)-C(11)	117.8(5)	F(14)-C(10)-C(9)	117.1(6)
				C(11)-C(10)-C(9)	125.2(6)	N(6)-C(7)-C(12)	119.6(6)
N(6)-C(7)-C(8)	119.2(5)	C(12)-C(7)-C(8)	121.1(5)
				C(12)-C(11)-C(10)	117.0(6)	O(13)-C(8)-C(7)	124.4(5)
O(13)-C(8)-C(9)	117.0(5)	C(7)-C(8)-C(9)	118.6(5)
				C(10)-C(9)-C(8)	117.8(6)

分子内扭角(H省略)

最小键长=0.80A：最大键长=1.80A

键	角	键	角
				C(7)-N(6)-C(2)-S(1)	-6.6(4)	C(7)-N(6)-C(2)-N(3)	174.4(9)
C(2)-N(6)-C(7)-C(12)	-62.8(7)	C(2)-N(6)-C(7)-C(8)	119.2(8)
				C(4)-N(3)-C(2)-S(1)	-9.3(4)	C(4)-N(3)-C(2)-N(6)	169.8(8)
C(2)-N(3)-C(4)-C(5)	27.2(5)	C(2)-N(3)-C(4)-C(15)	148.7(7)
				S(1)-C(2)-N(6)-C(7)	-6.6(4)	S(1)-C(2)-N(3)-C(4)	-9.3(4)
N(6)-C(2)-N(3)-C(4)	169.8(8)	N(3)-C(2)-N(6)-C(7)	174.4(9)
				O(16)-C(15)-C(4)-C(5)	-173.3(8)	O(16)-C(15)-C(4)-N(3)	70.2(6)
O(17)-C(15)-C(4)-C(5)	8.3(6)	O(17)-C(15)-C(4)-N(3)	-108.1(7)
				C(5)-C(4)-N(3)-C(2)	27.2(5)	C(5)-C(4)-C(15)-O(16)	-173.3(8)
C(5)-C(4)-C(15)-O(17)	8.3(6)	N(3)-C(4)-C(15)-O(16)	70.2(6)
				N(3)-C(4)-C(15)-O(17)	-108.1(7)	C(15)-C(4)-N(3)-C(2)	148.7(7)
C(11)-C(12)-C(7)-N(6)	-178.9(9)	C(7)-C(12)-C(11)-C(10)	-0.7(6)
				C(11)-C(12)-C(7)-C(8)	-0.9(6)	F(14)-C(10)-C(11)-C(12)	-178.7(10)
F(14)-C(10)-C(9)-C(8)	178.7(9)	C(9)-C(10)-C(11)-C(12)	2.5(7)
				C(11)-C(10)-C(9)-C(8)	-2.5(7)	C(12)-C(7)-N(6)-C(2)	-62.8(7)
N(6)-C(7)-C(12)-C(11)	-178.9(9)	N(6)-C(7)-C(8)-O(13)	-0.5(5)
				C(8)-C(7)-N(6)-C(2)	119.2(8)	N(6)-C(7)-C(8)-C(9)	178.9(9)
C(12)-C(7)-C(8)-O(13)	-178.5(10)	C(8)-C(7)-C(12)-C(11)	-0.9(6)
				C(12)-C(7)-C(8)-C(9)	1.0(6)	C(12)-C(11)-C(10)-F(14)	-178.7(10)
C(10)-C(11)-C(12)-C(7)	-0.7(6)	C(12)-C(11)-C(10)-C(9)	2.5(7)
				O(13)-C(8)-C(7)-N(6)	-0.5(5)	O(13)-C(8)-C(7)-C(12)	-178.5(10)
O(13)-C(8)-C(9)-C(10)	-179.8(9)	C(9)-C(8)-C(7)-N(6)	178.9(9)

C(9)-C(8)-C(7)-C(12)	1.0(6)	C(7)-C(8)-C(9)-C(10)	0.7(6)
				C(8)-C(9)-C(10)-F(14)	178.7(9)	C(10)-C(9)-C(8)-O(13)	-179.8(9)
C(10)-C(9)-C(8)-C(7)	0.7(6)	C(8)-C(9)-C(10)-C(11)	-2.5(7)

分子间非键合距离(H省略)

最小距离=1.95A：最大距离=3.50A

原子(1)-原子(2)	距离	ns	np	Ta	Tb	Tc	x(2)	y(2)	z(2)
										S(1)-F(14)	3.466(4)	3	1	0	1	1	0.43782	1.08343	0.53429
F(14)-C(9)	3.406(8)	3	1	-1	0	1	-0.48312	0.10096	0.45098
										O(16)-O(17)	3.319(6)	4	1	-1	-1	1	-0.59944	0.68598	0.76806
O(16)-O(13)	2.635(6)	4	1	0	0	1	-0.10236	0.8833	0.86719
										O(16)-N(6)	2.706(7)	4	1	-1	0	1	-0.74411	1.14494	0.85084
O(16)-N(6)	3.207(7)	4	1	0	0	1	0.25589	1.14494	0.85084
										O(16)-N(3)	3.434(7)	4	1	-1	0	1	-0.76558	1.33737	0.79559
O(16)-C(2)	3.471(8)	4	1	-1	0	1	-0.83615	1.27955	0.83792
										O(16)-C(2)	3.399(8)	4	1	0	0	1	0.16385	1.27955	0.83792
O(17)-C(5)	3.370(8)	1	1	-1	0	0	-0.99394	1.04756	0.66746
										O(17)-N(3)	2.732(7)	4	1	-1	0	1	-0.76558	1.33737	0.79559
O(17)-C(4)	3.498(8)	1	1	-1	0	0	-1.07126	0.97567	0.7166
										O(13)-C(5)	3.203(8)	1	1	0	-1	0	0.00606	0.04756	0.66746
N(3)-C(15)	3.424(8)	4	1	-1	-1	1	-0.7163	0.57321	0.75135
										S(1)-F(14)	3.466(4)	3	1	0	1	1	0.43782	1.08343	0.53429
F(14)-C(9)	3.406(8)	3	1	-1	0	1	-0.48312	0.10096	0.45098
										O(16)-O(17)	3.319(6)	4	1	-1	-1	1	-0.59944	0.68598	0.76806
O(16)-O(13)	2.635(6)	4	1	0	0	1	-0.10236	0.8833	0.86719
										O(16)-N(6)	2.706(7)	4	1	-1	0	1	-0.74411	1.14494	0.85084
O(16)-N(6)	3.207(7)	4	1	0	0	1	0.25589	1.14494	0.85084
										O(16)-N(3)	3.434(7)	4	1	-1	0	1	-0.76558	1.33737	0.79559
O(16)-C(2)	3.471(8)	4	1	-1	0	1	-0.83615	1.27955	0.83792
										O(16)-C(2)	3.399(8)	4	1	0	0	1	0.16385	1.27955	0.83792
O(17)-C(5)	3.370(8)	1	1	-1	0	0	-0.99394	1.04756	0.66746
										O(17)-N(3)	2.732(7)	4	1	-1	0	1	-0.76558	1.33737	0.79559
O(17)-C(4)	3.498(8)	1	1	-1	0	0	-1.07126	0.97567	0.7166
										O(13)-C(5)	3.203(8)	1	1	0	-1	0	0.00606	0.04756	0.66746
N(3)-C(15)	3.424(8)	4	1	-1	-1	1	-0.7163	0.57321	0.75135

ns是对称性算符数-(*表示倒置指标)

np是格点数

Ta、Tb和c是单位细胞转化(unit cell translation)。对称运算为：

1+X，+Y，+Z

2 1/2-X，-Y，1/2+Z

3 1/2+X，1/2-Y，-Z

4-X，1/2+Y，1/2-Z

生物学实施例：

动物：实验对成年雄性斯普拉-道来大鼠(Harlan，Indianapolis，IN，USA)进行，该成年雄性斯普拉-道来大鼠植入颈内静脉导管(JVC)，称重250-300克，分别被置于每只笼子，在恒定室温21±2℃下12小时光照：12小时黑暗循环。动物随意获得食物和水。

化合物：柠檬酸芬太尼(Hospira，Lake Forest，IL，USA)被静脉内给予。本发明的化合物被静脉内给予。

伤害性测试/热敏感性：利用甩尾分析(模型IITC 33(T)，IITC Life Science，Woodland Hills，CA，USA)分析抗伤害感受，其中光束集中于距尾巴末端约5cm的大鼠尾巴背面。光照强度经调节使得基线潜伏期为2-4秒。截止时间设定至12秒，以防止任何组织损伤。所用测试均由对各个大鼠的治疗不知情的实验人员进行。

实验范例A：本研究被设计以评价本发明的化合物对芬太尼反应增大的影响。在开始实验前，撤缩(撤退，withdrawal)时间的基线潜伏期值被设定为2-3秒之间。在第一次芬太尼(25μg/kg，IV)给药前15分钟，动物通过预植入的颈内静脉导管(JVC)接受本发明的治疗化合物或载体。在第一芬太尼给予后，甩尾潜伏期值在60、120和180分钟时被记录下来。第二次芬太尼给药在第一次芬太尼给药后210分钟通过JVC途径给予。在第二次芬太尼给药后，甩尾潜伏期在30、60、90、120和150分钟时被记录下来。

实验范例B：本研究被设计以评价本发明的化合物对芬太尼反应增大的影响，其模拟了临床环境。在开始实验前，撤缩时间的基线潜伏期被设定为2-3秒之间。在第一次芬太尼(25μg/kg，IV)给药前15分钟，动物通过预植入的颈内静脉导管(JVC)接受本发明的治疗化合物或载体。在第一次芬太尼给药后在75、135、195分钟，多剂量的芬太尼(10μg/kg，IV)分别被给予两组。最后一次芬太尼(25μg/kg，IV)给药在第一次芬太尼(25μg/kg，IV)给药后刚好240min后给予。在第一次芬太尼给药后，甩尾潜伏期在30、60、90、120、150、180、210和240min时被记录下来。

数据分析：用GraphPad Prism软件进行数据分析，其中在载体和治疗组之间从热刺激撤缩的潜伏期进行比较。将数据以可能最大效果的百分数(%MPE=[(注射后TFL-基线TFL)/(12-基线TFL)×100)作图和分析。基线潜伏期(基线：在给予药物或载体前的撤缩潜伏期)撤缩大于6秒的动物被排除于本研究外。利用双向方差分析(ANOVA)和用于多重比较的Benferroni校正来确定不同的时间点的统计学显著性(p<0.05)。

化合物活性分析：两种不同的方法用于评估本发明化合物的活性，和生成SAR值。

1.反应面积分析：分析是基于得到表示在讨论中的时间段的最大可能反应的%的值。例如，5%MPE时间点的最大可能值=5×100=500。对于时间点T30、T60、T90、T120和T150具有最大可能效果(%MPE)分值100、75、50、25和10的大鼠，总分值或SUM=260。该值为(260/500)×100=最大值的52%=%MAX。计算小组中各单独对象的该值。计算小组的平均和标准误差，并且利用单向方差分析(ANOVA)和用于多重比较的Benferroni校正来确定统计学显著性。

2.评价半最大反应时间(time to half maximal response)的回归分析：为产生半最大反应时间，将数据转化为自基线变化%，将时间点转化为log10值。对小组中每个对象进行回归分析，产生半最大反应时间。通过运行单向方差分析(ANOVA)和利用ANOVA的误差平均平方项以及用于平均值之间多重比较的Bonferroni校正来确定小组平均值之间的差异。

实验实施例1：

通过本发明的化合物抑制过氧亚硝酸根氧化

鲁米诺样化合物“L-012”是由ROS和/或RNS如过氧亚硝酸根的存在激活的化学发光探针。在本分析中，L-012通过添加3-吗啉基-斯德酮亚胺(“SIN-1”)——已知的过氧亚硝酸根生成剂—被氧化。发射的荧光与SIN-1浓度直接成比例。然后对本发明的化合物评估其通过阻止过氧亚硝酸根引起的荧光增加而清除过氧亚硝酸根的能力。计算产生50%荧光信号抑制的化合物浓度(IC₅₀值)，这是通过在多种浓度测试本发明的化合物和对三板IC₅₀取平均进行的。

L-012分析方案

将下列溶液添加至白色聚苯乙烯，非无菌96孔板(Costar#3912)：196μL 50μM L-012；2μL测试化合物；和2μL 500mM SIN-1。对于每个所分析的96孔板制备50μM L-012的PBS pH 7.4新制原液。将该板在FlexStation3(分子装置)中采用发光模式于37℃下读取30min，每30秒进行测量，整合时间100msec。

L-012数据收集和分析

由FlexStation3于37℃下动力学记录发光信号30分钟，每30秒进行测量，整合时间100msec。将各板A和H行的数据放弃，以排除‘边缘效应’的可能性。因此，每板的各测试化合物具有3次重复。将15分钟数据时间点作图，以确定后续浓度-反应曲线的对照值%或IC50(表2)。

表2

通过本发明的化合物体外抑制SIN-1生成的过氧亚硝酸根引起的L-012荧光

实验实施例2：抑制过氧亚硝酸根介导的细胞毒性

ATPlite是基于萤火虫荧光素酶的三磷酸腺苷监测体系。ATP监测被用作PC12细胞成活力的量度，因为其存在于所有代谢活性细胞，且其浓度在细胞经历坏死和凋亡时极快地下降。ATPlite基于ATP&D-荧光素在荧光素酶存在下发生反应的过程中发出的光的产生。发射光与ATP浓度成比例。对本发明的化合物评估其抑制SIN-1引起的细胞毒性的能力。通过在多种浓度下测试本发明的化合物和对两板的IC₅₀取平均来计算抑制浓度，IC₅₀值。

细胞制备

所有细胞工作均在细胞培养罩下、无菌环境中进行。在第1天，将大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)细胞以约2分钟用0.25%胰蛋白酶/EDTA从T75烧瓶分离。通过添加10mL F12K介质至各烧瓶和将细胞收集到无菌15mL锥形管中来收获细胞。由此，将10μL细胞置于1.5mL微量离心管中的90μL台盼蓝中。这等同于稀释因子10。通过简单涡旋混合微量离心管，并将10μL添加到血细胞计数器一侧。在倒置显微镜下以10×在血细胞计数器的4个大角象限中计数细胞，并计算4个象限的平均值。未计数蓝色细胞，因为这些细胞表示非成活细胞。利用下列等式测定1mL介质中存在的细胞数：细胞/mL=(#计数细胞/#计数方形)×10⁴×稀释因子。(例如：2.5×10⁶细胞/mL=(100细胞/4平方)×10000×10)。将收获的细胞稀释于含有高血清(10%马血清、5%胎牛血清、1%青霉素链霉素)的F12K介质中，使得1mL中有300,000个细胞。由此，将100μL细胞/介质添加至无菌、清底胶原蛋白涂覆的96孔板(30,000细胞/孔)。使细胞于37℃、5%CO₂下粘附过夜。

抑制过氧亚硝酸根介导的细胞毒性-方案

所有细胞工作均在细胞培养罩下、无菌环境中进行。在第2天，从各板去除介质，并替换为100μL含有低血清(1%马血清、1%青霉素链霉素)的F12K。为测试本发明化合物的浓度反应，制备这些化合物在PBS中从5mM降至0.02mM的系列稀释液。将各稀释液(2μL体积)一式四份添加至适当的孔。在添加2μL 50mM SIN-1前于37℃下在细胞上培育测试化合物。然后将细胞于37℃下培育过夜。

在第3天，将10.25ml ATPlite缓冲剂添加至1瓶冻干的底物溶液(ATPlite 1步发光ATP检测分析系统(Perkin Elmer，#6016731))。向各板添加100μL/孔冻干溶液，并在250rpm下于轨道板振动器上混合2min。通过FlexStation3在5min内以发光模式读取该板。

基于细胞的数据分析：

通过FlexStation3记录发光信号，并计算对照的百分数。仅含细胞的孔用于计为对照100%，仅含SIN-1的孔用于计为0%。通过减去SIN-1对照平均值和除以100%对照值将其余数据绘制为对照%(表3)。

表3.抑制SIN-1细胞毒性

实验实施例#3：

大鼠甩尾分析的芬太尼镇痛保持

进行大鼠甩尾分析以评估化合物2对芬太尼引起镇痛的效果。第一组大鼠被静脉内注射化合物，然后15分钟后被注射芬太尼(25μg/kg)。第二组大鼠仅被静脉内注射芬太尼(25μg/kg)。芬太尼给药后在60、120和180分钟，得到并记录两组的甩尾潜伏期值。在30分钟(距第一次给予芬太尼合计210分钟)的时间后，第二次芬太尼用药被给予两组，并芬太尼注射后在30、60、90、120和180分钟测量甩尾潜伏期(TFL)。得到以[(注射后TFL-基线TFL)/(12-基线TFL)×100]计算的最大可能效果百分数(%MPE)，如图1。

实验实施例#4：

哈格里夫斯热足底模型的芬太尼镇痛保持

进行测量对于高强度热光束撤爪的足底分析，所谓哈格里夫斯端点(参见Hargreaves et al.，1988，Pain 32：77-88)，以评估化合物2对芬太尼引起镇痛的效果。第一组大鼠被静脉内注射化合物2，然后15分钟后被注射芬太尼(25μg/kg)。第二组大鼠仅被静脉内注射芬太尼(25μg/kg)。在芬太尼给药后20、40，60、90和120分钟，得到并记录两组的撤爪潜伏期(PWL)值。在30分钟(距第一次给予芬太尼合计150分钟)时间后，第二次芬太尼用药(25μg/kg)被给予两组，并在芬太尼给药后20、40，60、90和120分钟得到PWL值。该数据以作图显示在图2中。

实验实施例#5：

阿片样物质剂量节省

联合阿片样物质给药方案给予化合物2，该阿片样物质给药方案被设计以刺激患者的受控镇痛，其中在负荷剂量(loading dose)后按患者需要给予小剂量镇痛剂。在本实验中，载体或化合物2在如图3所示五次每小时芬太尼用药前被给予大鼠，得到撤爪潜伏期值，并用于计算%MPE。药物治疗组中保持显著水平的镇痛，表明保持镇痛需要较低剂量。

实验实施例#6：

化合物2的作用持续时间

在大鼠中单次IV给予化合物2后，在间隔2.5小时的三次给予芬太尼(25μg/kg)的每一次后30、60、90和120分钟得到潜伏期值(图4)。

实验实施例#7：

化合物2的作用持续时间

在大鼠中单次IV给予化合物2后，在一日两次芬太尼用药(25μg/kg)的每一次后30、60、90和120分钟得到潜伏期值。在第二天，随后一日两次的芬太尼用药以与第1天相同的方式被给予，而不给予额外的化合物2(图5)。

实验实施例#8：

化合物2的作用持续时间

在大鼠中单次IV给予化合物2后，在四天中以每日给予芬太尼用药(25μg/kg)后20、40、60、90和120分钟得到潜伏期值(图6)。

实验实施例#9：

化合物2对已存在的阿片样物质抗性/痛觉增敏的效果

以两天三次芬太尼用药处理大鼠，如图7所示。在第3天，在芬太尼挑战后将载体或单次IV剂量化合物2给予大鼠，在第20、40、60、90和120分钟得到潜伏期值。该数据显示，本发明的化合物可逆转预先形成的阿片样物质抗性/痛觉增敏。

实验实施例#10：

化合物2对辣椒素引起的痛觉增敏的效果

在足底内给予辣椒素前IV给予大鼠化合物2，并测量撤缩潜伏期。该数据，在图8中作图显示，表明本发明的化合物可防止通过激活表达TRPV1受体/通道的主要传入感觉神经元而形成的痛觉增敏疼痛状态的发展。

实验实施例#11：

化合物2对切口痛觉增敏的效果

在手术切割结束后IV给予载体、参考化合物(吲哚美辛)或化合物2，并在24小时后(0时间点)以及其后30和60分钟测量潜伏期值。随后以相同的方式在48小时和72小时进行潜伏期测定(图9)。

实验实施例#12：

化合物2对已形成的切口痛觉增敏的效果

在手术切割结束后24小时给予载体、参考化合物(吲哚美辛(indomethacin))或化合物2；24和48小时后(0时间点)以及其后30和60分钟测量潜伏期值(图10)。该数据证明，本发明的化合物可再次逆转由于手术后疼痛造成的痛觉增敏。

实验实施例#13：

化合物2抑制SIN-1造成的痛觉增敏

在第一次给予SIN-1(1mg/kg)前15分钟IV给予载体或化合物2。在2小时后第一次测量潜伏期(测试1)。在测试1后30分钟再次给予SIN-1(1mg/kg)，并在2小时后再次测量潜伏期(测试2)。在测试2后30分钟再次给予SIN-1(1mg/kg)，并在2小时后再次测量潜伏期(测试3)。结果显示在图11中，证明本发明的化合物可阻止SIN-1造成的痛觉增敏产生。

实验实施例#14：

化合物2对阿片样物质引起的毒性的效果

在本研究中，评价了先占性给予的单剂量化合物2对芬太尼引起的毒性(死亡)和镇痛的效果。阴性对照为载体(0.5%甲基纤维素，在磷酸盐缓冲液中)。采用给药时250-300g的雄性斯普拉-道来大鼠(Harlan，Ill)。

利用指向左后爪足底表面的辐射热源(Ugo Basile，意大利)评估对于热刺激的撤爪潜伏期(哈格里夫斯测试；Hargeaves et al.,1988,Pain 32:77-88)。设定40秒的截止潜伏期以避免组织损伤。基线潜伏期取在药物给予前，并给予化合物2(25mg/kg，静脉内)或载体。15分钟后，给予第一次芬太尼用药(25μg/kg，静脉内)，随后在芬太尼后15和45分钟评估行为。以60分钟为间隔给予五次另外的芬太尼用药，并且在每次用药后15和45分钟进行行为评估。

利用双向方差分析(Graphpad Prism，NC)确定未转换数据的统计学显著性。进一步通过随后的Bonferronni post-hoc测试分析显著的主要影响。显著性水平被设定为p<0.05。数据显示为平均±S.E.M.(星号表示相对于载体处理对照的显著性)。根据下列等式计算存活率百分数；

%存活率=[(初始n-终止n)/(初始n)]×100

表3概括了体内药理学数据。表4概括了图17所示的撤爪潜伏期数据。表5概括了图16所示的存活率(%)。

表3.

表4.撤爪潜伏期。

表5.存活率(％)。

	载体	化合物
			0h	100	100
1h	100	100
			2h	100	100
3h	50	83.33
			4h	33.3	83.33
5h	33.3	83.33
			6h	16.66	83.33

随着实验时间进程，动物由于与重复给予高剂量芬太尼有关的呼吸抑制或其他急性毒性而死亡。化合物2减少死亡程度，从而观察到存活率%显著增加(图16)：“化合物2”组中1/6动物死亡，载体治疗组中5/6动物死亡(其余动物垂死)。这表明化合物2减少阿片样物质引起的毒性并提高安全性。

对于镇痛测量，动物作为基线，并在芬太尼(25μg/kg，静脉内)前15min以单剂量给予化合物2(25mg/kg，静脉内)。另外的芬太尼剂量以60min为间隔被给予，并且在每次芬太尼给药后15和45分钟评估行为(图17)。

在载体治疗的动物中，芬太尼在每次用药后15分钟产生强烈镇痛，但撤爪潜伏期在用药后45分钟回到接近基线水平。撤爪潜伏期在第4次、第5次、第6次给予芬太尼后45分钟跌至基线水平以下，与阿片样物质引起的痛觉增敏一致。

化合物2在给予芬太尼后45分钟产生统计学上显著的镇痛效力保持。撤爪潜伏期在第4次、第5次、第6次给予芬太尼后45分钟没有跌至基线水平以下。这表明，用化合物2进行预处理防止阿片样物质引起的痛觉增敏产生(图16)。

先占性给予的化合物2显著减少芬太尼导致的死亡。此外，化合物2(25mg/kg，静脉内)保持芬太尼的镇痛效力，并防止阿片样物质引起的痛觉增敏出现。该数据表明，化合物2减少阿片样物质的毒性，保持阿片样物质镇痛效力，和防止阿片样物质引起的痛觉增敏。在临床环境中，化合物2可提高阿片样物质的安全性，同时增强镇痛。

实验实施例#15：

化合物2对足底内弗氏完全佐剂引起的热痛觉增敏、触觉异常性疼痛和浮肿 的效果

在炎性疼痛的大鼠弗氏完全佐剂(FCA)模型中评价化合物2。炎性疼痛的大鼠弗氏完全佐剂(FCA)足底内模型产生类似于在患者中观察到的行为，并已被广泛用于评估新型药理学治疗(Lam et al.,2008,J Ethnopharmacol.120:44-50)。

阳性对照为塞来昔布(celecoxib)(TRC，Montreal)，阴性对照为载体(0.5%甲基纤维素，在磷酸盐缓冲盐水中)。采用给药时250-300g的雄性斯普拉-道来大鼠(Harlan，Il)。哈格里夫斯设备得自Ugo Basile，意大利。弗氏完全佐剂得自Sigma，St.Louis，电子触觉测量仪（electronic von frey）得自Stoelting，Ill。

对于本分析，利用指向左后爪足底表面的辐射热源(Ugo Basile，意大利)评估对于热刺激的撤爪潜伏期(哈格里夫斯测试；Hargreaves et al.,1988,Pain 32:77-88)。设定截止潜伏期为40秒以防止组织损伤。利用电子触觉测量仪设备评估对于非伤害性触觉刺激的撤爪阈值，该电子触觉测量仪设备向后爪足底表面给予递增的机械力。通过置换水和假设组织密度等于水来测量爪体积。在FCA注射前取基线潜伏期、阈值和体积，并在24-72小时后进行重新评估。在FCA前(先占性)一刻或在FCA后24-72小时(治疗性)给予化合物2或载体(25mg/kg，静脉内；或3-100mg/kg，口服)。在先占性给予化合物2时，在用药后24-72小时评估行为或爪体积。在治疗性给予化合物2时，在用药后30-180min评估行为或爪体积。塞来昔布(30mg/kg口服)充当阳性对照。

足底内注射在2.5-4%异氟醚/O₂麻醉下进行—通过鼻锥体递送。在引起麻醉后，以无菌方式准备注射位置，并注射100μL 50%的FCA悬浮液。注射后，将动物称重，并使其恢复，然后将其送回其饲养笼。

利用双向方差分析(Graphpad Prism，NC)测定未转换数据的统计学显著性。进一步通过随后的Bonferronni post-hoc测试分析显著的主要影响。显著性水平被设定为p<0.05。数据显示为平均±S.E.M.(星号表示相比载体处理对照的显著性)。

后爪中足底内注入100μL FCA导致热痛觉增敏、触觉异常性疼痛(通过电子触觉测量仪评估)与浮肿产生，其通过对于伤害性热刺激的潜伏期减少、对于非伤害性触觉刺激的阈值降低和爪体积增加指示(图18-20)。先占性给予的化合物2(25mg/kg，静脉内)防止热痛觉增敏(图18A)和触觉异常性疼痛(图18B)的产生。相比载体治疗对照，在FCA后72小时达到热痛觉增敏的统计学显著性(图18A)，在FCA后24、48和72小时达到触觉异常性疼痛的统计学显著性(图18B)。

表6概括了体内药理学数据。表7概括了图18A所示的撤爪潜伏期。表8概括了图18B所示的撤爪潜伏期。表9概括了图19A所示的撤爪阈值。表10概括了图20A所示的爪体积(mL)。表11概括了图20B所示的爪体积(mL)。

表6.体内药理学数据

表7.图18A所示的撤爪潜伏期(s)

	基线	第1天	第3天	第4天
					载体	18.72	16	12.7	10.66
载体	22.5	12.65	9.76	9.28
					载体	21.2	12.2	9.16	9.85
载体	21.55	8.72	8.84	9.5
					载体	19.45	26.63	11.3	7.73
载体	20.52	23.6	16.5	13.85
					化合物2	16.6	14.4	12.5	14
化合物2	17.55	156.3	19.12	16.25

化合物2	20.74	15.1	19.5	16.51
					化合物2	20.9	15.1	19.5	16.51
化合物2	20.6	15.7	15.7	16.6
					化合物2	19.33	22.7	17.7	18.2

表8.图18B所示的撤爪潜伏期(s)

	基线	第1天	第3天	第4天
					载体	33.2	15.5	13.8	13.65
载体	32.8	14	17.5	9.8
					载体	29.6	17.6	15.9	18.2
载体	31.3	15.1	20.2	12.8
					载体	32.2	29.4	28.5	24.7
载体	28.1	12.4	15.4	15.65
					化合物2	29.6	36.7	29.8	25
化合物2	32.5	26.7	28	27.23
					化合物2	29.8	38.9	30	36.5
化合物2	27.5	25	27.7	31.3
					化合物2	31.4	27	23.5	31.9
化合物2	29.6	29	33.8	24.3

表9.图19所示的撤爪阈值(g)

表10.图20A所示的爪体积(mL)

化合物2(10mg/kg)

1.7	1.6	1.8	1.9	1.8	1.7
						2.7	2.6	3.1	3.1	3.1	2.7
2.6	2.5	2.9	2.9	3.2	2.6

化合物2(30mg/kg)

1.6	1.7	1.9	1.8	1.7	1.8
						2.1	2.9	3	3	2.9	2.9
2.5	2.8	3.1	2.8	2.7	2.9

塞来昔布	塞来昔布	塞来昔布	塞来昔布	塞来昔布	塞来昔布
						1.8	1.9	1.9	1.7	1.5	1.7
2.8	3.1	2.7	3	2.2	2.7
						2.7	2.7	2.8	2.8	2.2	2.8

表11.图20B所示的爪体积(mL)

FCA/载体

	FCA前
给药前
	1小时
3小时
	给药前(D2)
1小时(D2)
	3小时(D2)

FCA/化合物2，10mg/kg

FCA/GAL-	FCA/GAL-	FCA/GAL-	FCA/GAL-	FCA/GAL-	FCA/GAL-	FCA/GAL-	FCA/GAL-
								1.7	1.6	1.8	1.6	1.8	1.8	1.5	1.7
3.1	2.8	3.1	2.8	2.9	3	2.7	3.4
								2.9	2.9	3.1	2.7	2.8	3	2.7	3.1

2.9	2.9	3.1	2.7	2.9	2.9	2.4	3.2
								2.7	2.7	3	2.6	2.6	2.8	2.4	3.2
2.7	2.7	2.9	2.7	2.5	2.8	2.3	3.2
								2.7	2.7	3	2.6	2.5	2.8	2.4	3.2

	FCA前
给药前
	1小时
3小时
	给药前(D2)
1小时(D2)
	3小时(D2)

FCA/化合物2，30mg/kg

FCA/GAL-	FCA/GAL-	FCA/GAL-	FCA/GAL-	FCA/GAL-	FCA/GAL-	FCA/GAL-	FCA/GAL-
								1.7	1.8	1.5	1.8	1.7	1.7	1.9	1.7
2.8	3	2.9	3.2	3	2.6	3.4	2.8
								2.6	3	2.8	2.8	2.9	2.5	3.1	2.7
2.8	2.9	2.7	3	2.8	2.6	3.2	2.7
								2.4	2.7	2.6	2.8	2.9	2.4	3.1	2.7
2.5	2.7	2.6	2.9	2.7	2.4	3.2	2.7
								2.5	2.7	2.6	2.8	2.9	2.4	3	2.7

	FCA前
给药前
	1小时
3小时
	给药前(D2)
1小时(D2)
	3小时(D2)

FCA/塞来昔布，30mg/kg

在FCA后24小时给予化合物2(3-100mg/kg，口服)时，在给予10、30和100mg/kg后30和60分钟注意到FCA引起的触觉异常性疼痛被明显逆转(图19)。阳性对照，塞来昔布(30mg/kg，口服)，给药后60分钟也产生统计学上显著的逆转(图19)。

化合物2(10或30mg/kg，口服)对FCA引起的浮肿不具有统计学上显著的效果，如爪体积增加所测，而与先占性给予(图20A)还是FCA后24小时给予无关(图20B)。相反，阳性对照，塞来昔布(30mg/kg，口服)，在给药后24和48小时产生统计学上显著的浮肿抑制(图20A和图20B)。

这些结果表明，通过静脉内或口服给予途径的化合物2可完全或部分防止FCA引起的触觉异常性疼痛和热痛觉增敏产生。重要地，在触觉异常性疼痛的情况下，这种效果保持至少3天。对于相同口服给药的塞来昔布没有观察到这种效果。此外，化合物2在口服给予时还能逆转已形成的炎性触觉异常性疼痛，在这种情况下产生相当于塞来昔布的效果。最后，化合物2对该模型的浮肿不产生影响，表明对疼痛行为的效果不次于抗炎性效果。塞来昔布对照的作用与浮肿减少有关。综上所述，这些数据表明在GAL-044与塞来昔布之间关于作用机制和治疗应用性方面存在明显区别。

实验实施例#16：

化合物2对足底内角叉菜聚糖引起的热痛觉增敏和浮肿的效果

评价化合物2在急性炎性疼痛的大鼠角叉菜聚糖模型中的效果。大鼠急性炎性疼痛的足底内角叉菜聚糖模型产生类似与在患者中观察到的行为，并已被广泛用于评估新型药理学治疗(Whiteside et al.,2005,J.Pharmacol.Exp.Ther.314:1234-1240)。本研究的目的是在大鼠急性炎性疼痛的角叉菜聚糖模型中评价化合物2逆转或防止热痛觉增敏和浮肿产生的能力。

阳性对照为吲哚美辛(Sigma，St.Louis)，阴性对照为载体(0.5%甲基纤维素)。雄性斯普拉-道来大鼠(Harlan，Il)在给药时为250-300g。哈格里夫斯设备得自UgoBasile，意大利，λ-角叉菜聚糖得自Sigma，St.Louis。

关于本分析，利用指向左后爪足底表面的辐射热源(Ugo Basile，意大利)评估对于热刺激的撤爪潜伏期(哈格里夫斯测试)。设定截止潜伏期为40秒以防止组织损伤。通过置换水和假设组织密度等于水来测量爪体积。在角叉菜聚糖给予前取基线潜伏期，并在4h后进行重新评估。在角叉菜聚糖后3小时(治疗性)给予化合物2或载体(10和30mg/kg，口服)，并在1小时后评估行为。此外，在角叉菜聚糖前15分钟(先占性)给予化合物2，并在角叉菜聚糖后4小时评估行为。在角叉菜聚糖前给予吲哚美辛(阳性对照，30mg/kg口服)，并在角叉菜聚糖后4小时评估行为。

足底内注射在2.5-4%异氟醚/O₂麻醉下进行——通过鼻锥体递送。在引起麻醉后，以无菌方式准备注射位置，并注射50μl 2%λ-角叉菜聚糖。注射后，将动物称重，并使其恢复，然后送回其饲养笼。

利用双向方差分析(Graphpad Prism，NC)确定未转换的数据的统计学显著性。进一步通过随后的Bonferronni post-hoc测试分析显著的主要影响。显著性水平被设定为p<0.05。数据显示为平均±S.E.M.(星号表示相比载体治疗对照的显著性)。

表12概括了体内药理学数据。表13概括了图21A的撤爪潜伏期。表14概括了图21B的爪体积(mL)。表15概括了图22A的撤爪潜伏期。表16概括了图22B的爪体积(mL)。

表12.体内药理学。

表13.图21A所示的撤爪潜伏期(s)。

化合物2(10mg/kg)

19.8	15.34	22.07	17.39	31.03	14.07
						11.14	3.17	5.54	5.86	8.02	5.73

化合物2(30mg/kg)

23.87	12.41	16.08	28.86	18.1	22.77	17.58
							7.9	5.16	6.78	10.22	16.05	7.56	7.34

表14.图21B所示的爪体积(mL)

化合物2(10mg/kg)

1.7	1.8	1.8	1.7	1.6	1.8
						2.6	2.6	2.9	2.5	2.7	2.7

化合物2(30mg/kg)

1.6	1.7	1.6	1.7	1.8	1.5	1.6
							2.4	2.6	2.6	2.6	2.5	2.9	2.3

表15.图22A所示的撤爪潜伏期

化合物2(10mg/kg)

20.94	40	25.09	26.96	13.66	23.25
						8.1	5.07	20.71	12.18	11.94	9.38

化合物2(30mg/kg)

27.75	15.78	35.57	23.26	18.37	25.78
						11.57	16.63	6.81	11	32.38	11.6

表16.图22B所示的爪体积(mL)

化合物2(10mg/kg)

1.7	1.6	1.5	1.6	1.7	1.6
						3.3	2.8	2.8	3.2	3.1	2.9

化合物2(30mg/kg)

1.7	1.7	1.6	1.8	1.6	1.7
						2.9	2.7	2.7	2.7	2.8	2.7

Indo	Indo	Indo	Indo	Indo	Indo
						1.7	1.5	1.7	1.8	1.5	1.4
2.5	2.4	2.3	2.2	2.3	1.8

后爪中足底内注入50μL角叉菜聚糖导致热痛觉增敏和浮肿产生，其由对伤害性热刺激的潜伏期减少和爪体积增加所指示。化合物2(30mg/kg，口服)在角叉菜聚糖后3小时在以单一给药被给予时显著逆转浮肿，而不显著逆转热痛觉增敏(图21)。在先占性给予时，化合物2(10和30mg/kg，口服)不显著防止角叉菜聚糖引起的浮肿或热痛觉增敏(图22)。在先占性给予时，吲哚美辛(30mg/kg口服)——阳性对照——产生统计学上显著的热痛觉增敏和浮肿抑制(图22)。

化合物2(30mg/kg，口服)在角叉菜聚糖后3小时以单一给药被给予时显著逆转浮肿，但不显著逆转热痛觉增敏。在先占性给予时，单剂量化合物2(10和30mg/kg，口服)不显著防止角叉菜聚糖引起的浮肿或热痛觉增敏生成。这些数据表明，先占性化合物2不防止急性炎症引起的热痛觉增敏或浮肿。但是，在治疗性给予时减少浮肿，而不显著减少热痛觉增敏。

实验实施例#17：

化合物2对脊神经结扎引起的触觉异常性疼痛的效果

在神经性疼痛的大鼠脊神经结扎(SNL)模型(Chung模型)中评价化合物2。大鼠神经性疼痛的脊神经结扎(SNL)模型产生类似于在患者中观察到的行为(Kim andChung,1992,Pain 50(3):355-63)，并已被广泛用于评估新型药理学治疗(Sindrup andJensen,1999,Pain 83(3):389-400)。在神经性疼痛大鼠模型中对化合物2评价其逆转或防止触觉异常性疼痛产生的能力。

阳性对照为加巴喷丁(gabapentin)(Toronto Research Chemicals，加拿大)。阴性对照为载体(0.5%甲基纤维素；2-羟基-丙基-β-环糊精)。雄性斯普拉-道来大鼠(Harlan，Il)在给药时为250-300g。触觉测试丝得自Stoelting，Ill，7-0丝、4-0薇乔缝线得自Ethicon，NJ。

外科手术在2.5-4%异氟醚/O₂麻醉下进行—通过鼻锥体递送，在手术过程中保持麻醉。在引起麻醉后，切口位置以无菌方式被剃毛和制备。进行中线切割，去除L5横突(transverse process)，用7-0丝缝合材料紧紧结扎L5脊神经。层中的伤口用4-0薇乔缝线封闭。假手术对照大鼠进行相同程序，但脊神经未被操作或结扎。手术后，将动物称重，并使其恢复，然后送回其饲养笼。

在紧紧结扎L5脊神经后1-3周利用触觉测试丝研究化合物2对神经创伤引起的触觉异常性疼痛的效果。利用一系列经过校准的触觉测试单丝(Stoelting，WoodDale，IL)评估触觉阈值。触觉异常性疼痛的评估被测量为后爪撤缩阈值，其利用上-下法产生50%的撤缩可能性。阈值在手术前评价，并且在SNL手术后1-3周进行重新评估。对大鼠在手术当天给予单次急性化合物2用药(30mg/kg)，在手术后1-5天给予QD(10和50mg/kg)或在手术后1-5天给予QD(30mg/kg)。在给予后1和3小时、3和5小时或一周一次再次评估触觉阈值。载体治疗的动物被包括在内，并且加巴喷丁(100mg/kg，腹膜内)被用作阳性对照。每组动物数为8。

利用双向方差分析(Graphpad Prism，NC)确定未转换数据的统计学显著性。进一步通过随后的Bonferronnipost-hoc测试分析显著的主要影响。显著性水平被设定为p<0.05。数据显示为平均±S.E.M。

表17概括了体内药理学数据。表18概括了图23所示的撤爪阈值(g)。表19概括了图24所示的撤爪阈值(g)。表20概括了图25所示的爪阈值(g)。表21概括了图26所示的爪阈值(g)。

表17.体内药理学数据

表18.图23所示的撤爪阈值(g)

	载体	载体	载体	载体	载体	载体	载体	载体
									Sx前	15	15	15	15	15	15	15	15
给药前	3.13	2.81	3.13	1.56	4.25	3.73	5.04	3.67
									1小时(D1)	2	5.04	10.04	2.38	7.94	4.25	4.25	2.81
3小时(D1)	1.56	3.67	10.04	2	3.58	3.73	2.81	2.81
									1小时(D2)	1.4	1.12	5.04	3.55	2.37	2.2	2.81	1.56
3小时(D2)	1.85	5.54	3.13	2.81	3.33	3.13	4.25	1.65
									1小时(D3)	1.4	2.64	4.25	1.19	4.25	1.58	3.58	1.85
3小时(D3)	1.85	6.66	3.58	2.2	2.37	2.2	2.37	2

化合物2(10mg/kg)

11.69	15	15	15	15	15	15	15
								2.2	3.13	4.25	3.58	3.73	4.4	2.64	3.13
1.56	4.98	4.25	15	4.25	3.13	2.81	4.4
								2	7.94	1.4	15	2.81	2.64	1.85	3.57
1.31	1.85	1.85	2.38	1.85	2.64	1.65	1.4
								0.4	1.56	1.56	11.69	2.81	2.37	2	3.71
0.44	3.67	1.85	7.94	3.33	2	2.81	4.4
								0.99	2.37	1.56	2.38	2.81	0.65	3.33	2.81

化合物2(50mg/kg)

15	15	15	15	15	15	15	15
								2.81	3.33	3.73	2.81	2.2	5.04	4.25	3.58
2.81	6.64	2.81	5.56	3.67	5.56	4.23	4.98
								1.18	3.13	3.33	6.66	6.64	6.66	3.13	4.7
1.19	2.81	3.12	7.94	2.81	6.66	1.18	2.37
								1.65	4.47	2.81	3.58	2.65	6.58	2.81	3.33
0.78	6.58	3.67	4.72	2.81	5.57	1.85	1.19
								1.18	1.85	5.57	2.81	1.85	4.72	3.13	3.13

表19.图24所示的撤爪阈值(g)

化合物2

15	15	15	15	15	15	15	15
								6.58	4.4	2.75	1.4	2.81	5.04	1.18	2.81
4.23	10.04	6.64	3.13	6.64	5.04	1.56	5.04
								5.04	7.31	3.55	1.85	3.72	5.04	3.67	3.13
4.25	8.44	2.81	1.4	4.98	6.4	2	3.33
								6.58	6.58	4.47	3.13	6.58	4.25	3.67	4.4
2.81	4.25	6.66	1.85	6.64	4.25	2.81	6.64

加巴喷丁	加巴喷丁	加巴喷丁	加巴喷丁	加巴喷丁	加巴喷丁	加巴喷丁	加巴喷丁
								15	15	15	15	15	15	15	15
6.64	1.65	1.33	1.56	2.81	4.23	5.04	2.81
								15	5.18	15	3.67	15	15	6.58	5.56
10.31	5.56	6.58	1.99	6.66	7.94	6.4	6.58
								6.64	1.56	1.4	1.65	5.57	3.55	3.58	2.81
15	15	15	3.33	11.69	8.61	6.58	9.86
								15	4.4	4.72	2.37	6.58	15	7.31	6.66

表20.图25所示的爪阈值(g)

	载体	载体	载体	载体	载体	载体	载体	载体
									Sx前	15	15	15	15	15	15	15	15
1wk	6.42	4.25	3.33	4.25	5.57	5.37	9.86	13.96
									2wks	6.66	4.25	0.4	1.85	2.81	2.2	2.81	6.42

化合物2

15	15	15	15	15	15	15	15
								1.85	1.18	2.81	4.47	6.4	2.2	15	4.25
1.65	2.81	2	2	3.73	0.99	5.56	5.04

加巴喷丁	加巴喷丁	加巴喷丁	加巴喷丁	加巴喷丁	加巴喷丁	加巴喷丁	加巴喷丁
								15	15	15	15	15	15	15	15
1.56	1.56	6.58	3.73	2.2	6.58	4.25	1.4
								0.99	1.31	3.13	1.4	2.81	2.81	1.4	2.81

表21.图26所示的爪阈值(g)

	载体	载体	载体	载体	载体	载体	载体	载体
									Sx前	15	15	11.69	15	15	15	15	15
1周	15	1.85	3.33	5.56	15	15	6.66	4.25
									2周	7.94	3.33	6.64	6.66	6.42	15	3.67	2.81
3周	15	4.25	2.2	2.2	2.64	6.66	2.81	3.13

化合物2

15	15	15	15	15	11.69	15	15
								15	11.41	15	3.13	1.18	15	6.66	15
13.96	4.25	5.37	11.69	2.8	8.44	7.94	13.96
								7.53	6.64	4.98	2.2	4.4	2.38	10.31	15

脊神经结扎导致触觉异常性疼痛产生，如在手术后3至4周对于非伤害性触觉机械刺激的撤爪阈值减少(图23-26)指示。采用非禁食动物，在三次给予任一次后任何时间点上，化合物2(10和50mg/kg，口服)不产生统计学上与载体治疗的动物显著的区别(图23)。在单独实验中，加巴喷丁(100mg/kg腹膜内)，阳性对照，对异常性疼痛始终产生统计学上显著的逆转(例如图24)。

在后续研究中，采用在化合物给予前禁食过夜的动物，化合物2(50mg/kg，口服)在第一次给予的施药后3小时对异常性疼痛产生统计学上显著的剂量和时间依赖性逆转。但是效果量级小(图24)，并在随后给予(48小时后)时，化合物2不产生统计学上显著的效果。相反，加巴喷丁(100mg/kg，腹膜内)，阳性对照，在每次给予后3和5小时对痛觉增敏产生统计学上显著的逆转。

在手术后立即以单一给药给予化合物2(30mg/kg，口服)并在1和2周后进行行为评估时，在治疗动物和载体对照之间没有观察到明显的区别。加巴喷丁在仅在手术当天施药时，也不改变异常性疼痛的产生进程(图25)。相反，在从手术当天开始一日一次重复给予化合物2(30mg/kg，口服)5天时，在手术后1、2和3周观察到触觉异常性疼痛显著减轻(图26)。

总之，化合物2(50mg/kg，口服)在手术后3周以单一给药被给予时对触觉异常性疼痛不产生强烈和显著的逆转。相反，在异常性疼痛产生期间重复给予时(QD，在手术后1-5天，30mg/kg，口服)，化合物2导致相比起载体治疗对照触觉异常性疼痛显著减轻。这些数据表明，化合物2在治疗已形成的神经性疼痛中不具有急性效力。但是，其可在产生阶段影响异常性疼痛的时间进程和/或量级，即，化合物2可延迟神经性疼痛的发作或减少神经性疼痛的发生或严重程度。

实验实施例#18：

共济失调加速旋转分析中化合物2对跌倒潜伏期的影响

在共济失调大鼠加速旋转模型中评价化合物2。共济失调是CNS-活性化合物常见的临床问题，并可通常干扰在临床前疼痛模型中的效力解释。共济失调旋转分析已被广泛用于评估新型药理学治疗的副作用责任(Jones&Roberts,1968,J.Pharm.Pharmacol.20:302-04)。在大鼠共济失调加速旋转分析中评价了化合物2对跌倒潜伏期的影响。一方面，数据可用于建立化合物2对于共济失调/镇静的治疗性指标。

阳性对照为氟哌啶醇(haloperidol)(Sigma，St.Louis)，阴性对照为载体(对于化合物2为HP甲基纤维素；对于氟哌啶醇为15%DMA、65%PEG300和20%D5W)。雄性斯普拉-道来大鼠(Harlan，Ill)在给药时为250-300g。旋转(Rotarod)得自IITC，CA。

为考察化合物2对运动性能的潜在影响，对大鼠进行加速旋转(IITC，Ca)测试。在本分析中，大鼠被置于旋转中，其速度设定为经300秒从4至40rpm加速。最大旋转时间设定为300秒。大鼠在第一天接受两个计时训练试验(取平均，以得到报告基线)，然后24小时后大鼠被给予化合物2(30、100和300mg/kg，口服)、氟哌啶醇(3mg/kg，口服)、阳性对照或载体。在药物给予后1小时——相应于大鼠口服给予时化合物2的T_max——评估跌倒潜伏期。

利用双向方差分析(Graphpad Prism，NC)确定未转换数据的统计学显著性。进一步通过随后的Bonferronnipost-hoc测试分析显著的主要影响。显著性水平被设定为p<0.05。数据显示为平均±S.E.M.(星号表示相比起载体治疗对照的显著性)。

表22概括了体内药理学数据。表23概括了图27所示的跌倒潜伏期数据。

表22体内药理学数据

表23.图27所示的跌倒潜伏期(秒)

基线

用药后

基线

用药后

所有小组中基线与用药后效果之间的跌倒潜伏期均得到增加；在旋转中反复跑动的性能提高。旋转分析中化合物2(30、100和300mg/kg，口服)在用药后1小时相比起载体治疗的动物不显著减少跌倒潜伏期。相反，氟哌啶醇(3mg/kg，口服)，阳性对照，在给药后1h产生显著的运动丧失(图27)。

本研究在大鼠加速旋转分析、共济失调和镇静模型中评价了化合物2。化合物2(30-300mg/kg，口服)在用药后1小时不显著减少跌倒潜伏期。相反，氟哌啶醇(3mg/kg，口服)导致潜伏期显著减少。这些数据表明，高剂量的化合物2不导致大鼠共济失调。这进而表明，在多种疼痛模型观察到的效力信号不是由于干扰共济失调和镇静产生的。该数据还表明，化合物2不导致共济失调和临床镇静。这与化合物2具有有限的CNS渗透一致，而且表明GAL-044的镇痛效果的主要作用位置可在外周。

在此将本文引用的各和每一专利、专利申请和出版物的公开内容以其整体引入作为参考。

虽然已参考具体实施方式公开了本发明，但显然本领域技术人员可设计其他实施方式和对本发明的变化，而没有脱离本发明的本质精神和范围。所附权利要求意图被解释为包括所有这种实施方式及等同变化。

Claims (20)

1.根据式I所示的化合物或其盐：

式I

其中：

R¹和R²独立地是氢或烷基，或R¹和R²一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；和

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基。

2.权利要求1所述的化合物，其中R¹和R²是CH₃。

3.权利要求1所述的化合物，其中所述根据式I所示的化合物选自(S)-2-(2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(R)-2-(2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(R)-2-(2-羟基-4-甲氧基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(4-氟-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(3,5-二氯-2-羟基-4-甲基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(5-叔丁基-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(2-羟基-4-甲氧基羰基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(5-乙磺酰基-2-羟基-苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(4-氯-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(R)-2-(2-羟基-5-甲氧基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸、(S)-2-(2-羟基-5-氯苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(S)-2-(2-羟基-5-氯苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(S)-2-(2-羟基-5-甲基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(S)-2-(2-羟基-5-甲基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(S)-2-(2-羟基-4-甲氧基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(S)-2-(2-羟基-4-甲氧基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(S)-2-(4-氯-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(S)-2-(2-羟基-5-硝基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(S)-2-(2-羟基-5-硝基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(S)-2-(5-乙磺酰基-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(S)-2-(5-乙磺酰基-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸、(R)-2-(2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸甲酯、(S)-2-(2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(R)-2-(4-氯-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸甲酯、(S)-2-(4-氯-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、(R)-2-(4-氯-2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-4-羧酸和(R)-2-(2-羟基苯基氨基)-噻唑啉-5,5-二甲基-4-羧酸甲酯、其混合物和其盐。

4.制备根据式I所示的化合物或其盐的方法，所述方法包括：

a)使根据式A所示的化合物：

与根据式C所示的化合物：

发生反应，得到根据式D所示的化合物：

和

b)使根据式D所示的化合物去保护，得到根据式I所示的化合物或其盐；

其中

R¹和R²独立地是氢或烷基，或R¹和R²一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基；

Z是Cl、Br或I；和

P是硫羟基保护基。

5.制备根据式I所示的化合物或其盐的方法，所述方法包括：

使根据式A所示的化合物：

与根据式B所示的化合物：

发生反应，得到根据式I所示的化合物或其盐；

其中

R¹和R²独立地是氢或烷基，或R¹和R²一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基；和

Z是Cl、Br或I。

6.在需要的对象中减少实现疼痛减轻所需的麻醉性镇痛剂剂量的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的至少一种根据式I所示的化合物或其盐的步骤，

式I

其中：

R¹和R²独立地是氢或烷基，或R¹和R²一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；和

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基，由此减少实现所述对象疼痛减轻所需的所述麻醉性镇痛剂剂量。

7.权利要求6所述的方法，其中所述化合物以治疗性给药方案或预处理给药方案给予。

8.权利要求6所述的方法，其中所述对象是人。

9.在需要的对象中延长麻醉性镇痛剂的作用或镇痛效力持续时间的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的至少一种根据式I所示的化合物或其盐的步骤，

式I

其中：

R¹和R²独立地是氢或烷基，或R¹和R²一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；和

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基，由此所述麻醉性镇痛剂在所述对象内的作用或镇痛效力持续时间被延长。

10.权利要求9所述的方法，其中所述化合物以治疗性给药方案或预处理给药方案给予。

11.权利要求9所述的方法，其中所述对象是人。

12.在需要的对象中防止快速耐受性的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的至少一种根据式I所示的化合物或其盐的步骤，

式I

其中：

R¹和R²独立地是氢或烷基，或R¹和R²一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基，由此防止所述对象中的快速耐受性。

13.权利要求12所述的方法，其中所述以化合物治疗性给药方案或预处理给药方案给予。

14.权利要求12所述的方法，其中所述对象是人。

15.在需要的对象中减少活性氧物质和活性氮物质的活性水平的方法，所述方法包括给予所述对象治疗有效量的至少一种根据式I所示的化合物或其盐的步骤，

式I

其中：

R¹和R²独立地是氢或烷基，或R¹和R²一起形成根据式(CH₂)_n所示的自由基，其中2≤n≤6；

R³在每次出现时独立地是氢、烷基、取代烷基、烯基、炔基、卤素、苯基、取代苯基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羟基、烷氧基、氰基、硝基、酰基、羧基、羧基烷基或酰氨基；

R⁴是氢、烷基、取代烷基或酰基；和

W是氢、烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、羧基或羧基烷基，由此所述对象中所述活性氧物质和活性氮物质的活性水平被减少。

16.权利要求15所述的方法，其中所述活性氧物质是过氧亚硝酸根。

17.权利要求15所述的方法，其中所述对象出现选自如下的至少一种疾病的症状：中风、心肌梗塞、慢性心力衰竭、循环性休克、慢性炎性疾病、癌症、神经生成性疾病、睡眠呼吸暂停、糖尿病、麻醉性镇痛剂快速耐受性、胰腺炎疼痛、成瘾行为和高血压。

18.权利要求15所述的方法，其中所述化合物以治疗性给药方案或预处理给药方案给予。

19.权利要求15所述的方法，其中所述活性氧物质的活性水平通过减少活性氧物质产生而降低。

20.权利要求15所述的方法，其中所述对象是人。

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