CN111432919B - 用于等速电泳的系统、设备和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及用于处理、提取或纯化一种或多种分析物的流体系统和设备。这些系统和设备可用于处理样品和提取核酸，例如通过等速电泳。特别地，所述系统和相关方法可允许从样品如组织或细胞中提取核酸，包括非交联核酸。所述系统和设备也可用于多路平行样品处理。

Description

用于等速电泳的系统、设备和方法
交叉引用
本申请要求于2017年8月2日提交的名称为“Isotachophoresis forPurification of Nucleic Acids”的美国临时申请号62/540,515[代理人案卷号43647-718.101]；于2017年8月3日提交的名称为“Isotachophoresis Devices for Purificationof Nucleic Acids”的美国临时申请号62/541,086[代理人案卷号43647-719.101]；以及于2017年8月3日提交的名称为“Nucleic Acid Analysis Using Isotachophoresis andIntercalating Dye”的美国临时申请号62/541,089[代理人案卷号43647-720.101]的权益，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。
本申请涉及于2017年1月28日提交的名称为“Isotachophoresis forPurification of Nucleic Acids”的未决PCT申请号PCT/US2017/015519[代理人案卷号43647-712.601]，该申请的全部内容通过引用并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是通过国立卫生研究院授予的合同号1R43HG007620-01在美国政府的支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品已经在大型组织库中收集、制备、储存和存档超过一个世纪。截至2008年，全球生物库中储存了超过4亿个FFPE样本，并且这一数字还在增长。这些样品通常伴有临床信息如初步诊断、治疗方案和随访数据，使其成为用于治疗学开发以及基因组和转录组生物标志物发现的重要资源。
从FFPE样品中提取和纯化核酸的样品制备方法仍然是人工密集且费力的。用于FFPE提取和纯化的方法差异很大，但通常包括难以自动化且难以加速的除蜡、离心、缓冲液更换、温度控制、交联还原和酶处理的步骤。FFPE通常是指使用福尔马林使样品中的蛋白交联并将样品包埋在石蜡(蜡)中。样品的FFPE处理通常能够使样品随时间而得以保存，并且可对于长期储存尤其有用。交联蛋白可以结合样品中的DNA和RNA，从而通常使其不能用于如扩增、文库制备或测序等下游应用。
去除FFPE样品中的石蜡和蛋白质交联物可能是一个具有挑战性的过程。传统上使用高度易燃的二甲苯进行脱蜡。备选地或连续地，可以采用其他溶剂、矿物油和碱性化学和/或升高的温度对样品进行处理。脱蜡后，样品中的蛋白质可以用不同的试剂进行处理或经受可能需要额外时间和精力的条件。
在消化和变性结束时，交联核酸和非交联核酸的混合物可能仍然保留。去除非交联物质对于来自诸如扩增或测序的测定的高质量结果可能是重要的；在一些情况下，如果非交联物质的级分太低，则下游测定可能无法进行，从而不仅导致样品本身的损失，而且还导致劳动力、时间和资源的损失。
发明内容
等速电泳(ITP)是一种电泳技术，其可以使用含有具有较高有效迁移率量值的前导电解质(LE)和具有较低有效迁移率量值(例如，相对于LE)的尾随电解质(TE)的不连续缓冲液来聚焦具有比尾随电解质更大的有效迁移率量值但比前导电解质更低的有效迁移率量值的样品种类。ITP可以在少于五分钟的时间内选择性地将样品中的核酸聚焦10,000倍以上。本公开内容提供了采用ITP并使其自动化以进行样品制备(包括提取、纯化、富集和高灵敏度定量)的方法和设备，并且特别适用于从FFPE样品和其他生物样品制备和纯化核酸。
样品制备对于基因组分析是重要的，但它仍然是分析可变性的主要来源并且可能需要大量的手工劳动。本公开内容包括克服这一挑战的技术和设备，如通过使用芯片上等速电泳(ITP)来提取和纯化核酸。这些技术包括富集(浓缩)非交联核酸以实现更高产量和更高质量的核酸样品制备并从FFPE和其他保存的或新鲜样品中产生更多可用样品(例如，更少质量检查不合格)的方法。
本公开内容包括用于从样品(包括实体组织、裂解的实体组织、保存或固定的组织样品(例如，FFPE)、全血、血浆和血清、口腔拭子、干血斑和其他法医样品、新鲜或新鲜冷冻(FF)组织、活检组织、器官组织、实体器官组织、包含细胞之间连接(例如间隙连接、紧密连接、粘附连接)的样品、从血液或组织中培养或收获的细胞、粪便和体液(例如，唾液、尿液)或其任何组合)中自动化制备核酸样品的技术和设备。对于真核生物和原核生物两者或其任何组合而言，样品可包括细胞核酸和无细胞核酸。与现有方法相比，本公开内容的技术可以更快、更少手工密集，更适合于小起始量和大起始量的组织，并且可以从样品中获得更高的产量和更高质量的样品分析。
本公开内容的一方面提供了一种包含等速电泳(ITP)回路的流体设备，所述ITP回路包括：(a)第一通道，其包含间隔开的第一毛细管屏障和第二毛细管屏障；和(b)经由所述第一通道中的第一孔口与所述第一通道流体连通的第一装载储器，其中所述第一孔口定位在所述第一毛细管屏障与所述第二毛细管屏障之间，以允许经由所述第一孔口进入所述第一通道的液体沿所述第一通道在一个方向上流动并停滞在所述第一毛细管屏障处以及沿所述第一通道在另一方向上流动并停滞在所述第二毛细管屏障处。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，经由所述第一孔口进入所述第一通道的所述液体沿着路径流动到长于所述第一通道的宽度的所述第一毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，经由所述第一孔口进入所述第一通道的所述液体沿着路径流动到长于所述第一通道的宽度的所述第二毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，经由所述第一孔口进入所述第一通道的所述液体流动成使得所述第一液体的弯液面(meniscus)停滞在所述第一毛细管屏障或所述第二毛细管屏障处。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一毛细管屏障被配置和布置成在将第一破裂压力施加到所述一个或多个分支流体回路时被液体破坏，并且所述第二毛细管屏障被配置和布置成在将第二破裂压力施加到所述一个或多个分支流体回路时被所述液体破坏。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一破裂压力和所述第二破裂压力大致相等。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一破裂压力高于所述第二破裂压力。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一毛细管屏障和第二毛细管屏障中的一者或两者是悬崖毛细管屏障(cliff capillary barrier)。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述ITP回路包括与所述第一通道流体连通的第二通道，并且所述第一毛细管屏障被配置和布置成在第二液体沿所述第二通道流动时停滞第二液体的流动，使得在所述第一毛细管屏障处在所述第一液体与所述第二液体之间形成液-液界面。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一毛细管屏障和第二毛细管屏障中的一者或两者是平台毛细管屏障(plateau capillarybarrier)。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述平台毛细管屏障被配置和布置成使得在所述第一液体停滞在所述平台毛细管屏障处后并且在第二液体在另一方向上流向所述平台毛细管屏障并与所述第一液体相对地停滞在所述平台毛细管屏障处后，在所述第一液体与所述第二液体之间形成气隙。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一毛细管屏障和所述第二毛细管屏障中的一者或两者包括平台。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一毛细管屏障和所述第二毛细管屏障中的一者或两者包括没有平台的斜坡。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一毛细管屏障是悬崖毛细管屏障，并且所述第二毛细管屏障是平台毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述至少一个ITP分支还包括是平台毛细管屏障的第三毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一最小压力比所述第二最小压力高至少两倍。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备还包含具有第一面和第二面的基底，其中所述第一面包括多个包含所述第一装载储器的储器，并且所述第二面包括多个包含所述第一通道的通道，其中所述多个储器经由所述基底中的通孔与所述多个通道连通。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述ITP回路还包括第二装载储器和第二通道，其中所述第二装载储器经由第二孔口与所述第二通道流体连通，并且所述第二通道包括第三毛细管屏障，其中所述第三毛细管屏障被配置和布置成利用毛细管力在所述第三毛细管屏障处停滞液体的弯液面沿所述第二通道流动。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通道与所述第一通道内的所述第二毛细管屏障相邻，并且所述第二毛细管屏障被配置和布置成利用毛细管力在所述第二毛细管屏障处停滞所述液体的弯液面沿所述第二通道流动。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述ITP回路还包括经由第三孔口与第三通道流体连接的第三装载储器，其中所述第三通道与所述第二储器流体连接，其中所述第三通道包括定位在所述第二孔口与所述第三孔口之间的第四毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通道或第一装载储器包含样品缓冲液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通道或第二装载储器包含第一前导电解质缓冲液(leading electrolytebuffer)。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第三通道或第三装载储器包含第二前导电解质缓冲液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备还包含与所述第一通道流体连通并与所述第一毛细管屏障相邻的第四通道或储器。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第四通道或装载储器包含尾随电解质缓冲液(trailingelectrolyte buffer)。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述ITP回路包括在洗脱连接件处与第一洗脱储器连接的洗脱通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述洗脱通道、所述第一洗脱储器或两者包含第一洗脱缓冲液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一孔口、所述第二孔口、所述第三孔口、所述洗脱连接件或其组合是通孔。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述ITP回路包括第二洗脱储器，其通过所述洗脱通道与所述第一洗脱储器分离，并且其中所述洗脱通道包括第五毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第三毛细管屏障、第四毛细管屏障或第五毛细管屏障的任何组合是平台毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二洗脱储器包含离子浓度高于所述第一洗脱缓冲液的第二洗脱缓冲液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述ITP回路包括通过缓冲通道与第二前导电解质缓冲液储器连接的第一前导电解质缓冲液储器，其中所述缓冲通道包含在平台毛细血管屏障所位于的界面处相遇的第一前导电解质缓冲液和第二前导电解质缓冲液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一毛细管屏障、所述第二毛细管屏障、所述第三毛细管屏障、所述第四毛细管屏障或所述第五毛细管屏障的任何组合与包含收窄件的空气通道相邻。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备还包含至少两个额外的ITP回路，每个ITP回路包括第一装载储器和第一通道，其中所述第一装载储器经由第一孔口与所述第一通道流体连通，并且所述第一通道包括间隔开且定位在所述第一孔口的任一侧的第一毛细管屏障和第二毛细管屏障，以允许液体经由所述第一孔口进入所述第一通道，以沿所述第一通道在一个方向上流动并停滞在所述第一毛细管屏障处以及沿所述第一通道在另一方向上流动并停滞在所述第二毛细管屏障处。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备还包含至少五个额外的ITP回路，每个ITP回路包括第一装载储器和第一通道，其中所述第一装载储器经由第一孔口与所述第一通道流体连通，并且所述第一通道包括间隔开且定位在所述第一孔口的任一侧的第一毛细管屏障和第二毛细管屏障，以允许液体经由所述第一孔口进入所述第一通道，以沿所述第一通道在一个方向上流动并停滞在所述第一毛细管屏障处以及沿所述第一通道在另一方向上流动并停滞在所述第二毛细管屏障处。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品储器通过通孔与所述样品通道连接。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品储器由可去除材料闭合。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述可去除材料是薄膜。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述可去除材料是热封材料或粘合材料。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述可去除材料是包括塑料或聚合物的薄膜。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备还包含在一个或多个气动端口处开口并与每个所述毛细管屏障连通的一个或多个气动通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备还包含：(a)具有第一面和第二面的基底，其中所述第一面包括多个包含所述第一装载储器的储器，并且所述第二面包括多个包含所述第一通道的通道，其中所述多个储器经由所述基底中的通孔与所述多个通道连通；(b)覆盖所述第二面的材料层，从而形成闭合的通道；以及(c)覆盖所述第一面的至少一部分并包含通孔的盖，所述通孔通过垫圈与所述第一面中的端口连通。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一面还包括所述一个或多个气动端口。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述一个或多个气动端口具有短于所述第一装载储器的头部高度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述一个或多个气动端口具有短于所述多个储器中的至少一个储器的头部高度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述覆盖层通过溶剂热结合、压力、粘合剂结合、激光焊接或其组合附接到所述第二面。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述盖还包含定位在所述端口中的通孔之间的多孔、透气、疏水的材料。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通道是深度小于2mm的样品通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通道是具有大于约10μm的深度的样品通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品通道具有约400μm至约1.2mm的深度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通道是深度小于约1mm的前导电解质缓冲液通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述前导电解质缓冲液通道具有约10μm至约600μm的深度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述洗脱通道具有小于约1mm的深度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述洗脱通道具有约10μm至约600μm的深度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通道、第二通道或洗脱通道或其组合具有大于约40μm的深度或大于约10μm的深度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品通道具有约10μL至约1ml的体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品通道、所述前导电解质缓冲液通道、所述洗脱通道或其组合具有小于约1ml的体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，至少一个装载储器包含(a)在所述至少一个储器与所述基底邻接的区域中的圆锥形截面，以及(b)穿透所述基底的圆柱形通孔或孔口。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备包含至少一个装载储器，其包括：(a)在一端的环境空气的入口通道和(b)在所述装载储器的另一端穿透所述基底的孔口，其中所述至少一个装载储器具有截头圆锥形形状，所述截头圆锥形形状的较宽区域定位在用于环境空气的所述入口通道处，并且较窄区域定位在穿透所述基底的所述孔口处。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述截头圆锥形包括导壁，所述导壁以相对于所述基底的所述表面约60度至约90度的范围内的角度定位。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述基底包括气动端口，其被配置成具有使样品损失最小化的高度或深度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述气动端口具有短于所述样品装载储器的高度的相对于所述基底的表面的高度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述基底上的所述气动端口以约1μm至约1mm的深度插入到所述基底的所述第一面的表面中，或者以约0μm至约2mm的高度从所述基底的所述第一面的表面突出。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述基底上的所述气动端口以约1μm至约500μm的深度插入到所述基底的所述第一面的表面中，或者以约0μm至约1mm的高度从所述基底的所述第一面的表面突出。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一装载储器是样品装载储器，所述第二装载储器是前导电解质缓冲液储器，所述第三装载储器是第二前导电解质缓冲液储器，所述第四装载储器是尾随电解质缓冲液储器，所述第五装载储器是洗脱储器缓冲液，并且所述第六装载储器是洗脱缓冲液高储器。
本公开内容的一方面提供了装载所述流体设备的方法，包括将缓冲液装载到所述第一装载储器、第二装载储器、第三装载储器、第四装载储器、第五装载储器或第六装载储器中。
本公开内容的一方面提供了装载所述流体设备的方法，包括将缓冲液装载到所述第一通道、第二通道、第三通道、第四通道、第五通道或第六通道中。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备包含第一通道，其包括与第二通道相邻的平台毛细管屏障，并且所述缓冲液的所述装载包括将第一缓冲液装载到所述第一通道或储器中以及将第二缓冲液装载到所述第二通道或储器中。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法还包括向所述流体设备施加第一正气动压力或第一负气动压力，以使得第一缓冲液和第二缓冲液停滞在所述平台毛细管屏障内的斜坡基部。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一正气动压力或所述第一负气动压力的施加包括以固定的增量增大或减小所述第一正压力或第一负压力。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法还包括向所述流体设备施加第二正气动压力或第二负气动压力，使得所述第一缓冲液和所述第二缓冲液沿所述平台毛细管屏障的任一侧的斜坡流动。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二正气动压力或第二负气动压力的所述施加包括以固定的增量增大或减小所述第二正压力或第二负压力。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液停滞在所述平台毛细管屏障的平台处且在它们之间具有气隙，所述气隙位于所述平台毛细管屏障的所述平台的上方或下方。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法还包括向所述流体设备施加第三正气动压力或第三负气动压力，使得所述第一液体和所述第二液体进入所述气隙，使得在所述平台毛细管屏障的所述平台的上方或下方的所述第一缓冲液和第二缓冲液之间形成液-液界面。
本公开内容的一方面提供了一种流体设备，其包含流体通道和安设在所述流体通道中的毛细管屏障，所述毛细管屏障限制液体在所述流体通道中的流动，其中所述毛细管屏障包括：(a)以第一角度从所述流体通道的表面突出的斜坡；(b)平台区域，和(c)从所述平台区域延伸至所述流体通道的所述表面的悬崖区域，并且其中所述悬崖区域以比所述第一角度实质上更陡的第二角度与所述表面相交。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二角度比所述第一角度陡至少约10度、至少约15度或至少约20度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述斜坡沿所述流体通道的长度下降或倾斜。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一角度小于60度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二角度大于60度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述平台区域与所述流体通道的所述表面实质上平行。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述平台区域相对于所述流体通道的所述表面倾斜不大于约10度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述斜坡、平台区域或悬崖区域的任何组合具有实质上平坦的表面。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述斜坡、平台区域或悬崖区域的任何组合具有弯曲的表面。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述斜坡、平台区域或悬崖区域的任何组合具有包括一个或多个凹槽、脊、凹痕、台阶、蚀刻或突起的表面。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述斜坡、平台区域或悬崖区的任何组合具有包括具有不同角度的面的区域的表面。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述斜坡、平台区域或悬崖区域的宽度实质上占据所述流体通道的宽度。
本公开内容的一方面提供了一种流体设备，其包含流体通道和安设在所述流体通道中的毛细管屏障，所述毛细管屏障限制液体在所述流体通道中的流动，其中所述毛细管屏障包括：(a)以小于80度的第一角度从所述流体通道的表面突出的第一斜坡；(b)平台区域；以及(c)从所述平台区域延伸至所述流体通道的所述表面的第二斜坡，并且其中所述第二斜坡以小于80度的第二角度与所述表面相交。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一角度和所述第二角度相同或实质上相同。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一角度和所述第二角度不同。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一斜坡、所述第二斜坡或所述平台区域的任何组合具有包括一个或多个凹槽、脊、凹痕、台阶、蚀刻或突起的表面。
本公开内容的一方面提供了一种包含毛细管屏障的流体设备，所述毛细管屏障：(a)包括具有梯形形状的横截面；(b)从所述流体通道的内表面突出；(c)具有实质上平行于所述流体通道的所述内表面的平台表面；(d)具有将所述平台表面与所述流体通道的所述内表面连接的斜坡表面，其中所述斜坡表面沿所述流体通道的长度倾斜或下降；以及(e)被配置和布置用于停滞并定位沿所述流体通道的长度流动的液体的弯液面。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述毛细管屏障实质上跨越所述流体通道的宽度延伸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述毛细管屏障还被配置和布置用于创建液-液界面。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述梯形形状是等腰梯形。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述梯形形状是包含基本为直角的两个角度的直角梯形。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述梯形形状是不等边梯形。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述毛细管屏障是“平台毛细管屏障”。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述毛细管屏障是“悬崖毛细管屏障”。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备包含在同一流体回路中的悬崖毛细管屏障和平台毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备还包含样品通道，所述样品通道包括悬崖毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备还包含位于缓冲液通道之间的平台毛细管屏障。
本公开内容的一方面提供了一种等速电泳(ITP)系统，其包含：(a)被配置用于接合流体设备的接口，其中所述流体设备包含一个或多个分支流体回路，每个所述分支流体回路包括多个装载储器，所述多个装载储器包括尾随电解质储器、第一前导电解质储器和第一洗脱缓冲液储器，并且其中所述接口包括：(i)气动歧管，其包括向一个或多个歧管端口开口并与正气动压力或负气动压力源连通的多个歧管气动通道，每个歧管端口被配置成当所述流体设备与所述接口接合时接合所述流体设备的一个或多个气动端口；和(ii)多个电极，每个电极都与电压或电流源连通，包括第一电极、第二电极和第三电极，其中所述多个电极被配置成当所述流体设备与所述接口接合时分别定位在所述尾随电解质储器、所述第一前导电解质储器和所述第一洗脱缓冲液储器中；(b)与所述气动歧管连通的正气动压力或负气动压力源；以及(c)与所述电极连通的电压或电流源。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述等速电泳系统包括马达，以使接口与接合的流体设备接合。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备与所述接口接合。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述气动歧管还包含用于控制通往所述分支流体回路的至少一个中的气动通道的气动压力的阀。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述等速电泳系统还包含：(d)具有长且窄的端头的脊、被配置用于加热所述端头的加热元件、以及被配置用于将所述脊端头压靠与所述接口接合的流体设备以闭合所述微流体设备中的多个流体通道的致动器。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述系统被配置成使得多个流体通道可以用可热封材料、PCR薄膜、石蜡膜、保鲜膜、粘合层或不通过密封件固定的材料闭合。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述系统被配置成使得所述流体设备内的多个流体通道可以被承载块闭合。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述系统被配置成使得所述流体设备内的多个流体通道可以被具有橡胶密封构件的机械致动器块闭合。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述系统还包含温度测量设备。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述系统还包含显示器以显示系统的操作参数。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述显示器显示温度。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述显示器显示由光传感器所检测的光的量度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述显示器显示流体回路上的电压或电流。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述系统还包含电压或电流测量设备。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述系统还包含光学组装件，所述光学组装件包括被配置用于将光引导至所述流体回路的流体通道的一个或多个光源以及一个或多个光传感器，以检测从所述流体回路的流体通道发射的光。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述接口还包括一个或多个对准标记以将所述流体设备在特定取向上对准。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述系统还包含响应于温度、电流或电压调控所述电极的软件。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备还包含多个分支流体回路，每个分支流体回路包括独立的电路。在本文提供的各方面的一些实施方式中，每个所述分支流体回路耦合至相同的电压或电流源或者不同的电压或电流源。
本公开内容的一方面提供了一种创建流体回路的方法，其包括：(a)提供流体设备，其中所述流体设备包含至少一个分支流体回路，所述分支流体回路包括尾随电解质缓冲液储器、第一通道、第一前导电解质缓冲液储器、样品装载储器、第二前导电解质缓冲液储器和第一洗脱缓冲液储器，所有这些均彼此流体连通，其中：(i)所述尾随电解质缓冲液储器包含尾随电解质缓冲液；(ii)所述第一前导电解质缓冲液储器包含第一前导电解质缓冲液；(iii)所述第二前导电解质缓冲液储器包含不同于所述第一电解质缓冲液的第二电解质缓冲液；并且(iv)所述第一洗脱缓冲液储器包含第一洗脱缓冲液；(b)向所述尾随电解质缓冲液储器和所述前导电解质缓冲液储器施加气动压力，使得所述尾随电解质缓冲液和所述前导电解质缓冲液各自进入所述第一通道并且停滞在所述第一通道内，在所述尾随电解质缓冲液与所述前导电解质缓冲液之间具有气隙；(c)将样品装载到所述第一通道内的所述尾随电解质缓冲液与所述前导电解质缓冲液之间的所述气隙中；以及(d)向所述第二前导电解质缓冲液储器和所述第一洗脱缓冲液储器施加气动压力，使得所述第二前导电解质缓冲液和所述第一洗脱缓冲液各自实际上同时进入所述流体回路。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述气动压力是正气动压力或负气动压力。在本文提供的各方面的一些实施方式中，操作(b)中的所述施加气动压力导致所述尾随电解质缓冲液停滞在所述第一通道内的第一毛细管屏障处，并且所述前导电解质缓冲液停滞在所述第一通道内的第二毛细管屏障处。在本文提供的各方面的一些实施方式中，操作(d)中的所述施加气动压力导致所述第二前导电解质缓冲液停滞在所述流体回路内的第三毛细管屏障处，并且所述第一洗脱缓冲液停滞在所述流体通道内的第四毛细管屏障处。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一毛细管屏障和所述第二毛细管屏障是悬崖毛细管屏障或斜坡毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第三毛细管屏障和所述第四毛细管屏障是平台毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第三毛细管屏障和所述第四毛细管屏障各自具有低于所述第一毛细管屏障或所述第二毛细管屏障的破裂压力的破裂压力。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品包括润湿剂。
本公开内容的一方面提供了一种包含一个或多个分支流体回路的流体设备，其中每个所述分支流体回路包括等速电泳(“ITP”)分支和与所述ITP分支连通的洗脱分支，其中：(a)所述ITP分支包括尾随电解质缓冲液储器、样品通道、前导电解质缓冲液通道、第一前导缓冲液电解质储器和第二前导电解质缓冲液储器，所有这些均彼此连通，其中：(i)所述样品通道通过第一悬崖毛细管屏障与所述尾随电解质储器分离，并通过第二悬崖毛细管屏障与所述前导电解质缓冲液通道分离；(ii)所述前导电解质储器通过第一平台毛细管屏障与所述第二前导电解质储器分离；并且(b)所述洗脱分支包括洗脱通道、第一洗脱缓冲液储器和第二洗脱缓冲液储器，所有这些均彼此连通，其中：(i)所述第一洗脱缓冲液储器通过第二平台毛细管屏障与所述第二洗脱缓冲液储器分离，并且(ii)所述前导电解质缓冲液通道通过第三平台毛细管屏障与所述洗脱通道的至少一部分分离。
本公开内容的一方面提供了一种创建流体回路的方法，其包括：(a)提供本文提供的一方面的流体设备，其中：(i)所述尾随电解质缓冲液储器包含尾随电解质缓冲液；(ii)所述第一前导电解质缓冲液储器包含第一前导电解质缓冲液；(iii)所述第二前导电解质缓冲液储器包含第二前导电解质缓冲液；(iv)所述第一洗脱缓冲液储器包含第一洗脱缓冲液；并且(v)所述第二洗脱缓冲液储器包含第二洗脱缓冲液；(b)向所述第一悬崖毛细管屏障和所述第二悬崖毛细管屏障施加负气动压力，以启动所述悬崖毛细管屏障处的尾随电解质缓冲液和第一前导电解质缓冲液；(c)将样品装载到所述样品通道中，其中所述样品包含足以在所述第一悬崖毛细管屏障与所述第二悬崖毛细管屏障之间创建流体连接的润湿剂；以及(d)向所述第一平台毛细管屏障、第二平台毛细管屏障和第三平台毛细管屏障施加负气动压力，以在所述第一平台毛细管屏障、第二平台毛细管屏障和第三平台毛细管屏障之间创建流体连接。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法还包括：(e)将第一电极插入所述尾随电解质缓冲液储器中的尾随电解质缓冲液中；(f)将第二电极插入所述第二前导电解质缓冲液储器中的第二前导电解质缓冲液中；以及(g)在所述第一电极和所述第二电极之间施加电压或电流。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法还包括：(h)将第三电极插入所述第二洗脱缓冲液储器中的第二洗脱缓冲液中；以及(i)在操作(g)之后，在所述第一电极和所述第三电极之间施加电压或电流，并且任选地减小所述第二电极的电流。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法还包括将顶层液体(topperliquid)添加至所述样品储器。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法还包括用尾随电解质缓冲液使所述样品成峰。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法还包括响应于触发事件施加电压或电流。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述电压在约0V至约1500V的范围内。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法还包括施加约0mpsi至约200mpsi的负气动压力。在本文提供的各方面的一些实施方式中，辅助施加的负气动压力在约10mpsi至约80mpsi之间。
本公开内容的一方面提供了一种包含流体通道的流体设备，所述流体通道包含：(a)实质上平行于第三壁的第一壁和实质上平行于第四壁的第二壁；以及(b)毛细管屏障，其中所述毛细管屏障包含：(i)安设在所述第二壁的内表面上或集成到所述第二壁的内表面中并且实质上在所述第一壁与所述第三壁之间延伸的侧面；(ii)分别与所述第一壁和第三壁连接、集成或相邻的第一横向侧壁和第二横向侧壁，其中所述第一横向侧壁和所述第二横向侧壁各自包含具有梯形形状的横截面；(iii)实质上平行于所述第二壁并位于所述第二壁和所述第四壁之间的平台表面；以及(iv)将所述第二壁与所述平台表面连接的斜坡，其中所述斜坡沿所述流体通道的长度倾斜或下降。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述梯形形状是等腰梯形。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述梯形形状是包含基本为直角的两个角度的直角梯形。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述梯形形状是不等边梯形。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述毛细管屏障是“平台毛细管屏障”。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述毛细管屏障是“悬崖毛细管屏障”。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备包含在同一流体回路中的悬崖毛细管屏障和平台毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述设备还包含样品通道，所述样品通道包括悬崖毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述设备还包含位于缓冲液通道之间的平台毛细管屏障。
本公开内容的一方面提供了包含流体通道的流体设备，所述流体通道包含从所述流体通道的第一壁突出到所述流体通道中的毛细管屏障，其中所述毛细管屏障包含(i)两个各自具有梯形形状的横截面的横向侧；(ii)实质上平行于所述通道的所述第一壁的平台侧；以及(iii)斜坡，其一个边缘与所述平台侧相交以形成所述毛细管屏障的内钝角，并且相对边缘与所述通道的所述第一壁相交以形成所述毛细管屏障的内锐角。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述毛细管屏障还包括将所述平台侧与所述第一壁的侧面。在本文提供的各方面的一些实施方式中，将所述平台侧与所述第一壁连接的所述侧面大致垂直于所述第一壁。在本文提供的各方面的一些实施方式中，将所述平台侧与所述第一壁连接的所述侧面以锐角与所述第一壁相交。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述横向侧中的至少一个实质上平行于或集成在所述流体通道的第二壁中。
本公开内容的一方面提供了一种流体系统，其包含：(a)微流体芯片中的第一等速电泳回路，其包括：(i)第一样品储器；(ii)与所述样品储器流体连通的包含尾随电解质缓冲液的尾随电解质缓冲液储器；和(iii)与所述样品储器流体连通的包含前导电解质缓冲液的前导电解质缓冲液通道；(b)被配置用于检测所述前导电解质缓冲液通道中的温度变化的传感器；以及(c)被配置用于监测所述第一等速电泳回路中的电压或电流并在所述第一等速电泳回路内供应恒定电流的装置。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述前导电解质通道包括洗脱通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述传感器被配置和布置用于检测所述洗脱通道中的温度变化。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体系统还包含洗脱孔。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一等速电泳回路还包括包含洗脱缓冲液的洗脱通道。
本公开内容的一方面提供了一种流体系统，其包含：(a)微流体芯片中的第一等速电泳回路，其包括：(i)与第一流体通道流体连通的第一样品储器；(ii)与所述第一流体通道流体连通的第一缓冲液储器、第二缓冲液储器和第三缓冲液储器，其中所述第一缓冲液储器和所述第二缓冲液储器被第一毛细管屏障分离；和(iii)与所述第一流体通道流体连通的洗脱储器；(b)被配置用于检测所述第一等速电泳区域内的所述第一流体通道中的温度变化的传感器；以及(c)被配置用于监测电压或电流并在所述第一等速电泳回路内供应恒定电流的装置。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一流体通道包括与所述第一样品储器相邻的第二毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一毛细管屏障是平台毛细管屏障，并且所述第二毛细管屏障是悬崖毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一毛细管屏障是悬崖毛细管屏障、平台毛细管屏障或斜坡毛细管屏障。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一流体通道包含悬崖毛细管屏障和所述悬崖屏障下游的收窄件。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述系统还包含配置在所述收窄件下游的温度传感器。
本公开内容的一方面提供了一种流体系统，所述流体系统包含：包括多个回路的流体芯片，其中所述回路中的每一个包括与洗脱储器流体连通的洗脱通道；以及包括脊的机械构件，其中所述机械构件被配置用于经由所述脊同时向多个所述洗脱通道施加机械压力，以通过所述洗脱通道的至少一个壁的塑性变形至少部分闭合所述洗脱通道。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述系统还包含与基底层结合的底膜，所述底层形成每个所述洗脱通道的壁，其中所述底膜和所述基底层各自包含具有相同熔点的材料。在本文提供的各方面的一些实施方式中，每个洗脱通道包含弯曲，并且其中所述脊在横跨弯曲的两个位置至少部分闭合每个洗脱通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述脊完全闭合所述通道。
本公开内容的一方面提供了一种从测定检索分析物的方法，其包括：将所述分析物引入本文提供的一方面的所述流体系统中的所述回路之一中；使所述分析物迁移至所述回路之一中的所述洗脱通道；以及接合所述机械构件，以经由所述脊向所述多个洗脱通道施加机械压力，以便通过所述洗脱通道的至少一个壁的塑性变形至少部分闭合所述洗脱通道。
本公开内容的一方面提供了一种流体设备，其包含：第一液体通道；与所述第一液体通道流体连通的气体通道；与所述气体通道流体连通的气动端口；以及跨所述气动端口安设的透气疏水膜，其中所述疏水膜不是液体可渗透的，并且被配置成当经由所述气动端口向所述气体通道施加负压时抑制液体离开所述气动端口。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述设备还包含安设在所述气动端口上方的垫圈。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述设备还包括在液体与气体通道之间的收窄件以抑制液体离开所述气体通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述垫圈通过覆盖层固定到位，所述覆盖层包含通过所述端口与所述气体通道连通的通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述覆盖层包含过盈配合，所述过盈配合被配置用于维持所述垫圈上的压缩力。
本公开内容的一方面提供了一种方法，其包括：(a)提供流体回路，其包括：(i)与含有洗脱缓冲液的洗脱通道相邻的洗脱孔，其中所述洗脱通道与含有前导电解质缓冲液的前导电解质通道连接，和(ii)位于所述洗脱缓冲液与所述前导电解质缓冲液之间的界面处的毛细管屏障；(b)使所述前导电解质缓冲液与所述洗脱缓冲液之间的所述界面流向所述洗脱孔；以及(c)停滞所述前导电解质缓冲液与所述洗脱缓冲液之间的所述界面的流动，使得所述毛细管屏障被所述前导电解质缓冲液完全淹没。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体回路还包括与所述洗脱孔口流体连通的样品孔口。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括将核酸样品引入所述样品孔口中，并向所述流体回路施加电流，以使所述核酸样品在所述毛细管屏障上移动。
本公开内容的一方面提供了一种方法，其包括：(a)提供包含流体回路的流体设备，所述流体回路具有尾随电解质缓冲液储器、样品通道、前导电解质缓冲液通道和洗脱储器，所有这些均彼此连通，其中：(i)所述前导电解质缓冲液通道经由位于所述洗脱储器下方的所述前导电解质缓冲液通道中的孔口与所述洗脱储器流体连接；(ii)所述尾随电解质缓冲液储器包含尾随电解质缓冲液，(ii)所述样品通道包含分析物，(iii)所述前导电解质缓冲液通道包含前导电解质缓冲液，(iv)所述洗脱储器包含洗脱缓冲液；以及(b)在所述流体回路上施加电流，以使所述分析物移动至所述洗脱储器，其中所述电流被配置和布置成在所述分析物与所述尾随电解质缓冲液之间的界面处生成第一温度，并在所述样品与所述前导电解质缓冲液之间的界面处生成第二温度，其中在所述第一温度与所述第二温度之间存在温差；并且其中当所述分析物到达位于所述洗脱储器下方的所述前导电解质缓冲液通道中的所述孔口时，所述分析物由所述温差促进进入所述洗脱储器。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法还包括从所述洗脱储器移出所述分析物。
本公开内容的一方面提供了一种定量核酸样品的方法，所述方法包括：提供包含等速电泳(ITP)通道的流体设备，所述ITP通道包含核酸样品，其中所述核酸样品包括与插入染料复合的核酸；在所述流体通道中执行ITP，以便聚焦与所述插入染料复合的所述核酸；以及在执行ITP后，通过测量所述插入染料的强度来定量所述通道内的与所述插入染料复合的所述核酸，其中所述插入染料包括SYTOTM13、
Figure GDA0003654970080000201
或
Figure GDA0003654970080000202
中的一种或多种。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述染料包括SYTOTM 13。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述染料包括
Figure GDA0003654970080000203
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述染料包括
Figure GDA0003654970080000204
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述染料包括
Figure GDA0003654970080000205
在本文提供的各方面的一些实施方式中，与所述插入染料复合的所述核酸位于包含前导电解质缓冲液或洗脱缓冲液的所述ITP通道的区域中。在本文提供的各方面的一些实施方式中，与所述插入染料复合的所述核酸包括RNA或DNA或其组合。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述核酸样品还包括污染物。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述污染物包括蛋白质、细胞碎片、脂质、质膜、小分子或其组合。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述在所述流体通道中执行ITP导致与所述插入染料复合的所述核酸与所述污染物分离。
本公开内容的一方面提供了一种包含一个或多个分支流体回路的流体设备，其中每个所述分支流体回路包括等速电泳(“ITP”)分支和与所述ITP分支连通的洗脱分支，其中：所述ITP分支包括尾随电解质缓冲液储器、样品通道、前导电解质缓冲液通道、第一前导缓冲液电解质储器和第二前导电解质缓冲液储器，所有这些均彼此连通；并且所述洗脱分支包括洗脱通道和洗脱孔，所述洗脱孔包括与所述洗脱通道连通的第一通孔和第二通孔。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔和第二通孔为圆形的。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔具有椭圆形形状。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔具有小于1.5mm的最大尺寸，或小于1mm的最大尺寸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通孔具有小于1.5mm的最大尺寸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通孔具有小于1mm的最大尺寸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔和所述第二通孔在洗脱孔内的同一垂直平面上。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔和所述第二通孔在洗脱孔内的不同垂直平面上。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔和所述第二通孔与洗脱通道的纵轴对准。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔被配置用于将移液管端头约束在预定的耦合位置。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔包括圆形横截面。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔包括椭圆形横截面。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔包括D形横截面。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔包括相对于所述通道以约60度至约90度范围内的角度安设的导壁。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述洗脱孔包含一个或多个垂直门，其将第一通孔与第二通孔分离。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述洗脱孔包括圆形横截面。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述洗脱孔包括细长横截面。
本公开内容的一方面提供了一种流体设备，其包含：终止于第一通孔中的端部的第一通道；终止于第二通孔中的端部的第二通道；以及由具有不大于25mm、不大于15mm、不大于10mm或大于10mm的高度的壁限定的流体储器；其中所述储器通过第一通孔和第二通孔与两个流体通道中的每一个流体连通，并且其中所述第一通孔在所述储器中比所述第二通孔低的位置进入所述储器。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通道与第一电极连通；并且所述第二通道与第二电极连通，其中所述通道和所述储器包含导电流体，并且其中在第一电极和第二电极之间的电压施加产生行进通过所述储器的电流。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述壁具有在约8mm至约10mm的范围内的高度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔和所述第二通孔分别具有约0.2mm2至7mm2和约0.2mm2至7mm2的面积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔和所述第二通孔分别具有约0.8mm2至1.5mm2和约1mm2至2.75mm2的面积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通孔通过在储器中定位在所述第一通孔进入所述储器的点上方约1mm至约6mm的平台进入所述储器。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔与所述第二通孔之间的所述储器的所述体积不大于约2.5ml、1ml或0.5ml。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔与所述第二通孔之间的所述储器的体积为0.1mL。
本公开内容的一方面提供了一种方法，其包括：提供本文所述的任何流体设备，其中所述通道和储器包含导电流体，并且所述第一通道还包含离子分析物；在第一电极和第二电极之间施加电压，以产生行进通过储器的电流；以及使所述分析物通过第一通孔移动到所述储器中。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述分析物包括核酸，例如，RNA或DNA。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法还包括在第一通道中执行等速电泳，从而使所述分析物移动到储器中。
本公开内容的一方面提供了一种流体设备，其包含：具有长度和宽度的流体通道；定位在所述流体通道上方并通过一个或多个通孔与所述流体通道流体连接的储器；其中每个通孔的至少一部分在所述流体通道的所述宽度上与所述流体通道实质上共同延伸并且具有形状，其中当所述流体通道和所述储器包含导电流体并且电流通过所述流体通道时，至少5％、至少6％、至少7％、至少10％或至少20％的所述电流通过所述储器。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述储器包含一个通孔。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述储器包含沿通道的纵轴布置的两个通孔。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述一个或两个通孔具有正方形、矩形、椭圆形的形状，或者在宽度方向上具有细长的尺寸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述一个或两个通孔包括跨越所述流体通道的所述宽度或所述储器的宽度的一个或两个侧面，其中所述侧面各自是至少75％线性的。
本公开内容的一方面提供了一种方法，其包括：提供本文所述的任何设备，其中所述通道和所述储器包含导电流体，并且所述储器包含离子分析物；以及使通过所述通道的电流通过，其中所述电流使至少一些所述分析物从所述储器移动到所述通道中。
本公开内容的一方面提供了一种包含一个或多个分支流体回路的流体设备，其中每个所述分支流体回路包括等速电泳(“ITP”)分支，其中：所述ITP分支包括尾随电解质缓冲液储器、样品通道、前导电解质缓冲液通道、第一前导缓冲液电解质储器和第二前导电解质缓冲液储器，所有这些均彼此连通，样品储器包括与所述样品通道连通的第一通孔。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔具有正方形或矩形形状。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔具有在约0.5mm至约5mm的范围内的最大尺寸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔具有约1.5mm的最大尺寸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔具有约1mm的最大尺寸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔具有小于约15ul的体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔具有约7ul的体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔具有在所述样品通道的宽度的约80％至约120％的范围内的宽度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔具有所述样品通道的宽度的约100％的宽度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品储器还包括与所述样品通道连通的第二通孔。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通孔和所述第二通孔由填充块分离。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述填充块在所述通道内具有在约0.2mm至约2mm的范围内的高度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述填充块在所述通道内具有约1.2mm的高度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通孔具有正方形或矩形形状。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通孔具有在约0.5mm至约5mm的范围内的最大尺寸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通孔具有约1.5mm的最大尺寸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通孔具有约1mm的最大尺寸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通孔具有小于约15ul的体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通孔具有约7ul的体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通孔具有在所述样品通道的宽度的约80％至约120％的范围内的宽度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二通孔具有在所述样品通道的宽度的约80％至约120％的范围内的宽度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，当将电场施加到所述ITP分支时，施加的电流中大于10％在所述样品储器的长度上在所述样品通道的顶表面上方行进。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品储器具有圆锥形形状，其较窄部分具有在约0.1mm至约4mm范围内的直径。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品储器具有圆锥形形状，其较窄部分具有在约1mm至约4mm范围内的直径。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品储器具有椭圆形形状。
本公开内容的一方面提供了一种用于执行垂直等速电泳的设备，所述设备包含：一个或多个圆柱形柱，其包括由所述圆柱形柱的内壁限定的内部通道，每个圆柱形柱包括：第一台阶，其包括安设在所述内部通道内的第一位置的第一凝胶塞和安设在所述第一凝胶塞与所述圆柱形柱的上端之间的所述内部通道内的第一空间；第二台阶，其包括安设在所述内部通道内的第二位置的第二凝胶塞和安设在所述第一凝胶塞与所述第二凝胶塞之间的所述内部通道内的第二空间，所述第二位置位于所述第一位置下方并与重力一致地取向；以及第三台阶，其包括安设在所述内部通道内的第三位置的第三凝胶塞和安设在所述第二凝胶塞与所述第三凝胶塞之间的所述内部通道内的第三空间，所述第三位置位于所述第二位置下方并与重力一致地取向。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，一个或多个圆柱形柱包括多个圆柱形柱，所述多个圆柱形柱被布置成符合标准微量滴定板尺寸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述一个或多个圆柱形柱具有约9mm×9mm的横截面柱面积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一空间包含尾随电解质缓冲液，所述第二空间包含分析物，并且所述第三空间包含第一前导电解质缓冲液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述设备还包括第四台阶，其包括安设在所述内部通道内的第四位置的第四凝胶塞和安设在所述第三凝胶塞与所述第四凝胶塞之间的所述内部通道内的第四空间，所述第四位置位于所述第三位置下方并与重力一致地取向。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第四空间包含洗脱缓冲液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述设备还包含第五台阶，其包括安设在所述内部通道内的第五位置的第五凝胶塞和安设在所述第四凝胶塞与所述第五凝胶塞之间的所述内部通道内的第五空间，所述第五位置位于所述第四位置下方并与重力一致地取向。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第五空间包含第二前导电解质缓冲液。
本公开内容的一方面提供了一种用于聚焦分析物的方法，所述方法包括：将所述分析物引入本文所述的任何垂直或柱状ITP设备的所述第二凝胶塞上方的所述第二台阶的所述第二空间中；以及在所述设备上施加电流，以使所述分析物在重力方向上从所述第二空间移动穿过第二凝胶塞并进入所述第三空间。
根据权利要求255所述的方法，还包括在所述设备上施加所述电流，以使所述分析物在重力方向上从所述第三空间移动穿过第三凝胶塞并进入所述第四空间。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法还包括从所述第四空间去除所述分析物。
本公开内容的一方面提供了一种用于样品纯化的方法，该方法包括：(a)将以下物质装载到流体设备中：(i)包含裂解的实体组织的组织样品，其中所述裂解的实体组织包含核酸和污染物，(ii)尾随电解质缓冲液，其包含具有有效迁移率的第一尾随电解质离子，所述有效迁移率的量值低于所述核酸的有效迁移率的量值，和(iii)前导电解质缓冲液，其包含具有第二有效迁移率的第一前导电解质离子，其中所述第二有效迁移率的量值大于所述核酸的所述有效迁移率的所述量值；以及(b)在所述流体设备内施加电场以采用所述第一尾随电解质离子、所述核酸和所述第一前导电解质离子进行等速电泳，从而从所述组织样品中的所述污染物中纯化所述核酸。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一尾随电解质离子的所述有效迁移率的量值大于所述污染物的有效迁移率的量值。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备为微流体芯片，并且将所述组织样品、所述尾随电解质缓冲液和所述前导电解质缓冲液装载到所述微流体芯片的第一区中。本文提供的一方面的一些实施方式可进一步包括在所述微流体芯片的所述第一区中，对所述组织样品进行选自下组的至少一种样品制备程序：(1)去除包埋材料，(2)破坏组织，(3)裂解细胞，(4)使所述核酸解交联，(5)消化蛋白质，和(6)消化所述核酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述等速电泳在所述微流体芯片的第二区中进行，其中所述第二区与所述第一区分隔开并与之流体连接。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述实体组织来源于实体器官。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述裂解的实体组织包含化学固定剂。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述化学固定剂为福尔马林。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述实体组织为福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述裂解的实体组织包含尿素或硫脲。本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括破坏细胞-细胞连接、细胞外基质或结缔组织，以获得所述裂解的实体组织。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述裂解的实体组织包含固体颗粒。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述核酸包括分散的或溶剂化的核酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述污染物选自交联核酸、包埋材料、组织碎片、固定化学品、蛋白质、抑制剂及其组合。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述污染物包含交联核酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，在所述装载之前将所述组织样品与所述尾随电解质缓冲液合并。在本文提供的各方面的一些实施方式中，在所述装载之前将所述组织样品与所述前导电解质缓冲液合并。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述前导电解质缓冲液的所述装载在所述组织样品的所述装载之前进行。在本文提供的各方面的一些实施方式中，在所述组织样品的所述装载之前将所述实体组织在所述前导电解质缓冲液中裂解。在本文提供的各方面的一些实施方式中，在所述组织样品的所述装载之前，将所述实体组织在所述尾随电解质缓冲液中裂解。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品制备程序包括在所述电场的所述施加之前，通过将所述组织样品在所述流体设备中在至少约37℃的温度下温育至少约1分钟的持续时间来去除包埋材料。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述温度为约40℃至约80℃。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述持续时间为约1分钟至约120分钟。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品制备程序包括通过向所述组织样品施加机械应力来破坏组织或裂解细胞。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品制备程序包括通过向所述组织样品施加热量来破坏组织或裂解细胞。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述施加热量导致所述组织样品的温度为约30℃至约80℃。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品制备程序包括通过使所述组织样品与pH为至少10的溶液接触或通过蛋白水解消化所述组织样品来破坏组织或裂解细胞。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述蛋白水解消化在大于约25℃的温度下进行。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品制备程序包括通过向所述组织样品施加至少一种表面活性剂来破坏组织或裂解细胞。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品制备程序包括通过向所述组织或细胞样品施加包含尿素的溶液来破坏组织或裂解细胞。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述溶液进一步包含硫脲。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述溶液中所述尿素的浓度在约4M至约9M的范围内，并且所述溶液中所述硫脲的浓度在约0.5M至约3.5M的范围内。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述溶液中所述尿素的浓度为约6.5M至约7.5M，并且所述溶液中所述硫脲的浓度为约1.5M至约2.5M。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品制备程序包括通过用蛋白酶K消化交联蛋白来使所述核酸解交联。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品制备程序包括用DNA酶或RNA酶消化所述核酸。本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括从所述流体设备的出口储器洗脱包含所述纯化的核酸的输出溶液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述输出溶液中的所述纯化的核酸的浓度比所述组织样品中的所述核酸的浓度高至少约两倍。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品和所述输出溶液中的所述纯化的核酸包含交联核酸，并且所述输出溶液中的所述交联核酸的浓度比所述组织样品中的所述交联核酸的浓度低至少约二分之一。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述污染物以比所述组织样品中的所述污染物的浓度低至少二分之一的浓度存在于所述输出溶液中。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一尾随电解质离子包含己酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质离子包含氯化物。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质缓冲液包含具有与所述第一尾随电解质离子不同的有效迁移率的第二尾随电解质离子。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二尾随电解质离子包含HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)或MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二尾随电解质离子包含HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，并且所述第一尾随电解质离子包含己酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二尾随电解质离子包含MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)，并且所述第一尾随电解质离子包含己酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二尾随电解质离子包含HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，并且所述第一尾随电解质离子包含MOPS。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质缓冲液包含具有第二有效迁移率的第二尾随电解质离子，其中所述第二有效迁移率的量值与所述污染物的所述有效迁移率的所述量值大致相同或低于所述污染物的所述有效迁移率的所述量值。在本文提供的各方面的一些实施方式中，装载到所述流体设备中的所述组织样品具有至少50μl的体积。本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括，在所述微流体芯片的所述第一区中，对所述组织样品进行第一样品处理程序，并且在所述微流体芯片的第二区中，对所述组织样品进行酶促反应。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一样品处理程序包括去除包埋材料、破坏组织或细胞裂解，并且所述酶促反应包括使所述核酸解交联、消化蛋白质或消化核酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，将所述第一区和所述第二区各自加热至37℃以上的温度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，在所述第一样品处理程序期间将所述第一区加热至约60℃至100℃的温度，并且其中将所述第二区加热至40℃至60℃的温度。
本公开内容的一方面提供了一种用于同时从至少两个不同的样品中纯化核酸的方法，该方法包括：(a)将以下物质装载到微流体芯片的第一通道中：(i)包含第一核酸和第一污染物的第一样品，(ii)包含第一尾随离子的第一尾随电解质缓冲液，其中所述第一尾随离子的有效迁移率的量值小于所述第一核酸的有效迁移率的量值，和(iii)包含第一前导离子的第一前导电解质缓冲液，其中所述第一前导离子的有效迁移率的量值大于所述第一核酸的所述有效迁移率的所述量值；(b)将以下物质装载到所述微流体芯片的第二通道中：(i)包含第二核酸和第二污染物的第二样品，(ii)包含第二尾随离子的第二尾随电解质缓冲液，其中所述第二尾随离子的量值小于所述第二核酸的有效迁移率的量值，和(iii)包含第二前导离子的第二前导电解质缓冲液，其中所述第二前导离子的有效迁移率的量值大于所述第二核酸的所述有效迁移率的所述量值；以及(c)在所述微流体芯片内施加第一电场以在所述第一通道中利用所述第一尾随离子、所述第一核酸和所述第一前导离子进行等速电泳，并施加第二电场以在所述第二通道中利用所述第二尾随离子、所述第二核酸和所述第二前导离子进行等速电泳，从而同时从所述第一污染物中纯化所述第一核酸和从所述第二污染物中纯化所述第二核酸。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一样品和所述第二样品是不同的样品类型。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一核酸和所述第二核酸是不同类型或长度的核酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一尾随电解质缓冲液或所述第一前导电解质缓冲液进一步包含裂解剂或组织破坏剂。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述裂解剂或所述组织破坏剂包含选自pH大于约12的溶液、蛋白酶、尿素、硫脲和表面活性剂的一种或多种试剂。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一样品包含裂解的实体组织。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二样品包含裂解的细胞。在本文提供的各方面的一些实施方式中，在所述进行等速电泳的过程中，所述第一样品不接触所述第二样品。本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括将以下物质装载到所述微流体芯片的第三通道中：(i)包含第三核酸和第三污染物的第三样品，(ii)包含第三尾随离子的第三尾随电解质缓冲液，其中所述第三尾随离子的有效迁移率的量值小于所述第三核酸的有效迁移率的量值，和(iii)包含第三前导离子的第三前导电解质缓冲液，其中所述第三前导离子的有效迁移率的量值大于所述第三核酸的所述有效迁移率的所述量值，其中在所述微流体芯片内施加所述电场以在所述第三通道中利用所述第三尾随离子、所述第三核酸和所述第三前导离子进行所述等速电泳，从而同时从所述第一污染物中纯化所述第一核酸、从所述第二污染物中纯化所述第二核酸和从所述第三污染物中纯化所述第三核酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一电场和第二电场由单个电极对生成。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一电场和第二电场由不同的电极对生成。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通道和第二通道耦合至独立的传感器。在本文提供的各方面的一些实施方式中，来自所述独立的传感器的反馈用于独立地控制所述第一电场和第二电场。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述独立的传感器感应电压，并且所述反馈用于控制所述第一通道和第二通道内的电流(或电阻)。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述核酸包含DNA。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述核酸包含RNA。
本公开内容的一方面提供了一种用于样品纯化的方法，该方法包括：(a)将以下物质装载到流体设备上：(i)包含固定细胞、固定组织或包埋组织的样品，其中所述样品包含核酸，(ii)包含尾随电解质的尾随电解质缓冲液，其中所述尾随电解质具有比所述核酸更低的有效迁移率，和(iii)包含前导电解质的前导电解质缓冲液，其中所述前导电解质具有比所述核酸更高的有效迁移率；以及(b)在所述流体设备上施加电场以利用所述尾随电解质、所述核酸和所述前导电解质进行等速电泳，从而从所述样品中的污染物中纯化所述核酸。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述污染物选自交联核酸、包埋材料、固定化学品、酶和抑制剂。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品包含所述固定细胞、所述固定组织，或所述固定细胞和所述固定组织两者。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品是福尔马林固定的。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品包含所述包埋组织。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品包含包埋在石蜡中的所述组织。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品包含组织活检物。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品为解剖的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括将所述核酸的特征与来自其他样品的核酸进行比较，其中所述特征为表达水平、核酸序列、分子量、核酸完整性、核酸链型(例如，双链与单链)或核酸纯度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品为肿瘤样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质缓冲液具有大于约7的pH。本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括，在所述施加所述电场之前，将所述组织样品在所述流体设备中在至少约37℃的温度下温育至少约1分钟的持续时间。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述温度为约40℃至约80℃。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述持续时间为约1分钟至约120分钟。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述前导电解质缓冲液包含蛋白酶K。本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括使用所述蛋白酶K从所述核酸中去除蛋白质交联物。本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括在所述施加所述电场之后，利用加热从所述核酸中去除蛋白质交联物。本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括从所述流体设备的出口储器洗脱包含所述纯化的核酸的输出溶液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述输出溶液中的所述纯化的核酸的浓度比所述组织样品中的所述核酸的浓度高至少约两倍。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述输出溶液中的所述交联核酸的浓度比所述组织样品中的所述交联核酸的浓度低至少约二分之一。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述输出溶液具有等于或小于约50μL的体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品具有至少约1ng的质量。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品具有大于25μL的体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质具有比所述污染物更高的有效迁移率。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质包含(i)第一离子，其中所述第一离子具有比所述污染物更高的有效迁移率量值，和(ii)第二离子，其中所述第二离子具有与所述污染物大致相同或低于所述污染物的有效迁移率量值。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述进行等速电泳将所述组织样品的pH猝灭至约7.5。本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括，在所述装载之前，对所述样品进行脱蜡。本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括检测所述核酸的浓度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述浓度小于或等于约1皮克/微升(pg/μL)。
本公开内容的一方面提供了一种用于样品纯化的方法，该方法包括：(a)将以下物质装载到流体设备中：(i)包含裂解的实体组织和核酸的组织样品，(ii)尾随电解质缓冲液，所述尾随电解质缓冲液包含具有第一有效迁移率的尾随电解质离子，其中所述第一有效迁移率的量值低于所述核酸的有效迁移率的量值，(iii)在第一前导电解质储器中的第一前导电解质缓冲液，所述第一前导电解质缓冲液包含具有第二有效迁移率的第一前导电解质离子，其中所述第二有效迁移率的量值大于所述核酸的所述有效迁移率的所述量值，和(iv)在第二前导电解质储器中的第二前导电解质缓冲液，所述第二前导电解质缓冲液包含具有第三有效迁移率的第二前导电解质离子，其中所述第三有效迁移率的量值大于所述核酸的所述有效迁移率的所述量值，其中所述第一前导电解质缓冲液与所述第二前导电解质缓冲液不同；(b)采用所述尾随电解质离子、所述核酸和所述第一前导电解质离子第一次进行等速电泳，从而从所述组织样品中的所述污染物中纯化所述核酸；以及(c)采用所述尾随电解质离子、所述核酸和所述第二前导电解质离子第二次进行等速电泳。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二次进行等速电泳包括将施加的电流从第一通道改变为第二通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质离子与所述第二前导电解质离子相同，并且其中所述第一前导电解质缓冲液中的所述第一前导电解质离子的浓度与所述第二前导电解质缓冲液中的所述第二前导电解质离子的浓度不同。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二有效迁移率的量值大于所述第三有效迁移率的所述量值。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质离子与所述第二前导电解质离子不同。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质离子与所述第二前导电解质离子相同，并且其中所述第一前导电解质缓冲液中的所述第一前导电解质离子的浓度与所述第二前导电解质缓冲液中的所述第二前导电解质离子的浓度相同，并且其中所述第一前导电解质缓冲液包含第三前导电解质离子。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质离子与所述第二前导电解质离子相同，并且其中所述第一前导电解质缓冲液中的所述第一前导电解质离子的浓度与所述第二前导电解质缓冲液中的所述第二前导电解质离子的浓度相同，并且其中所述第二前导电解质缓冲液包含第三前导电解质离子。本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括在所述第二前导电解质储器中收集所述核酸，并且从所述第二前导电解质储器中去除所述核酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一次进行等速电泳和所述第二次进行等速电泳通过施加单个电场来进行。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一次进行等速电泳和所述第二次进行等速电泳通过施加多于一个电场来进行。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二前导电解质缓冲液中的所述第二前导电解质离子的浓度小于50mM。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二前导电解质缓冲液包含50mM Tris HCl。
本公开内容的一方面提供了一种微流体设备，该微流体设备包括：(a)在微流体芯片中的第一等速电泳区，该第一等速电泳区包括：(i)与第一流体通道流体连通的第一样品储器，(ii)与所述第一流体通道流体连通的第一缓冲液储器，和(iii)与所述第一通道流体连通的第二缓冲液储器；以及(b)在所述微流体芯片中的第二等速电泳区，该第二等速电泳区包括：(i)与第二流体通道流体连通的第二样品储器，(ii)与所述第二流体通道流体连通的第三缓冲液储器，和(iii)与所述第二通道流体连通的第四缓冲液储器，其中所述第一等速电泳区不与所述第二等速电泳区流体连通，并且其中所述微流体设备被配置为独立地控制向所述第一等速电泳区施加电流的第一电路和向所述第二等速电泳区施加电流的第二电路。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一等速电泳区与第二等速电泳区之间的泄漏速率小于1μl/小时。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一等速电泳区与第二等速电泳区之间的电流泄漏小于1μA。在本文提供的各方面的一些实施方式中，阻抗大于1兆欧。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一流体通道容纳大于100μl的液体体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一流体通道与所述第二流体通道以比所述第一通道的宽度小至少4/5的距离分隔开。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述微流体设备被配置为与所述第二电路同时控制所述第一电路。本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括与所述第一通道流体连通的洗脱储器，其中温度传感器位于所述洗脱储器的5mm内。
本公开内容的一方面提供了一种方法，该方法包括：(a)提供包含与通道流体连通的样品输入储器的电动流体设备；(b)将样品体积装载到所述样品输入储器中；(c)将至少50％的所述样品体积从所述样品输入储器移动至所述通道，而未向所述样品输入储器添加额外的体积；以及(d)通过所述通道施加离子电流。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述移动借助于重力进行。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述离子电流基本不通过所述通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述至少50％的所述样品体积包括至少80％的所述样品体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品体积包含核酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品体积包含组织样品或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述施加离子电流包括进行等速电泳。在本文提供的各方面的一些实施方式中，装载到所述样品输入储器中的总样品体积小于或等于所述输入储器的内部体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品输入储器包含经由锥形区域与底部区域连接的顶部区域，其中所述顶部区域具有第一直径，并且所述底部区域具有第二直径，其中所述第一直径比所述第二直径长至少两倍，以促进所述将至少50％的所述样品体积从所述样品输入储器移动至所述通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品体积为至少25μl。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品体积为至少50μl。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品体积为至少100μl。
本公开内容的一方面提供了一种微流体芯片，该微流体芯片包括：第一样品输入储器，其中所述第一样品输入储器包含经由锥形区域与底部区域连接的顶部区域，其中所述顶部区域具有第一内部水力直径，并且所述底部区域具有第二内部水力直径，其中所述第一内部水力直径比所述第二内部水力直径长至少2倍，并且其中所述第一样品输入储器与第一通道流体连通；与所述第一通道流体连通的第一缓冲液储器，其中所述第一样品储器被配置为使得所述第一样品储器中的液体的自由表面相对于所述第一缓冲液储器中的液体具有可忽略的缓冲液头部高度差；以及与所述第一通道流体连通的第二缓冲液储器。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一内部水力直径在约1mm至约15mm的范围内。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二内部水力直径在约0.5mm至约5mm的范围内。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一样品储器被配置为容纳至少100μl的样品体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述微流体芯片被配置为当对其施加真空时，将至少50％的所述样品体积从所述第一样品储器移动至所述第一通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述微流体芯片被配置为对进入所述第一通道的样品进行等速电泳。
本公开内容的一方面提供了一种提取核酸的方法，该方法包括：(a)使包含细胞或组织的生物样品暴露于包含尿素或硫脲的溶液，从而裂解所述生物样品内的所述细胞或组织并产生细胞裂解物；(b)将所述细胞裂解物引入设备中；以及(c)采用所述设备进行等速电泳，以从所述细胞裂解物中分离核酸。
本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括用蛋白酶K消化所述样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述溶液包含尿素和硫脲。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述溶液包含比例为约2:1的尿素与硫脲。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述溶液中所述尿素的浓度为约4M至约9M，并且所述溶液中所述硫脲的浓度为约0.5M至约3.5M。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述溶液中所述尿素的浓度为约6.5M至约7.5M，并且所述溶液中所述硫脲的浓度为约1.5M至约2.5M。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述溶液包含尾随电解质离子或前导电解质离子，或尾随电解质离子和前导电解质离子两者。
本公开内容的一方面提供了一种从组织样品中纯化高分子量核酸的方法，该方法包括：(a)将以下物质装载到流体设备中：(i)包含基因组DNA和污染物的细胞样品，其中在所述将所述细胞样品装载到所述流体设备中之前或之后，使所述细胞样品与裂解缓冲液接触，(ii)尾随电解质缓冲液，所述尾随电解质缓冲液包含具有第一有效迁移率的尾随电解质离子，其中所述第一有效迁移率的量值低于所述高分子量核酸的有效迁移率的量值并且大于所述污染物的量值，和(iii)第一前导电解质缓冲液，所述第一前导电解质缓冲液包含具有第二有效迁移率的第一前导电解质离子，其中所述第二有效迁移率的量值大于所述高分子量核酸的所述有效迁移率的所述量值；(b)采用所述尾随电解质离子、所述高分子量核酸和所述第一前导电解质离子进行等速电泳，从而将所述高分子量核酸与所述污染物分离并在等速电泳区中富集所述高分子量核酸；以及(c)将所述基因组DNA洗脱到输出储器中的溶液中，其中所述溶液内大于50％的质量的核酸大于30千碱基。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述裂解缓冲液不包括碱性缓冲液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述裂解缓冲液包含辛基酚乙氧基化物。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述溶液内大于50％的质量的核酸大于50千碱基。
本公开内容的一方面提供了一种进行等速电泳的方法，该方法包括：(a)提供包含第一通道的流体设备，所述第一通道与包含含有裂解的实体组织的组织样品的样品输入储器、包含第一前导电解质缓冲液的第一缓冲液储器和包含尾随电解质缓冲液的第二缓冲液储器流体连通；(b)使第一电极与所述第一缓冲液储器中的所述第一前导电解质缓冲液接触；(c)使第二电极与所述第二缓冲液储器中的所述尾随电解质缓冲液接触；以及(d)在所述流体设备内施加电场以进行等速电泳，其中所述等速电泳在所述组织样品与所述第一电极和第二电极之间没有直接接触的情况下发生。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备进一步包含与所述第一通道和所述第一缓冲液储器流体连通的第三缓冲液储器，所述第三缓冲液储器包含比所述第一缓冲液储器更低浓度的所述第一前导电解质缓冲液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第三缓冲液储器和所述第一缓冲液储器通过包含一个或多个毛细管屏障的第二通道连接，以限制所述第二通道内和所述第三缓冲液储器与所述第一缓冲液储器之间的压力驱动的流动。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体设备进一步包含洗脱储器。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述洗脱储器与第四缓冲液储器流体连通。
本公开内容的一方面提供了一种微流体系统，所述微流体系统包含：(a)微流体芯片，其包含第一通道和与所述第一通道流体连通的第一储器，其中所述第一通道和所述第一储器在第一连接件相遇；以及(b)包含第一齿的机械构件，其中所述机械构件被配置为经由所述第一齿向所述第一通道施加机械压力，以通过所述第一通道的至少一个壁的塑性变形至少部分地闭合所述第一通道并增加所述第一通道与所述第一储器之间的流体阻力。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述微流体芯片进一步包含与所述第一储器流体连通的第二储器和连接所述第一储器和所述第二储器的第二通道，并且其中所述机械构件进一步包含第二齿，所述第二齿被配置为向所述第二通道施加机械压力，以塑性地闭合所述第二通道并阻止所述第一储器与所述第二储器之间的流体连通。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一齿被配置为将机械压力递送至所述第一连接件，以通过所述第一通道的至少一个壁的塑性变形来闭合所述第一通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一齿被配置为加热所述第一通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述机械构件包含杨氏弹性模量大于所述第一通道的杨氏弹性模量的材料。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述微流体系统被配置为进行等速电泳。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一齿热耦合至加热元件。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一齿被加热至高于所述第一通道的所述至少一个壁的玻璃化转变温度的温度。本文提供的各方面的一些实施方式包括在流体系统中完成过程的方法，该方法包括使用所述微流体系统通过塑性变形至少部分地闭合所述第一通道，从而增加对所述第一通道与所述第一储器之间的流体流动的阻力。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述机械构件的所述第一齿向所述第一通道施加至少0.25lbs的力。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述流体系统中的所述过程为等速电泳。
本公开内容的一方面提供了一种对包含核酸的样品进行等速电泳的方法，该方法包括：(a)将包含核酸的所述样品装载到微流体芯片的第一储器中；(b)将尾随电解质缓冲液装载到所述微流体芯片的第二储器中，其中所述尾随电解质缓冲液包含具有有效迁移率的第一尾随电解质离子，所述有效迁移率的量值低于所述核酸的有效迁移率的量值；(c)将前导电解质缓冲液装载到所述微流体芯片的第三储器中，其中所述第三储器包含具有第二有效迁移率的第一前导电解质离子，其中所述第二有效迁移率的量值大于所述核酸的所述有效迁移率的所述量值；(d)在所述微流体芯片内施加电场以采用所述第一尾随电解质离子、所述核酸和所述第一前导电解质离子进行等速电泳，从而将所述核酸或其一部分限制在等速电泳区；以及(e)使用温度传感器来感测所述等速电泳区中或附近的温度变化，其中来自所述温度传感器的反馈用于控制所述电场。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述控制所述电场导致所述核酸或其一部分定位在所述微流体芯片的洗脱储器或区域中。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述温度传感器位于所述洗脱储器的至多8mm内。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述温度变化在约0.2℃至5℃的范围内。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述施加的电场使所述前导电解质和所述尾随电解质在等速电泳界面处相遇，并且所述温度传感器感测所述等速电泳界面。
本公开内容的一方面提供了一种微流体设备，该微流体设备包括：(a)在微流体芯片中的第一等速电泳区，该第一等速电泳区包括：(i)与第一流体通道流体连通的第一样品储器；(ii)与所述第一流体通道流体连通的第一缓冲液储器、第二缓冲液储器和第三缓冲液储器，其中所述第一缓冲液和第二缓冲液储器由毛细管屏障分隔开；和(iii)与所述第一流体通道流体连通的洗脱储器；(b)传感器，其被配置为检测所述第一等速电泳区内的所述第一流体通道中的温度变化；以及(c)被定位为在所述第一等速电泳区内的所述第一通道内提供电流的装置。
本文提供的各方面的一些实施方式进一步包括控制器，所述控制器被配置为当所述传感器接收热信号时触发所述电流的减少或消除。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述温度变化为温度在约0.2℃至5℃范围内的增加。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述微流体设备进一步被配置为在所述传感器检测到温度变化之后在所述洗脱储器中分离核酸样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，采用位于所述洗脱储器的至多8mm内的传感器进行所述核酸的所述感测。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一通道包含单个传感器。
本公开内容的一方面提供了一种试剂盒，该试剂盒包括：(a)权利要求111所述的微流体设备、权利要求165所述的微流体设备或权利要求128所述的微流体芯片；(b)包含尾随电解质的尾随电解质缓冲液；以及(c)包含前导电解质的前导电解质缓冲液。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质缓冲液包含具有不同的有效迁移率的至少两种电解质的混合物。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述混合物包含(i)具有比核酸更低的有效迁移率量值且比污染物更高的有效迁移率量值的第一电解质，和(ii)具有比所述污染物更低的有效迁移率量值的第二电解质。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一电解质包含己酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二电解质包含HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含样品缓冲液，其中所述样品缓冲液包含任意组合的前导电解质缓冲液、尾随电解质缓冲液或尿素。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含含有尿素和硫脲的样品缓冲液。
本公开内容的一方面提供了一种用于样品纯化的方法，该方法包括：(a)将以下物质装载到流体设备中：(i)包含核酸和污染物的组织样品，其中所述组织样品不是未裂解的全血样品，(ii)尾随电解质缓冲液，其包含具有有效迁移率的尾随电解质离子，所述有效迁移率的量值大于所述污染物的有效迁移率的量值且低于所述核酸的有效迁移率的量值，和(iii)前导电解质缓冲液，其包含具有第二有效迁移率的前导电解质离子，其中所述第二有效迁移率的量值大于所述核酸的所述有效迁移率的所述量值；以及(b)在所述流体设备内施加电场以用所述尾随电解质离子、所述核酸和所述前导电解质离子进行等速电泳，从而从所述组织样品中的所述污染物中纯化所述核酸。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品不是全血样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质离子包含己酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述前导电解质离子包含氯化物。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质缓冲液包含具有与所述第一尾随电解质离子不同的有效迁移率的第二尾随电解质离子。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二尾随电解质离子包含HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二尾随电解质离子包含MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二尾随电解质离子包含HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)，并且第一尾随电解质离子包含己酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二尾随电解质离子包含MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)，并且第一尾随电解质离子包含己酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二尾随电解质离子包含HEPES，并且第一尾随电解质离子包含MOPS。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质缓冲液包含具有第二有效迁移率的第二尾随电解质离子，其中所述第二有效迁移率的量值与所述污染物的所述有效迁移率的所述量值大致相同或低于所述污染物的所述有效迁移率的所述量值。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述污染物选自交联核酸、包埋材料、固定化学品、蛋白质、抑制剂及其组合。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述污染物包含交联核酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，在所述装载之前将所述组织样品与所述尾随电解质缓冲液合并。在本文提供的各方面的一些实施方式中，在所述装载之前将所述组织样品与所述前导电解质缓冲液合并。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述前导电解质缓冲液的所述装载在所述组织样品的所述装载之前进行。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括从所述流体设备的出口储器洗脱包含所述纯化的核酸的输出溶液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述输出溶液中的所述纯化的核酸的浓度比所述组织样品中的所述核酸的浓度高至少约两倍。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述输出溶液中的所述交联核酸的浓度比所述组织样品中的所述交联核酸的浓度低至少约二分之一。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述输出溶液不包含所述污染物。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品为新鲜组织。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品为新鲜冷冻(FF)组织。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品为福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括在所述装载之前，裂解或破坏所述组织样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述裂解或破坏使用尿素或硫脲进行。
本公开内容的一方面提供了一种用于样品纯化的方法，该方法包括：(a)将以下物质装载到流体设备上的第一通道中：(i)包含第一核酸和第一污染物的第一组织样品，(ii)包含第一尾随离子的第一尾随电解质缓冲液，其中所述第一尾随离子的有效迁移率的量值小于所述第一核酸的有效迁移率的量值，和(iii)包含第一前导离子的第一前导电解质缓冲液，其中所述第一前导离子的有效迁移率的量值大于所述第一核酸的所述有效迁移率的所述量值；(b)将以下物质装载到所述流体设备上的第二通道中：(iv)包含第二核酸和第二污染物的第二组织样品，(v)包含第二尾随离子的第二尾随电解质缓冲液，其中所述第二尾随离子的量值小于所述第二核酸的有效迁移率的量值，和(vi)包含第二前导离子的第二前导电解质缓冲液，其中所述第二前导离子的有效迁移率的量值大于所述第二核酸的所述有效迁移率的所述量值；以及(c)在所述流体设备内施加电场以在所述第一通道中利用所述第一尾随离子、所述第一核酸和所述第一前导离子进行等速电泳，并且在所述第二通道中利用所述第二尾随离子、所述第二核酸和所述第二前导离子进行等速电泳，从而从所述第一污染物中纯化所述第一核酸以及从所述第二污染物中纯化所述第二核酸。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一尾随电解质缓冲液或所述第一前导电解质缓冲液进一步包含裂解剂或组织破坏剂。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二尾随电解质缓冲液或所述第二前导电解质缓冲液进一步包含裂解剂或组织破坏剂。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述裂解剂或所述组织破坏剂包含选自pH大于约12的溶液、蛋白酶、尿素、硫脲和表面活性剂的一种或多种试剂。
本公开内容的一方面提供了一种用于样品纯化的方法，该方法包括：(a)将以下物质装载到流体设备的第一区中：(i)包含核酸和污染物的组织样品，(ii)包含尾随离子的尾随电解质缓冲液，其中所述尾随离子的有效迁移率的量值低于所述核酸的有效迁移率的量值，和(iii)包含前导离子的前导电解质缓冲液，其中所述前导离子的有效迁移率的量值大于所述核酸的所述有效迁移率的所述量值；以及(b)在所述流体设备上施加电场以在所述流体设备的第二区中利用所述尾随离子、所述核酸和所述前导离子进行等速电泳，从而从所述污染物中纯化所述核酸，其中在所述施加过程中，使所述第一区保持在第一温度，并且使所述第二区保持在与所述第一温度不同的第二温度。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质缓冲液或所述前导电解质缓冲液进一步包含裂解剂或组织破坏剂。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述裂解剂或所述组织破坏剂包含选自pH大于约12的溶液、蛋白酶、尿素、硫脲和表面活性剂的一种或多种试剂。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一温度为约4℃至约40℃。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一温度为约40℃至约80℃。
本公开内容的一方面提供了一种用于样品纯化的方法，该方法包括：(a)将以下物质装载到流体设备的第一区中：(i)包含核酸的组织样品，(ii)包含尾随离子的尾随电解质缓冲液，其中所述尾随离子的有效迁移率的量值低于所述核酸的有效迁移率的量值，和(iii)包含前导离子的前导电解质缓冲液，其中所述前导离子的有效迁移率的量值大于所述核酸的所述有效迁移率的所述量值；(b)在所述第一区中，对所述组织样品进行选自下组的至少一种样品制备：(1)去除包埋材料，(2)破坏组织，(3)裂解细胞，(4)使核酸解交联，(5)消化蛋白质，和(6)消化核酸；以及(c)在所述流体设备内施加电场以在所述流体设备的第二区中利用所述尾随离子、所述核酸和所述前导离子进行等速电泳，从而从所述组织样品中的污染物中纯化所述核酸。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述去除包埋材料或所述裂解细胞包括，在所述施加所述电场之前将所述组织样品在所述流体设备中在至少约37℃的温度下温育至少约1分钟的持续时间。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述温度为约40℃至约80℃。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述持续时间为约1分钟至约60分钟。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述破坏组织或所述裂解细胞包括向所述样品施加机械应力。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述破坏组织或所述裂解细胞包括向所述样品施加热量。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述施加热量导致所述组织样品的温度为约30℃至约65℃。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述破坏组织或所述裂解细胞包括pH为至少12的溶液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述破坏组织或所述裂解细胞包括蛋白水解消化。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述蛋白水解消化在大于约25℃的温度下进行。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述温度为约30℃至约65℃。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述破坏组织或所述裂解细胞包括向所述组织或所述细胞施加至少一种表面活性剂。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述破坏组织或所述裂解细胞包括向所述组织或所述细胞施加包含尿素的溶液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述溶液进一步包含硫脲。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述溶液中所述尿素的浓度为约4M至约9M，并且所述溶液中所述硫脲的浓度为约0.5M至约3.5M。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述溶液中所述尿素的浓度为约6.5M至约7.5M，并且所述溶液中所述硫脲的浓度为约1.5M至约2.5M。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述使核酸解交联包括用蛋白酶K消化交联蛋白。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述消化核酸用DNA酶或RNA酶进行。
本公开内容的一方面提供了一种用于样品纯化的方法，该方法包括：(a)将以下物质装载到流体设备上：(i)包含核酸的组织样品，其中所述组织样品被包埋或固定，(ii)包含尾随电解质的尾随电解质缓冲液，其中所述尾随电解质具有比所述核酸更低的有效迁移率，和(iii)包含前导电解质的前导电解质缓冲液，其中所述前导电解质具有比所述核酸更高的有效迁移率；以及(b)在所述流体设备上施加电场以利用所述尾随电解质、所述核酸和所述前导电解质进行等速电泳，从而从所述组织样品中的污染物中纯化所述核酸。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述污染物选自交联核酸、包埋材料、固定化学品、酶和抑制剂。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述包埋材料包含石蜡。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品是福尔马林固定的。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品被包埋且固定。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品为福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品为解剖的组织样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述解剖的组织样品为解剖的FFPE样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述核酸的特征与来自其他样品的核酸进行比较的步骤。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述特征为表达水平。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述特征为核酸序列。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述特征为分子量。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述特征为核酸完整性。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述特征为核酸纯度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括基于所述核酸的所述特征施用药物的步骤。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品为肿瘤样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质缓冲液具有约7的pH。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质缓冲液具有大于约7的pH。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括，在所述施加所述电场之前，将所述组织样品在所述流体设备中在至少约37℃的温度下温育至少约1分钟的持续时间。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述温度为约40℃至约80℃。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述持续时间为约1分钟至约60分钟。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述前导电解质缓冲液包含蛋白酶K。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括使用所述蛋白酶K从所述核酸中去除蛋白质交联物。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括在所述施加所述电场之后，利用加热从所述核酸中去除蛋白质交联物。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括从所述流体设备的出口储器洗脱包含所述纯化的核酸的输出溶液。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述输出溶液中的所述纯化的核酸的浓度比所述组织样品中的所述核酸的浓度高至少约两倍。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述输出溶液中的所述交联核酸的浓度比所述组织样品中的所述交联核酸的浓度低至少约二分之一。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述输出溶液不包含所述污染物。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述输出溶液具有等于或小于约50μL的体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品具有至少约1ng的质量。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品具有小于约500μL的体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质具有比所述污染物更高的有效迁移率。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质包含(i)第一离子，其中所述第一离子具有比所述污染物更高的有效迁移率量值，和(ii)第二离子，其中所述第二离子具有与所述污染物大致相同或低于所述污染物的有效迁移率量值。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述进行等速电泳将所述组织样品的pH猝灭至约7。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括，在所述装载之前，对所述组织样品进行脱蜡。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述组织样品为历史性福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品，所述方法进一步包括将所述核酸的特征与来自不同组织样品的不同核酸的特征进行比较。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括检测所述核酸的浓度的步骤。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述浓度小于或等于约1皮克/微升(pg/μL)。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述浓度小于或等于约0.5pg/μL。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述浓度为至少约1皮克/微升(pg/μL)。
本公开内容的一方面提供了一种流体设备，该流体设备包括：样品纯化区域，其包含：(a)第一区；(b)位于所述第一区的样品入口；(c)与所述第一区流体连通的尾随电解质储器；(d)与所述第一区流体连通的第二区；(e)与所述第二区流体连通的前导电解质储器；(f)与所述第二区流体连通的样品出口；(g)与所述第一区热连通的第一加热器；以及(h)被配置为将热量传递至所述第二区的第二加热器，其中所述第一区与所述第二区基本上热隔离。
本公开内容的一方面提供了一种流体设备，该流体设备包括：样品纯化区域，其包含：(a)第一区；(b)位于所述第一区的样品入口；(c)与所述第一区流体连通的尾随电解质储器；(d)与所述第一区流体连通的第二区；(e)与所述第二区流体连通的前导电解质储器；(f)与所述第二区流体连通的样品出口；以及(g)与所述第一区和所述第二区热连通的加热器。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述设备进一步包括第二样品纯化区域。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一区为脱蜡区。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一区为破坏区。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二区为等速电泳区。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一区或所述第二区具有小于约1mm的宽度。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一区或所述第二区具有小于约0.5mm的宽度。
本公开内容的一方面提供了一种试剂盒，该试剂盒包含本文提供的设备、包含尾随电解质的尾随电解质缓冲液和包含前导电解质的前导电解质缓冲液。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述尾随电解质缓冲液包含具有不同的有效迁移率的至少两种电解质的混合物。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述混合物包含(i)具有比核酸更低的有效迁移率量值且比污染物更高的有效迁移率量值的第一电解质，和(ii)具有比所述污染物更低的有效迁移率量值的第二电解质。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述污染物包含交联核酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一电解质包含己酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二电解质包含HEPES。
本公开内容的一方面提供了一种用于样品纯化的方法，该方法包括：(a)将以下物质装载到流体设备中：(i)包含核酸的组织样品，(ii)尾随电解质缓冲液，所述尾随电解质缓冲液包含具有第一有效迁移率的尾随电解质离子，其中所述第一有效迁移率的量值低于所述核酸的有效迁移率的量值，(iii)在第一前导电解质储器中的第一前导电解质缓冲液，所述第一前导电解质缓冲液包含具有第二有效迁移率的第一前导电解质离子，其中所述第二有效迁移率的量值大于所述核酸的所述有效迁移率的所述量值，和(iv)在第二前导电解质储器中的第二前导电解质缓冲液，所述第二前导电解质缓冲液包含具有第三有效迁移率的第二前导电解质离子，其中所述第三有效迁移率的量值大于所述核酸的所述有效迁移率的所述量值，其中所述第一前导电解质缓冲液与所述第二前导电解质缓冲液不同；(b)采用所述尾随电解质离子、所述核酸和所述第一前导电解质离子第一次进行等速电泳，从而从所述组织样品中的所述污染物中纯化所述核酸；以及(c)采用所述尾随电解质离子、所述核酸和所述第二前导电解质离子第二次进行等速电泳。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二次进行等速电泳包括将施加的电流从第一通道改变为第二通道。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质离子与所述第二前导电解质离子相同，并且其中所述第一前导电解质缓冲液中的所述第一前导电解质离子的浓度与所述第二前导电解质缓冲液中的所述第二前导电解质离子的浓度不同。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质缓冲液中的所述第一前导电解质离子的所述浓度与所述第二前导电解质缓冲液中的所述第二前导电解质离子的所述浓度相差至少1.5倍。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质离子与所述第二前导电解质离子不同。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质离子与所述第二前导电解质离子相同，并且其中所述第一前导电解质缓冲液中的所述第一前导电解质离子的浓度与所述第二前导电解质缓冲液中的所述第二前导电解质离子的浓度相同，并且其中所述第一前导电解质缓冲液包含第三前导电解质离子。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质离子与所述第二前导电解质离子相同，并且其中所述第一前导电解质缓冲液中的所述第一前导电解质离子的浓度与所述第二前导电解质缓冲液中的所述第二前导电解质离子的浓度相同，并且其中所述第二前导电解质缓冲液包含第三前导电解质离子。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括在所述第二前导电解质储器中收集所述核酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述方法进一步包括从所述第二前导电解质储器中去除所述核酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，将所述尾随电解质缓冲液装载到尾随电解质储器中，所述尾随电解质储器与所述第一前导电解质储器和所述第二前导电解质储器分隔开。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一次进行等速电泳和所述第二次进行等速电泳通过施加一个电场来进行。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一次进行等速电泳和所述第二次进行等速电泳通过施加多于一个电场来进行。
本公开内容的一方面提供了一种流体设备，该流体设备包括：样品纯化区域，其包含：(a)包含第一区和与所述第一区流体连通的第二区的通道；(b)样品入口、包含尾随电解质缓冲液的尾随电解质储器和包含第一前导电解质缓冲液的第一前导电解质储器，每个均与所述第一区流体连通；以及(c)包含第二前导电解质缓冲液的第二前导电解质储器，其中所述第二前导电解质缓冲液与所述第二区流体连通，并且其中所述第二前导电解质缓冲液与所述第一前导电解质缓冲液不同。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品入口能够接收包含至少一些非液体生物材料的样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第二前导电解质缓冲液包含与所述第一前导电解质缓冲液不同的前导电解质共离子。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质缓冲液包含第一前导电解质离子，并且所述第二前导电解质缓冲液包含与所述第一前导电解质离子相同的第二前导电解质离子，并且其中所述第一前导电解质缓冲液中的所述第一前导电解质离子的浓度与所述第二前导电解质缓冲液中的所述第二前导电解质离子的浓度不同。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质缓冲液包含第一前导电解质离子，并且所述第二前导电解质缓冲液包含第二前导电解质离子，并且其中所述第一前导电解质缓冲液中的所述第一前导电解质离子的所述浓度与所述第二前导电解质缓冲液中的所述第二前导电解质离子的所述浓度相差至少1.5倍。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质缓冲液包含第一前导电解质离子，并且所述第二前导电解质缓冲液包含与所述第一前导电解质离子不同的第二前导电解质离子。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质缓冲液包含第一前导电解质离子，并且所述第二前导电解质缓冲液包含与所述第一前导电解质离子相同的第二前导电解质离子，并且其中所述第一前导电解质缓冲液中的所述第一前导电解质离子的浓度与所述第二前导电解质缓冲液中的所述第二前导电解质离子的浓度相同，并且其中所述第一前导电解质缓冲液包含第三前导电解质离子。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述第一前导电解质缓冲液包含第一前导电解质离子，并且所述第二前导电解质缓冲液包含与所述第一前导电解质离子相同的第二前导电解质离子，并且其中所述第一前导电解质缓冲液中的所述第一前导电解质离子的浓度与所述第二前导电解质缓冲液中的所述第二前导电解质离子的浓度相同，并且其中所述第二前导电解质缓冲液包含第三前导电解质离子。
本公开内容的一方面提供了一种方法，该方法包括：(a)提供包含与通道流体连通的储器的电动流体设备；(b)将样品体积装载到所述储器中；(c)将至少50％的所述样品体积从所述储器移动至所述通道；以及(d)通过所述通道施加离子电流。
在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述移动借助于重力进行。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述离子电流基本不通过所述储器。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述至少50％的所述样品体积包括至少80％的所述样品体积。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品体积包含核酸。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品体积包含组织样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述样品体积包含福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。在本文提供的各方面的一些实施方式中，所述施加离子电流包括进行等速电泳(ITP)。
援引并入
本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其全文并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方式加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：
图1A示出了用于样品处理和核酸提取或纯化的示例性方案。
图1B示出了用于使样品处理和核酸提取或纯化自动化的示例性方案。
图2A示出了从污染物中等速电泳分离和纯化DNA和RNA的示例性示意图。
图2B示出了与蛋白酶介导的组织破坏和核酸的解交联同时从石蜡和其他可能的样品污染物中等速电泳分离和纯化核酸的示例性示意图。
图3示出了与典型的固相柱提取试剂盒的示例性结果相比，通过在流体设备中使等速电泳自动化而进行DNA提取和纯化的示例性结果。
图4A示出了使用等速电泳的以样品浓度比例混合的富含GC和富含AT的合成DNA寡核苷酸的无偏差(例如，相对于序列)提取的示例性结果。
图4B示出了使用等速电泳的DNA分子量梯纯化前和纯化后无偏差(例如，相对于大小或分子量)的示例性结果；示出了与两种基于固相柱的核酸纯化方法的比较。
图5A示出了具有样品制备区和等速电泳纯化区的通道的示例性示意图。
图5B示出了示例性流体设备盒，其包含八个平行的流体通道和储器以用于同时处理最多八个样品(如图5A所示)。
图5C示出了用于如图5B所示的流体设备盒的一个通道及其连接的储器的示例性俯视示意图，进一步例示了使用气体端口将外部压力或真空施加到流体设备盒内的通道。
图5D示出了如图5B所示的流体设备盒的示例性侧视示意图。
图5E示出了如图5B所示的流体设备盒的示例性端视示意图。
图6A示出了流体设备盒的示例性俯视示意图。
图6B示出了流体设备盒的示例性侧视示意图。
图6C示出了流体设备盒的示例性仰视示意图。
图6D示出了流体设备盒的示例性三维俯视全视示意图。
图7A示出了流体设备盒的示例性俯视示意图。
图7B示出了流体设备盒的示例性侧视示意图。
图7C示出了流体设备盒的示例性仰视示意图。
图7D示出了流体设备盒的示例性三维仰视全视示意图。
图8A示出了流体设备盒的示例性俯视示意图。
图8B示出了流体设备盒的示例性侧视示意图。
图8C示出了流体设备盒的示例性仰视示意图。
图8D示出了流体设备盒的示例性三维仰视全视示意图。
图9A示出了如图5B所示的包含八个平行通道的流体设备盒的示例性示意图。
图9B示出了两个热控制器的示例性示意图，每个热控制器与如图9A所示的八个平行通道的区域对准。
图10A示出了示例性气体通道，其可包含毛细管屏障。
图10B是图10A的气体通道的放大示意图。
图11示出了示例性的低损耗样品储器。
图12A示出了示例性机械构件，其可用于施加压力以闭合流体设备的通道。
图12B示出了示例性梳状机械构件。
图12C示出了梳状机械构件和流体设备的通道的对准。
图13A示出了用于在流体设备盒上进行自动化样品制备和等速电泳的示例性台式设备。
图13B示出了被编程或以其他方式被配置为实现本文提供的方法的示例性计算机控制系统。
图14示出了使用等速电泳对滴定系列核酸进行基于荧光的测量和定量的示例性结果。
图15示出了具有连接的储器、非接触式电极(可用作电导率传感器)和用于将流体自动化装载到通道/设备和使等速电泳自动化的气体端口的流体通道的示例性设计的示意图。
图16示出了在运行期间在ITP通道中电压测量值随时间的图。
图17示出了两个来自图16的电压测量值的导数分析的图。
图18示出了在洗脱储器附近的ITP通道中电导率测量值随时间的示例。
图19示出了C4D传感器实施的示例性示意图。
图20A示出了使用热成像相机拍摄的ITP通道的示例性温度图。
图20B示出了在图20A的光标1的位置处温度随时间的图。
图21示出了ITP运行期间温度测量值和温度导数随时间的图。
图22A示出了垂直(或柱)ITP设置的示例性示意图。
图22B示出了具有DNA ITP带的垂直ITP设置的示例性图像。
图23示出了使用等速电泳从FFPE样品的交联DNA中提取和分离可扩增(例如，解交联的)DNA的示例性图像和相应的荧光强度迹线。
图24A示出了使用等速电泳从FFPE样品中进行DNA提取和纯化的示例性图像。
图24B示出了与来自典型固相柱提取试剂盒的示例性结果相比，通过对使用等速电泳从FFPE样品中提取和纯化的DNA进行定量PCR所测量的示例性DNA产量。
图25A示出了装载有用染料染色的核酸(来自人体细胞的RNA提取和消化)以用于可视化的单通道ITP芯片的图像。
图25B示出了装载有用染料染色的核酸(来自人体细胞的RNA提取和消化)以用于可视化的单通道ITP芯片的图像。
图26A示出了纯化过程中芯片通道中RNA ITP带的图像。
图26B示出了纯化过程中芯片通道中总核酸ITP带的图像。
图26C示出了图26A所示的样品的RNA质量电泳图的图。
图26D示出了图26B所示的样品的RNA质量电泳图的图。
图27A示出了与小鼠全血的柱(菱形，Qiagen QiaAmp)提取相比作为起始样品中全血体积百分比的函数的ITP(方形)的DNA产量(ng)的结果。
图27B示出了在芯片上裂解的小鼠全血的ITP纯化过程中ITP带中的总核酸的图像。
图27C和图27D示出了ITP芯片通道的白光和荧光覆盖图像，其显示了在ITP纯化50％体积的全血裂解物之前和之后，样品/前导电解质通道中的血红素与洗脱通道和储器的物理分离。用绿色染料对核酸进行染色以在洗脱孔中可视化。图27C示出了ITP之前的芯片(装载在芯片中的血液裂解物和ITP缓冲液；洗脱孔中仅缓冲液)。图27D示出了ITP后的芯片(装载在芯片中的血液裂解物和ITP缓冲液；洗脱孔中纯化的DNA)。
图27E示出了ITP纯化(50％体积的血液)后的芯片。
图27F示出了ITP纯化(25％体积的血液)后的芯片。
图28示出了与固相提取相比，ITP的高分子量DNA纯化的结果。
图29A示出了包含8个闭合的通道的流体设备。
图29B示出了与每个通道的洗脱储器邻近的第二通道闭合位置的放大的微观视图。
图29C示出了作为施加到流体设备的力的函数的计算的闭合百分比。
图29D示出了通道闭合的电导率测量值结果。
图30示出了ITP运行过程中电压测量值和电压导数随时间的图。
图31A示出了在设备的样品通道区域中的8个样品中的每一个中具有聚焦的DNA的ITP带的显微照片。
图31B示出了8个通道中的每一个通道随时间在固定电流下的独立电压信号数据。
图31C示出了具有在洗脱储器中洗脱的样品的聚焦DNA的相同的8个ITP带的显微照片。
图31D是用于图31B中所示的触发的电压跟踪(监视)的放大部分。
图32A示出了用于从培养的哺乳动物细胞制备样品和用于DNA纯化的ITP的示例性方法。
图32B示出了用于从组织样品制备样品和用于DNA纯化的ITP的示例性方法。
图33示出了用于自动化ITP的示例性处理工作流程。
图34示出了被配置用于检测和防止ITP期间的电流泄漏的回路。
图35A-图35B示出了包括两个互锁部分的示例性流体设备。
图36A-图36B示出了包括多个部分的流体设备的示例。
图37A-图37B示出了包括三个部分的流体设备的示例。
图38示出了用于三部分流体设备的芯片底侧上的8个平行通道的示例性通道示意图。
图39示出了示例性的多部分流体设备。
图40示出了包括电压和温度感测的示例性流体回路。
图41A-图41B示出了示例性的“悬崖毛细管屏障”。
图42A-图42B示出了示例性的“平台毛细管屏障”。
图43示出了示例性通道或流体回路，其突出了装载后的初始流体界面位置。
图44示出了示例性通道或流体回路，其突出了装载后的最终流体界面位置。
图45A示出了芯片的流体层的示例。
图45B示出了气动端口的剖面图。
图45C示出了本设计的实现。
图46A示出了示例性微流体通道，其中可以检测到空的样品通道。
图46B示出了用于检测该通道是空的还是已填充的事件的顺序。
图46C示出了来自该技术的实现的压力迹线和控制信号迹线。
图47A-图47B示出了用于分阶段的液体装载的示例性气动控制方案。
图48A-图48H示出了被设计用于直接注入的示例性样品入口储器。
图49A和图49B示出了示例性的低分散洗脱通道。
图50A1示出了具有终止于通孔中的通道的基底的流体表面，该通孔与基底的相对的储器表面上储器连通。
图50A-图50B示出了芯片设备上的示例性洗脱储器的技术图。
图50C-图50E是图50A中的设计的不同洗脱步骤中流体设备的背景减除荧光图像。
图50F是表示洗脱工作流程中各步骤的框图。
图51A示出了可以用于核酸洗脱的示例性流体储器。
图51B示出了储器的第二实施方式，其具有为了注塑成型兼容性的进一步变化。
图51C和图51D示出了该储器设计的第三实施方式的两个视图。
图51E示出了在所公开的设计和参考设计之间核酸的停留时间的比较。
图51F示出了参考设计的横截面。其为没有任何内部结构的牵伸立式圆柱。
图52A-图52D示出了由椭圆形通孔组成的流体储器，其尺寸被设计成使得移液管端头可以容易地定位，以从所述设备可靠地回收流体。
图53A-图53C示出了另一示例性流体储器。
图53D示出了示例性洗脱储器的俯视图。图53E示出了图53D的洗脱储器的截面图。
图54A示出了示例性机械构件，其可用于施加压力以闭合流体设备的通道。
图54B示出了示例性的脊状机械构件。
图54C示出了脊状机械构件与流体设备通道的对准。
图54D示出了耦合至脊状结构以闭合通道的机械致动器的分解组件装配图。
图55描绘了β原型和生产仪器的气动控制框图。
图56A-图56B、图57和图58A-图58C示出了在不使用热或压力引起的流体设的备塑性变形的情况下，用于闭合通道的替代机构。
图59A-图59C示出了用于在流体设备盒上执行自动化等速电泳和/或样品制备的示例性台式设备。
图60示出了可以显示给用户以指示和指导用户完成储器装载过程的示例性图像。
图61示出了可以促进微流体芯片与仪器的接合的气动歧管。
图62示出了仪器中芯片的横截面。
图63描绘了垂直歧管运动机构，其包括用于对准和自动缩回运动的机械组装件设计。
图64示出了水平歧管运动机构的设计，其包括用于使用齿条和小齿轮进行水平运动的机械组装件设计。
图65描绘了具有热电冷却器设计的热管，用于将远离热电冷却器的位置的区域保持在规定温度。
图66示出了用于在流体设备盒上进行自动化等速电泳和/或样品制备的另一示例性台式设备。
图67示出了各种核酸结合染料对核酸质量的峰面积响应图。
图68示出了各种核酸结合染料对核酸质量的峰宽响应图。
图69A-图69C描绘了
Figure GDA0003654970080000601
与PCR的不兼容性。
图70描绘了PicoGreen与Qubit dsDNA测定的兼容性。
图71描绘了Syto13与Qubit dsDNA测定的兼容性。
图72A-图72B描绘了PicoGreen与PCR的兼容性。
图73A-图73C描绘了Syto13与PCR的兼容性。gDNA在存在和不存在Syto13的情况下使用等速电泳纯化。
图74描绘了PicoGreen与基于扩增子的测序文库制备的兼容性。
图75示出了Syto13与基于扩增子的测序文库制备的兼容性。
图76A-图76B描述了PicoGreen与全基因组测序文库制备的不兼容性。
图77A-图77B描绘了Syto13与下一代测序文库制备的兼容性。
图78示出了PicoGreen与全基因组测序文库制备的不兼容性。
图79描绘了Syto13与下一代测序文库制备的兼容性。
图80A-图80D描述了Syto13与全外显子组下一代测序文库制备的兼容性。
图81示出了描述光信号处理算法的框图。
图82示出了用于照明和检测与染料结合的样品的荧光的机械光学组装件设计的图。
图83示出了实现样品结合染料荧光的激发和来自样品结合染料荧光的发射光的捕获的光路。
图84A-图84F示出了用于可以如何验证由通道中的电极创建的电路的控制方案。
图85示出了通道闭合器——带有机械致动器的齿状构件。
图86示出了通道中染色的分析物材料的反差图像。
图87A示出了通过使用电导率仪测量洗脱材料的电导率所获得的电导率数据。
图87B示出了通道中染色的分析物材料的反差图像。
图88A示出了在运行期间由IR传感器捕获的温度信号的典型迹线。
图88B示出了图88A中的温度数据的一阶导数值。
图88C示出了数据减去拟合(0016)和数据减去零假设(0015)的残差的比较，以产生似然比。
图88D示出了触发过程的框图。
图88E示出了核酸提取过程的成功触发。
图88F示出了失败的触发运行。
图89A示出了样品(在这种情况下为在前导电解质中制备的样品)和前导电解质缓冲液之间的毛细管屏障。
图89B示出了添加慢离子(3-(N-吗啉代)丙磺酸)和对照的核酸的通过。
图89C展现了在提取过程中稍后的某个时间的核酸形态。
图89D示出了前导电解质缓冲液与洗脱缓冲液之间的毛细管屏障。
图89E示出了调节缓冲液界面的示例。
图89F示出了通过调节界面位置对核酸通过的促进。
图90A-图90C示出了三种不同细胞系的裂解效率。
图91A-图91B示出了使用红外热传感器来触发通道之一中的电流的减小或消除的示例性温度测量结果。
图92A示出了所使用的样品通道到LE通道触发过程的框图。
图92B示出了用于样品通道到LE通道触发的电压、电压导数和测量误差的示例性迹线。
图92C示出了所使用的LE通道触发过程的框图。
图92D示出了用于在LE通道内的毛细管屏障后的变窄处进行触发的电压、电压导数和测量误差的示例性迹线。
图92E示出了所使用的洗脱触发过程的框图。
图92F示出了用于洗脱触发的电压、电压导数和测量误差的示例性迹线。
具体实施方式
概述
样品制备是几乎所有基因组和转录组学分析的第一步骤，并且又可以是分析变异性的主要来源。样品制备也可以是手工密集的，特别是当样品是含有交联蛋白的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品时。
本公开内容提供了用于提高组织和细胞样品的核酸提取和纯化效率的方法和设备，该组织和细胞样品包括以某种方式处理的样品，诸如石蜡包埋样品或化学固定样品(例如，FFPE样品、含有实体组织的样品)。本文提供的方法包括在使用掺入前导电解质离子和尾随电解质离子的方法进行等速电泳之前在芯片上或芯片外制备这类处理过的样品的方法。在一些情况下，该方法包括在对样品进行等速电泳之前，在尾随电解质缓冲液或前导电解质缓冲液中处理(例如，通过去除包埋材料、裂解、酶促破坏)固定的实体组织。该方法还可以包括使用较低离子强度的第二前导电解质缓冲液，以产生与下游过程如扩增或其他酶测定相兼容的样品。本文提供的设备和系统包括适用于对源自组织的样品进行等速电泳的设备，包括具有平行处理特征和自动反馈控制机构的微流体设备，该自动反馈控制机构可包括检测样品处理通道内温度变化的热传感器。
本公开内容的方法和设备可提供从样品，特别是从低丰度样品(例如，小于100ng的核酸)、具有相对较大的体积(例如，总体积大于25μl、总体积大于50μl、总体积大于100μl或更多)的样品或含有固体颗粒的液体样品的改善的核酸回收。本文提供的方法和设备还可以提供高重复性，并降低短核酸的偏差。本文提供的设备可将样品制备(例如，去除交联或包埋材料)和核酸提取操作集成在一个设备内。本公开内容的设备和方法还可以提供与过程自动化的兼容性、与下游过程的集成、与在线定量的集成(例如，以单皮克分辨率)和/或与核酸长度和序列分布分析的集成。
本文提供的方法通常是在适于从某些样品，特别是FFPE样品中提取核酸的条件下进行等速电泳的方法。在一些情况下，所公开的方法包括使用含有至少两种具有不同有效迁移率量值的离子的尾随电解质缓冲液进行等速电泳的方法。该方法还可包括使用两种不同的前导电解质缓冲液(其中一种可以用作样品洗脱缓冲液)进行等速电泳的方法。该方法可包括过程自动化和多个样品的平行处理。
本公开内容还包括使用缓冲液和间隔物化学物质的方案。这些缓冲液和间隔物化学物质可包括使用多种种类的电解质来进行ITP。例如，尾随电解质可包含电解质种类的混合物，其能够将非交联核酸与交联核酸分离，同时将非交联核酸或交联和非交联核酸两者与样品内的污染物分离。
本文提供的设备包括注塑流体设备，其具有能够以多路方式进行ITP的平行样品处理通道和具有连接到热设备的两个或更多个区域的ITP设备。本公开内容的技术可采用ITP来同时收集、纯化和聚焦提取的RNA和DNA，以将芯片上提取的总核酸定量(例如，通过在线ITP辅助浓缩成非常小的体积或用插入荧光染料进行标记)，并将核酸向下游递送至与机器人移液相兼容的平行输出储器。
本公开内容的技术可以能够在不将样品材料结合至固体支持物上的情况下纯化样品材料(例如，核酸)。本公开内容的技术可以能够在不使用液相萃取的情况下纯化样品材料(例如，核酸)。这可以能够在不依赖于溶解度差异的情况下进行纯化。
本公开内容的设备的操作可以是自动化的、大部分自动化的或部分自动化的。在一些情况下，本公开内容的方法仅涉及将样品(例如，FFPE部分)分配至溶液(例如，碱性溶液、裂解溶液或包含尿素和/或硫脲的缓冲溶液)中的单个芯片外混合步骤，随后将样品装载到流体设备的储器中以用于进一步进行设备上样品制备(例如，脱蜡、组织破坏和细胞裂解、蛋白酶消化、蛋白水解消化或其他处理，包括蛋白质变性或核酸酶消化)和核酸提取、纯化、富集、在线定量以及按大小分类或分级(例如，大小选择)。在一些情况下，本公开内容的方法包括将样品(例如，FFPE部分或其他组织样品)分配到预先填充有溶液(例如，碱性溶液、裂解溶液或包含尿素和/或硫脲的缓冲溶液)的流体设备(例如，盒)的储器或通道中以用于进行设备上样品制备(例如，脱蜡、组织破坏和细胞裂解、蛋白酶消化或其他处理，包括蛋白质变性或核酸酶消化)和核酸提取、纯化、富集、在线定量以及按大小分类或分级(例如，大小选择)。在一些情况下，本公开内容的方法包括破坏组织和/或裂解芯片外样品的细胞，随后将样品(其可以是均质的，或可以是裂解的实体组织和核酸的非均质混合物)装载到流体设备的储器中以进一步进行设备上样品制备(例如脱蜡、蛋白酶消化或其他处理，包括蛋白质变性或核酸酶消化)和核酸提取、纯化、富集、在线定量以及按大小分类或分级(例如，大小选择)。核酸酶消化可包括去除DNA以进行无DNA的RNA提取或去除RNA以进行无RNA的DNA提取。本文提供的流体设备可以与台式系统一起使用以使从样品中提取DNA和RNA的基于电场的方法自动化。
本公开内容的设备包括可以使芯片上加热(例如，至37℃至80℃的温度)、样品制备(例如，脱蜡、组织破坏和细胞裂解)、缓冲液更换、核酸提取和纯化、非交联或可扩增的核酸的富集(例如，通过将其分离并与交联的核酸分开递送)以及将纯化的核酸递送至输出储器(如与手动或机器人移液相兼容的阵列)自动化和集成的系统。例如，本公开内容包括标准的、机器人自动化兼容的微量滴定板形式的八通道盒以及集成的台式控制器原型，该集成的台式控制器原型可提供对缓冲液和其他流体的装载的自动化控制、向设备施加温度和电场、以及自动化开始和结束运行的样品平行处理。根据需要，将来可以容易地修改该系统，以提供用于较大的诊断或临床实验室(例如，96孔样品格式)的更高通量。
例如，图1A示出了使用本公开内容的技术进行样品处理和核酸提取的示例性过程示意图。可以提供样品(101)并使样品经受任何预处理步骤102，诸如与缓冲液混合、裂解或去除包埋材料(如果存在)。然后可以将样品(和，例如缓冲液)装载到流体设备上(103)。然后可以在流体设备上进行样品制备步骤(104)，诸如去除包埋材料(如果存在并且如果之前没有在预处理过程中进行去除)、组织破坏、细胞裂解、蛋白质或蛋白水解消化和(例如)核酸酶消化。然后可以进行等速电泳(105)以从样品内的污染物(例如细胞碎片、质膜、小分子、包埋材料、交联核酸、固定剂如福尔马林、抑制剂、酶如消化酶或限制酶)中分离和纯化核酸。其他步骤可以与等速电泳同时发生，诸如交联核酸的解交联(例如使用加热或蛋白酶消化)。可在等速电泳期间或之后对核酸进行检测和定量(106)。一旦提取或纯化，则可以洗脱核酸并从设备中回收(107)。
图32A示出了利用本文提供的方法和设备用于从培养的哺乳动物细胞制备样品和用于DNA纯化的ITP的非限制性示例性方法。通常，步骤可以包括分离(步骤151)和细胞洗涤(步骤152)、细胞裂解(步骤153-155)和蛋白质降解(步骤156-157)，以及使裂解物中释放的DNA均质化(步骤158-159)，同时维持适当的离子含量以进行下游ITP。
在步骤151中，培养的哺乳动物细胞可以通过离心(例如，250g x 5min)从活的健康的(例如，>90％活力)对数期细胞培养物中沉淀。在至少一些情况下，例如在使用贴壁或半贴壁细胞时，可以在沉淀之前进行胰酶消化。可以丢弃用过的培养基，然后在新鲜培养基中洗涤细胞，沉淀细胞，将细胞重悬在新鲜培养基中并计数细胞。可以将适当密度的细胞悬液(例如，每道ITP提取道100,000个活细胞)沉积在微量离心管(例如，2ml Eppendorf Lo-Bind微量离心管)中，以进行下游处理(例如，以下步骤152-163)。在一些情况下，如对本领域普通技术人员而言将会显而易见的，可以使用重悬的荧光激活细胞分选术(FACS)来将感兴趣的细胞分离并计数到接受管中，然后可如本文所述制备接受管以进行ITP。
在步骤152中，可以用诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)等缓冲液洗涤细胞。细胞可以通过离心(例如，以250g x 5min)沉淀。然后可以丢弃细胞培养基，并将沉淀重悬于PBS(例如，190uL 1X PBS(无Ca2+或Mg2+))中。可以将重悬的细胞离心以形成沉淀，并且可以从沉淀的细胞去除PBS上清液。
在步骤153中，可以通过在裂解缓冲液中，例如在专有的碱性CCD裂解缓冲液(“L1”)中通过移液重悬(例如，通过使用P1000移液管移液5次)来裂解细胞沉淀。裂解可以备选地或组合地使用本领域普通技术人员将已知的其他裂解技术进行，例如通过超声处理、手动研磨、珠磨、均质化、冷冻、酶消化和/或化学破坏。然后可以将裂解的细胞涡旋混合(例如，3秒)。通常，在步骤153中，裂解缓冲液是高度碱性的。在一些情况下，碱性溶液可以包括在约10-13的pH下的30-120mM NaOH(在一些情况下为40-80mM NaOH)。示例性的碱性溶液可以包括80mM NaOH、11mM DTT和0.5％v/v Igepal CA-630。
在步骤154中，细胞可以在室温下在裂解缓冲液中温育(例如，2min)，以使裂解过程裂解细胞。
在步骤155中，可以停止裂解并且可以中和样品pH。例如，可以将专有的酸性猝灭缓冲液(“猝灭”)施加于裂解的细胞样品。在一些情况下，猝灭缓冲液可以仅含有LE、含有LE和TE或者仅含有TE。在一些情况下，在猝灭缓冲液中包括LE和TE或者仅包括TE可以减少核酸在毛细管屏障处，特别是在样品与LE之间的毛细管屏障处的保留。在一些情况下，不在本文公开的方法中进行步骤155中所述的猝灭(例如，用于高分子量DNA应用)。例如，当裂解溶液处于中性或非碱性pH内时，猝灭可能是不必要的。在这样的情况下，裂解溶液中可以包括LE、LE和TE或者TE。当在裂解步骤期间使用碱性裂解液时(例如，用于培养细胞应用或原代人细胞)，猝灭通常是有用的。
样品可以通过移液(例如，通过上下移液五次)然后涡旋(例如，3秒)来混合。
在步骤156中，可以处理裂解细胞悬浮液，以使细胞裂解物中的蛋白质变性。任选地，RNA(或DNA，如果ITP感兴趣的样品分子是RNA)可以被降解。例如，可以添加蛋白酶K(例如，20mg/mL)和任选的RNA酶A(例如，10mg/mL)。样品可以被涡旋(例如，3秒)以混合然后脉冲旋转(例如，2min)，随后在室温下温育
在步骤157中，样品可以在56℃下温育10min。
在步骤158中，样品可以通过涡旋(例如，3秒)和脉冲旋转来均质化。
在步骤159中，可以随后将样品冷却至室温(例如，5min)。在一些情况下，在样品在LE中制备的情况下，可以在冷却后添加TE以减少或最小化核酸在毛细管屏障处，特别是在样品与LE之间的毛细管屏障处的保留。
在步骤160中，可以任选地将样品表面活性剂(例如，MOPS)添加至样品。
在步骤161中，可以任选地冷冻样品以供日后使用。
在步骤162中，可以将样品温热至20℃。
在步骤163中，可以任选地将核酸染料或染色剂添加至样品裂解物以用于核酸的可视化和检测(例如，用于核酸质量的定量)。例如，当在ITP过程期间进行核酸质量的在线定量时，可以使用添加核酸染色剂，诸如核酸结合或插入染料。
在步骤164中，可以将样品装载至一个或多个样品储器中。在装载之前，样品可以被脉冲涡旋(例如，两次)和脉冲旋转，以搅动和混合样品。ITP通道可以用本文所述的前导电解质缓冲液、尾随电解质缓冲液和/或其他缓冲液预启动(pre-prime)。或者，样品可以与通道中的其余液体同时装载。
在步骤165中，可以执行ITP。在ITP过程期间，当样品内的DNA移动通过通道时，可以纯化(即浓缩)样品内的DNA，直至到达如本文所述的洗脱储器。样品DNA可以如本文所述进行定量。
在步骤166中，洗脱的样品可以通过洗脱(例如，通过移液)从洗脱储器回收。
图32B示出了利用本文提供的方法和设备用于从组织样品(例如，新鲜的或FFPE组织样品)制备样品以及用于DNA纯化的ITP的非限制性示例性方法。通常，这些步骤可以包括从组织修剪过量石蜡(例如，当使用安装在载玻片的FFPE组织切片时)(步骤171)、组织裂解(步骤172-175)和蛋白质降解(步骤176-177)，以及裂解物中释放的DNA的反向交联(步骤178-179)，同时维持适当的离子含量以进行下游ITP。
在步骤171中，可以任选地从FFPE组织样品修剪或去除过量的石蜡(例如，在进一步的样品制备步骤之前)。FFPE组织样品可以直接从石蜡块或安装在载玻片的切片获取。
在步骤172中，可以将组织收集在微量离心管(例如，Eppendorf Lo-Bind微量离心管)中。收集可以任选地包括将FFPE组织样品从载玻片刮下，或者以其他方式将新鲜的或FFPE组织样品置于管中。
在步骤173中，可以通过在裂解缓冲液中，例如在专有的碱性CCD裂解缓冲液(“L1”)中通过移液重悬(例如，通过使用P1000移液管移液5次)来裂解组织。裂解可以备选地或组合地使用本领域普通技术人员将已知的其他裂解技术进行，例如通过超声处理、手动研磨、珠磨、均质化、冷冻、酶消化和/或化学破坏。然后可以将裂解的组织涡旋混合(例如，5秒)。通常，在步骤173中，裂解缓冲液是高度碱性的。在一些情况下，碱性溶液可以包括在约10-13的pH下的30-120mM NaOH(在一些情况下为40-80mM NaOH)。示例性的碱性溶液可以包括80mM NaOH、11mM DTT和0.5％v/v Igepal CA-630。
在步骤174中，组织可以在裂解缓冲液中于80℃下温育(例如，3min)，以允许裂解过程裂解组织。然后样品可以通过移液(例如，通过上下移液五次)混合然后涡旋(例如，3秒)。
在步骤175中，裂解的组织可以在室温下温育(例如，3min)以冷却。
在步骤176中，可以处理裂解的组织悬浮液，以使组织裂解物中的蛋白质变性。任选地，RNA(或DNA，如果ITP感兴趣的样品分子是DNA)可以降解。例如，可以添加蛋白酶K(例如，20mg/mL)。
在步骤177中，样品可以在56℃下温育1小时。样品在温育后可以涡旋并脉冲旋转。
在步骤178中，样品可以在90℃下温育1小时。
在步骤179中，样品可以随后冷却至室温(例如，5min)。
在步骤180中，可以任选地添加RNA酶A(例如，10mg/mL)。
在步骤181中，样品可以在25℃下温育5min。样品在温育后可以涡旋并脉冲旋转。
在步骤182中，可以任选地将样品润滑剂(例如，MOPS)添加至样品。
在步骤183中，可以任选地将样品冷冻以供日后使用。
在步骤184中，可以将样品温热至20℃。
在步骤185中，可以任选地将核酸染料或染色剂添加至样品裂解物以用于核酸的可视化和检测(例如，用于核酸质量的定量)。例如，当在ITP过程期间进行核酸质量的在线定量时，可以使用添加核酸染色剂，诸如核酸结合或插入染料。
在步骤186中，可以将样品装载至一个或多个样品储器中。在装载之前，样品可以被脉冲涡旋(例如，两次)和脉冲旋转，以搅动和混合样品。ITP通道可以用本文所述的前导电解质缓冲液、尾随电解质缓冲液和/或其他缓冲液预启动。或者，样品可以与通道中的其余液体同时装载。
在步骤187中，可以执行ITP。在ITP过程期间，当样品内的DNA移动通过通道时，可以纯化(即浓缩)样品内的DNA，直至到达如本文所述的洗脱储器。样品DNA可以如本文所述进行定量。
同样在步骤187中，洗脱的样品可以通过洗脱(例如，通过移液)从洗脱储器回收。
图1B示出了用于自动化ITP的示例性处理工作流程。在步骤110中，可以选择方案，诸如通过使用台式设备上的图形用户界面。该用户界面软件可以实现易用性或免手动操作。例如，用户可以从菜单(例如，下拉菜单)中进行选择。或者，该设备可以扫描与样品或流体设备芯片相关联的条形码(例如，光学条形码、RFID芯片)，该条形码可以指示要进行的方案。在步骤111中，可以打开仪器盖(例如，手动或通过马达自动打开)。电动盖开口可与机器人实验室自动化相兼容。在步骤112中，用户可以将芯片(例如，流体设备)装载到台式仪器上。该芯片可包含用于自动化ITP的单片、多通道SLAS标准微量滴定板(MTP)足迹。在步骤113中，可以将ITP液体装载到芯片孔中。用于ITP流体和用户样品的储器可以被设计成易于装载，诸如通过多通道移液器(例如，9mm间距SLAS标准微量滴定板形式)。将储器连接到ITP通道的通道的几何设计(例如，毛细管屏障)可以在操作之前抵抗液体进入通道的重力驱动流或润湿。这些结构可阻止ITP通道内限定位置(包括建立前导电解质/尾随电解质界面)的流体以及实现无气泡装载。在一些情况下，在操作之前，可以施加气动致动来启动(prime)通道。可以选择芯片材料以防止或抵抗流体润湿或芯吸到通道中(例如，具有疏水性质或高接触角的塑料)。用户可以将ITP试剂和缓冲液装载到芯片上(例如，5种不同的流体)；或者，可以为芯片提供预装载的试剂。在步骤114中，用户或设备可以关闭设备盖。可以通过芯片上的气体或空气端口致动样品装载。润湿和/或重力驱动流可用于用液体填充通道，例如在没有主动压力施加的情况下。
在步骤115中，仪器可施加压力以在芯片中装载流体，从而启动通道。在步骤116中，设备可检查通道是否已经被恰当地启动。例如，光学(例如，反射)、电、压力和/或流速传感器可用于检查流体是否已被装载到芯片内的正确位置。传感器和设备软件可实现液体装载的实时监测和控制。可以在将样品装载到芯片上之前进行ITP试剂和缓冲液装载，以便在错误装载的情况下不浪费样品材料。如果通道没有被适当地启动，则设备可进行错误报告(130)。在步骤117中，可以打开设备盖。在步骤118中，可以将样品装载到设备上。样品装载可以由用户手动进行，或者可以以自动方式进行，诸如通过实验室自动化机器人。也可以进行其他样品制备步骤。例如，可以装载石蜡包埋样品(例如，FFPE)，然后该设备可以控制样品储器内的温度以使样品脱蜡。在步骤119中，可以关闭设备盖。在步骤120中，设备可进行自检。例如，来自与芯片上储器接合的设备电极的电反馈可用于对液体的成功启动进行自检(例如，气泡检测)。光学传感器可用于实现对液体启动状态进行反馈(例如，液体是否已到达指定的毛细管屏障)。也可以使用其他传感机制，例如本文所公开的传感机制。如果自检确定设备没有被恰当地启动，则设备可以进行错误报告(131)。
在步骤121中，可以进行基于ITP的纯化。使用如本文所述的传感器(例如，触发)的反馈控制和过程定时可用于控制ITP纯化和/或使ITP纯化自动化。设备可以确定是否成功地进行纯化，如果没有，则设备可以进行错误报告(132)。在步骤122中，设备上的传感器(例如，光学传感器)可以用于定量样品，例如通过荧光、UV或其他光学检测。也可以进行样品大小分类。如果设备确定样品没有被恰当地定量或发现其他问题，则设备可以进行错误报告(133)。在步骤123中，可以检测电导率变化，其可用于指示结束ITP运行(例如，当核酸到达指定的洗脱位置或储器时)的定时。本文所述的其他检测方法(如温度或驱动电压)也可用于确定运行结束定时或其他触发。例如，温度或电压传感器可用于控制施加到设备内的通道的电场，以使ITP过程自动化。作为一个实例，可向通道施加电场以开始ITP纯化。感测到的电压变化可用于触发通道内固定位置处(如在洗脱储器处或附近)的温度或其他感测的开始。电压可以在包含受限核酸的ITP区移动时改变。指示通过通道特征诸如横截面面积减小的截面的ITP区的变化可以由电压传感器感测，并且可使用反馈来改变电场，例如通过减小所施加的电流。当ITP区通过洗脱储器处或附近的温度传感器时可以检测到温度变化，并且可以使用来自传感器的反馈来控制电场，例如通过移除它来结束ITP运行。在步骤124中，设备可以例如基于触发信号来终止运行。当ITP运行终止时，可以在洗脱储器或区域内将核酸定位或分离。在步骤125中，设备可以将通道闭合，这可以固定洗脱体积以维持恒定的洗脱体积(例如，通过在移出洗脱体积过程中抵抗或防止流入洗脱储器或出口储器中)。固定洗脱体积可有助于易用性，并且可以帮助报告洗脱的样品材料的浓度。在步骤126中，可以打开设备盖(例如，由用户打开或自动打开)。
在步骤127中，可以从设备中提取纯化的样品。如本文所讨论的，可以针对给定的洗脱体积设计芯片和/或设备。从设备中取出纯化的材料可以通过移液或以其他方式从芯片中去除材料来进行。或者，可以通过将ITP芯片与另一个流体芯片或系统接合来进行样品提取(例如，在没有洗脱储器的情况下)。然后可以使用其他流体系统对纯化的样品材料进行其他操作，诸如下一代测序(NGS)文库制备、样品分析(如PCR、ddPCR)、其他测序操作或其他下游过程。在步骤128中，设备可以报告关于样品的定量数据，例如样品量和/或样品浓度。该设备可含有用于将测量(例如，荧光信号)转换为样品定量的算法或其他软件，并且可以将该数据报告给用户。在步骤129中，该过程结束。
图33示出了使用本文所述的方法、设备和系统用于自动化ITP的详细的非限制性示例性处理工作流程。
在步骤250中，用户可以打开仪器。
在步骤251中，可以任选地进行仪器初始化。初始化可以包括例如以下检查/步骤中的一个或多个：(a)可以在0psi和-0.1psi下检查压力控制公差；(b)可以确认在负压阀关闭的情况下通道内的可忽略流速；(c)可以观察比例阀值；(d)可以检查HVS温度；(e)可以检查HVS电压轨；(f)可以确认在HVS禁用时无电压；(g)可以检查光学器件温度；(h)可以检查光学器件电压轨；(i)可以确认打开每个LED时的传感器值(pickoff value)增加；(j)可以确认打开每个LED时的检测器值增加；和/或(k)可以确认在室温或近室温下的红外传感器。
在步骤252中，仪器可以任选地向用户显示“开始”或“主页”菜单。
在步骤253中，用户可以选择在仪器显示器上点击“开始新运行”。
在步骤254中，仪器门可以打开。
在步骤255中，用户可以将新的微流体芯片放置在仪器台上。
在步骤256中，可以任选地使用“芯片到位”传感器来检测芯片是否已放置在仪器平台上和/或芯片是否已在台上正确地放置或定向。
在步骤257中，仪器可以任选地读取芯片上的条形码标识符。例如，用户可以使用手持扫描仪。
在步骤258中，仪器可以任选地根据扫描的条形码标识符选择要运行的方案。
在步骤259中，仪器可以任选地检查仪器(例如，加热器)的温度。例如，可以由仪器读取加热/冷却元件的温度。仪器可以读取由任选的热传感器所检测的温度。可以确认仪器的温度范围，例如，通过检查仪器温度和由热传感器所检测的温度相差不大于约5℃。
在步骤260中，仪器可以任选地显示如何将缓冲液(例如，一种或多种尾随电解质缓冲液、一种或多种前导电解质缓冲液、一种或多种洗脱缓冲液等)装载到芯片上的指令。例如，仪器可以向用户显示可视的和/或颜色编码的指令(例如，如图60所示)。
在步骤261中，用户可以将缓冲液移液到芯片上。
在步骤262中，用户可以关闭仪器门，例如通过按压显示器上的按钮。
在步骤263中，仪器可以将一种或多种缓冲液体装载到芯片中。显示器可以任选地向用户提供正在发生装载的指示，例如通过显示“启动进行中”消息。
在步骤264中，仪器可以任选地检查，以确保已经装载了缓冲试剂，并且已经用缓冲液正确地启动了通道。例如，可以通过测试两个高压电极之间的电导率来确认装载，如本文所述。例如，可以从一个电极拉出10μA，并且可以从另一电极灌入10μA。可以测量两个电极之间的电压差，如本文所述。通道的启动可以在确认缓冲液装载之前、期间或之后确认。例如，可以通过确保源电极和接地电极之间的电导率来确认通道启动。
在步骤265中，在确认正确装载了一种或多种缓冲液之后，仪器可以打开门/盖，以允许用户访问芯片。
在步骤266中，仪器可以任选地向用户显示如何将样品装载到芯片的指令。
在步骤267中，用户可以将样品移液到芯片上。用户可以任选地从芯片的样品孔去除密封件，以实现样品装载。如本文所述，在装载样品后，用户可以任选地向样品储器添加额外体积的“顶层”。
在步骤268中，用户可以关闭仪器门，例如通过按压显示器上的按钮。
在步骤269中，仪器可以任选地确认样品已被正确装载。如本文所述，样品的装载可以通过检查每个电极对地面的电导率来确认。在样品装载后，当一种或多种缓冲液保持未装载状态时，仪器可以将剩余的缓冲液装载到芯片上。
在步骤270中，仪器可以开始ITP运行。在装载芯片后，仪器可以任选地等待预定量的时间，以允许芯片中的流体达到平衡。开始ITP运行可能需要激活高压(“HV”)电源供应器、调节芯片温度至运行温度(“T_run”)和/或打开光学检测系统(例如，发光二极管)。例如，典型的ITP程序的运行温度可以在约15℃至约23℃的范围内。
在步骤271中，仪器可以任选地记录和处理检测到的电压信号，如本文所述。
在步骤272中，仪器可以任选地检测电压的变化，以作为开始ITP的触发器，如本文所述。电压的变化可以任选地作为触发器，以改变驱动电极的极性和/或驱动电压，如本文所述。
在步骤273中，仪器可以任选地执行光学检测。
在步骤274中，仪器可以任选地处理检测到的光信号。
在步骤275中，仪器可以任选地感测芯片内预定位置处的温度变化，例如使用如本文所述的红外传感器。温度变化可以任选地作为终止ITP的触发器，如本文所述。
在步骤276中，仪器可以任选地检测电压的变化，以作为终止ITP的触发器，如本文所述。
在步骤277中，仪器可以任选地被触发以关闭高压电源供应器，从而结束ITP运行。仪器还可以关闭光学系统。
在步骤278中，仪器可以任选地使用通道闭合器封锁通道，如本文所述。
在步骤279中，仪器可以任选地向用户显示指示符或消息，以提醒他们ITP已完成。
在步骤280中，仪器可以任选地向用户显示在ITP运行期间收集的任何定量数据。
在步骤281中，用户可以返回机器或在机器处。
在步骤282中，仪器可以任选地将芯片保持在固定温度，直至用户返回仪器，如步骤281所示。例如，该固定温度可以在约4℃至约20℃的范围内。
在步骤283中，用户可以任选地打开仪器门/盖，例如通过按压显示器上的按钮。
在步骤284中，用户可以任选地从洗脱储器中回收样品。备选地或组合地，仪器可以任选地从洗脱储器中自动回收样品。然后，可以根据用户期望任选地将样品用于进一步的下游分析。
在步骤285中，用户可以从仪器去除使用过的芯片。
在步骤286中，芯片到位传感器可以任选地检测用户对芯片的去除。存储在仪器上的条形码信息可以被清除。
在步骤287中，如果需要，用户可以任选地使他们的试剂和样品准备好进行额外的ITP运行。
在步骤288中，用户可以关闭门。
在步骤289中，用户可以根据需要的次数任选地使用新的芯片、缓冲液、样品等来重复步骤253至步骤288。在运行之间的空转时，仪器可以任选地调节仪器的温度，例如调节到约20℃至约25℃范围内的温度。
在步骤290中，用户可以任选地转移在ITP运行期间收集的数据，例如，经由仪器上的USB端口或经由无线连接。
在步骤291中，用户可以任选地关闭仪器。在一些情况下，仪器可以被编程为当芯片到位传感器确认仪器中没有芯片时在预定的空转时间后关闭。
表1示出了使用图33中描述的示例性方法的ITP过程的各个步骤的典型操作时间，这些步骤是手动的(由用户执行)或自动的(由仪器执行)。
表1
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这些问题对于解决珍贵的、难以收集的或低丰度的(例如，小于100ng的核酸或含有低丰度的未损伤或未交联的核酸的样品)样品可能尤其重要。对于此类样品，当前的方案可能缺乏重复性、引入样品材料的损失、引入短或长核酸靶标的偏差、引入对核酸靶标序列的偏差和/或缺乏重复性。这样的方案也可能缺乏与过程自动化或下游分析的兼容性。当前用于核酸制备的方案可包括液相萃取(LPE)如苯酚-氯仿萃取或Trizol萃取，以及固相提取(SPE)。SPE型方法可使用包括填充珠子、整体多孔结构和/或磁珠的结构。在一些情况下，LPE和SPE型方法可在处理过程中导致机械剪切，这可能引起片段化和/或降低长或高分子量核酸的产量。
本文提供的等速电泳方法和设备特别适合于进行从实体组织或半实体组织的裂解物中提取核酸。固相提取(SPE)技术通常通过将整个裂解物样品体积泵送通过柱来处理裂解物，以选择性地将核酸吸附至柱的表面上。这种通过多孔柱泵送复杂裂解物(其可包含液体-颗粒混合物)可导致柱的堵塞或结垢，从而可降低核酸提取的效率。相比之下，本文所述的等速电泳方法和设备通常不涉及通过柱泵送或“过滤”整个裂解物样品体积。而是可以对裂解物施加电场，以使分散在整个复合样品裂解物中的带电荷的、溶剂化核酸迁移通过样品的连续液相并从样品的连续液相中迁移出来。相对于样品裂解物中的其他溶质、碎片或污染物，核酸可包含相对高的电泳迁移率量值。样品中的溶质可具有相对低的电泳迁移率并且太低而不能聚焦到位于前导电解质与尾随电解质之间的界面处的等速电泳区。施加电场可导致核酸迁移，同时留下颗粒和/或其他组织碎片(包括例如细胞碎片、未裂解的细胞或可以将细胞连接到其他细胞的组织)。因此，本文提供的等速电泳方法和设备可很好地适合于从复杂裂解实体组织样品中提取带电荷的溶剂化核酸，而不必像SPE中那样通过柱处理整个混合物。
如本文所用，“颗粒”可以指样品混合物或样品裂解物混合物的组分，其是与样品的连续液相(例如，水溶液)不同的相。颗粒可以是样品混合物的非液体组分。颗粒可以是例如悬浮在样品中的悬浮固体颗粒或胶体。这类颗粒可具有范围为约1纳米(nm)到约1毫米(mm)的多种特征长度尺度。在一些情况下，颗粒可能不是单细胞生物或细胞。
与典型的SPE方法相比，本文提供的等速电泳方法和设备可以在样品移动通过通道时提供降低的应变率。在一些情况下，本文提供的方法和设备的应变率小于约250s-1、500s-1、750s-1、1000s-1、2000s-1、3000s-1、4000s-1、5000s-1、6000s-1、7000s-1、8000s-1、9000s-1或10,000s-1。在一些情况下，本文提供的方法和设备的应变率大于约250s-1、500s-1、750s-1、1000s-1、2000s-1、3000s-1、4000s-1、5000s-1、6000s-1、7000s-1、8000s-1、9000s-1或10,000s-1。在一些情况下，本文提供的方法可以在不离心的情况下进行。
等速电泳化学过程和操作
图2A示出了纯化核酸的等速电泳(ITP)过程的示例性示意图。使包含核酸(DNA和RNA)202和污染物203的样品201(例如裂解的实体组织样品)可以装载尾随电解质(TE)204进入含有前导电解质(LE)205的等速电泳通道200中。在施加到等速电泳通道210的电场220的影响下，核酸212可以远离污染物213迁移。电场还可以使尾随电解质214迁移通过在通常位于核酸后面的位置的通道，并通常使前导电解质215迁移通过通常在核酸前面的通道。前导电解质的有效迁移率的量值大于核酸的有效迁移率的量值，反过来核酸的有效迁移率的量值大于尾随电解质的有效迁移率的量值，而尾随电解质的有效迁移率的量值大于污染物的有效迁移率的量值。
图2B示出了在流体设备上使用等速电泳(ITP)将解交联的核酸与交联的核酸和污染物(例如，石蜡)分离的同时使核酸解交联的过程的示例性示意图。在一些情况下，污染物可包含交联核酸。将石蜡包埋样品在碱性缓冲液中可以装载到流体设备上，并在约pH 10和约50℃至约80℃的温度下温育10-30分钟，以用于组织裂解和初始脱蜡。可在施加电场进行等速电泳之前或同时进行温育。或者，可将样品装载到前导电解质缓冲液中。在温育之后，在第一时间点240，包含交联核酸236和石蜡237的样品可以位于具有尾随电解质232的ITP通道中。在ITP通道的前方，在前导电解质(LE)区238中是前导电解质231和蛋白酶K酶233。在第二时间点250，在50℃下，ITP驱动的pH猝灭使pH降低，并且蛋白酶K酶接触交联核酸并使交联核酸解交联，从而产生非交联核酸235，其聚焦在尾随电解质与前导电解质之间的ITP区239中。pH的降低(例如至约10-12至约7(或约6.5至约8.5)的范围)可提供适合于酶活性和改善的核酸化学稳定性的环境。在第三时间点260，蛋白酶K使更多核酸解交联，从而产生游离蛋白234，并且解交联的核酸进一步从石蜡、游离蛋白和其他污染物向上游迁移。这种过程的操作可以由流体设备或由台式系统自动进行。
在一些情况下，样品可装载在样品缓冲液中，该样品缓冲液包含一定浓度的前导电解质205、231，其不同于用于进行等速电泳的前导电解质205、231的浓度。在一些情况下，样品可装载在样品缓冲液中，该样品缓冲液包含与前导电解质215不同的第二前导电解质。第二前导电解质可具有大于核酸的有效迁移率量值的有效迁移率量值。第二前导电解质可具有小于前导电解质215的有效迁移率量值的有效迁移率量值。
在一些情况下，可以通过进行等速电泳来猝灭样品的pH。在一些情况下，可将样品的pH猝灭至约6.5至约8.5的范围内(例如约7或7.5)。
可以使用各种前导电解质和尾随电解质来进行ITP。可以选择前导电解质以具有比提取靶标(例如，核酸)更大的有效迁移率量值，并且可以选择尾随电解质以具有比提取靶标更低的有效迁移率量值。前导电解质和/或尾随电解质可以以约10mM至约200mM的浓度存在。前导电解质和/或尾随电解质可以以约10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM的浓度存在。前导电解质和/或尾随电解质可以以至少约10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM的浓度存在。前导电解质和/或尾随电解质可以以至多约10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM的浓度存在。在特定ITP情形中使用的前导电解质可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的离子种类。在特定ITP情形中使用的尾随电解质可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种不同的离子种类。前导电解质和/或尾随电解质中的不同种类的离子可以以不同的浓度存在。可以选择不同浓度的离子(如在尾随电解质或前导电解质中)，以操纵间隔区的大小。间隔区可用于进一步将一种类型的靶标与另一种靶标分离，如将解交联的核酸与蛋白质交联的核酸分离。
尾随电解质可包含具有不同有效迁移率量值的离子的混合物。使用具有第一有效迁移率量值的第一尾随电解质离子和具有低于第一离子的第一有效迁移率量值的第二有效迁移率量值的第二尾随电解质离子可用于将非交联核酸与蛋白质交联核酸分离，同时将两种核酸(或至少解交联的核酸)与污染物分离。在这种情况下，非交联核酸可具有比第一尾随电解质离子更大的有效迁移率量值，第一尾随电解质离子可具有比交联核酸更大的有效迁移率量值，反过来交联核酸可具有比第二尾随电解质离子更大的有效迁移率量值，反过来第二尾随电解质离子可具有比污染物更大的有效迁移率量值。例如，交联核酸和非交联核酸可通过使用前导电解质和两种尾随电解质(如作为第一离子的己酸和作为第二离子的HEPES)进行等速电泳来单独富集。
还可以基于酸度(例如，pKa)选择电解质离子。可以选择具有特定pKa的离子，例如，以沿着ITP通道产生pH变化。还可以基于非电泳原因，诸如与下游过程的兼容性(例如，酶促过程如PCR或下一代测序文库制备)来选择离子。例如，可以选择己酸、MOPS和HEPES来获得良好的下游酶促兼容性。
示例性的前导电解质离子包括但不限于盐酸、乙酸、2-氯异巴豆酸、水杨酸、氯巴豆酸、烟酸、没食子酸、三氯乳酸、丁酸、对氨基苯磺酸、苯甲酸、巴豆酸、三氯丙烯酸、丙酸、乙酰丙酸、山梨酸、乳清酸、戊酸、苦味酸、2-萘磺酸、糖精、二硝基苯酚、对甲苯磺酸、天冬氨酸、三甲基丙烯酸、异己酸、己酸、辛基磺酸、硝基苯酚、GABA、二甲胂酸、三甲基丙酮酸、乙基马来酸、乙基富马酸、甲苯酸、庚酸、扁桃酸、肉桂酸、甲酚、谷氨酸、MES、它们的异构体，以及它们的组合。
示例性的尾随电解质离子包括但不限于辛酸、葡萄糖酸、香草酸、癸基磺酸、阿司匹林、葡糖醛酸、壬酸、苄基天冬氨酸、抗坏血酸、十二烷基磺酸、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)、二氯苯酚、己酸、癸酸、酪氨酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、它们的异构体，以及它们的组合。
使用不同尾随电解质离子的混合物可用于实现括号内分离(例如，非交联核酸与交联核酸与污染物的分离)的迁移率、与下游测定的兼容性、有利的表面能或流体与流体设备材料之间的接触角、缓冲能力和总离子溶解度。
可以将前导电解质装载到前导电解质缓冲液中。前导电解质缓冲液可以包含一种或多种前导电解质，以在ITP期间在通道中压缩前导电解质后的靶核酸。前导电解质还可以将靶核酸与任何污染物或抑制剂分离，这些污染物或抑制剂具有大于靶核酸的有效迁移率。前导电解质缓冲液可以例如包含氯化物。前导电解质缓冲液可以包含足够浓度的氯化物，以使得前导电解质缓冲液的分离能力大于样品核酸的离子强度。前导电解质缓冲液可以包含与核酸稳定性兼容的pH。前导电解质缓冲液可以包含表面活性剂(例如，吐温)以减少或最小化电渗流。前导电解质缓冲液可以包含表面活性剂(例如，Brij-35)以减少或最小化表面吸附。前导电解质缓冲液可以包含一种或多种如本文所述的表面活性剂。可以调节一种或多种表面活性剂的浓度，以确保LE不失控地浸透本文所述的毛细管屏障(例如，平台毛细管屏障)。
在一些实施方式中，可以将前导电解质装载到高浓度前导电解质缓冲液中，其可以起到缓冲较低浓度前导电解质缓冲液的作用。高浓度前导电解质缓冲液可以具有足够的缓冲能力，以便不在整个ITP运行期间发生的电解过程中改变pH。高浓度的前导电解质缓冲液可以包含一种或多种前导电解质，其可以与前导电解质缓冲液的前导电解质相同但浓度更高。高浓度前导电解质缓冲液可以包含Tris和氯化物。高浓度前导电解质缓冲液可以包含被配置用于使缓冲能力最大化的比率的Tris和氯化物，例如高的Tris:氯化物比率，以在ITP运行期间提供Tris来源。高浓度前导电解质缓冲液可以包含一种或多种表面活性剂以确保高浓度前导电解质缓冲液润湿高浓度前导电解质缓冲储器的壁，并在施加负压时装载至毛细管屏障。可以调节一种或多种表面活性剂的浓度以确保LE不会失控地浸透本文所述的毛细管屏障(例如，斜坡屏障)。
在一些实施方式中，可以将前导电解质装载到洗脱缓冲液中。洗脱缓冲液可以包含一种或多种前导电解质。洗脱缓冲液的一种或多种前导电解质可以具有比前导电解质缓冲液的前导电解质更低的离子强度。一种或多种前导电解质可以实现从较高离子强度的前导电解质缓冲液到较低离子强度的洗脱缓冲液的ITP带的切换。洗脱缓冲液可以提供与本文所述的一种或多种下游测定(例如，NGS文库制备、PCR等)的兼容性。洗脱缓冲液可以包含Tris和氯化物，例如10mM Tris-HCl。洗脱缓冲液可以包含与核酸稳定性兼容的pH。前导电解质缓冲液可以包含表面活性剂(例如，吐温)以减少或最小化电渗流。前导电解质缓冲液可以包含表面活性剂以减少或最小化流体通道中的气泡生长(例如，在本文所述的温度测量期间)。前导电解质缓冲液可以包含表面活性剂以减少或最小化表面吸附。洗脱缓冲液可以包含如本文所述的一种或多种表面活性剂。可以调节一种或多种表面活性剂的浓度以便确保洗脱缓冲液不失控地浸透本文所述的毛细管屏障(例如，斜坡屏障)。
在一些实施方式中，可以将前导电解质装载到高浓度洗脱缓冲液中，所述缓冲液可以起到缓冲较低浓度洗脱缓冲液(例如，适于提取和在本文所述的下游测定中使用的较低浓度)的作用。高浓度洗脱缓冲液可以具有足够的缓冲能力，以便不在整个ITP运行期间发生的电解过程中改变pH。高浓度洗脱缓冲液可以在高浓度洗脱缓冲液与洗脱缓冲液之间具有最少(例如，小于1μl)的遗留物量。高浓度洗脱缓冲液可以包含足够低的离子浓度，以使得这种遗留物不影响下游兼容性。高浓度洗脱缓冲液可以包含Tris和氯化物。高浓度洗脱缓冲液可以包含被配置用于使缓冲能力最大化的比率的Tris和氯化物，例如高的Tris:氯化物比率，以在ITP运行期间提供Tris来源。高浓度洗脱缓冲液可以包含足够高的离子浓度的Tris和氯化物以实现稳健的缓冲，同时使遗留物的影响最小化。高浓度洗脱缓冲液可以包含一种或多种表面活性剂以确保高浓度洗脱缓冲液润湿高浓度洗脱缓冲储器的壁，并在施加负压时装载至毛细管屏障。可以调节一种或多种表面活性剂的浓度以确保高浓度洗脱缓冲液不失控地浸透本文所述的毛细管屏障(例如，斜坡屏障)。
尾随电解质可以在尾随电解质缓冲液中。尾随电解质缓冲液可包含一种或多种尾随电解质，其在ITP期间在通道中压缩尾随电解质前的靶核酸。尾随电解质还可以将靶核酸与任何污染物或抑制剂分离，这些污染物或抑制剂具有小于靶核酸的有效迁移率。尾随电解质缓冲液可以具有足够的缓冲能力，以便不在整个ITP运行期间发生的电解过程中改变pH。尾随电解质缓冲液可以例如包含己酸。尾随电解质缓冲液可以包含MOPS。尾随电解质缓冲液可以包含己酸和MOPS。尾随电解质缓冲液可以包含高浓度的己酸。高浓度的己酸可以导致过度润湿的流体。可以将MOPS添加到尾随电解质缓冲液的己酸以在不增加过高浓度的己酸的润湿的情况下在尾随电解质储器中提供必要的缓冲能力。尾随电解质缓冲液可以包含与核酸稳定性兼容的pH。
前导电解质缓冲液可以包含本文所述的一种或多种表面活性剂(例如，吐温)。可以调节一种或多种表面活性剂的浓度以确保TE不失控地浸透本文所述的毛细管屏障(例如，平台毛细管屏障)。可以调节一种或多种表面活性剂的浓度以在电解过程中不产生气泡或产生小气泡，而不产生可能导致流体波动并从而可以引起ITP带、电压迹线和/或温度迹线的干扰的大气泡，或者产生可能移动并对触发产生负面影响的非常大的气泡。
等速电泳可将样品的pH猝灭至中性或约中性。影响局部pH的离子(例如，钠离子(Na+))可在等速电泳过程中从样品区移位，从而将样品区中的pH转变为中性。
等速电泳可以在一定范围的电压、电流和场强下进行。例如，等速电泳可以在约100V至约1500V的电压下进行。等速电泳可以在约100V、200V、300V、400V、500V、600V、700V、800V、900V、1000V、1100V、1200V、1300V、1400V或15000V的电压下进行。等速电泳可以在至少约100V、200V、300V、400V、500V、600V、700V、800V、900V、1000V、1100V、1200V、1300V、1400V或15000V的电压下进行。等速电泳可以在至多约100V、200V、300V、400V、500V、600V、700V、800V、900V、1000V、1100V、1200V、1300V、1400V或15000V的电压下进行。等速电泳可以在约10nA至约10mA的电流下进行。等速电泳可以在约10nA、20nA、30nA、40nA、50nA、60nA、70nA、80nA、90nA、100nA、200nA、300nA、400nA、500nA、600nA、700nA、800nA、900nA、1mA、2mA、3mA、4mA、5mA、6mA、7mA、8mA、9mA或10mA的电流下进行。等速电泳可以在至少约10nA、20nA、30nA、40nA、50nA、60nA、70nA、80nA、90nA、100nA、200nA、300nA、400nA、500nA、600nA、700nA、800nA、900nA、1mA、2mA、3mA、4mA、5mA、6mA、7mA、8mA、9mA或10mA的电流下进行。等速电泳可以在至多约10nA、20nA、30nA、40nA、50nA、60nA、70nA、80nA、90nA、100nA、200nA、300nA、400nA、500nA、600nA、700nA、800nA、900nA、1mA、2mA、3mA、4mA、5mA、6mA、7mA、8mA、9mA或10mA的电流下进行。等速电泳可以在约10V/cm至约100V/cm的场强下进行。等速电泳可以在约10V/cm、15V/cm、20V/cm、25V/cm、30V/cm、35V/cm、40V/cm、45V/cm、50V/cm、55V/cm、60V/cm、65V/cm、70V/cm、75V/cm、80V/cm、85V/cm、90V/cm、95V/cm或100V/cm的场强下进行。等速电泳可以在至少约10V/cm、15V/cm、20V/cm、25V/cm、30V/cm、35V/cm、40V/cm、45V/cm、50V/cm、55V/cm、60V/cm、65V/cm、70V/cm、75V/cm、80V/cm、85V/cm、90V/cm、95V/cm或100V/cm的场强下进行。等速电泳可以在至多约10V/cm、15V/cm、20V/cm、25V/cm、30V/cm、35V/cm、40V/cm、45V/cm、50V/cm、55V/cm、60V/cm、65V/cm、70V/cm、75V/cm、80V/cm、85V/cm、90V/cm、95V/cm或100V/cm的场强下进行。
可以使用等速电泳来浓缩样品中的核酸。样品中核酸的浓度可在等速电泳之后增加至少约2倍、5倍、10倍、100倍、1,000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、100,000,000倍或1,000,000,000倍。用等速电泳浓缩核酸的操作时间可小于或等于约5小时、4.5小时、4小时、3.5小时、3小时、2.5小时、2小时、1.5小时、1小时、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、45秒、30秒、20秒、10秒或1秒。在一些情况下，可以使用等速电泳使样品中核酸的浓度在小于或等于约2分钟内增加1,000,000倍。在一些情况下(例如，来自25μL血液裂解物的样品)，可以使用等速电泳使样品中核酸的浓度在小于或等于约5分钟内增加100,000倍。
本公开内容的技术可用于降低样品中交联核酸的浓度。样品中交联核酸的浓度可在等速电泳之后降低至少约2倍、5倍、10倍、100倍、1,000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、100,000,000倍或1,000,000,000倍。可以使用等速电泳来降低样品中污染物的浓度。样品中污染物的浓度可在等速电泳之后降低至少约2倍、5倍、10倍、100倍、1,000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、100,000,000倍或1,000,000,000倍。
核酸样品可含有约0.1皮克(pg)至约25微克(μg)。例如，核酸样品可含有约5pg至约5μg。核酸样品可含有约0.1pg、0.2pg、0.3pg、0.4pg、0.5pg、0.6pg、0.7pg、0.8pg、0.9pg、1pg、2pg、3pg、4pg、5pg、6pg、7pg、8pg、9pg、10pg、20pg、30pg、40pg、50pg、60pg、70pg、80pg、90pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1纳克(ng)、2ng、3ng、4ng、5ng、6ng、7ng、8ng、9ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、10μg、11μg、12μg、13μg、14μg、15μg、16μg、17μg、18μg、19μg、20μg、21μg、22μg、23μg、24μg或25μg。
核酸样品可包含脱氧核糖核酸(DNA)、单链DNA、双链DNA、基因组DNA、互补DNA、核糖核酸(RNA)、核糖体RNA、转移RNA、信使RNA、微RNA等等，或其任何组合。核酸样品可包含至少约0.5、1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500kB或更长的长度。本公开内容的技术可用于在流体设备的不同通道中提取不同的样品类型。例如，可以使用不同的通道来提取不同长度和/或不同类型的核酸。
在一些情况下，可以将核酸样品的特征与来自另一个样品的一种或多种核酸进行比较。该特征可以是例如表达水平、核酸序列、分子量、核酸完整性、核酸链型或核酸纯度。
核酸样品可在提取或其他处理之前和/或之后具有特定的质量。可以通过多种度量(包括但不限于RNA完整性编号(RIN)、DNA完整性编号(DIN)、大小分布(例如，使用电泳)和扩增的能力(例如，通过PCR)或以其他方式进行酶促处理(例如，用于下一代测序文库制备的片段化、连接、a-加尾或杂交))来评估核酸质量。本公开内容的技术可用于提取或处理核酸，并提供RIN为至少约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0的提取或处理的核酸。本公开内容的技术可用于提取或处理核酸，并提供RIN为至多约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0的提取或处理的核酸。本公开内容的技术可用于提取或处理核酸，并提供DIN为至少约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0的提取或处理的核酸。本公开内容的技术可用于提取或处理核酸，并提供DIN为至多约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0的提取或处理的核酸。本公开内容的技术可用于提取或处理核酸，并提供提取或处理的核酸，使得样品中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％的质量的核酸具有至少约0.5、1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500kB或更高的分子量。在一些情况下，约90％至约100％的质量的处理的核酸为约10bp至约1000bp、约200bp至约2000bp或约200-5000bp。
可以使用等速电泳来以一定的提取效率或产率(被描述为由给定起始量的核酸产生的核酸的产率百分比)来提取核酸。本公开内容的技术可以以至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的产率提供提取的核酸。即使对于低输入量的核酸(包括小于或等于约104纳克(ng)、103ng、102ng、101ng、100ng、10-1ng或10-2ng)，本公开内容的技术也可以提供高产率。例如，图3示出了由一定范围的不同输入量和核酸来源而产生的示例性核酸产率。核酸的高产率和/或低损耗对于下一代测序文库制备可能是重要的。核酸的回收率可以为100％或接近100％。
本公开内容的技术可以在低序列偏差或无序列偏差的情况下提取核酸。也就是说，提取和纯化的核酸的序列组成(例如，富含GC的核酸与富含AT的核酸的比率)可以与输入核酸的序列组成相似或相同(参见，例如，图4A)。提取的核酸的序列组成与输入核酸的序列组成的差异可以小于或等于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。
本公开内容的技术可以在低长度偏差或无长度偏差的情况下提取核酸。也就是说，提取的核酸的长度分布(例如，不同大小的核酸的比例)可以与输入核酸的长度分布相似或相同(参见，例如，图4B)。提取的核酸的长度分布与输入核酸的长度分布的差异可以小于或等于约20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。例如，可以以减小的失落或偏差来提取短核酸(例如，约10bp至约300bp)、长核酸(例如，约10kB、20kB、30kB、40kB、50kB、60kB、70kB、80kB、90kB、100kB或更长)，或短核酸和长核酸两者。在一些情况下，固相柱可能损失最多100％的短核酸和/或长核酸材料。本公开内容的技术可以回收大小为单个碱基至数百个千碱基的核苷酸。本公开内容的技术可以回收存在于样品中的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的短核酸和/或长核酸。
本公开内容的技术可以导致污染物从样品中去除。污染物可包括但不限于包埋材料、细胞碎片、细胞外基质组分、组织碎片、包埋碎片、脂质、碳水化合物、酶、连接副产物、引物、未结合的探针或连接剂、二价金属、洗涤剂、防腐剂、固定剂、抗凝血剂、胶原纤维和PCR抑制剂。污染物可以来自样品中的组织或细胞、来自样品上使用的防腐剂或包埋材料或来自先前在样品上进行的制备、反应或测定。例如，可以使用酶如限制性核酸酶来制备用于指纹分析测定的DNA，并且在消化(例如，DNA酶消化)之后，可以将DNA与酶分离。
样品
本公开内容的技术可用于处理不同的样品类型，包括但不限于生物样品、实体组织、活检物、组织活检物、液体活检物、器官、肿瘤、新鲜组织、实体器官、保存的组织(例如，FFPE)、解剖的FFPE、新鲜冷冻组织、固定的样品、固定的组织、包埋样品、裂解的样品、未裂解的样品、包含细胞之间连接(例如，间隙连接、紧密连接、粘附连接)的样品、包含裂解的实体组织和核酸的样品、多相样品、非均质液体或溶液(如组织、全血或未裂解的细胞悬浮液)、包含基因组DNA的生物样品、裂解和未裂解的全血、血浆和血清、口腔拭子、干燥血斑和其他法医样品、新鲜或新鲜冷冻(FF)组织、从血液或组织中培养或收获的细胞(裂解和未裂解的)、固定细胞、粪便和体液(如唾液、尿液)或其任何组合。实体器官的非限制性实例包括肝脏、胰腺、脑、心脏、胆囊、结肠、肺和生殖器官。对于真核生物和原核生物两者而言，样品可包括细胞核酸和无细胞核酸。固定的样品可以化学固定或物理固定(例如，加热或冷冻)。例如，样品可用化学固定剂如福尔马林、中性缓冲福尔马林(NBF)、甲醛、多聚甲醛、戊二醛、乙二醛、氯化汞、锌盐、布安液(Bouin’s fluid)、乙醇-福尔马林-乙酸(AFA或FAA))、柠檬酸盐-丙酮-福尔马林(CAF)、丙酮、甲醇、乙醇、Clarke液、卡诺氏固定液(Carnoy’s fluid)或Puchtler'smethacarn进行化学固定。包埋样品可以包埋在包括但不限于蜡(例如，石蜡)、琼脂、明胶或塑料树脂的材料中。可以使用本公开内容的技术处理福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品。样品可包含口腔拭子、血斑和其他法医样品。样品可包含临床样品、细针抽吸物、活检物、全血、裂解的血液、血清、血浆、尿液、细胞培养裂解物或新鲜收获的细胞(例如，血细胞、分离的新鲜组织、干细胞)裂解物、血细胞、循环细胞(例如，循环肿瘤细胞(CTC))、来自血液或其他体液的核酸以及其他样品类别。可以使用本公开内容的技术回收无细胞核酸(例如，cfDNA或cfRNA)，诸如从未裂解的全血中回收；通常，无细胞核酸为循环无细胞核酸。样品可以来自多种来源，包括但不限于正常组织、良性肿瘤、恶性肿瘤、干细胞、人体组织、动物组织、植物组织、细菌、病毒和环境来源(例如，水)。人或动物组织可包括但不限于上皮组织、结缔组织(例如，血液、骨骼)、肌肉组织(例如，平滑肌、骨骼肌、心肌)和神经组织(例如，脑、脊髓)。
样品可包含一个或多个悬浮颗粒。该一个或多个颗粒可在胶体大小到可见的范围内。该一个或多个颗粒可具有至少约1纳米(nm)、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、950nm、1微米(μm)、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、175μm、200μm、225μm、250μm、275μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm或1毫米(mm)的大小。该一个或多个颗粒可具有至多约1纳米(nm)、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、950nm、1微米(μm)、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、175μm、200μm、225μm、250μm、275μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm、950μm或1毫米(mm)的大小。该一个或多个颗粒可以是相同大小或不同大小。样品可以例如包含大小范围为1nm至500μm的多个颗粒。
可以在流体设备上处理多种体积的样品(例如，以提取和纯化核酸)。例如，样品体积(有或没有缓冲液)可以为至少约1纳升(nL)、10nL、20nL、50nL、100nL、200nL、500nL、1微升(μL)、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、150μL、175μL、200μL、225μL、250μL、275μL、300μL、350μL、400μL、450μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1毫升(mL)、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。样品体积(有或没有缓冲液)可以为至多约1纳升(nL)、10nL、20nL、50nL、100nL、200nL、500nL、1微升(μL)、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1毫升(mL)、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。在一些情况下，样品体积可以为约1nL至约10nL。样品体积(有或没有缓冲液)可以为至少约1纳升(nL)、10nL、20nL、50nL、100nL、200nL、500nL、1微升(μL)、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1毫升(mL)、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。在一些情况下，样品体积可以为约1nL至约10nL。
可以在流体设备上处理具有不同数目细胞的样品(例如，以提取和纯化核酸)。例如，样品可含有小于或等于约20,000个细胞、15,000个细胞、10,000个细胞、9,000个细胞、8,000个细胞、7,000个细胞、6,000个细胞、5,000个细胞、4,500个细胞、4,000个细胞、3,500个细胞、3,000个细胞、2,500个细胞、2,000个细胞、1,500个细胞、1,000个细胞、900个细胞、800个细胞、700个细胞、600个细胞、500个细胞、400个细胞、300个细胞、200个细胞、100个细胞、90个细胞、80个细胞、70个细胞、60个细胞、50个细胞、40个细胞、30个细胞、20个细胞、10个细胞、5个细胞、2个细胞或1个细胞。在一些情况下，样品含有至少约10,000,000个细胞、5,000,000个细胞、1,000,000个细胞、500,000个细胞、100,000个细胞、50,000个细胞、20,000个细胞、15,000个细胞、10,000个细胞、9,000个细胞、8,000个细胞、7,000个细胞、6,000个细胞、5,000个细胞、4,500个细胞、4,000个细胞、3,500个细胞、3,000个细胞、2,500个细胞、2,000个细胞、1,500个细胞、1,000个细胞、900个细胞、800个细胞、700个细胞、600个细胞、500个细胞、400个细胞、300个细胞、200个细胞或100个细胞。
可以在流体设备上处理不同质量的样品(例如，以提取和纯化核酸)。例如，样品可含有约0.001毫克(mg)至约10mg的组织。样品可含有至多约0.001mg、0.002mg、0.003mg、0.004mg、0.005mg、0.006mg、0.007mg、0.008mg、0.009mg、0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg的组织。样品可含有至少约0.001mg、0.002mg、0.003mg、0.004mg、0.005mg、0.006mg、0.007mg、0.008mg、0.009mg、0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg的组织。样品可含有约0.001mg、0.002mg、0.003mg、0.004mg、0.005mg、0.006mg、0.007mg、0.008mg、0.009mg、0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg或10mg的组织。
可以在流体设备上处理具有不同量的核酸的样品(例如，以提取和纯化核酸)。例如，样品可含有小于或等于约1微克(1μg)、100纳克(ng)、10ng、1ng、100皮克(pg)、10pg或1pg的核酸。在一些情况下，样品可含有大于或等于约1微克(1μg)、100纳克(ng)、10ng、1ng、100皮克(pg)、10pg或1pg的核酸。
可以将样品装载到样品缓冲液中。样品缓冲液可以包含裂解剂或表面活性剂，以在芯片外处理期间裂解输入的样品，从而提供对靶核酸的访问。样品缓冲液可以包含一种或多种前导电解质。样品缓冲液可以具有足够的润湿性，以便由于重力和/或表面张力自动装载到样品通道中。样品缓冲液可以包含一种或多种表面活性剂以减少或最小化靶核酸与流体通道壁的吸附。样品缓冲液可以包含离子含量，其被优化以具有足够的盐用于裂解和/或核酸保存，同时仍适应核酸分离。本领域普通技术人员将理解，样品缓冲液(或本文所述的任何缓冲液)的离子含量越高，转移样品缓冲液的电荷所需的电流就越多。
可以将样品装载在包含尾随电解质或前导电解质的缓冲液中。可以将样品装载在包含第二前导电解质的缓冲液中，该第二前导电解质与用于进行ITP的前导电解质不同。可以将样品装载在缓冲液如碱性水性缓冲液或中性水性缓冲液中。示例性的碱性溶液或缓冲液(例如，用于DNA提取)可包含pH为约10-13的30-120mM NaOH(在一些情况下，40-80mMNaOH)(在一些情况下，具有至少一种其他组分)。在一些情况下，当样品在装载到芯片上之前通过用碱性溶液或缓冲液处理进行裂解时，随后可以通过添加酸性溶液或缓冲液来猝灭该裂解的样品以使该裂解的样品的pH在进行等速电泳之前在约7.5至约8.5的范围内。示例性的水性缓冲液(例如，用于DNA或RNA提取)可包含2-150mM Tris-HCl(pH为约7至约8)或pH为约5.8至约7.3的BisTris-HCl，其具有至少一种其他组分。缓冲液中使用的其他组分可包括非离子表面活性剂或洗涤剂、离子或两性离子表面活性剂或洗涤剂、离液剂、二硫键还原剂、蛋白酶、核酸酶以及为了提取、纯化、富集或以其他方式分离核酸的目的而消化、变性、破坏或降解的其他添加剂或组分。
可以将样品可以装载到缓冲液中，所述缓冲液包含添加的尾随电解质或前导电解质以减少或最小化核酸在毛细管屏障处，特别是样品与LE之间的毛细管屏障处的保留。例如，可以将少量尾随电解质(例如，MOPS和/或己酸)添加至裂解物样品，以有意减缓DNA ITP带的压缩。不希望受到特定理论的限制，认为这可能有助于在DNA穿过毛细管屏障(例如，样品与LE之间的连接件处的悬崖毛细管屏障)的收缩空间时将DNA维持在更分散的状态，该收缩空间可能另外损害更紧凑的ITP带的通过。由于掺入的TE具有比DNA和LE更慢的迁移率，因此一旦ITP带进入LE缓冲液，TE可能会落后，并允许ITP带在到达洗脱储器之前充分压缩。
非离子表面活性剂或洗涤剂可包括但不限于来自以下类别的表面活性剂：辛基酚乙氧基化物、聚山梨醇酯、泊洛沙姆或聚氧乙烯。辛基酚乙氧基化物表面活性剂可包括但不限于支化的辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630)、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TritonTM X-100)或具有芳烃亲脂或疏水基团的其他聚环氧乙烷链。聚山梨醇酯表面活性剂可包括但不限于聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(
Figure GDA0003654970080000941
20)、聚乙二醇脱水山梨糖醇单油酸酯(
Figure GDA0003654970080000942
80)或脱水山梨糖醇单油酸酯(
Figure GDA0003654970080000943
80)。泊洛沙姆表面活性剂(即基于环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物)可包括但不限于聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(
Figure GDA0003654970080000944
F-68)或聚乙二醇-聚丙二醇嵌段共聚物(
Figure GDA0003654970080000945
F-127)。聚氧乙烯表面活性剂可包括但不限于壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)。
非离子表面活性剂或洗涤剂可包括但不限于
Figure GDA0003654970080000946
(例如，
Figure GDA0003654970080000947
CA-630)、TritonTM X-100、
Figure GDA0003654970080000948
20、
Figure GDA0003654970080000949
80、NP-40、包括
Figure GDA00036549700800009410
(例如，F-68或F-127)的其他嵌段共聚物、
Figure GDA00036549700800009411
80和聚乙二醇化聚合物或共聚物。非离子表面活性剂或洗涤剂可用于减少或防止生物分子吸附到通道壁，或控制流体的润湿和/或表面张力性质以控制样品装载到流体设备中。非离子表面活性剂或洗涤剂可以以约0.0005-5％v/v或w/v的浓度存在。例如，IGEPAL CA-630可以以约0.05-0.5％v/v使用。离子表面活性剂或洗涤剂可包括但不限于十二烷基硫酸钠(例如，以0.01-2％w/v)、十二烷基苯磺酸钠(例如，以0.01-2％w/v)、胆固醇硫酸钠(例如，以0.01％-2％w/v)和脱氧胆酸钠(例如，以约10-1000mM)。离液剂可包括但不限于尿素(例如，约0.5-9.5M，或在一些情况下，5-9.5M)、硫脲、丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化锂、氯化镁、苯酚和丙醇。例如，可以在5-50mMTris-HCl(在一些情况下，10-20mM Tris-HCl)缓冲溶液中使用7.0M尿素和2.0M硫脲以用于RNA或DNA提取，或用于总核酸提取。尿素与硫脲的比例可以为至少约1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1或8:1。二硫键还原剂可包括但不限于DTT(例如，以约0.1-40mM，或在一些情况下约10mM)和β-巯基乙醇(例如，以约0.5-2％，或在一些情况下约1％)。蛋白酶可包括但不限于蛋白酶K、蛋白酶、内切蛋白酶(例如，胰蛋白酶、LysC、GluC、AspN)、肽酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。核酸酶可包括但不限于非特异性核酸消化酶如包括DNA酶I的DNA酶(例如，用于制备无DNA的RNA提取物)和RNA酶(如RNA酶A、RNA酶T)或其组合(例如，用于制备无RNA的DNA提取物)。核酸酶还可以包括特异性核酸消化酶(例如，限制酶)，其可以切割特定的核酸序列并且可以产生可预测的片段大小和片段大小分布。在一些情况下，本文提供的一种或多种方法或过程在不使用核酸酶、不使用DNA酶或不使用RNA酶的情况下进行。例如，本文提供的方法包括在不使用DNA酶的情况下提取RNA。
限制酶可包括但不限于1型至V型限制酶、BamHI、EcoP15I、EcoRI、EcoRII、EcoRV、HaeIII、HgaI、HindIII、HinFI、KpnI、NotI、PstI、PvuII、SacI、SalI、SmaI、SpeI、SphI、XbaI和StuI。核酸酶可以以包括50-400μg/mL的浓度使用。核酸酶消化可在包括约20℃至约37℃的温度下进行。可以使用其他核酸修饰酶，诸如转座酶、连接酶、聚合酶和磷酸酶。可以使用其他蛋白质或多核苷酸消化剂或降解剂，诸如溶菌酶。
在装载到流体设备上之前，可使样品经受不同程度的预处理。在一些情况下，可以在装载到流体设备上之前将样品简单地装载到缓冲液中，并且可以在设备上进行任何其他必要或所需的样品制备步骤。在其他情况下，可以将样品添加到预先填充有处理流体(如溶液或缓冲液)的样品储器中。在其他情况下，样品可在装载到流体设备上之前经受包埋材料去除、组织破坏、细胞裂解或消化。在一个实例中，在装载到流体设备上之前将样品脱蜡，并且在流体设备上进行核酸的解交联。在另一个实例中，在装载到流体设备上之前对样品进行脱蜡、破坏和裂解，并且任选地，在流体设备上进行核酸的解交联。在另一个实例中，在装载到流体设备上之前对样品进行脱蜡，并且在流体设备上进行组织破坏和细胞裂解。在另一个实例中，将样品装载到流体设备上，并且脱蜡、组织破坏、细胞裂解和核酸的解交联均在流体设备上进行。在本公开内容中进一步讨论了样品制备步骤。
样品制备
可以在等速电泳之前制备样品。样品制备可涉及包括但不限于去除包埋材料、组织破坏、细胞裂解、蛋白质消化、去除核酸交联、等温酶促过程、酶促扩增、酶促消化、细胞-细胞连接的破坏、细胞外基质的破坏、结缔组织的破坏及其组合的步骤。样品制备可涉及诸如聚合酶链反应(PCR)或其他核酸扩增、分离或纯化感兴趣的材料(例如，细胞、核酸)、探针杂交和抗体杂交(例如，抗体与核小体的杂交)的技术。在一些情况下，可以通过从样品中分离细胞的一部分材料来制备样品以供进一步分析。例如，可以使用细胞分选设备如流式细胞仪或磁化柱从异质细胞群中分离循环肿瘤细胞。在另一个实例中，可以从血液样品中分离外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。样品制备可以在设备上或在设备外进行。在一些情况下，一些样品制备步骤在设备外进行，并随后将样品装载到流体设备上，在那里进行额外的样品制备步骤。
可以从包埋材料中去除包埋样品中的生物材料(例如，细胞、组织、核酸)。例如，可对石蜡包埋样品进行脱蜡。可以使用包括但不限于热处理、化学处理(例如，酸或碱)、酶处理及其组合的技术进行包埋材料的去除。脱蜡可以通过化学处理样品、通过热处理样品、通过酶处理样品或通过其他方法进行。例如，脱蜡可以在升高的温度(例如，约50℃至约80℃)下在中性缓冲液或略微酸性的缓冲液(例如，低至pH约5.5)或略微碱性的缓冲液(高至pH约9)或碱性溶液(例如，pH约12至约13)的存在下进行。可以在设备外或设备上进行包埋材料的去除。在一个实例中，可以将包埋样品在容器中在升高的温度下温育，并随后装载到流体设备上。在另一个实例中，可以将包埋样品装载到流体设备上并在设备上(例如在通道或储器中)在升高的温度下温育。
可以通过热处理进行包埋材料的去除。用于去除包埋材料的温育可以在至少约35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、99.5℃或100℃的温度下进行。用于去除包埋材料的温育可以在约40℃至约80℃、约50℃至约80℃、约50℃至约99.9℃或约95℃至约99.5℃的温度下进行。用于去除包埋材料的温育可以进行至少约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、85分钟、90分钟、95分钟、100分钟、105分钟、110分钟、115分钟或120分钟的持续时间。用于去除包埋材料的温育可进行约1分钟至约20分钟、约1分钟至约30分钟、约1分钟至约60分钟、约1分钟至约120分钟或约5分钟至约20分钟的持续时间。用于去除包埋材料的温育可以例如在至少约37℃的温度下进行至少约1分钟的持续时间。用于去除包埋材料的温育可以在碱性缓冲液或中性缓冲液(例如裂解缓冲液)的存在下进行。碱性缓冲液(例如裂解缓冲液)可具有至少约8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0或13.5的pH。中性缓冲液可具有约7.0(例如，约7至约8)的pH。
可以破坏或裂解组织或细胞，从而释放核酸以用于分离、纯化或提取。可以使用包括但不限于机械应力、声处理、电穿孔、渗透压、化学处理(例如，酸或碱)、酶处理、热处理及其组合的技术进行组织破坏或细胞裂解。例如，可以使用压力来驱动组织通过结构(例如，通道、树脂诸如玻璃熔块或多孔树脂或玻璃材料)以机械地破坏组织或裂解细胞。在一些情况下，尾随电解质缓冲液可包含一种或多种组织破坏剂和/或细胞裂解剂。在一些情况下，前导电解质缓冲液可包含一种或多种组织破坏剂和/或细胞裂解剂。在一些情况下，可以通过与组织破坏或细胞裂解相同的过程来实现包埋材料的去除。例如，在升高的温度(例如，约30℃至约80℃、约50℃至约80℃或约30℃至约65℃)下温育可以实现包埋材料的去除、组织破坏和细胞裂解。组织破坏或细胞裂解可以在设备外或设备上进行。在一个实例中，组织样品在容器中被破坏，并随后装载到流体设备上。在另一个实例中，先前装载到流体设备上的组织样品在设备上被破坏。
可以在装载到流体设备上之前或之后使用与等速电泳兼容的裂解溶液或缓冲液裂解包含组织或细胞的样品。与等速电泳兼容的裂解缓冲液可包括非离子表面活性剂或洗涤剂、离子或两性离子表面活性剂或洗涤剂、离液剂、二硫键还原剂、蛋白酶、核酸酶和为了提取、纯化、富集(浓缩)或以其他方式分离核酸的目的而消化、变性、破坏或降解的其他添加剂或组分。在一些情况下，裂解缓冲液可包含碱性缓冲液。在一些情况下，裂解缓冲液可以不包含碱性缓冲液。示例性的裂解缓冲液可包括0.5M至9.5M、4M至9M或6.5M至7M如本文所述的尿素。示例性的裂解缓冲液可包括0.5M至3.5M或1.5M至2.5M如本文所述的硫脲。示例性的裂解缓冲液可包括0.5-9.5M尿素和硫脲，例如具有如本文所述的非离子表面活性剂的7M尿素和2M硫脲。单独使用尿素或与硫脲组合使用可用于裂解细胞以用于核酸纯化。在组合中，尿素和硫脲可协同作用以裂解细胞，并且可提供不带电荷的等速电泳兼容的缓冲液以用于核酸纯化。
示例性的裂解缓冲液可包括非离子表面活性剂，如本文所述的0.05-0.5％v/vIGEPAL CA-630。在一些情况下，裂解缓冲液可包含一种或多种尾随电解质。在一些情况下，裂解缓冲液可包含具有用于如本文所述的组织破坏或细胞裂解的添加剂的尾随电解质缓冲液。在一些情况下，裂解缓冲液可包含一种或多种前导电解质。在一些情况下，裂解缓冲液可包含具有用于如本文所述的组织破坏或细胞裂解的添加剂的前导电解质缓冲液。在一些情况下，裂解缓冲液可包含一种或多种前导电解质和一种或多种尾随电解质。在一些情况下，裂解缓冲液可包含具有用于如本文所述的组织破坏或细胞裂解的添加剂的一种或多种前导电解质和一种或多种尾随电解质。
在一些情况下，本文中的方法或过程可涉及使用裂解缓冲液裂解细胞或组织样品，该裂解缓冲液在裂解反应过程中使DNA和/或RNA的机械破坏最小化。例如，可以在包含具有HCl(例如，1mM、5mM、10mM HCl)的Tris(例如，5mM、10mM、20mM、30mM Tris)和非离子表面活性剂的缓冲溶液中裂解细胞或组织。非离子洗涤剂(例如，IGEPAL CA-630)可以在裂解缓冲液中以约1％、约2％、约3％、约4％或更高或者小于约1％存在。可以通过温和混合(如通过翻转和低速(自动移液器))在裂解缓冲液中裂解细胞或组织。在一些情况下，诸如蛋白酶K的酶可包括在裂解物或裂解缓冲液中。在一些情况下，在不离心的情况下进行裂解。在一些情况下，在裂解方法中使用离心。可以将裂解物引入等速电泳设备中，以纯化所需的分析物如高分子量DNA片段。
可以消化样品中的蛋白质，例如通过用蛋白酶进行酶促消化。蛋白酶可包括但不限于蛋白酶K、蛋白酶、内切蛋白酶(例如，胰蛋白酶、LysC、GluC、AspN)、肽酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。可以使用其他蛋白质或多核苷酸消化剂或降解剂，如溶菌酶。蛋白质的消化可以从交联核酸中去除交联蛋白，从而将它们转化为非交联核酸。蛋白质的消化可以在室温或在本文所述的升高的温度(例如，大于约25℃)下发生。
样品可以在设备(例如，具有连接到至少一个通道的至少一个储器的电动设备或系统)上进行处理，使得样品体积通过储器进入通道，其中小于20％的样品体积留在储器中，并随后可以施加离子电流通过通道中的样品体积。离子电流可以基本上不通过通道。在一些情况下，小于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的样品体积留在储器中。
样品可以在设备(例如，具有连接到至少一个通道的至少一个储器的电动设备或系统)上进行处理，使得通过储器进入通道的样品体积为装载到储器中的样品体积的至少50％，并随后可以施加离子电流通过通道中的样品体积。在一些情况下，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多的样品体积从储器中移动至通道。在一些情况下，装载到储器中的总体积小于或等于储器的内部体积。离子电流可以基本上不通过通道。在一些情况下，施加离子电流包括进行等速电泳。
在一些实施方式中，在样品体积已被装载到储器中并且随后被装载到通道中之后，可以将顶层缓冲液添加至储器，以促进样品体积移入通道。可以将一定体积的顶层缓冲液添加至储器，以将额外的样品体积“推入”通道中。例如，可以向储器添加大于或等于储器中剩余的样品体积的顶层缓冲液体积，以便使剩余样品体积的至少一部分移入通道。顶层缓冲液可以例如包含与样品缓冲液相同的缓冲液，但其中无分析物。
等速电泳设备
等速电泳和/或样品制备(例如，脱蜡、消化、裂解)可以在流体设备(例如微流体芯片)中进行。例如，图5A示出了通道的示意图，该通道包含具有样品入口501和尾随电解质储器502的样品制备(例如，脱蜡)区500、具有前导电解质储器511的纯化(例如，等速电泳)区510和洗脱出口520。毛细管屏障可在施加电压之前在样品流体与前导电解质缓冲液之间提供界面。可以在样品制备区500与尾随电解质储器502之间提供毛细管屏障，以限制、减少或防止样品流体和尾随电解质缓冲液的混合或压力驱动的流动。可以在纯化区510与前导电解质储器511之间提供毛细管屏障，以限制、减少或防止区510和前导电解质储器511的内容物的混合或压力驱动的流动。在另一个实例中，脱蜡可以首先在芯片外进行，或者由于起始材料可以是不必要的，在这种情况下，通道可包含裂解和消化区(例如，pH 7，56℃)以及交联去除和纯化(例如，等速电泳)区(例如，pH 7，80℃)。在另一个实例中，脱蜡可以首先在芯片外进行，或者由于起始材料可以是不必要的，在这种情况下，通道可包含裂解和消化区(例如，pH 7，温度T1)以及交联去除和/或纯化(例如，等速电泳)区(例如，pH 7，温度T2)。在另一个实例中，脱蜡可以首先在芯片外进行，或者由于起始材料可以是不必要的，在这种情况下，通道可包含破坏和/或裂解区(例如，pH 7，温度T1)以及消化和/或纯化(例如，等速电泳)区(例如，pH 7，温度T2)。在另一个实例中，脱蜡可以首先在芯片外进行，或者由于起始材料可以是不必要的，在这种情况下，通道可包含破坏和/或裂解区(例如，pH 7，温度T1)以及等温酶促扩增区(例如，pH 7，温度T2)。在另一个实例中，脱蜡可以首先在芯片外进行，或者由于起始材料可以是不必要的，在这种情况下，通道可包含破坏和/或裂解区(例如，pH7，温度T1)以及等温酶促消化区(例如，pH 7，温度T2)。在一些情况下，通道可包括三个区，例如破坏和/或裂解区(例如，pH 7，温度T1)、等温酶促扩增区(例如，pH 7，温度T2)和纯化(例如，等速电泳)区(例如，pH 7，温度T3)。图5B示出了具有八个平行通道的示例性流体设备盒，每个通道如图5A所示。图5C示出了图5B中所示的流体设备的俯视示意图，而图5D和图5E分别示出了侧视图和端视图。设备可包含样品入口或储器530、ITP电解质缓冲储器531和样品洗脱出口或储器532。通道和/或储器可耦合至一个或多个气动端口。流体设备的八个平行通道中的每一个可以从每个其他通道独立地操作。在一些情况下，每个通道均具有一组专用电极和电路来驱动ITP。电极可以例如位于尾随电解质储器502和前导电解质储器511中，使得电极不直接接触样品材料。
在一些情况下，平行通道之间可以几乎没有或没有流体或离子流动。在一些情况下，平行通道可以不彼此流体连通。平行通道之间的流体泄漏速率可以小于约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1μL/小时。
在一些情况下，平行通道之间可以几乎没有或没有电通信，使得平行通道彼此电隔离。每个平行通道可以独立地进行电控制，以向每个通道施加独立的电场。在一些情况下，通道之间的电流泄漏小于约0.1微安(μA)、0.2μA、0.3μA、0.4μA、0.5μA、0.6μA、0.7μA、0.8μA、0.9μA或1μA。在一些情况下，通道之间的阻抗可以大于0.1兆欧(MOhm)、0.2MOhm、0.3MOhm、0.4MOhm、0.5MOhm、0.6MOhm、0.7MOhm、0.8MOhm、0.9MOhm、1MOhm、5MOhm、10MOhm、20MOhm、30MOhm、40MOhm或50MOhm。
在一些情况下，每个平行通道可以耦合至相同的电流或电压源，并且被独立地电控制。在一些情况下，每个平行通道可以耦合至不同的电流或电压源，并且被独立地电控制。
图34示出了被配置用于检测和防止平行通道中在ITP期间的电流泄漏的回路。所述回路可以配置用于监测从单个HV电极进入ITP系统的电流和通过高压板泄漏的电流。通过以规律间隔或连续测量两种电流，即使在泄漏电流发生变化时也可以精确控制进入芯片的电流。这可以允许电极以净拉或净灌配置运行。所述回路可以包括电压源VS、灌电流控制器3406、拉电流控制器3408和两个电流测量回路3405和3409，其测量流经受控电流源3406和3408的电流。可以通过微处理器通过使用数模(DAC)转换器3402和3403来控制受控电流源。DAC转换器3402可以控制进入电极和泄漏路径的电流。DAC转换器3403可以控制进入泄漏路径的电流。微处理器可以通过使用模数转换器(ADC)3401和3404读取测量的电流。ADC3401可以测量电源VS处的电流。ADC 3404可以测量泄漏路径处的电流，所述泄漏路径处的电流被引导至地面。电流控制源3406和3408可以与装载3407连接，使得电流源3408可以向装载3407拉出电流，并且使电流源3406可以从装载3407灌入电流。流入装载3407的电流可以表示为IRL。流过受控电流源3408的电流可以表示为Im1。流过受控电流源3406的电流可以表示为Im2。因此，将会流入或流出装载3407的电流可以由等式IRL＝Im1-Im2描述。电流Im1由受控源3408命令的电流(将由Ic1表示)和泄漏电流(由IL1表示)组成，该泄漏电流是由于任何可物理实现的回路中存在的寄生导电路径。电流Im1可用等式Im1＝Ic1+IL1描述，并且类似地，电流Im2可用Im2＝Ic2+IL2描述。因此，通过扩展，流入或流出装载3407的电流可以由等式IRL＝Ic1+IL1-Ic2-IL2描述。在一些应用中，可能期望将电路命令为断开状态，以使IRL＝0。为此，通常会命令受控电流源使得Ic1＝0且Ic2＝0，然而，由于泄漏电流IL1和IL2，在断开状态期间流入或流出装载3407的电流可以是由IRL＝IL1-IL2描述的一些非零电流。为了将断开状态电流IRL减小到明显小于泄漏电流IL1或IL2的值，回路可以操纵额外电流通过受控电流源3406或3408，直至流入IRL的电流平衡为零。例如，回路可以设置Ic1＝Ic2+IL2-IL1或Ic2＝Ic1+IL1-IL2。在任一种情况下，所产生的电流IRL将减小至IRL＝0。换句话说，回路可以调节来自电流源3406、3408的电流以平衡和抵消泄漏电流，从而驱动平行通道之间的净流为0。
在许多应用中，在将受控电流源施加到装载一段时间然后从装载去除一段时间的情况下，诸如在等速电泳中，当要去除受控电流源时，可能期望电流源回路尽可能少地向装载泄漏。当打算关闭控制回路时，用于构造电流源的许多或所有回路组件可以允许一些寄生泄漏电流流过回路。使这种泄漏最小化通常需要使用表现出更低寄生泄漏性质的更复杂且更高质量的组件，然而，这样做的成本较高，并且通常需要更多的物理体积来实现回路。所公开的本公开内容允许通过操纵泄漏电流远离装载来减小施加到装载的泄漏电流。因此，本公开内容可以允许在电流源的构造中使用更简单的回路组件，实现具有为了其他目的如低成本或物理大小进行优化的回路组件的可以实现较低的泄漏电流的电流源。电流泄漏可以由流体通道之间的液体泄漏而引起，在所述流体通道中，材料层闭合了基底表面中的流体通道。确保在整个基底表面上所述层的牢固结合可以减少此类泄漏。电流泄漏还可能由液体在不同流体回路的端口，特别是作为通往流体通道的负压源的端口之间的移动所引起。在此类端口处提供疏水屏障可以减少此类泄漏。
在一些情况下，可以加热等速电泳设备上的每个区。在一些情况下，将这些区加热至相同的温度。在一些情况下，将各个区加热至不同的温度。在一些情况下，可以将第一区加热至37℃以上的温度，例如在约60℃至约100℃的范围内。在一些情况下，可以将第二区加热至37℃以上的温度，例如在约40℃至约60℃的范围内。
等速电泳流体设备可包含一个或多个储器，包括但不限于缓冲液装载储器、样品装载储器(包括接受固体、多相或其他非均质液体或溶液如组织、全血或未裂解的细胞悬浮液的储器)、前导电解质储器、尾随电解质储器、试剂储器、洗脱储器(例如，用于卸载处理过的样品)以及气体或空气储器。在一些情况下，一个物理储器可用于多种目的，诸如缓冲液装载和样品装载。液体或空气储器可用于施加外部压力以用于液体装载(例如，向液体孔施加正压力或仅向气体储器施加真空)。本领域普通技术人员将理解，本文所述的任何储器可用于装载或取回本文所述的任何缓冲液和/或样品。
储器可以与加热源或冷却源热连通，从而允许控制储器及其内的任何材料(例如，试剂、样品、产物)的温度。例如，当在流体设备内时可以对洗脱储器进行热控制以控制洗脱产物的温度(例如，用于保持结构完整性)。
试剂储器可用于在等速电泳之前、期间或之后装载一种或多种试剂来处理样品。试剂可包括消化试剂、扩增试剂、逆转录试剂、用于基于大小的分离的线性聚合物溶液、用于杂交反应的探针、连接试剂、染料(例如，本文所述的插入染料)、示踪剂、标记物和其他试剂。试剂储器可以连接到反应通道或另一通道的反应部分，在那里可以发生反应。可以施加加热或冷却(例如，使用如本文所讨论的热控制器)以催化反应(如与核酸或蛋白质的酶促反应)、使核酸杂交或解链，或从核酸中去除插入的染料(例如，在洗脱之前)。加热和冷却也可以用于控制固定操作温度以进行ITP(例如，可以施加冷却以减少焦耳加热的影响)，或将储器(例如，洗脱储器)保持在固定温度(例如，比室温更冷)，诸如用于纯化的核酸的稳定储存。可以施加光(例如，采用如本文所讨论的光源)以用于包括光学询问、荧光激发和反应能量或催化的目的。
气体或空气储器或气体或空气出口可以通过气体通道连接到流体设备内的液体通道，以允许从流体设备吹扫空气或其他气体(例如，在流体设备的液体填充期间)。气体或空气储器或气动压力端口可以通过气体通道连接到液体通道，以允许将流体泵送到流体设备上或流体设备内(例如，用于将流体从储器泵送到通道中)。
设备可包含彼此连接的多个纯化(例如，等速电泳)区。例如，第二等速电泳区可以与第一等速电泳区分隔开并平行运行，从而允许以特定比例(例如，基于两个区之间的电流比)分离样品带以供平行处理。
流体设备可包含多个平行的纯化区(参见，例如，图5C)。例如，流体设备可包含超过一组的纯化区，每组纯化区均具有相关的储器、入口、出口、通道和本文所述的任何其他组件(例如，样品制备区、电极、加热器、检测器)，这些组件平行，彼此分离，并且各自能够独立地处理样品。流体设备可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、48、96个或更多个平行的纯化区。流体设备可包含多个平行的通道。流体设备可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、48、96个或更多个平行的通道。位置平行的组件如纯化区或通道可以是并排的，位于不同的设备层(例如，水平或垂直层)，或者以不同的排列放置。平行的组件可以是相同的，或者可以进行不同的设计，但功能等效或几乎等效。例如，平行通道可具有不同的几何形状以允许更小的整体流体设备占地，但仍然具有类似的功能。或者，平行的组件可被设计为功能不同，例如平行地处理不同类型的样品，或者使样品经受不同的操作。在一些情况下，平行的组件可被设计为使不同的样品类型平行地经受不同的操作。在一些情况下，平行的组件可被设计为使相同的样品类型平行地经受不同的操作。在一些情况下，平行的组件可被设计为使不同的样品类型平行地经受相同的操作。在一些情况下，平行的组件可被设计为使相同的样品类型平行地经受相同的操作。在一些情况下，平行的组件可被设计为同时和/或独立地使两个或更多个样品平行地经受一个或多个操作。在一些情况下，两个或更多个通道之间(或两个或更多个纯化区之间)的泄漏速率可以小于0.5μl/小时、小于1μl/小时、小于5μl/小时、小于10μl/小时。在一些实施方式中，两个或更多个通道之间(或两个或更多个纯化区之间)的电流泄漏速率可以小于0.5μA、小于1μA、小于5μA或小于10μA。在一些实施方式中，通道或区域之间的阻抗可以大于0.5兆欧、大于1兆欧、大于5兆欧或大于10兆欧。
如本文所讨论的，流体设备可被设计为处理不同的样品体积。例如，图6A、图6B、图6C和图6D分别示出了用于样品体积大于或等于约200μL的快速纯化ITP流体设备600的俯视图、侧视图、仰视图和四分之三俯视图。该设备包含通过如本文所述的通孔或孔口连接到样品输入孔601、ITP缓冲液孔602和样品输出(洗脱)孔603的通道600。ITP缓冲液孔602可包括洗脱缓冲储器605、前导电解质储器606、前导电解质缓冲储器607和尾随电解质储器608。可以通过洗脱缓冲通道609将洗脱储器603连接到洗脱缓冲储器605。可以在洗脱缓冲通道609中提供毛细管屏障(例如，如本文所述的平台毛细管屏障、斜坡毛细管屏障或悬崖毛细管屏障)以减少或防止洗脱缓冲储器605与洗脱储器603的内容物之间的混合或压力驱动的流动。前导电解质储器606可通过前导电解质缓冲通道610连接到前导电解质缓冲储器607。可以在前导电解质缓冲通道610中提供毛细管屏障(例如，平台毛细管屏障、斜坡毛细管屏障或悬崖毛细管屏障)以减少或防止前导电解质缓冲储器607与前导电解质储器606的内容物之间的混合或压力驱动的流动。缓冲储器605可含有洗脱缓冲液电解质，其离子强度高于洗脱储器603中的电解质的离子强度，而缓冲储器607可含有前导电解质，其离子强度高于前导电解质储器606中的电解质的离子强度。该设备可进一步包含沿其边缘的气动端口604，其被配置为耦合至气动设备，例如台式仪器上的真空源。气动端口604可通过如本文所述的气体通道耦合至通道600和储器。在气动端口604处施加抽吸可将样品、前导电解质和洗脱缓冲液装载到通道600中。在一些情况下，尾随电解质缓冲液流体保留在尾随电解质储器608中。抽吸可以同时或顺序地施加到气动端口604，以分别同时或分阶段地装载通道600。可以将样品装载到通道600的第一区或子通道，其在通道600中以180°低色散转向从尾随电解质储器608延伸到毛细管屏障611。毛细管屏障611可在装载过程中在样品与前导电解质缓冲液之间提供界面，以限制、减少或防止混合或压力驱动的流动。毛细管屏障611可包括如本文所述的悬崖毛细管屏障。可在尾随电解质储器608与第一区或子通道之间提供毛细管屏障(例如，悬崖毛细管屏障、斜坡毛细管屏障或平台毛细管屏障)，以限制、减少或防止尾随电解质储器608的内容物与样品之间的混合或压力驱动的流动。可将前导电解质装载到通道600的第二区或子通道，其从毛细管屏障611延伸到毛细管屏障612。毛细管屏障612(例如，平台毛细管屏障、斜坡毛细管屏障或悬崖毛细管屏障)可以在前导电解质缓冲液与洗脱缓冲液之间提供界面。可以将洗脱缓冲液装载到通道600的第三区或子通道，其从毛细管屏障612延伸到洗脱储器603。在一些实施方式中，ITP缓冲液孔602可进一步包含尾随电解质缓冲储器(未示出)，该尾随电解质缓冲储器含有离子强度高于尾随电解质储器608中的电解质的离子强度的尾随电解质。尾随电解质缓冲储器可通过尾随电解质缓冲通道(未示出)连接到尾随电解质储器608。尾随电解质缓冲通道可包含毛细管屏障(例如，斜坡毛细管屏障、平台毛细管屏障或悬崖毛细管屏障)，以限制、减少或防止尾随电解质缓冲储器与尾随电解质储器608的内容物之间的混合或压力驱动的流动。
电极可以例如位于尾随电解质储器608、尾随电解质缓冲储器(未示出)、前导电解质储器606和/或前导电解质缓冲储器607中，使得电极不直接接触样品材料。响应于来自传感器(例如本文所述的电压、电流、电导率或温度传感器)的反馈，电极可被触发以改变或控制所施加的电场。例如，可以检测ITP区内的核酸从通道600的第二区到通道600的第三区的通路，并且来自检测器的反馈可以触发所施加的电流改变。例如，可以根据仪器的方案增加、减少或结束电流。例如，可以暂停电流(例如暂时降至零)，以能够对核酸进行芯片上量化。备选地或组合地，可以降低电流，以减缓第三区内的等速电泳，从而使在从前导电解质缓冲液转变至洗脱缓冲液(或第二前导电解质缓冲液)时可能已经分散的核酸在到达洗脱孔603之前进一步浓缩。
本文提供的方法和过程包括使用本文提供的任何设备的方法和过程。本文提供的具有用于平行处理多个样品的多个信道的设备可以在多种环境中使用。在一些情况下，方法可包括使用设备处理共同具有某个特征(例如，实体组织裂解物、细胞裂解物、实体组织、固定组织)的多个样品(例如，通过对这些样品进行等速电泳)。在一些情况下，所述多个样品可以是不同的样品。例如，该方法可涉及在设备的一个区域中对组织样品进行等速电泳，同时但独立地对不同的样品(如细胞样品或包含交联核酸的样品)进行等速电泳。
在一些情况下，本文提供的方法或多路过程可涉及对通道中的样品进行等速电泳，其与使用相同或相似的前导电解质和/或尾随电解质缓冲液对第二通道中的第二样品进行等速电泳平行。在一些情况下，使用第一前导电解质缓冲液处理一个通道中的样品，并使用与第一前导电解质缓冲液不同的第二前导电解质缓冲液处理不同通道中的样品。例如，第一前导电解质缓冲液可含有一种或多种与第二前导电解质缓冲液中所含有的前导电解质离子不同的前导电解质离子。在另一个实例中，第一前导电解质缓冲液可含有一种或多种与第二前导电解质缓冲液中所含有的前导电解质离子相同的前导电解质离子，但第一前导电解质缓冲液中的这类前导电解质离子的浓度与第二前导电解质缓冲液中的这类离子的浓度不同。在一些情况下，本文提供的方法或过程可涉及对通道中的样品进行等速电泳，其与使用相同或相似的尾随电解质或尾随电解质缓冲液对第二通道中的第二样品进行等速电泳平行。在一些情况下，使用第一尾随电解质缓冲液处理一个通道中的样品，并使用与第一尾随电解质缓冲液不同的第二尾随电解质缓冲液处理不同通道中的样品。例如，第一尾随电解质缓冲液可含有一种或多种与第二尾随电解质缓冲液中所含有的尾随电解质离子不同的尾随电解质离子。在另一个实例中，第一尾随电解质缓冲液可含有一种或多种与第二尾随电解质缓冲液中所含有的尾随电解质离子相同的尾随电解质离子，第一尾随电解质缓冲液中的这类尾随电解质离子的浓度与第二尾随电解质缓冲液中的浓度不同。
在一些实施方式中，可将一个或多个储器连接到两个通道或子通道。例如，可将洗脱储器603连接到通道600和洗脱缓冲通道609两者。备选地或组合地，可将前导电解质储器606连接到通道600和前导电解质缓冲通道610。备选地或组合地，可将尾随电解质储器608连接到600和尾随电解质缓冲通道两者。备选地或组合地，可将样品输入孔601连接到通道600中的中点，使得通道600延伸到输入孔601的左侧(作为第一子通道)和右侧(作为第二子通道)。可将两个通道或子通道连接到一个或多个储器，其中两个通道之间的角度(在流体设备的主平面中扫描)为至少约5°、10°、20°、30°、40°、45°、50°、60°、70°、80°、90°、100°、110°、120°、130°、135°、140°、150°、160°、170°或180°。可将两个通道或子通道连接到一个或多个储器，其中两个通道之间的角度(在流体设备的主平面中扫描)为至多约5°、10°、20°、30°、40°、45°、50°、60°、70°、80°、90°、100°、110°、120°、130°、135°、140°、150°、160°、170°或180。
例如，所述设备可包含如图所示的8个通道。每个通道可容纳约50μL至约275μL的样品体积和约500μL的总体积。每个通道中的180°低色散转向可以在具有标准SLAS足迹的8通道多通道板中促进如此大的样品体积。
图7A、图7B、图7C和图7D分别示出了用于样品体积小于或等于约100μL的快速纯化ITP流体设备700的俯视图、侧视图、仰视图和四分之三仰视图。该设备包含样品输入孔701、ITP缓冲液孔702和样品输出(洗脱)孔703。设备700可以与设备600基本上相似，但具有不包括通道中的180°转向的不同通道几何形状(和相应的储器几何形状)。
例如，所述设备可包含如图所示的8个通道。每个通道可容纳约10μL至约100μL的样品体积。具有较小样品体积的设备可用于PCR清理或其他反应清理应用或用于较小的样品大小(例如具有少量细胞或少量组织的样品)。
图8A、图8B、图8C和图8D分别示出了用于样品体积小于或等于约100μL的另一快速纯化ITP流体设备800的俯视图、侧视图、仰视图和四分之三仰视图。该设备包含样品输入孔801、ITP缓冲液孔802和样品输出(洗脱)孔803。设备800可以与设备600和700基本上相似，但在单个芯片上包含多个不同的通道几何形状。
本文所述的任何流体设备可包含一个或多个电极，该电极将电场施加到流体设备或流体设备的一部分。所施加的电场可用于进行等速电泳。流体设备可包含一个或多个电极，该电极将单个电场施加到流体设备的所有通道。流体设备可包含一个或多个电极，该电极将多于一个电场施加到流体设备，例如设备上的每个通道一个电场。在一些情况下，第一和第二电场由单个电极对生成。在一些情况下，第一和第二电场由不同的电极对生成。电场可以同时、顺序地和/或独立地施加或彼此施加。电极可以是外部的，如落入储器的电线。电极可以是内部的，如微加工的、印刷的或包括在流体设备的制造中的其他包埋元件。电极材料可包括但不限于金属(例如，铂、钛)和碳。
流体设备的一个或多个电极可以是一个或多个电路的一部分，该电路将电场施加到流体设备或流体设备的一部分。流体设备可包含一个或多个电路，该电路将单个电场施加到流体设备的区域的所有通道或等速电泳区。流体设备可包含一个或多个电路，该电路将多于一个电场施加到流体设备，例如设备上的每个通道一个电场。在一些情况下，第一和第二电场可以由单个电路生成。在一些情况下，第一和第二电场可以由不同的电路生成。电场可以通过一个或多个电路同时、顺序地和/或独立地或彼此施加。在一些情况下，设备(或台式仪器)可被配置为与第二电路同时且独立于第二电路控制第一电路。
电极可以位于储器如尾随和前导电解质储器中，其可以通过缓冲通道与样品储器分离。在一些情况下，电极位于缓冲通道或缓冲储器中。电解质储器或电解质缓冲储器中的电极的位置可以将电极与分析物如核酸隔离，以减少或消除样品材料对电极的污染。该方法可以允许重复使用电极而不会在样品之间产生交叉污染。在一个实例中，尾随电解质储器或尾随电解质通道通过缓冲通道连接到缓冲储器，该缓冲储器含有尾随电解质离子和电极，并且尾随电解质储器还连接到样品储器或样品通道，该样品储器或样品通道反过来通过前导电解质通道连接到前导电解质储器；前导电解质储器还通过缓冲通道连接到缓冲储器，该缓冲储器还含有前导电解质和电极。在另一个实例中或作为前一个实例的延续，含有洗脱缓冲液的洗脱储器通过洗脱通道连接到前导电解质储器，并且还连接到含有洗脱缓冲液电解质和电极的缓冲储器。缓冲储器与其相应的储器之间的缓冲通道可包括毛细管屏障和/或低横截面面积，以限制、减少或防止如本文所述的混合和压力驱动的流动。缓冲储器可含有与其相应的储器具有相同或更高离子强度的电解质。例如，洗脱储器可连接到含有与洗脱储器具有相同或更高离子强度或浓度的洗脱缓冲液电解质的缓冲储器。尾随电解质储器可连接到含有与尾随电解质储器具有相同或更高离子强度或浓度的尾随电解质的缓冲储器。前导电解质储器可连接到含有与前导电解质储器具有相同或更高离子强度或浓度的前导电解质的缓冲储器。提供连接到具有较高离子强度的洗脱储器、尾随电解质储器和/或前导电解质储器的专用缓冲储器可以提供额外的离子池以在样品移动通过通道时维持通道中的pH和电导率。
流体设备可与一个或多个热控制器一起使用。例如，图9A示出了八重样品制备和等速电泳设备的示意图，其包含图5A所示设计的八个平行通道900。图9B示出了第一和第二热控制器901、902的示意图。温度T1(例如，80℃)下的第一热控制器901与通道的样品制备区对准，并且温度T2(例如，50℃)下的第二热控制器902与通道的等速电泳区对准。在一些情况下，额外的热控制器可以与通道的额外的区域对准(未示出)，例如，温度T3下的第三热控制器可与温度T3下的第三区对准。在一些情况下，每个通道的每个区域可具有自身单独的热控制器，而不是与其他通道的相应区域共享公共热控制器。在其他情况下，所有区域或通道可共享一个热控制器。在其他情况下，多个一个但少于所有区域或通道可共享一个热控制器。热控制器可包含组件，该组件包括但不限于电阻加热器、基于流体的加热或冷却系统和珀耳帖设备(Peltier devices)。热控制器可由包括但不限于金属(例如，铂、钛、铜、金)、碳和氧化铟锡(ITO)的材料制成。热控制器可包含温度传感器，其可用于监控受控温度并提供温度反馈以进行热控制。如本公开内容中进一步讨论的，热控制器可以与计算机控制系统一起使用。在一些情况下，热控制器在没有温度反馈的情况下进行操作。热控制器可集成到流体设备中或位于外部，如在台式系统内。
流体设备可与一个或多个光源一起使用。光源可集成到流体设备中或者位于流体设备外部，诸如在台式系统内或在单独的设备中。光源可以为光学询问、荧光激发、温度感测、反应能量或催化以及其他目的提供光。
流体设备可被设计成使得其最外层框架或尺寸符合微量滴定板标准(例如，SLAS微量滴定板标准)。流体设备可被设计为使用微量滴定板(例如，SLAS标准微量滴定板)的限定端口作为液体储器，其中气动致动端口位于液体储器外部的未使用表面上。气动端口可以布置在具有与微量滴定板兼容的布局的流体设备的边缘处，从而避免通过在液体储器的气动致动的交叉污染，并且使得端口易于用气动硬件进入。除了其他功能外，所限定的端口的子集还可用于气动致动。在一些情况下，流体设备可以以两个互锁部件进行设计和制造：第一，包括通道单元(例如具有易于薄膜粘合的平坦表面的层)、孔和气动端口的插入件；以及第二，符合微量滴定板标准(例如，SLAS微量滴定板尺寸标准)的外环或覆盖件，包括用于将流体设备与台式系统对准的对准特征和用于与第一部件互锁的配合特征。可以将这些孔连接以形成凸台，这可以与注塑成型更加兼容。在一些情况下，可以将流体设备设计和制造为三个连接部分；首先，芯片或基底，其包括孔和其顶面上的气动端口以及其底面上的蚀刻或模制通道；第二，材料层(例如，薄膜)，其密封到芯片的底面以形成闭合通道(一起足以形成流体芯片)；以及第三，提供符合微量滴定板标准(例如，SLAS微量滴定板尺寸标准)的覆盖件外环或覆盖件，包括用于将流体设备与台式系统对准的对准特征和用于与第一部分互锁的配合特征。这样的设备也可以称为盒。
图35A-图35B示出了包括两个互锁部分的流体设备3500的示例。图35A示出了覆盖件3501，其安装到微流体芯片插入部分3502上，如图35B所示。图35B示出了芯片3502和盖3501之间的分解图。芯片或基底3502可以具有第一面和第二面。第一面可以包括被配置用于容纳液体的多个储器3508。第二面可以包括多个通道。储器3508可以经由基底3502中的通孔与通道连通。疏水膜3503可以夹在芯片3502与盖3501之间。盖3501可以被配置用于捕获并压缩两个疏水膜过滤器3503，疏水膜过滤器3503可以用作可以允许空气而不是流体通过的阀。当将盖3501组装到微流体芯片3502上时，盖3501的底侧上的可压缩垫圈3504(如图35A所示)可以在芯片3502上提供恒定的向下压缩力，从而创建密封，以防止或减少通道和/或仪器之间的泄漏。这种向下的力可以最初在组装期间在芯片3502与盖3501之间的两组特征接合时创建。首先，盖周围的一组卡扣3505可与芯片3502上的配合特征3506接合，从而确保盖3501与芯片3502之间的对准，并提供从垫圈特征到膜3503上的初始压缩。随着组装期间施加额外的力，盖上的过盈配合特征3507可以与芯片3502上的有限组的流体储器3508的外壁接合。过盈配合3507可以被设计成维持固定的位移，因此当去除组装力时在垫圈3504上维持固定的压缩力。与过盈特征3507相邻的固定高度支座3509可以限制盖3502能够下压到储器3508上的距离。覆盖件3501可以包括用于与气动设备，例如本文所述的气动歧管接口的配合表面3510。
例如，芯片3502可以包括本领域普通技术人员所期望的任何数目的过盈配合特征3507。例如，芯片3502可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个过盈配合特征3507。如本领域普通技术人员将理解的，过盈配合特征3507的保持能力可以取决于芯片3502上的过盈配合特征3507的数目。例如，四个过盈配合特征3507可以具有4lb-f/特征3507的保持能力，而对于相同的去耦合力，八个过盈配合特征3507可以具有2lb-f/特征3507的保持能力。过盈配合特征3507可以具有在约10um至约120um的范围内的径向过盈，例如在约30um至约60um的范围内，例如约45um。
图36A-图36B示出了包括多个部分的流体设备3600的示例。图36A示出了三部分流体设备3600的分解透视图。图36B示出了三部分流体设备3600的分解横截面图。流体设备3600可以包括覆盖件或覆盖层3601、芯片板或基底3602、疏水膜3603以及可压缩垫圈3604。疏水膜3603可以包括安设在气动端口3605内和/或跨气动端口3605安设且夹在盖3601与基底3602之间的疏水膜3603的条带。可压缩垫圈3604可以包括含有孔口的垫圈材料的条带，所述孔口被成形和间隔成对应于气动端口3605。可压缩垫圈条带3604可以被夹在盖3601、疏水膜3603和芯片3602之间，以在芯片3602上提供恒定的压缩力，并创建密封以减少或防止通道之间的泄漏。盖3601和芯片3602可以包括一个或多个配合特征(例如，卡扣、过盈配合、夹具、粘合剂、螺钉、螺栓、高度支座等)，其被配置用于将两个零件耦合在一起，如本文所述。配合特征可以被配置用于向可压缩垫圈3604施加力以密封气动端口3605，如本文所述。盖3601可以被配置用于与气动设备和/或仪器如本文所述的任何仪器的其他元件接口。
气动端口3605可以包括从芯片3605的气动通道延伸并穿过覆盖层3601的立式圆柱形通孔或孔口。芯片层3602上的气动端口3605的部分可以具有芯片3602的通道的高度或在其附近的高度。气动端口3605可以被配置为具有使样品损失最小化的高度。基底3602上的气动端口3605可以具有相对于基底3602的顶表面在约-1mm至约2mm范围内的高度，例如相对于基底3602的顶表面在约-500um至约1000um范围内的高度。气动端口3605中的一个或多个可以从基底3602的顶表面插入(例如，高度为相对于顶表面在约-1um至约-1mm范围内，或在约-1um至约-500um范围内)。气动端口3605中的一个或多个可以从基底3602的顶表面相对垂直地突出(例如，高度为相对于顶表面在约0um至约2mm范围内，或在约0um至约1000um范围内)。疏水膜3603和垫圈3604在芯片层3602上方的气动端口3605内的放置可以减少或防止当向其施加负压时通过气动端口3605的液体损失。
在一些实施方式中，疏水膜3603和/或可压缩垫圈3604可以在层互锁前附接到盖3601。或者，疏水膜3603和/或可压缩垫圈3604可以在层互锁前附接到芯片3602。
芯片3602可以包含本文所述的任何流体元件。例如，芯片3602可以包含样品入口储器3606、尾随电解质储器3607、前导电解质缓冲储器3608、前导电解质储器3609、洗脱缓冲储器3610和洗脱储器3611，如本文所述。芯片3602的第一(例如，顶部)面或侧面可以包含储器3606-3611，如所示。芯片3602的第二(例如，底部)面或侧面可以包含一个或多个ITP通道(本文也称为流体回路)。芯片3602的第二侧可以包含本文所述的任何ITP通道，或ITP通道的任何组合。例如，芯片3602的第二侧可以包含如图38中所示的8个平行通道。
图37A-图37B示出了包括三个部分的流体设备3700的示例。图37A示出了三部分流体设备3700的分解透视图。图37B示出了三部分流体设备3700的分解横截面图。流体设备3700可以包括覆盖件或覆盖层3701、芯片板或基底3702、疏水膜3703和可压缩垫圈3704，这些基本类似于设备3600。疏水膜3703可以包括安设在气动端口3705内和/或跨气动端口3705安设并夹在盖3701与基底3702之间的疏水膜3703的条带。可压缩垫圈3704可以包括含有孔口的垫圈材料的条带，所述孔口被成形和间隔成对应于气动端口3705。气动端口3705可以与设备3600的气动端口基本相似。盖3701和芯片3702可以包括一个或多个配合特征(例如，卡扣、过盈配合、高度支座等)，其被配置用于将两个零件耦合在一起，如本文所述。配合特征可以被配置用于向可压缩垫圈3704施加力，以密封气动端口3705，如本文所述。盖3701可以被配置用于与气动设备和/或仪器如本文所述的任何仪器的其他元件接口。设备3700可以进一步包括材料的底层3706。芯片3702可以制造成使得在芯片3702的底层或底侧上形成通道的三个壁。材料的底层3706可以耦合至芯片3702的底侧以形成通道的第四壁，从而创建闭合通道。材料的底层3706可以通过使用溶剂、加热、溶剂热结合、压力、粘合剂结合、激光焊接或其组合耦合至芯片3702的底侧。例如，所述材料可以是热封件，其通过施加热量而结合到芯片表面，所述热量使材料部分熔化，从而使它们结合。在某些实施方式中，可以通过使用溶解材料从而使它们一起流动并结合的溶剂来实现结合。
在一些实施方式中，材料的底层3706可以包含如本文所述的环烯烃共聚物。例如，材料的底层3706可以包含
Figure GDA0003654970080001161
8007。
在一些实施方式中，可以通过使用有机溶剂(例如，甲苯)来实现将材料的底层3706与芯片3702的底侧的结合。
图38示出了三部分流体设备3800的芯片底侧上的8个平行通道的示例性通道示意图。设备3800可以包括多部分设备，其可以基本类似于本文所述的设备3500、3600或3700。设备3800可以包括8个平行通道，如本文所述。每个通道可以连接到样品输入孔或储器3801、洗脱储器3802、洗脱缓冲储器3803、前导电解质储器3804、前导电解质缓冲液储器3805和尾随电解质储器3806。储器3801-3806可以通过通孔或孔口与通道耦合，如本文所述。洗脱储器3802可以通过洗脱缓冲通道3807连接至洗脱缓冲储器3803。可以在洗脱缓冲通道3807中提供毛细管屏障3808(例如，如本文所述的平台毛细管屏障)以减少或防止在洗脱缓冲储器3803与洗脱储器3802的内容物之间的混合或压力驱动的流动。前导电解质储器3804可以通过前导电解质缓冲通道3809连接到前导电解质缓冲储器3805。可以在前导电解质缓冲通道3809中提供毛细管屏障3810(例如，平台毛细管屏障)以减少或防止前导电解质缓冲储器3805与前导电解质储器3804的内容物之间的混合或压力驱动的流动。缓冲储器3803可以含有比洗脱储器3802中更高的离子强度的洗脱缓冲液电解质，而缓冲储器3805可以含有比前导电解质储器3804中的离子强度更高的离子强度的前导电解质。所述设备还可以包含沿其边缘的气动端口3811，其被配置用于耦合至气动设备，例如台式仪器上的真空源。气动端口3811可以通过气体通道3812耦合至通道和储器，如本文所述。在气动端口3811处施加吸力(即负气动压力)可以将样品、前导电解质和洗脱缓冲液装载到通道中。气体通道3812可以在一个或多个毛细管屏障处耦合至通道，使得负压被施加至所述毛细管屏障。可以同时或顺序地向气动端口3811施加吸力以分别同时或分阶段地装载通道。可以将样品装载到第一区或子通道中，所述第一区或子通道以通道中的180°低分散转向从尾随电解质储器3806延伸至毛细管屏障3813。毛细管屏障3813可以在装载期间在样品与前导电解质缓冲液之间提供界面，以限制、减少或防止混合或压力驱动的流动。毛细管屏障3813可以包括如本文所述的悬崖毛细管屏障。尾随电解质储器3806可以通过尾随电解质通道3814连接至通道第一区或子通道。可以在尾随电解质储器3806和第一区或子通道之间的尾随电解质通道3814中提供毛细管屏障3815(例如，悬崖毛细管屏障)，以限制、减少或防止尾随电解质储器3806的内容物与样品之间的混合或压力驱动的流动。可以将前导电解质装载到通道的第二区或子通道中，所述第二区或子通道从毛细管屏障3813延伸到毛细管屏障3816。毛细管屏障3816(例如，平台毛细管屏障)可以在前导电解质缓冲液与洗脱缓冲液之间提供界面。第一区或子通道和第二区或子通道可以构成流体通道或回路的ITP分支。可以将洗脱缓冲液装载到通道的第三区或子通道中，所述通道的第三区或子通道从毛细管屏障3816延伸至洗脱储器3802。第三区或子通道可以构成流体通道或回路的洗脱分支。
例如，电极可以位于尾随电解质储器3806、前导电解质储器3804和/或前导电解质缓冲储器3805中，使得电极不直接接触样品材料。电极可被触发以响应于来自传感器(例如，如本文所述的电压、电流、电导率或温度传感器)的反馈来改变或控制所施加的电场。例如，可以检测ITP区内的核酸从通道的第二区到通道的第三区的通过，并且来自检测器的反馈可以触发所施加的电流改变。例如，可以根据仪器的方案来增大、减小或终止电流。例如，可以暂停电流(例如，暂时降至零)，以实现核酸的芯片上量化。备选地或组合地，可以减小电流以减缓第三区内的等速电泳，从而允许在从前导电解质缓冲液转变至洗脱缓冲液(或第二前导电解质缓冲液)时可能已经分散的核酸在到达洗脱孔3802之前进一步浓缩。
毛细管屏障3808可以包括本领域普通技术人员期望的任何毛细管屏障。例如，毛细管屏障3808可以包括斜坡毛细管屏障、平台毛细管屏障或悬崖毛细管屏障。
毛细管屏障3810可以包括本领域普通技术人员期望的任何毛细管屏障。例如，毛细管屏障3810可以包括斜坡毛细管屏障、平台毛细管屏障或悬崖毛细管屏障。
毛细管屏障3813可以包括本领域普通技术人员期望的任何毛细管屏障。例如，毛细管屏障3813可以包括斜坡毛细管屏障、平台毛细管屏障或悬崖毛细管屏障。
毛细管屏障3815可以包括本领域普通技术人员期望的任何毛细管屏障。例如，毛细管屏障3815可以包括斜坡毛细管屏障、平台毛细管屏障或悬崖毛细管屏障。
毛细管屏障3816可以包括本领域普通技术人员期望的任何毛细管屏障。例如，毛细管屏障3816可以包括斜坡毛细管屏障、平台毛细管屏障或悬崖毛细管屏障。
图39示出了可以与本文所述的多部分设备基本相似的示例性多部分设备3900。设备3900可以包括覆盖层3901和芯片或基底3902，如本文所述。设备3900可以包括样品孔3903，其可以经由如本文所述的通孔或孔连接至样品通道。样品孔3903可以包括本文所述的任何样品孔。在使用前，设备3900可以包括样品密封层3904，其被配置用于在装载样品之前密封样品孔3903，例如，以使一种或多种液体从其他储器气动装载到样品之前的通道中，如本文所述。样品密封层3904可以包括可去除材料。样品密封层3904可以包括热封材料或粘合材料。样品密封层3904可以包括热塑性薄膜。样品密封层3904可以包括聚合物或塑料。例如，样品密封层3904可以包括可剥离的聚合物密封件，如
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Clear Heat SealPlus。设备3900还可以包括一个或多个定向特征3905，其被配置用于防止设备3900错误插入仪器(例如，本文所述的任何仪器)。定向特征3905还可以防止设备3900在插入仪器后移动。盖3901可以包括配合接口3906，其被配置用于与仪器例如本文所述的任何仪器的气动设备接口。设备3900还可以包括便于将芯片与仪器一起使用的一个或多个元件，例如，条形码追踪标签3907，其被配置用于当如本文使用时帮助用户追踪设备3900。
流体设备可由多种材料制成，包括但不限于玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃)、硅、塑料和弹性体。塑料可包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、高密度聚乙烯(HDPE)和低密度聚乙烯(LDPE)。弹性体可包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
本文所述的任何流体设备可以包括多部分流体设备。多部分流体设备可以由本文所述的一种或多种材料制成。在一些实施方式中，本文所述的多部分流体设备的所有部分可以由相同的材料制成。在一些实施方式中，本文所述的多部分流体设备的一个或多个部分可以由相同的材料制成。在一些实施方式中，本文所述的多部分流体设备的所有部分可以由不同的材料制成。
覆盖件可以由多种材料制成，包括但不限于玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃)、硅、塑料和弹性体。塑料可包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、高密度聚乙烯(HDPE)和低密度聚乙烯(LDPE)。弹性体可包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
芯片或基底可以由多种材料制成，包括但不限于玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃)、硅、塑料和弹性体。塑料可包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、高密度聚乙烯(HDPE)和低密度聚乙烯(LDPE)。弹性体可包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。例如，芯片或基底可以包含COC，诸如TOPAS8007。
底层可以由多种材料制成，包括但不限于玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃)、硅、塑料和弹性体。塑料可包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、高密度聚乙烯(HDPE)和低密度聚乙烯(LDPE)。弹性体可包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。例如，芯片或基底可以包含COC，诸如TOPAS 8007。在一些实施方式中，底层可以包含与芯片相同或相似的材料。例如，两种材料可以具有相同的熔化温度。
疏水膜可以包括透气的疏水膜。疏水膜可以不是液体可渗透的。疏水膜可以是多孔的。疏水膜可以包括柔性材料，使得其可被盖和/或可压缩垫圈压缩，从而密封气动端口并减少或防止流体泄漏，如本文所述。
可压缩垫圈可以由多种材料制成，包括但不限于氯丁橡胶。
图40示出了包括电压和温度感测的示例性流体回路4000。流体回路4000可以基本类似于图38所述的回路。流体回路4000可以包括通道，其连接到样品输入孔或储器、洗脱储器(EB)、洗脱缓冲储器(EBH)、前导电解质储器(LE)、前导电解质缓冲储器(LEH)和尾随电解质储器(TEH)，如本文所述。储器4001可以定位在设备(例如，设备3800)中以使得孔4001位于微量滴定板的标准位置，如本文所述。储器4001可以通过通孔或孔口耦合至通道，如本文所述。可以在前导电解质缓冲通道中(LE和LEH之间)提供毛细管屏障(例如，平台毛细管屏障)，以减少或防止前导电解质缓冲储器(LEH)与前导电解质储器(LE)的内容物之间的混合或压力驱动的流动，如本文所述。设备4000还可以包括沿其边缘的气动端口4002，其被配置成耦合至气动设备，例如台式仪器上的真空源。气动端口4002可以定位在设备中用于与通常可用的气动歧管接口的标准位置处。气动端口4002可以通过气体通道耦合至通道和储器，如本文所述。在气动端口4002处施加吸力(即负气动压力)可将样品、前导电解质和洗脱缓冲液装载到通道中，如本文所述。气体通道4002可以在一个或多个毛细管屏障处耦合至通道，以使得将负压施加至所述毛细管屏障，如本文所述。可以同时或顺序地将吸力施加至气动端口4002，以分别同时或分阶段地装载通道。可以将样品装载到第一区或子通道4003中，所述第一区或子通道以通道中的180°低分散转向从尾随电解质储器(TEH)延伸至毛细管屏障4004。毛细管屏障4004可在装载期间在样品与前导电解质缓冲液之间提供界面，以限制、减少或防止混合或压力驱动的流动。毛细管屏障4004可以包括如本文所述的悬崖毛细管屏障。毛细管屏障4004可以实现通道4000内的样品和洗脱缓冲液的无气泡启动或装载，如本文所述。毛细管屏障4004可以用于反馈触发，如本文所述。例如，当ITP带通过毛细管屏障4004时，电压的导数可以表现出峰值，如图92B所示。该峰值可以触发仪器执行如本文所述的附加电压信号处理。尾随电解质储器(TEH)可以通过尾随电解质通道连接至通道第一区或子通道。可以在尾随电解质储器(TEH)与第一区或子通道4003之间的尾随电解质通道中提供毛细管屏障4005(例如，悬崖毛细管屏障)，以限制、减少或防止尾随电解质储器(TEH)的内容物与样品之间的混合或压力驱动的流动，如本文所述。可以将前导电解质装载到通道的第二区或子通道中，所述第二区或子通道从毛细管屏障4004延伸到毛细管屏障4006(例如，平台毛细管屏障)，所述毛细管屏障可以在前导电解质缓冲液与洗脱缓冲液之间提供界面。可以在通道的第二区内提供变窄或构造4007。构造4007可以用于反馈触发，如本文所述。例如，当ITP带通过构造4007时，电压的导数可以表现出峰值，如图92D所示。该峰值可以触发仪器执行本文所述的附加信号处理(例如，温度信号处理)。还可以在通道的第二区内提供集成定量区域4008。集成定量区域4008可以用于对通过的ITP带中的核酸进行在线(即芯片上)定量，如本文所述。第一区或子通道4003和第二区或子通道可以构成流体通道或回路4000的ITP分支。可以将洗脱缓冲液装载到通道的第三区或子通道中，所述第三区或子通道从毛细管屏障4006延伸到洗脱储器(EB)。第三区或子通道可以构成流体通道或回路4000的洗脱分支。第三区可包括本文所述的红外温度传感器4009。
毛细管屏障4004可以包括本领域普通技术人员期望的任何毛细管屏障。例如，毛细管屏障4004可以包括斜坡毛细管屏障、平台毛细管屏障或悬崖毛细管屏障。
毛细管屏障4005可以包括本领域普通技术人员期望的任何毛细管屏障。例如，毛细管屏障4005可以包括斜坡毛细管屏障、平台毛细管屏障或悬崖毛细管屏障。
毛细管屏障4006可以包括本领域普通技术人员期望的任何毛细管屏障。例如，毛细管屏障4006可以包括斜坡毛细管屏障、平台毛细管屏障或悬崖毛细管屏障。
可以根据其光学性质选择用于制造流体设备的材料。例如，可以使用在感兴趣的波长(例如，核酸标记物或染料的激发和发射波长)下显示出低自发荧光、低散射和高透射的材料。可以在一个流体设备中使用不同的材料；例如，检测区域可以用显示出有用光学性质的材料制成，而设备的其他区域可包含其他材料。
可以根据其热性质选择用于制造流体设备的材料。例如，可以选择高热导率的材料。或者，可以选择低热导率的材料(例如，使流体设备或流体设备的区域热绝缘)。可以在一个流体设备中使用不同的材料；例如，加热区域可以具有高热导率的材料以用于改善与热控制器的热连通，同时加热区域由低热导率的材料包围以与设备的其他区域热隔离。
可以根据其弹性或变形性质选择用于制造流体设备或微通道的材料。例如，可以选择低弹性的材料，以允许如本文所述的塑料通道闭合。或者，可以选择高弹性的材料。可以在一个流体设备中使用不同的材料；例如，可以在单个流体设备中使用聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)等等。材料可具有至少1GPa、1.5GPa、2GPa、2.5GPa、3GPa、3.5GPa、4GPa、4.5GPa或5GPa的弹性模量。材料可具有至多1GPa、1.5GPa、2GPa、2.5GPa、3GPa、3.5GPa、4GPa、4.5GPa或5GPa的弹性模量。材料可具有至少10MPa、20MPa、30MPa、40MPa、50MPa、60MPa、70MPa、80MPa、90MPa、100MPa、110MPa、120MPa、130MPa、140MPa、150MPa、160MPa、170MPa、180MPa、190MPa、200MPa的拉伸强度。材料可具有至多10MPa、20MPa、30MPa、40MPa、50MPa、60MPa、70MPa、80MPa、90MPa、100MPa、110MPa、120MPa、130MPa、140MPa、150MPa、160MPa、170MPa、180MPa、190MPa、200MPa的拉伸强度。
在一些情况下，可以使用流体设备的表面而无需表面处理或涂层。在其他情况下，流体设备的表面可以与表面涂层如疏水处理、亲水处理或选择性结合剂(例如，抗体)一起使用。流体设备的不同区域可包含不同的表面处理(或缺少表面处理)。例如，一些通道、储器或其部件可以是疏水的，而其他通道、储器或其部件是亲水的。
流体设备可包括一系列流量控制单元和技术，包括但不限于毛细管屏障、空气出口储器、气体/空气管线、填充水平监测器(例如，通过电极测量)、特定储器几何形状、特定通道流体阻力和流体装载顺序。
毛细管屏障是流体通道的内部横截面的收窄件，其通过毛细管力防止液体流过屏障。收窄件的纵向形状可以是突然的或锥形的。毛细管屏障的形状可以采取许多形式。然而，本文特别考虑三种形式，“平台”毛细管屏障、“悬崖”毛细管屏障和“斜坡”毛细管屏障。
如本文所用，“平台”毛细管屏障包括被称为“斜坡”的第一锥形区域和第二锥形区域，所述第一锥形区域和第二锥形区域以相反的方向定向并且通常被平台隔开，在所述平台处，通道的内部横截面面积基本保持不变。因此，在平台屏障中，通道的内部横截面面积表现出先减小后增大。斜坡和平台的形状可以是平的(线性)，如平面或楔形，或是弯曲的(非线性)，如驼峰，并且可以具有圆形、椭圆形或抛物线形的纵向形状，等等。线性形状允许相等压力以线性方式移动液体通过屏障。斜坡的基部与最大收缩点之间的角度可以例如在约25度至约70度之间，例如在约30度至45度之间。斜坡基部处的通道的内部横截面直径可以在约50微米至2000微米之间(例如，400微米至1200微米)。斜坡或平台顶部处通道的内部横截面直径可以在约10微米至约300微米之间。两者之比可以是2倍。平台可以用来分离屏障的第一侧上的液体弯液面，使其不接触屏障的第二侧上的液体弯液面，直至施加足够的压力，如在两个弯液面之间施加负压。
“悬崖”毛细管屏障包括第一锥形区域和悬崖，通常由平台分离。第一锥形区域和平台可以具有如针对平台毛细管屏障所描述的形状和尺寸。悬崖在通道的内部横截面面积中产生突然变化。通常，悬崖呈陡峭壁的形状，其可以是平的或弯曲的，并且以约80度至约100度(例如，约90度)的角度从通道底板上升。通过避免尖锐角度，可以存在平台以便于制造。
如本文所用，“斜坡”毛细管屏障包括第一锥形区域和悬崖。任选地，“斜坡”毛细管屏障可以包括平台。第一锥形区域和平台(若存在)可以具有如针对平台毛细管屏障所描述的形状和尺寸。悬崖在通道的内部横截面面积中产生突然变化。通常，悬崖呈陡峭壁的形状，其可以是平的或弯曲的，并且以约80度至约100度(例如，约90度)的角度从通道底板上升。通过避免尖锐角度，可以存在平台以便于制造。
术语“毛细管屏障”是指流体通道中的收窄件，其通过毛细管力阻止或限制流体流过所述收窄件。通常，收窄件由安设在通道中的物体形成。通过对流动受到屏障限制的流体施加最小正压力或负压力，可以破坏毛细管屏障。毛细管屏障的某些实施方式描述于专利申请公开美国2016/0160208(圣地亚哥)中。毛细管屏障可与空气出口储器配对以吹扫空气(例如，以防止气泡)，从而定位并成功地建立(i)等速电泳所需的前导电解质溶液与尾随电解质溶液之间的液-液界面，和(ii)缓冲储器与前导电解质或尾随电解质和/或样品溶液之间的液-液界面。可以结合通道几何形状设计毛细管屏障，以按优选顺序自动填充通道。可以选择通道阻力，如通过通道尺寸的设计，以提供不同的流体阻力。液体装载的排序可以允许正确地形成没有气泡的液-液界面以用于进行电动过程。在一个实例中，尾随离子储器直接连接到分析物或样品通道。
毛细管屏障可以使用利用毛细管力将流体的弯液面定位在流体界面区域处。毛细管屏障可以作为被动的停止机构，并利用表面力将流体的液体弯液面保持或钉在所需的固定位置。一旦流体的弯液面被钉在连接件处，就可以装载不同的液体并将其回填到第一流体的弯液面，以形成液-液界面。例如，毛细管屏障可以包括通道内的收缩或膨胀(例如，横截面面积的变化)。流体在通道内的流动可以部分取决于毛细管力，其可以由流体和通道壁之间的表面张力所引起。毛细管力的大小可以由流体与通道壁之间的接触角决定。毛细管屏障可以被配置用于在流过通道时在液体所经历的毛细管力中引入突变，例如，通过改变通道的有效直径(扩大或缩窄通道)。毛细管力的变化可以与在毛细管屏障的每一侧上的流体表面张力的差异成比例。由于通道内横截面面积的变化所引起的表面力，流体流动可能会被毛细管屏障阻滞。横截面面积变化处的流体可能面对能垒，所述能垒与毛细管屏障每一侧上的不同表面张力有关。
如本文所用，术语“破裂压力”是指使停止的液体弯液面移动通过毛细管屏障所需的最小压力。
“斜坡毛细管屏障”，例如在专利申请公开美国2016/0160208(圣地亚哥)中所述，可以包括斜坡和悬崖，而在其间之间没有平台区域。
图41A-图41B示出了示例性的“悬崖毛细管屏障”4110。图41A示出了通道4100的俯视图，其中安设有悬崖毛细管屏障4110。图41B示出了通道4100中的悬崖毛细管屏障4110的纵向横截面侧视图。悬崖毛细管屏障4110可以包括梯形横截面，其具有由悬崖毛细管屏障4110的成角度的表面4111和平台表面4112形成的通道4100内的收窄件，随后是由悬崖表面4113形成的通道内的突然膨胀。通道4100可以包括第一壁4101、第二壁4102、第三壁4103和第四壁4104，以形成闭合通道。例如，通道4100可以具有包括四个壁的正方形或矩形横截面(沿通道4100的横向轴线截取)。第一壁4101和第三壁4103可以彼此基本平行。第二壁4102和第四壁4104可以彼此基本平行。悬崖毛细管屏障4110可以从第二通道壁4102突出到通道4100中。悬崖毛细管屏障4110可以安设在第二壁4102上。或者，悬崖毛细管屏障4110可以形成第二壁4102的一部分。悬崖毛细管屏障4110可以包括安设在第二壁4102的内表面上、与第二壁4102的内表面共同延伸或整合在其中的侧面。悬崖毛细管屏障4110可以基本延伸通道4100的宽度。例如，悬崖毛细管屏障4110可以基本在第一壁4101与第三壁4103之间延伸，如图41A所示。悬崖毛细管屏障4110可以包括第一横向壁或侧面4114和第二横向壁或侧面4115。第一横向壁或侧面4114和第二横向壁或侧面4115可以分别连接到第一通道壁4101和第三通道壁4103。或者，第一横向壁或侧面4114和第二横向壁或侧面4115可以分别与第一通道壁4101和第三通道壁4103共同延伸。或者，第一横向壁或侧面4114和第二横向壁或侧面4115可以分别与第一通道壁4101和第三通道壁4103相邻。第一横向壁或侧面4114和第二横向壁或侧面4115可各自包括具有梯形形状的横截面面积(例如，图41B所示的横截面面积)。梯形横截面可以包括基本平行于第二通道壁4102的平台表面或侧面4112。平台表面或侧面4112可以位于通道4100中的第二通道壁4102与第四通道壁4104之间。成角度的表面或侧面(本文也称为斜坡)4111可以在第一边缘4116处将第二壁4102连接到平台表面或侧面4112。悬崖表面或侧面4113可以在第二相对边缘4117处将第二壁4102连接到平台表面或侧面4112。
成角度的表面或侧面4111可以被配置成在沿通道长度的距离内，将通道4100的高度从第一高度h1逐渐减小到第二较小的高度h2。第一高度h1可以是第二高度h2的至少两倍。例如，成角度的表面或侧面4111可以是从通道4100的底壁上升的倾斜平面或从通道4100的顶壁下降的倾斜平面。例如，成角度的表面或侧面4111可以是从通道4100的侧壁延伸到通道4100中的成角度平面。成角度的表面或侧面4111可以具有第一边缘4116，其与平台区域或侧面4112相交以形成悬崖毛细管屏障的内钝角，以及第二相对边缘4118，其与第二通道壁4102相交以形成悬崖毛细管屏障4110的内锐角θ。
悬崖表面或侧面4113可以配置成沿通道4100的长度在很短的距离或没有距离的情况下，将通道4100的高度从第一高度h2突然增加到第二较大的高度h3。例如，悬崖表面或侧面4113可以是将平台表面或侧面4112连接到第二壁4102的垂直表面(相对于第二壁4102)。例如，悬崖表面或侧面4113可以基本垂直于第二壁4102。
沿成角度的表面或侧面向上芯吸到平台表面或侧面4111的液体可能面临与膨胀通过平台表面或侧面4112相关联的能垒(由于需要额外的液体表面积或压力来推进液体)，这可能导致液体被悬崖毛细管屏障4110阻挡，并且弯液面被定位在最靠近成角度表面或侧面4111的平台表面或侧面4112的边缘4116处或者悬崖表面或侧面4113上方的边缘4116处。悬崖毛细管屏障4110可以被配置成使得被毛细管屏障4110停止的液体可以被从其另一侧(例如，从悬崖侧4113)接近悬崖毛细管屏障4110的液体润湿，以创建无气泡的液-液界面。悬崖毛细管屏障4110可以安设在邻近气体通道4120，气体通道4120被配置用于当液体进入通道4100时促进从通道4100去除气泡，并且液体的弯液面停止在悬崖毛细管屏障4110处，如本文所述。
悬崖毛细管屏障4110可以被配置用于将悬崖毛细管屏障4110的任一侧上的液体弯液面保持分离，在它们之间具有跨越平台表面或侧面4112的气隙，直至经由空气通道4120在毛细管屏障上施加的压力超过悬崖毛细管屏障4110的破裂压力，并且一种或两种液体穿过平台表面或侧面4112彼此相遇并形成液-液界面，如本文所述(例如，如图47A所示)。
悬崖毛细管屏障4110可以被配置用于当向其施加气动压力时保持或停止液体。悬崖毛细管屏障4110可以被配置成在约0mpsi至约200mpsi的范围内的压力下，例如在约10mpsi至约80mpsi的范围内的压力下保持液体。悬崖毛细管屏障4110可以被配置成保持液体直至达到破裂压力(例如，使停止的液体移动越过平台4112和/或悬崖4113并通过悬崖毛细管屏障4110所需的最小压力)。本领域普通技术人员将理解，悬崖毛细管屏障4110的破裂压力可以取决于由悬崖毛细管屏障4110保持的液体，润湿性较强的液体比润湿性较弱的液体具有更低的破裂压力。
成角度的表面或侧面4111可以被配置成将通道4100的高度从约50um至约2mm范围内的第一高度h1逐渐减小到约10um至约30mm范围内的第二高度h2。例如，第一高度h1可以在约400um至约1.2um的范围内。
成角度的表面或侧面4111可以具有第一边缘4116，其与平台区域或侧面4112相交，以形成悬崖毛细管屏障4110的内钝角。
成角度的表面或侧面4111可以具有第二相对边缘4118，其与第二通道壁4102相交，以形成悬崖毛细管屏障4110的内锐角θ。内锐角θ可在约0度至约70度的范围内，例如在约30度至约45度的范围内，或在约30度至约60度的范围内。
平台表面或侧面4112可以具有在约500um至约1mm的范围内，例如约750um的沿通道4110的纵轴的长度。
悬崖表面或侧面4113可以基本垂直于第二通道壁4102和/或平台表面或侧面4112。悬崖表面或侧面4113可以与第二通道壁4102相交，以形成在约60度至约90度的范围内的内角
Figure GDA0003654970080001291
斜坡4111、平台区域4112或悬崖区域4113的任何组合可以具有基本平坦的表面。
斜坡4111、平台区域4112或悬崖区域4113的任意组合可以具有弯曲的表面。
斜坡4111、平台区域4112或悬崖区域4113的任何组合可以具有包含一个或多个凹槽、脊、凹痕、台阶、蚀刻或突起的表面。
斜坡4111、平台区域4112或悬崖区域4113的任何组合可以具有包含具有不同角度的面的区域的表面。
悬崖毛细管屏障4110可以由多种材料制成，包括但不限于玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃)、硅、塑料和弹性体。塑料可包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、高密度聚乙烯(HDPE)和低密度聚乙烯(LDPE)。弹性体可包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。例如，芯片或基底可以包含COC，诸如TOPAS8007。悬崖毛细管屏障4110可以由与通道相同的材料或与通道4100不同的材料制成。
悬崖毛细管屏障4110的任一侧上的通道4100的深度可以相同。或者，悬崖毛细管屏障4110的每个侧面4111、4113可以耦合至不同深度的通道4110。例如，悬崖毛细管屏障4110的斜坡部分4111可以耦合至样品通道4105，其包含在约10um至约2mm的范围内，例如在约400um至约1.2mm的范围内的深度，如本文所述。悬崖毛细管屏障4110的悬崖部分4113可以耦合至前导电解质通道4106，其包含在约10um至约1mm的范围内，例如在约10um至约600um的范围内的深度，如本文所述。
因此，例如，参考图41B，当将元件相邻地定位为斜坡-平台-悬崖4111-4112-4113时，悬崖毛细管屏障4110可以包括以浅角度θ从通道4100的表面4102上升的斜坡4111，具有大致平行于通道表面4102、4104的其他部分的表面的平台区域4112，以及下降至表面4102并且具有比斜坡4111的角度θ显著更陡的角度
Figure GDA0003654970080001301
的悬崖4113。浅角度θ可以小于60度，例如，不大于45度或不大于30度。悬崖角度
Figure GDA0003654970080001302
可以大于60度，例如，为约90度。平台4112可以与通道表面4102偏离平行不大于10度。
图42A-图42B示出了示例性的“平台毛细管屏障”4210。图42A示出了通道4200的俯视图，其中安设有平台毛细管屏障4210。图42B示出了通道4200中的平台毛细管屏障4210的纵向横截面侧视图。平台毛细管屏障4210可以包括梯形截面，所述梯形截面具有由平台毛细管屏障4210的第一成角度表面4211和平台表面4212形成的在通道4200内的收缩，随后为由第二成角度表面4213形成的通道4200内的逐渐膨胀。通道4200可以包括第一壁4201、第二壁4202、第三壁4203和第四壁4204，以形成闭合通道。例如，通道4200可以具有包括四个壁的正方形或矩形横截面(沿通道4200的横向轴线截取)。第一壁4201和第三壁4203可以彼此基本平行。第二壁4202和第四壁4204可以彼此基本平行。平台毛细管屏障4210可以从第二通道壁4202突出到通道4200中。平台毛细管屏障4210可以安设在第二壁4202上。或者，平台毛细管屏障4210可以形成第二壁4202的一部分。平台毛细管屏障4210可以包括安设在第二壁4202的内表面上、与第二壁4202的内表面共同延伸或整合在其中的侧面。平台毛细管屏障4210可以基本延伸通道4200的宽度。例如，平台毛细管屏障4210可以基本在第一壁4101与第三壁4013之间延伸，如图42A所示。平台毛细管屏障4210可以包括第一横向壁或侧面4214和第二横向壁或侧面4215。第一横向壁或侧面4214和第二横向壁或侧面4215可以分别连接到第一通道壁4201和第三通道壁4203。或者，第一横向壁或侧面4214和第二横向壁或侧面4215可以分别与第一通道壁4201和第三通道壁4203共同延伸。或者，第一横向壁或侧面4214和第二横向壁或侧面4215可以分别与第一通道壁4201和第三通道壁4203相邻。第一横向壁或侧面4214和第二横向壁或侧面4215可各自包括具有梯形形状的横截面面积(例如，图42B所示的横截面面积)。梯形横截面可以包括基本平行于第二通道壁4202的平台表面或侧面4212。平台表面或侧面4212可以位于通道4200中的第二通道壁4202与第四通道壁4204之间。第一成角度表面或侧面4211(本文也称为斜坡)可以在第一边缘处将第二壁4202连接到平台表面或侧面4212。第二成角度表面或侧面4213可以在第二相对边缘4217处将第二壁4204连接至平台表面或侧面4212。
第一成角度表面或侧面4211可以被配置成在沿通道4200长度的距离内，将通道4200的高度从第一高度h4逐渐减小到第二较小的高度h5。第一高度h4可以是第二高度h5的至少两倍。例如，第一成角度表面或侧面4211可以是从通道4200的底壁上升的倾斜平面或从通道4200的顶壁下降的倾斜平面。例如，第一成角度表面或侧面4211可以是从通道4200的侧壁延伸到通道4200中的成角度平面。第一成角度表面或侧面4211可以具有第一边缘4216，其与平台区域或侧面4212相交以形成平台毛细管屏障4210的内钝角，以及第二相对边缘4218，其与第二通道壁4202相交以形成平台毛细管屏障4210的内锐角α。
第二成角度表面或侧面4213可以被配置呈在沿通道4200长度的距离内将通道4200的高度从第一高度h5逐渐增加到第二较大的高度h6。第一高度h5可以是第二高度h6的至少两倍小。例如，第二成角度表面或侧面4213可以是从通道4200的底壁下降的倾斜平面或从通道4200的顶壁上升的倾斜平面。例如，第二成角度表面或侧面4213可以是从平台表面或侧面4212向通道4200的侧壁延伸的成角度平面。第二成角度表面或侧面4213可以具有第一边缘4217，其与平台区域或侧面4212相交以形成平台毛细管屏障4210的内钝角，以及第二相对边缘4219，其与第二通道壁4202相交以形成平台毛细管屏障4210的内锐角β。
沿第一成角度表面或侧面4211向上芯吸到平台表面或侧面4212的液体可能面临与膨胀通过平台表面或侧面4212相关的能垒(由于需要额外的液体表面积或压力来推进液体)，这可能导致液体被平台毛细管屏障4210阻挡，并且弯液面被定位在最靠近第一成角度表面或侧面4211的平台表面或侧面4212的边缘4216处或者第二成角度表面或侧面4212上方的边缘4217处。平台毛细管屏障4210可以被配置成使得被平台毛细管屏障4210停止的液体可以被从其另一侧(例如，从第二成角度侧面)接近平台毛细管屏障4210的液体润湿，以创建无气泡的液-液界面。平台毛细管屏障4210可以被安设在邻近气体通道4220，气体通道4220被配置用于当液体进入通道4200时促进从通道4200去除气泡，并且液体的弯液面停止在平台毛细管屏障4210处，如本文所述。
平台毛细管屏障4210可以被配置用于将平台毛细管屏障4210的任一侧上的液体弯液面保持分离，在它们之间具有跨越平台表面或侧面4212的气隙，直至经由空气通道4220在毛细管屏障4210上施加的压力超过平台毛细管屏障4210的破裂压力，并且其中一种或两种液体穿过平台表面或侧面4212彼此相遇并形成液-液界面，如本文所述(例如，如图47A所示)。
平台毛细管屏障4210可以被配置用于当向其施加气动压力时保持或停止液体。平台毛细管屏障4210可以被配置成在约0mpsi至约200mpsi的范围内的压力下，例如在约10mpsi至约80mpsi的范围内的压力下保持液体。平台毛细管屏障4210可以被配置成保持液体直至达到破裂压力(例如，使停止的液体移动越过平台4112和/或移动到第二成角度区域4213上并通过平台毛细管屏障4210所需的最小压力)。本领域普通技术人员将理解，平台毛细管屏障4210的破裂压力可以取决于由平台毛细管屏障4210保持的液体，润湿性较强的液体比润湿性较弱的液体具有更低的破裂压力。
在一些实施方式中，悬崖毛细管屏障4110的破裂压力可以与平台毛细管屏障4210的破裂压力相同。
在一些实施方式中，悬崖毛细管屏障4110的破裂压力可以高于平台毛细管屏障4210的破裂压力。悬崖毛细管屏障4110较高的破裂压力可以促进具有较低表面张力的液体，例如包含一种或多种表面活性剂或洗涤剂的液体的装载(和停止)。例如，样品可以具有足够低的表面张力，以便在由仪器施加到通道的负气动压力下润湿透过平台毛细管屏障4220。在这样的情况下，样品可以通过悬崖毛细管屏障4110(例如，样品与LE之间的第一悬崖毛细管屏障4110和样品与TE之间的第二悬崖毛细管屏障4110，如本文所述)束缚在通道内，从而在芯片装载期间将样品保持在通道中。
第一成角度表面或侧面4211可以被配置成将通道4200的高度从约50um至约2mm范围内的第一高度h4逐渐减小到约10um至约30um范围内的第二高度h5。例如，第一高度h4可以在约400um至约1.2um的范围内。
第一成角度表面或侧面4211可以具有第一边缘4216，其与平台区域或侧面4212相交，以形成悬崖毛细管屏障4210的内钝角。
第一成角度表面或侧面4211可以具有第二相对边缘4218，其与第二通道壁4202相交，以形成平台毛细管屏障4210的内锐角α。内锐角α可在约0度至约70度的范围内，例如在约30度至约45度的范围内，或在约30度至约60度的范围内。
平台表面或侧面4212可以具有在约500um至约1mm的范围内，例如约750um的沿通道的纵轴的长度。
第二成角度表面或侧面4213可以被配置成将通道的高度从约10um至约30um范围内的第一高度h5逐渐增加到约50um至约2mm范围内的第二高度h6。例如，第一高度h5可以在约400um至约1.2um的范围内。
第二成角度表面或侧面4213可以具有第一边缘4217，其与平台区域或侧面4212相交，以形成平台毛细管屏障4210的内钝角。
第二成角度表面或侧面4213可以具有第二相对边缘4219，其与第二通道壁4202相交，以形成平台毛细管屏障4210的内锐角β。内锐角β可在约0度至约70度的范围内，例如在约30度至约45度的范围内，或在约30度至约60度的范围内。
第一成角度表面4211(即，斜坡)、平台区域4212或第二成角度表面区域4213的任何组合可以具有基本平坦的表面。
第一成角度表面4211(即，斜坡)、平台区域4212或第二成角度表面区域4213的任何组合可以具有弯曲的表面。
第一成角度表面4211(即，斜坡)、平台区域4212或第二成角度表面区域4213的任何组合可以具有包含一个或多个凹槽、脊、凹痕、台阶、蚀刻或突起的表面。
第一成角度表面4211(即斜坡)、平台区域4212或第二成角度表面区域4213的任何组合可以具有包含具有不同角度的面的区域的表面。
因此，例如，参考图42B，斜坡屏障可以包括由平台分离的两个斜坡。第一斜坡4211可以以浅角度α从通道4202的表面上升，平台区域4212可以大致平行于通道4200，并且第二斜坡4213可以以浅角度β下降到通道表面4202。浅角度α、β可以不大于60度、不大于45度或不大于30度。浅角度α、β可以是相同角度或不同角度。
平台毛细管屏障4210可以由多种材料制成，包括但不限于玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃)、硅、塑料和弹性体。塑料可包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、环烯烃共聚物(COC)、环烯烃聚合物(COP)、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、高密度聚乙烯(HDPE)和低密度聚乙烯(LDPE)。弹性体可包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。例如，芯片或基底可以包含COC，诸如TOPAS8007。平台毛细管屏障4210可以由与通道4200相同的材料或与通道4200不同的材料制成。
平台毛细管屏障4210的任一侧上的通道4200的深度可以相同。或者，平台毛细管屏障4210的每一侧可以耦合至不同深度的通道4200，如本文所述。
图43示出了示例性通道或流体回路4300，其突出了装载后的初始流体界面位置。流体回路4300可以与图38中所述的回路基本相似。流体回路4300可以连接到样品输入孔或储器4301、洗脱储器4302、洗脱缓冲储器4303、前导电解质储器4304、前导电解质缓冲储器4305和尾随电解质储器4306。储器4301-4306可以通过通孔或孔口与通道耦合，如本文所述。洗脱储器4302可以通过洗脱缓冲通道4307连接至洗脱缓冲储器4303。可以在洗脱缓冲通道4307中提供毛细管屏障4308(例如，如本文所述的平台毛细管屏障)以减少或防止洗脱缓冲储器4303与洗脱储器4302的内容物之间的混合或压力驱动的流动。前导电解质储器4304可以通过前导电解质缓冲通道4309连接至前导电解质缓冲储器4305。可以在前导电解质缓冲通道4309中提供毛细管屏障4310(例如，平台毛细管屏障)以减少或防止前导电解质缓冲储器4305与前导电解质储器4304的内容物之间的混合或压力驱动的流动。缓冲储器4303可以含有比洗脱储器4302中更高的离子强度的洗脱缓冲液电解质，而缓冲储器4305可以含有比前导电解质储器4304更高的离子强度的前导电解质。所述设备还可以包括沿其边缘的气动端口4311，其被配置用于耦合至气动设备，例如，台式仪器上的真空源。气动端口4311可以通过气体通道4312耦合至通道和储器，如本文所述。在气动端口4311处施加吸力(即负气动压力)可以将样品、前导电解质和洗脱缓冲液装载到通道中。气体通道4312可以在一个或多个毛细管屏障处耦合至通道，使得负压被施加到所述毛细管屏障。可以同时或顺序地向气动端口4311施加吸力以分别同时地或分阶段地装载通道。可以将样品装载到第一区或子通道中，所述第一区或子通道以通道中的180°低分散转向从尾随电解质储器4306延伸至毛细管屏障4313。毛细管屏障4313可以在装载期间在样品与前导电解质缓冲液之间提供界面，以限制、减少或防止混合或压力驱动的流动。毛细管屏障4313可以包括如本文所述的悬崖毛细管屏障。尾随电解质储器4306可以通过尾随电解质通道4314连接至通道第一区或子通道4317。可以在尾随电解质储器4306与第一区或子通道4317之间的尾随电解质通道4314中提供毛细管屏障4315(例如，悬崖毛细管屏障)，以限制、减少或防止尾随电解质储器4306的内容物与样品之间的混合或压力驱动的流动。可以将前导电解质装载到通道4300的第二区或子通道4318中，其从毛细管屏障4313延伸到毛细管屏障4316。毛细管屏障4316(例如，平台毛细管屏障)可以在前导电解质缓冲液与洗脱缓冲液之间提供界面。第一区或子通道4317和第二区或子通道4318可以构成流体通道或回路的ITP分支。可以将洗脱缓冲液装载到通道4300的第三区或子通道4319中，其从毛细管屏障4316延伸至洗脱储器4302。第三区或子通道4319可以构成流体通道或回路的洗脱分支。在将流体装载到通道中后，液体之间的界面可以位于其各自的毛细管屏障上方或位于其各自的毛细管屏障处。尾随电解质缓冲液与样品之间的界面可以位于悬崖毛细管屏障4315处。前导电解质缓冲液与样品之间的界面可以位于悬崖毛细管屏障4313处。前导电解质缓冲液与洗脱缓冲液之间的界面可以位于斜坡毛细管屏障4316处。前导电解质缓冲液与高浓度前导电解质缓冲液之间的界面可以位于斜坡毛细管屏障4310处。高浓度洗脱缓冲液与洗脱缓冲液之间的界面可以位于斜坡毛细管屏障4308处。
图44示出了示例性通道或流体回路4300，其突出了装载后的最终流体界面位置。在将各种缓冲液装载到通道4300中后，在缓冲液之间形成的一个或多个流体界面可以在通道内流动，以使所述界面远离形成流体界面的毛细管屏障移动。
使界面移动可以减少或最小化核酸在毛细管屏障处，特别是在前导电解质缓冲液与洗脱缓冲液之间的毛细管屏障处的保留。不希望受到特定理论的限制，认为这可以有助于在DNA穿过毛细管屏障(例如，LE与洗脱缓冲液之间的连接件处的悬崖毛细管屏障4316)的收缩空间时将DNA维持在更紧凑的状态，该收缩空间可能另外损害更分散的ITP带的通过。例如，前导电解质缓冲液与洗脱缓冲液之间的界面4402可以向下游朝向洗脱储器4302移动，使得当界面4402被阻滞在区4401内时，悬崖毛细管屏障4316被前导电解质缓冲液完全淹没。当界面4402的流动被阻滞时，与使DNA同时通过界面4402和毛细管屏障4316相比，DNA可以更容易地在前导电解质缓冲液中通过毛细管屏障4316的收缩空间，因为从前导电解质缓冲液到洗脱缓冲液的转变可以导致ITP带扩展，从而使其更难以越过屏障。
备选地或组合地，使界面移动可以减少或最小化缓冲液的混合和不期望的缓冲液污染，特别是在洗脱缓冲液与高浓度洗脱缓冲液之间或在前导电解质缓冲液与高浓度前导电解质缓冲液之间。例如，洗脱缓冲液与高浓度洗脱缓冲液之间的界面4403可以向下游移向洗脱缓冲储器4303，以便增加界面4403与洗脱储器4302之间的距离，并减少或最小化高浓度洗脱缓冲液对洗脱缓冲液的污染，这种污染可能负面影响洗脱缓冲液与下游测定的兼容性。类似地，前导电解质缓冲液与高浓度前导电解质缓冲液之间的界面4404可以向下游移向前导电解质缓冲储器4305，以便增加界面4404与前导电解质储器4304之间的距离，并减少或最小化高浓度前导电解质缓冲液对前导电解质缓冲液的污染。
在一些实施方式中，可以通过向通道的一个或多个气动端口施加负压来使一个或多个界面远离其对应的毛细管屏障流动。
备选地或组合地，一个或多个界面可以由于重力远离其对应的毛细管屏障流动。例如，可以调节储器中的液柱头部高度以在通道内生成重力驱动的流动。在装载后，可以允许通道内的流体压力平衡，以使得通道内流体之间的一个或多个界面在通道内朝向其最终的流体界面位置流动。如本领域普通技术人员将理解的，可以通过调节储器内流体的相对头高度来调节流体界面的最终位置。
气体(例如，空气)通道或管线可用于向毛细管屏障或流体设备的其他区域提供致动的气动压力。气体通道可通过气动端口连接到外部气体压力源。气体通道可以具有比液体通道更高的流体阻力，其提供压力以例如减少或防止液体流入气体通道。例如，气体通道可小于主要等速电泳通道的横截面面积的一半。多个气体通道可以连接到单个气体储器或端口(例如，具有分支通道)。毛细管阀可以与分支空气管线一起使用以防止上游液体移动。图10A示出了示例性气体通道1001，其可包含连接到样品1004与前导电解质缓冲液1005子通道之间的液体通道界面1003的毛细管屏障1002。图10B为突出毛细管屏障1002的气体通道1001的放大示意图，该毛细管屏障1002防止上游液体朝向气动端口1006移动。
图45A示出了芯片的流体层的示例。在该示例中，气动致动通道(本文也称为空气通道或空气管线)4501是窄的、浅的且直的，以使总体积最小化。最小尺寸可以通过制造要求或通过这些气动通道之间的最大允许压降来设置。对于通道的宽度和高度，这些尺寸在50um与500um之间。这些气动通道通向气动端口4502。端口是终止于膜放置平面的立式圆柱形孔。与气动通道相比，芯片层上的液体通道更宽且更深。这可以允许少部分的液体被吸入气动管线。气动通道4501可以包括在气动通道4501与液体通道之间的连接处的收窄件，所述收窄件可以作为毛细管屏障以减少或防止液体进入气动通道4501。图45B示出了气动端口4502的剖面图。4504是端口与流体层上的气动通道的连接。4503是膜放置平面。将疏水膜施加于该表面，并通过压缩垫圈、通过粘合剂或通过热结合将其保持到位。空气可以通过该膜，但液体无法通过。该端口的直径由制造要求控制，全部可以具有小于1mm的直径。立式圆柱的高度应小于2mm。图45C示出了该设计的实现。疏水膜标记为4505。荧光液体4506被限制到气动端口的立式柱，而不向外铺展。可以使用气动致动使液体在流体通道中移动。此时，使进入气动致动通道的液体损失最小化可能是有价值的，因为这可能是未处理的液体体积。该设计是为了流体空气端口和通道设计，所述设计通过操纵通道和端口的几何形状使损失最小化，并包括防止液体转移但允许空气转移的疏水膜。
图46A示出了示例性微流体通道，其中可以检测到空的样品通道。样品通道4601在两侧4602上终止于在样品装载前可能已装载有液体(例如，分别为尾随电解质和前导电解质)的通道。由于液体移动到在装载前为空的样品通道4601中而使该装载经历失败。样品通道4601还在两端连接至气动致动端口4603，气动致动端口4603可以连接至压力控制回路，或被允许向大气或气动歧管排气，如本文所述。图上的箭头4604示出了检测路径，其从一个气动端口4603穿过样品通道4601并且穿过另一气动端口4603。图46B示出了用于检测该通道4601是空的还是已填充的事件的顺序。首先，设置气动控制回路(步骤4611)，以达到1psig与-1psig之间的目标压力。第二，将连接至通道的两个阀均连接至气动控制回路(步骤4612)。如果存在由阀开启引起的干扰，则允许压力返回到控制点，然后读取气动控制回路的信号(步骤4613)。该信号通常可以与施加到气动比例阀的电压相关联。此后，可以将任一个连接到通道的阀改变为使通道向大气排气的状态。这允许空气流过先前示出的检测路径(步骤4614，例如，图46A)。这种增加的空气流量将导致通往控制电路的信号变化，通常是电压变化，以进一步打开比例阀以允许空气流动。再次使压力稳定，并且测量控制电路上的信号(步骤4615)。减去两个测得的控制信号，并将其与阈值进行比较(步骤4616)，并确定通道是空的还是已填充的(步骤4617)。此后，通道的两侧可以返回到一些默认状态，这通常通过使它们向大气排气(步骤4618)。图46C示出了来自该技术的实现的压力迹线和控制信号迹线。在顶部迹线上，压力读取、向压力的稳定4621和阀的排气4628是可见的。下方的控制信号对应于施加到气动比例阀以调节压力的电压。其示出了向压力的稳定4621、两个阀打开4622、打开后的稳定值4623、单个阀关闭4624、信号的测量4625以及通道的排气4628。这种气动控制和检测方案允许在用户装载样品之前检测完全空的通道。这在其中样品装载需要在装载之前完全空的通道以成功完成装载的情况下是有用的。如果先前步骤润湿了通道，这允许用户避免将样品装载到该通道中，从而节省了样品。这种检测技术使用与气动启动相同的气动检测和致动硬件。
可以通过气体端口将负压或真空施加到气体通道，以装载流体通道。微流体设备上的每个流体通道可以同时或彼此独立地(例如顺序地)装载。在通道内，流体可以同时或彼此独立地装载。例如，可以在装载样品之前、同时或之后装载前导电解质缓冲液、高浓度前导电解质缓冲液、尾随电解质缓冲液、高浓度尾随电解质缓冲液、洗脱缓冲液、高浓度洗脱缓冲液或其任何组合。例如，可以将负压施加到芯片一侧上的气体端口以装载一种或多种流体(例如尾随电解质缓冲液、洗脱缓冲液等)。随后，可以将负压施加到芯片另一侧上的气体端口以装载额外的流体(例如，前导电解质缓冲液)。或者，可以将负压施加到芯片一侧上的气体端口以装载一种或多种流体(例如，前导电解质缓冲液和尾随电解质缓冲液)。随后，可以将负压施加到芯片另一侧上的气体端口以装载其他流体(例如，尾随电解质缓冲液、洗脱缓冲液等)。或者，可以将负压同时施加到连接到通道的所有气体端口。可以在装载等速电泳缓冲液之前、期间或之后通过施加负压或真空来装载样品。可以在不施加负压或真空的情况下装载样品，例如通过润湿或重力。
图47A-图47B示出了用于分阶段的液体装载的示例性气动控制方案。对于图47A中描述的每个步骤，中间示出了具有平台毛细管屏障4703的通道的俯视图，右侧示出了平台毛细管屏障4703的侧视示意图。可以将流体装载到微流体盒上的储器4701中，并且可控地启动至固定位置，然后在不产生气泡的情况下合并，如本文所述。在步骤1中，两种流体可以最初被装载到由微流体通道连接的储器4701中，在它们之间具有毛细管屏障4703。然后，在步骤2中，可以增加压力并保持在固定压力下，以使两种流体的弯液面4702从储器/通道边界移动到通道中，并向上到达毛细管屏障4703的基部。在步骤3中，压力可以再次渐进地增加，以将弯液面4702拉到毛细管屏障4703的顶部。可以在横跨毛细管屏障4703的平台区域上设置气隙4704，以维持弯液面4702之间的距离。在步骤4中，压力可以增加到超过屏障4703的耐受压力(本文也称为破裂压力)，以使两种流体合并，并且形成如本文所述的液-液界面。图47B示出了压力控制方案的步骤2-4的示意图，用于在微流体通道系统内的毛细管屏障4703处合并流体。真空压力可以以不连续的步伐增加，以使两种流体的弯液面4702移动到毛细管屏障4703，然后连接流体，如图47A所示。通过以逐步的方式增加负气动压力，弯液面4702可以合并以形成液-液屏障，在两种液体之间很少或没有发生主动混合。当一种液体在另一种液体之前到达毛细管屏障4703时，这可能有用。与不具有平台区域的毛细管屏障相比，通过将弯液面保持在平台区域的相对端可以大大减少较早的流体爆破通过毛细管屏障4703并进入通道另一侧(这可能导致在不期望的位置混合或形成液-液界面)的几率。如本领域普通技术人员将理解的，可以调节压力值、增量和时间，以适应一定范围的屏障几何形状和流体润湿性质。
可以使用传感器(例如，电极)来检测液体填充水平或气泡(例如，通过电流或电压感测)并提供反馈。几何特征(例如收缩、扩张或转向)可以与电极结合使用以监测通道的阻抗，从而监测等速电泳的时间进展。例如，在ITP过程中，聚焦核酸，并且可以使用电压来从开始到结束追踪通道中的聚焦带位置。在一个实例中，可以使用从具有较小横截面面积的连接通道监测流体扩张至储器(如洗脱储器)中来确定分析物洗脱的时间，从而允许自动洗脱和终止过程控制。在另一个实例中，可以设计通道收窄件以允许检测电动过程中的步骤的定时(或触发)，诸如当聚焦的分析物进入发生反应或发生光学检测事件的通道区时，从而允许控制反应定时或检测器触发。
例如，图21示出了可以用于触发目的的一种这样的几何特征。红外传感器可以定位在检测器位置2105中的微流体通道中的转向的中心。在等速电泳运行期间，相对于通道的其他部分，该几何转向特征可以有助于生成更高的局部电阻。如图21左侧所示，可以在温度和/或电压迹线中检测到较高的局部电阻。例如，运行过程中红外传感器捕获的温度信号迹线在2101与2012之间的增加可以指示从分离切换到洗脱过程。2103与2104之间的两步温升可以指示几何转向实现的触发特征。触发特征的到达时间可以在通道、芯片和仪器之间有所变化。对于相同的萃取化学，温度迹线的通用模式可能保持。在至少一些情况下，这样的几何特征可以提供减少的来自外部特征的干扰。
储器和通道特征可被设计为控制或防止压力驱动的流动。例如，储器(例如，样品和洗脱储器)可具有所设计的内部形状，使得液体高度的大的变化仅在如图11所示的预期的头部高度处产生内部体积的小的变化。这可以提供对储器中所含有的液体体积的更精确的控制。对于其他储器，液体体积可以变化而不会损害分离过程；这样的储器可被设计为响应于小的液体高度变化而具有大的体积变化，并且可以帮助稳定整个流体设备中的液体高度。储器之间的低流体阻力可用于实现头部压力的快速平衡时间，并且能够使在电动过程之前、期间或之后使通道中的液体流动最小化。
储器可被设计为使蒸发最小化，例如通过控制储器内的表面积以保持恒定或固定的体积。储器可被设计为使从储器中回收液体最大化，例如通过使用牵伸角壁设计来使死区最小化。储器可被设计为在卸载过程中防止连接通道中的液体流入储器，这可以帮助保持卸载的材料(例如，核酸)的纯度或分离。储器可被设计成易于通过移液装载或卸载，例如通过使尺寸适于接纳移液器尖端或具有在典型移液器操作中的体积。例如，洗脱储器可被配置为接纳用于核酸提取的移液器尖端。可以设计储器或将其间隔开以接受多通道移液器(例如，具有约9mm的间距)。
储器(例如，样品储器)可以位于待填充的通道的正上方，其可以使储器与其填充的通道之间的连接通道中的液体损失最小化。储器(例如，样品储器)可具有圆锥形底部和圆柱形通孔或孔口；这种储器顶部的大内径可允许其容纳大体积，而在储器底部的液体弯液面具有较小的内径，从而减少分配后留下的液体量。这种设计还可以减少或防止润湿流体芯吸到凹角中。在一些情况下，从储器(例如，样品储器)进入通道的通孔小于或等于约2毫米(mm)。
图11示出了样品储器1100，其被配置为在将样品移动至连接通道1101之后减少留在储器1100中(或丢失)的样品量。低损耗样品储器1100可以在将样品移动至连接通道1101之后减少留在储器1100中的样品量，而无需在将样品递送至连接通道1101之后或期间向样品储器1100中添加或泵入(样品或其他流体的)另外的体积。低损耗样品储器1100可包含具有被配置为在将样品装载到通道1101中之前包含样品体积的内部水力直径D1的上部或顶部1102、具有被配置为在将样品装载到通道1101中之后包含样品体积的内部水力直径或通孔D2和高度H1的下部或底部1103，以及在它们之间的锥形或圆锥形部分1104。在一些情况下，上部1102和/或下部1103是非对称的，在这种情况下，尺寸D1至D2可以分别代表上部和/或下部1102、1103的最大尺寸。
样品储器1100可被配置为产生留下的样品的头部高度H2，其等于或几乎等于连接到通道1101的其他储器1110中的缓冲液的头部高度H3，以限制、防止或者减小压力驱动的流动并在通道1101中混合。标准缓冲液储器1110可包含具有内部水力直径D3的上部1112和具有内部水力直径D4的下部1113。与样品孔不同，D3可以基本上类似于D4，使得当头部高度H2和H3相等或几乎相等时，与样品孔1100相比，较大体积的流体保持在缓冲液孔1110内。
样品储器1100可被配置为容纳至少约1纳升(nL)、10nL、20nL、50nL、100nL、200nL、500nL、1微升(μL)、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1毫升(mL)、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL的样品体积(有或没有缓冲液)。在一些情况下，样品储器1100可被配置为容纳在约1nL至约10nL的范围内的样品体积。
内部水力直径D1可以大于通孔水力直径D2。上部的内部水力直径D1可以为至少约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm或15mm。上部的内部水力直径D1可以为至多约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm或15mm。下部的内部水力直径D2可以为至少约0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm。下部的内部水力直径D2可以为至多约0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm。
D1与D2之比可确定在将样品移动到通道之后留在样品储器中的样品量。在一些情况下，D1与D2之比为至少约2:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1或50:1。在一些情况下，D1与D2之比为至多约2:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1或50:1。D1与D2之比可以大于2:1，以促进将至少50％的样品体积从低损耗样品储器1100移动到通道1101中。
上部的横截面面积可以为至少约3mm2、5mm2、10mm2、15mm2、20mm2、25mm2、30mm2、35mm2、40mm2、45mm2、50mm2、55mm2、60mm2、65mm2、70mm2、75mm2。上部的横截面面积可以为至多约3mm2、5mm2、10mm2、15mm2、20mm2、25mm2、30mm2、35mm2、40mm2、45mm2、50mm2、55mm2、60mm2、65mm2、70mm2、75mm2。下部的横截面面积可以为至少约0.2mm2、0.3mm2、0.4mm2、0.5mm2、1mm2、1.5mm2、2mm2、2.5mm2、3mm2、3.5mm2、4mm2、4.5mm2、5mm2、6mm2、7mm2、8mm2、9mm2、10mm2、11mm2、12mm2。下部的横截面面积可以为至多约0.2mm2、0.3mm2、0.4mm2、0.5mm2、1mm2、1.5mm2、2mm2、2.5mm2、3mm2、3.5mm2、4mm2、4.5mm2、5mm2、6mm2、7mm2、8mm2、9mm2、10mm2、11mm2、12mm2。
上部横截面面积与下部横截面面积之比可以确定在将样品移动到通道中之后留在样品储器中的样品量。在一些情况下，上部横截面面积与下部横截面面积之比为至少约4:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、450:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、1500:1、2000:1或2500:1。在一些情况下，上部横截面面积与下部横截面面积之比为至多约4:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、150:1、200:1、250:1、300:1、350:1、400:1、450:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、1500:1、2000:1或2500:1。
上部与下部之间的锥形部分可包含角度，以促进样品润湿到下部以及样品从低损耗样品孔移动到通道。在一些情况下，低损耗样品储器的锥形部分可包含小于约10°、20°、30°、40°、45°、50°、60°、70°、80°或90°的上部与下部之间的半角。在一些情况下，低损耗样品储器的锥形部分可包含大于约10°、20°、30°、40°、45°、50°、60°、70°、80°或90°的上部与下部之间的半角。
在一些情况下，下部的高度H1可被配置为产生留下的样品的头部高度，其等于或几乎等于连接到通道的其他储器中的缓冲液的头部高度，以限制、防止或减少压力驱动的流动并在通道中混合。下部的高度H1可以为至少约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。下部的高度H2可以为至多约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。
储器(例如，洗脱储器)可具有与分析物(例如，核酸)的扩散长度尺度相比更大的直径，以减少分析物从储器中扩散。在一些情况下，储器直径长度尺度可以是毫米量级，并且从储器中得到的分析物的扩散时间可以是数小时量级。通道与储器(例如，洗脱储器)之间的连接(例如，通孔或孔口)可以设计成没有尖角，从而减少这些连接处的高电场区域的普遍性并增加分析物在储器内的停留时间。在一些情况下，垂直于电场的储器(例如，洗脱储器)的横截面可以显著大于垂直于电场的通道的横截面，从而降低储器中的电场强度并增加分析物在储器内的停留时间。
在一些情况下，洗脱通道和/或洗脱储器可包含第二前导电解质缓冲液，其类型或浓度与主通道中使用的第一前导电解质缓冲液不同。这可以允许纯化的材料在第二前导电解质缓冲液(例如，洗脱缓冲液或输出溶液)中洗脱。第二前导电解质缓冲液内的第二前导电解质离子的有效迁移率量值可以大于核酸的有效迁移率量值。第二前导电解质缓冲液可具有低离子强度，例如与下游测定(例如，qPCR、下一代测序)兼容的离子强度。在一些情况下，第二前导电解质缓冲液与第一前导电解质缓冲液相同，但以不同的浓度或离子强度(例如，离子强度低于第一前导电解质缓冲液的离子强度)存在。例如，第一前导电解质缓冲液可具有70-100mM(例如70-100mM Tris HCl)的电解质离子浓度，而第二前导电解质缓冲液可具有小于70mM、小于60mM或小于50mM(例如，小于50mM Tris HCl)的电解质离子浓度。
储器(例如，样品储器)可以被配置用于经由施加压力或经由直接注入进行注入。使用直接注入储器，可以通过移液管将样品注入到微流体通道中。储器可以被配置成使得移液管端头的出口可以直接耦合至通道的入口。尖端在储器中的适当放置可以允许将样品注入通道中，同时使到储器侧面和/或内部的样品损失最小化。
图48A-图48H示出了被设计用于直接注入的示例性样品入口储器。
图48A-图48B示出了样品装载储器4800(或缓冲储器)的示例性设计，其被设计用于促进将样品(或缓冲液)直接注入微流体设备的通道中。装载储器4800可以被配置成通过导壁4802引导移液管朝向移液管端头的端部的放置位置4801的放置。放置位置4801通常是穿透芯片表面的孔口或通孔。导壁4802可以被配置成约束移液管端头的取向和位置，以适当地将移液管端头对准到放置位置4801中。例如，导壁4802可以具有截头圆锥形形状，其中圆锥的较窄区域4804位于放置位置4801处，并且圆锥的较宽区域4803位于装载储器4800的环境空气的入口通道4807处。较宽部分4803和较窄部分4804可以具有圆形横截面。导壁4802可以在较宽部分4803与较窄部分4804之间以一定的角度逐渐变细，所述角度被配置用于将移液管引导至放置位置4801。通过将移液管端头置于该位置4801，用户可以使用标准实验室微量移液管通过分配到第一档来将样品直接注入通道中。
样品(或缓冲液)装载储器4800可以被配置成通过使孔4800的直径最小化而使保持在孔4800中的样品(或缓冲液)体积的量最小化。总流体头部高度可以在距通道的底表面约1mm至约6mm的范围内，例如距通道的底表面约2.8mm。在装载到通道中后留在孔中的流体体积可以小于约15ul，例如约7ul，所述流体体积可以容纳在通道的顶部与样品储器4800之间(例如，在通孔4807内)。
样品(或缓冲液)装载储器4800可以被配置成在重力下将样品(或缓冲液)装载到其下方的通道中。通孔4807可以具有在约0.5mm至约5mm的范围内，例如约1.5mm，例如约1mm的直径。
样品(或缓冲液)装载储器4800可以包含截头圆锥形形状，其在流体头部高度处的直径(例如，在较窄部分4804中的放置位置4801处的直径)在约0.1mm至约4mm的范围内，例如在约1mm至约4mm的范围内，例如约1.8mm。
样品(或缓冲液)装载储器4800可以具有不大于约20mm、不大于约15mm、不大于约10mm或大于10mm的高度。例如，样品(或缓冲液)装载储器4800可以具有约6mm的高度。或者，样品(或缓冲液)装载储器4800可以具有在约8mm至约10mm范围内的高度。
样品(或缓冲液)装载储器4800的较宽部分4803可以具有约4.2mm的最大尺寸。
样品(或缓冲液)装载储器4800的较窄部分4804可以具有约1.5mm的最大尺寸。
样品(或缓冲液)装载储器4800的导壁4802可以在较宽部分4803与较窄部分4804之间以约60度至约90度范围内的角度逐渐变细。
图48C示出了可以与直接注入兼容的另一示例性储器4805的几何形状。与图48A-图48B所示的几何形状不同，储器4805缺乏确保正确放置的导壁。用户可以手动将移液管端头置于放置平面4806上，然后经由放置平面4806中的孔口4807将样品分配到下方的通道中。例如，储器4805可以具有细长的横截面形状，其被配置用于捕获注入期间来自移液管的溢流液体，并确保整个液体体积的无气泡装载。图48D示出了使用图48A中的储器4805将荧光水溶液4808注入微流体通道的结果。液体4808经由储器4805的导平面4806中的孔口4807注入，并且能够填充邻接的通道而没有气泡形成。
样品(或缓冲液)装载储器4805可以被配置成通过使孔4805的直径最小化而使以固定头部高度保持在孔4805中的样品(或缓冲液)体积的量最小化。总流体头部高度可以在距通道的底表面约1mm至约6mm的范围内，例如距通道的底表面约2.8mm。在装载到通道中后留在孔中的流体体积可以小于约15ul，例如约7ul，所述流体体积可以容纳在通道的顶部与样品储器4805之间(例如，在通孔4807内)。
样品(或缓冲液)装载储器4805可以被配置成在重力下将样品(或缓冲液)装载到其下方的通道中。通孔4807可以具有在约0.5mm至约5mm的范围内，例如约1.5mm，例如约1mm的直径。
样品(或缓冲液)装载储器4805可以包含细长形状，例如椭圆形形状，其具有约10mm的最大直径和约3mm的最小直径。
样品(或缓冲液)装载储器4805可以具有不大于约20mm、不大于约15mm、不大于约10mm或大于10mm的高度。例如，样品(或缓冲液)装载储器4805可以具有约6mm的高度。或者，样品(或缓冲液)装载储器4805可以具有在约8mm至约10mm范围内的高度。
图48E-图48F示出了样品装载储器4810(或缓冲液储器)的示例性设计，其可以促进将样品(或缓冲液)直接注入微流体设备的通道中。装载储器4810可以基本类似于图48A-图48B的储器4800，不同之处在于放置位置4811的形式可以是正方形孔口4813而不是圆形孔口。装载储器4810可以被配置用于通过导壁4812引导移液管朝向移液管端头的端部的放置位置4811的放置。导壁4812可以被配置成约束移液管端头的取向和位置，以适当地将移液管端头对准到放置位置4811中。例如，导壁4812可以具有截头圆锥形形状，其中圆锥的较窄区域4814位于放置位置4811处，并且圆锥的较宽区域8413位于装载储器4810的环境空气的入口通道4817处。较宽部分4813和较窄部分4814可以具有圆形横截面。放置位置4811可以在导壁4812的基部具有正方形横截面。导壁4812可以在较宽部分4813与较窄部分4814之间以一定的角度逐渐变细，所述角度被配置用于将移液管引导至放置位置4811。通过将移液管端头置于该位置4811，用户可以使用标准实验室微量移液管通过分配到第一档来将样品直接注入通道中。
样品(或缓冲液)装载储器4810可以被配置成通过使孔4810的直径最小化而使以固定头部高度保持在孔4810中的样品(或缓冲液)体积的量最小化。总流体头部高度可以在距通道的底表面约1mm至约6mm的范围内，例如距通道的底表面约2.8mm。在装载到通道中后留在孔中的流体体积可以小于约15ul，例如约7ul，所述流体体积可以容纳在通道的顶部与样品储器4810之间(例如，在通孔4817内)。
样品(或缓冲液)装载储器4810可以被配置成在重力下将样品(或缓冲液)装载到其下方的通道中。通孔4817可以具有在约0.5mm至约5mm的范围内，例如约1.5mm，例如约1mm的直径。
样品(或缓冲液)装载储器4810可以具有不大于约20mm、不大于约15mm、不大于约10mm或大于10mm的高度。例如，样品(或缓冲液)装载储器4810可以具有约6mm的高度。或者，样品(或缓冲液)装载储器4810可以具有在约8mm至约10mm范围内的高度。
样品(或缓冲液)装载储器4810的较宽部分4813可以具有约2.1mm的最大尺寸。
样品(或缓冲液)装载储器4810的较窄部分4814可以具有约1.5mm的最大尺寸。
样品(或缓冲液)装载储器4810的导壁4812可以在较宽部分4813和较窄部分4814之间以约60度至约90度的范围内的角度逐渐变细。
样品(或缓冲液)储器4810可以具有一个或多个通孔4817，通孔4817具有的形状被配置为允许通过储器4810下方的样品通道的电流的一部分进入样品储器4810，并将分析物从储器4810带出并进入下方的通道。通孔4817可以具有与储器4817定位在其上的通道的宽度基本或全部共同延伸的尺寸。共同延伸的尺寸可以是例如通道宽度的至少50％至150％，例如，在约1mm至约5mm之间。例如，通孔4817可以采取矩形形状，包括正方形。通孔4817还可以呈圆形形状，包括圆形或椭圆形。
矩形孔口4813可以足够大以允许施加到流体回路的电场的一些部分与样品的靶核酸相互作用。例如，如果样品的一部分在装载后保留在储器4810中，则当施加电场时，电场可以引起剩余的样品核酸从储器4810迁移到通道中以进行ITP浓缩。因此，即使在装载后一些样品缓冲液体积保留在孔4810中，靶核酸仍然可以进入通道，并且更少的分析物可能损失到孔4810。
当将电场施加到ITP分支时，大于10％的施加电流可以在所述样品储器长度的所述样品通道的顶表面上方行进。
矩形孔4813可以具有在所述样品通道宽度的约80％至约120％的范围内的宽度，例如样品通道的约100％的宽度(例如，对于2.2mm的通道为2.2mm的宽度)。
图48G-图48H示出了样品装载储器4820(或缓冲液储器)的示例性设计，其可以促进将样品(或缓冲液)直接注入到微流体设备的通道中。样品装载储器4820可以包括具有两个样品注入端口4821的椭圆形储器，用户可以通过样品注入端口4821将样品注入通道中。储器4810可以包括导壁4822，其被配置用于引导移液管向样品注入端口4821中的一个或两个的放置。例如，导壁4822可以具有位于放置位置4811处的圆锥的较窄区域4814以及位于装载储器4810的环境空气入口通道4817的圆锥的较宽区域8413。较宽部分4823和较窄部分4824可以具有椭圆形或细长的横截面。导壁4822可以在较宽部分4823与较窄部分4824之间以一定角度逐渐变细，所述角度被配置用于将移液管引导至样品注入端口4821中的一个或两个。通过将移液管端头置于任一端口4821中，用户可以使用标准实验室微量移液管通过分配到第一档来将样品直接注入通道中。
样品(或缓冲液)装载储器4820可以被配置成通过使孔4820的直径最小化，使以固定头部高度保持在孔4820中的样品(或缓冲液)体积的量最小化。总流体头部高度可以在距通道的底表面约1mm至约6mm的范围内，例如距通道的底表面约2.8mm。在装载到通道中后留在孔中的流体体积可以小于约15ul，例如约7ul，所述流体体积可以容纳在通道的顶部与样品储器4820之间(例如，在通孔4821内)。
样品(或缓冲液)装载储器4820可以被配置成在重力下将样品(或缓冲液)装载到其下方的通道中。通孔4821可以具有在约0.5mm至约5mm的范围内，例如约1.5mm，例如约1mm的直径。
通孔4821可以足够大，以允许施加到流体回路的电场的一些部分与样品的靶核酸相互作用。例如，如果样品的一部分在装载后保留在储器4820中，则当施加电场时，电场可以引起剩余的样品核酸从储器4820迁移到通道中以进行ITP浓缩。因此，即使在装载后一些样品缓冲液体积保留在孔4820中，靶核酸仍然可以进入通道，并且更少的分析物可能损失到孔4820。
储器4820可以是椭圆形的，以便为电场提供路径。
通孔4821可以由杆或填充块4825隔开。横穿孔4820底部的杆4825可以帮助引导电场进入保持在储器4820(通道上方)中的流体中。由于浮力作用，杆4825还可以帮助稳定孔4820中的流体防止二次流动，如本文所述。
当将电场施加到ITP分支时，大于10％的施加电流可以在所述样品储器4820长度的所述样品通道的顶表面上方行进通过。
通孔4821可以具有在所述样品通道宽度的约80％至约120％的范围内的宽度，例如样品通道的约100％的宽度(例如，对于2.2mm的通道为2.2mm的宽度)。
通孔4821可以具有在约0.2mm2至约7mm2的范围内，例如在约0.8mm2至约1.5mm2的范围内，或在约1mm2至约2.75mm2的范围内的面积。
通孔4821可以具有基本相同的形状。通孔4821可以具有不同的形状。
填充块或杆4825可以具有约3.7mm的宽度，沿孔4820的横向轴线跨越孔4820。填充块或杆4825可以具有约2mm的宽度，沿孔4820的纵向轴线跨越孔4820。
样品储器4820可以包括在通道中高度在0.2mm与2mm之间，例如约1.2mm的填充块4825。填充块4825可以将电流分为上分支和下分支。
样品(或缓冲液)装载储器4820可以包含细长形状，例如椭圆形形状，其具有约7.5mm的最大直径(即长度)和约5mm的最小直径(即宽度)。
样品(或缓冲液)装载储器4820可以具有不大于约20mm、不大于约15mm、不大于约10mm或大于10mm的高度。例如，样品(或缓冲液)装载储器4820可以具有约6mm的高度。或者，样品(或缓冲液)装载储器4820可以具有在约8mm至约10mm范围内的高度。
样品(或缓冲液)装载储器4820的较宽部分4823可以具有约2.1mm的最大尺寸。
样品(或缓冲液)装载储器4820的较窄部分4824可以具有约1.5mm的最大尺寸。
样品(或缓冲液)装载储器4820的导壁4822可以在较宽部分4823与较窄部分4824之间以在约60度至约90度的范围内的角度逐渐变细。
图49A和图49B示出了示例性的洗脱通道，其被配置用于在减少分散的同时保持高流体阻力和电阻以供自动化感测。图49A示出了通道设计。通道可以从宽通道4900开始，然后变窄4902。通道变窄所沿的轴向距离可以在最大通道宽度的2至50倍之间。通道可在完成90度转向4901之前变窄到最小宽度。这种缓慢过渡到狭窄通道的过程可能会产生低分散转向，其可以在转向时将核酸样品保留在紧密的带中。如本文所述，用于自动化信号处理的温度、电导率和/或电压测量的检测点可以位于转向4901的中心，其还可以是通道的最窄点。该检测点可以位于距洗脱储器4903较短的距离，从而允许在DNA洗脱之前做出信号处理决定(例如，触发)。图49B示出了从图49A中的通道收集的数据的示例。x轴是自分离开始后的时间。y轴是检测点4901的温度。在时间4904处，检测器前方的离子通过等速电泳替换为新的、较低迁移率的离子(例如，前导电解质)。在时间4905处，第三离子(例如，ITP带)取代第二离子，导致第二温度升高。在时间4906处，自动化信号处理系统检测该变化并关闭电压(和电流)，从而使转向4901内的温度迅速降低。
洗脱储器可以被配置用于在等速电泳过程中收集分析物。例如，洗脱室可以位于包含断裂的通道上方。从断裂点进入储器的通孔将要求电流流过通道，通过第一通孔进入储器，并从第二通孔流出，进入通道的连续部分。即，流体回路被设计成使得电流无法直接流到洗脱储器下方，而必须经过流入和流出储器。这样的配置在图50A1中示出，其示出了基底的流体表面5050，其中第一通道5051终止于与基底的相对储器表面上的储器连通的通孔5052、5053中(参见例如，图51C和图51D。)在一些实施方式中，在从通道5051流动的分析物方向上进入储器的通孔5052在储器中定位在低于离开储器通往第二通道5054的通孔5053。这在通孔5052、5053之间的储器中产生必须被填充以创建进出储器的电路径的体积。第一通道5051可以与第一电极连通，而第二通道5052可以与第二电极连通。通道5051、5054和储器可以包含导电流体(例如，洗脱缓冲液和/或高浓度洗脱缓冲液)。在第一电极和第二电极支架施加电压可以产生行进通过储器的电流。移动进入储器的分析物倾向于保留在储器中，而不是经由通道5054朝向额外的储器5055(例如，洗脱缓冲储器)在向上和向外方向上移动。储器可以包括台阶或平台，其定位在例如储器底板上方约0.5mm至约3mm处(例如，如图52B所示)。第二通孔5053可以穿透该台阶。这样的台阶或斜坡也产生适于移液的孔形区域。
在一些情况下，在第一通孔5052与第二通孔5053之间的储器中可以有两个台阶。第二通孔5053可以穿透较高的台阶，所述台阶可以比较低的台阶更远离第一通孔5052。或者，第二通孔5053可以穿透较低的台阶，其可以比较高的台阶更靠近第一通孔5052。
图50A是示例性洗脱储器5000的技术图的俯视图，所述洗脱储器可以位于本文所述的任何芯片设备上。储器5000可以被配置成容纳一定体积的洗脱缓冲液，如本文所述。在ITP运行完成后，靶核酸可以驻留在该体积内，如本文所述。储器5000可以包含第一通孔或孔口5001和第二通孔或孔口5002。第一通孔5001和第二通孔5002可以穿透芯片表面，并与位于储器5000下方的流体通道5003连通，如本文所述。例如，流体通道5003可以是如本文所述的洗脱通道。第一通孔5001和第二通孔5002可以通常彼此对准，并且与流体通道5003的纵轴对准，使得经由第二通孔5002将向通道5003中的流体施加将流体沿通道5003推向第一通孔5001。例如，用户可以将第一体积移出第一通孔5001，例如使用移液管。随后，可以经由第二通孔5002将新鲜洗脱缓冲液添加至通道5003，例如使用移液管。然后，用户可以执行从第一通孔5001最后清除所有剩余的缓冲液，例如使用移液管。通过这种方法，用户可以提高ITP纯化过程的总产率，并确保可以在两个洗脱步骤中从设备回收大部分纯化的靶核酸。
例如，第一通孔5001可以具有椭圆形形状。或者，第一通孔5001可以是圆形的。第一通孔5001可以具有本领域普通技术人员期望的任何形状。
例如，第二通孔5002可以是圆形的。或者，第二通孔5002可以具有椭圆形形状。第二通孔5002可以具有本领域普通技术人员期望的任何形状。
第一通孔5001可以具有在约100um至约3mm范围内的直径。
第一通孔5001可以具有小于约1.5mm，例如小于约1mm的最大尺寸。
第二通孔5002可以具有在约100um至约3mm范围内的直径。
第二通孔5002可以具有小于约1.5mm，例如小于约1mm的最大尺寸。
在一些实施方式中，储器5000下方的通道5003可以包含如图50A1所示的断裂，并且第一通孔5001和第二通孔5002可以与通道5003的第一终止端和第二终止端流体连通和/或电连通，如本文所述。第一通孔5001和第二通孔5002可以定位在储器内的不同高度处。第一通孔5001可以在储器中比第二通孔5002更低的位置处进入储器5000。第一通孔5001和第二通孔5002可以通过如本文所述的台阶或平台分离。
储器5000可以是圆形的。储器5000可以具有约5.3mm的直径。
储器5000可以由具有不大于25mm、不大于15mm、不大于10mm或大于10mm的高度的壁限定。储器5000可以具有约6mm的高度。储器5000可以具有在约8mm至约10mm范围内的高度。
第一通孔5001和第二通孔5002可以具有在约0.2mm2至7mm2的范围内的面积。第一通孔5001可以具有在约1mm2至约2.75mm2的范围内的面积。例如，第二通孔5002可以具有在约0.8mm2至约1.5mm2的范围内的面积。
通孔5001、5002可以具有基本相同的形状。通孔5001、5002可以具有不同的形状。
第一通孔5001可以具有正方形、矩形、椭圆形的形状，或者在通道5003的宽度或储器5000的宽度的方向上具有细长的方向。
第二通孔5002可以具有正方形、矩形、椭圆形的形状，或者在通道5003的宽度或储器5000的宽度的方向上具有细长的方向。
通孔5001、5002可以沿通道5003的纵轴布置。
第一通孔5001可以具有约1.75mm的最大距离(即，长度)和约1.3mm的最小距离(即，宽度)。
第二通孔5002可以是具有约1.2mm的直径的相对圆形。第二通孔5002可以被成形为使电场均匀地分布在储器5000上。
第一通孔5001与第二通孔5002之间的储器5000的体积可以不大于约2.5ml、1ml或0.5ml。第一通孔5001与第二通孔5002之间的储器5000的体积可以为约0.1mL。
每个通孔5001、5002的至少一部分可以在所述流体通道5003的所述宽度上与流体通道5003基本共同延伸。
第一通孔5001可以包括跨越流体通道5003的宽度和/或储器5000的宽度的至少一个侧面，例如一个侧面或两个侧面。至少一个侧面可以(各自)是至少75％线性的。
第二通孔5002可以包括跨越流体通道5003的宽度和/或储器5000的宽度的至少一个侧面，例如一个侧面或两个侧面。至少一个侧面可以(各自)是至少75％线性的。
第一通孔5001和第二通孔5002可以具有这样的形状，当所述流体通道5003和所述储器5000包含导电流体并且电流通过所述流体通道5003时，至少5％、至少6％、至少7％、至少10％或至少20％的所述电流在第一通孔5001与第二通孔5002之间通过所述储器5000。
图50B示出了另一示例性洗脱储器5010的横截面图，所述洗脱储器可以位于本文所述的任何芯片设备上。图50B示出了图6A中所示的洗脱储器设计603的另一视图。储器5010可以被配置用于容纳一定体积的洗脱缓冲液，如本文所述。在ITP运行完成后，靶核酸可以驻留在该体积内，如本文所述。储器5010可以包含单个通孔或孔口5011。通孔5011可以穿透芯片表面，并与位于储器5010下方的流体通道连通，如本文所述。例如，流体通道可以是本文所述的洗脱通道。例如，用户可以经由通孔5011将流体的第一体积移出储器5010，例如使用移液管。随后，可以经由储器5010的通孔5011将新鲜洗脱缓冲液添加至通道，例如使用移液管。然后，用户可以执行从通孔5011最后清除所有剩余的缓冲液，例如使用移液管。通过这种方法，用户可以提高ITP纯化过程的总产率，并确保可以在两个洗脱步骤中从设备回收大部分纯化的靶核酸。
图50C-图50E是图50A中的储器设计5000在不同洗脱步骤的流体设备的背景减除荧光图像。图50C表示ITP运行完成后即时的芯片状态，其中通道成功关闭以防止洗脱储器5000和通道(例如，通道5003)内的流体移动，如本文所述。图50D示出了在从第一通孔5001初始洗脱后的相同芯片，如本文所述。图50E是在用户向第二通孔5002添加了额外的洗脱缓冲液并通过移液从第一通孔5001完全排空洗脱储器5000之后的芯片的最终状态。从这些背景减除的图像显而易见，可以从第一洗脱获得大多数DNA物质，而第二洗脱步骤可以使用户能够洗涤并从储器回收剩余的DNA。图50F是示出了用于储器5000的洗脱工作流程的步骤的框图。在步骤5020中，可以完成ITP，如本文所述。在步骤5021中，可以关闭洗脱通道，如本文所述。在步骤5022中，可以通过从洗脱储器5000的第一通孔5001移除洗出液来执行第一洗脱。在步骤5023中，可以将额外的洗脱缓冲液添加至洗脱储器5000的第二通孔5002。在步骤5024中，可以通过从洗脱储器5000的第一通孔5001移除洗出液来执行第二洗脱。
本文提供了可以在完成ITP运行后与多于一种洗脱储器设计一起使用的洗脱方法或过程(步骤5020)。仪器通道闭合器可以分离稳定缓冲液(洗脱缓冲液)中的DNA(步骤5021)。本文所述的洗脱策略通常被设计为利用这种分离，并使总DNA产率最大化。洗脱技术的第一步骤可以是移除储器5000(或本文所述的任何洗脱储器)中的大部分液体体积(即洗脱缓冲液加上已使其到达储器的核酸)。这可以通过将移液管放置在第一储器通孔5001处并从中抽吸30至90uL的流体来完成(步骤5022)。其次，用户可以使用清洁缓冲液洗涤储器5000(步骤5023)。用户可以从第二通孔5002向第一通孔5001洗涤，以试图将最大量的分析物驱动到第一通孔5001的抽吸点。例如，用户可以通过将10至50uL的新鲜缓冲液吸移到洗脱储器5000的第二通孔5002中实现此该目的。最后，用户可以通过从第一通孔5001抽吸尽可能多的体积来回收剩余的分析物(步骤5024)。这种多步洗脱工作流程可以允许用户获得更高或最大可能的DNA产率。
芯片设备中的核酸(NA)处理的最后阶段通常可以是将核酸从微流体通道转移到储器(洗脱储器)中。与通道不同，该储器可以通过移液管接近。这可以允许用户在ITP运行完成和任何后续的芯片上处理后回收材料(核酸)，如本文所述。
减小该储器的体积可能是有益的，因为这可以增加回收的核酸的浓度。本文提供的储器被设计具有低液体体积(～50uL)，但核酸需要长时间来穿过。
图51A示出了可以用于核酸洗脱的示例性流体储器5100。储器5100可以位于本文所述的任何芯片设备上。储器5100可以具有圆形横截面。储器5100可以被配置用于容纳一定体积的洗脱缓冲液，如本文所述。在ITP运行完成后，靶核酸可以驻留在该体积内，如本文所述。储器5100可以包括第一通孔或孔口5101和第二通孔或孔口5102。两个通孔5101、5102可以各自连接到流体设备底层上的流体通道5104。第一通孔5101和第二通孔5102可以穿透芯片表面，并与位于储器5100下方的流体通道5104连通，如本文所述。例如，流体通道5104可以是本文所述的洗脱通道。第一通孔5101可以包括从通道5104到洗脱前可以在其上捕获有靶核酸的平台5103的流体高度的急剧上升(例如，从通道处的100-400um到孔内的2-3mm)。储器5100内的另一个垂直上升5106可以将平台5103耦合至第二通孔5102。第一通孔5101和第二通孔5102可以在储器5100内的不同的垂直平面。第一通孔5101和第二通孔5102可以通常彼此对准，并且与流体通道5104的纵轴对准，使得经由第二通孔5102向通道5104中的流体施加将流体沿通道5104推向第一通孔5101，如本文所述。第二通孔5102可以用于创建与高压电极的流体连接和电连接。图51B示出了储器5105的另一实施方式，其可以与储器5100基本相似，但具有为了注塑成型兼容性的进一步变化。例如，除了需要第二通孔壁的位置之外，第二通孔台阶5106的大小可以最小化。
例如，第一通孔5101可以具有椭圆形形状。或者，第一通孔5101可以是圆形的。第一通孔5101可以具有本领域普通技术人员期望的任何形状。
例如，第二通孔5102可以是圆形的。或者，第二通孔5102可以具有椭圆形形状。第二通孔5002可以具有本领域普通技术人员期望的任何形状。
第一通孔5101可以具有在约100um至约3mm的范围内的直径。
第一通孔5101可以具有小于约1.5mm，例如小于约1mm的最大尺寸。
第二通孔5102可以具有在约100um至约3mm的范围内的直径。
第二通孔5102可以具有小于约1.5mm，例如小于约1mm的最大尺寸。
第一通孔5101可以是细长的通孔，其穿透芯片表面以将储器5100耦合至通道5104。例如，第一通孔5101可以是如本文所述的圆柱形。例如，第一通孔5101可以具有在约1mm至约3mm的范围内的从通道5104到储器5100的高度。
第二通孔5102可以是细长的通孔，其穿透芯片表面以将储器5100耦合至通道5104。例如，第二通孔5102可以是圆柱形的，如本文所述。
第二通孔5102在通道5104上方的高度可以大于第一通孔5101在通道上方的高度。
储器5100可以包括圆形横截面。或者，储器5100可以包括细长的或椭圆形的横截面。
在一些实施方式中，储器5100下方的通道5104可以包含如图50A1所示的断裂，并且第一通孔5101和第二通孔5102可以与通道5104的第一终止端和第二终止端流体连通和/或电连通，如本文所述。第一通孔5101和第二通孔5102可以定位在储器内的不同高度处。第一通孔5101可以在储器中比第二通孔5102更低的位置处进入储器5100。第一通孔5101和第二通孔5102可以通过本文所述的台阶或平台5106分离。
储器5100可以是圆形的。储器5100可以具有约5.3mm的直径。
储器5100可以由具有不大于25mm、不大于15mm、不大于10mm或大于10mm的高度的壁限定。储器5100可以具有约6mm的高度。储器5100可以具有在约8mm至约10mm范围内的高度。
第一通孔5101和第二通孔5102可以具有在约0.2mm2至7mm2的范围内的面积。第一通孔5101可以具有在约1mm2至约2.75mm2的范围内的面积。例如，第二通孔5102可以具有在约0.8mm2至约1.5mm2的范围内的面积。
通孔5101、5102可以具有基本相同的形状。通孔5101、5102可以具有不同的形状。
第一通孔5101可以具有正方形、矩形、椭圆形的形状，或者在通道5104的宽度或储器5100的宽度的方向上具有细长的方向。
第二通孔5102可以具有正方形、矩形、椭圆形的形状，或者在通道5104的宽度或储器5100的宽度的方向上具有细长的方向。
通孔5101、5102可以沿通道5003的纵轴布置。
第一通孔5101可以具有约1.75mm的最大距离(即，长度)和约1.3mm的最小距离(即，宽度)。
第二通孔5102可以是具有约1.2mm的直径的相对圆形。第二通孔5102可以被成形为使电场均匀地分布在储器5100上。
第二通孔5102可以通过储器5100中的平台5106进入储器，所述平台定位在第一通孔5101进入储器5100的点上方约1mm至约6mm。
第一通孔5101与第二通孔5102之间的储器5100的体积可以不大于约2.5ml、1ml或0.5ml。第一通孔5101与第二通孔5102之间的储器5100的体积可以为约0.1mL。
每个通孔5101、5102的至少一部分可以在所述流体通道5104的所述宽度上与流体通道5104基本共同延伸。
第一通孔5101可以包括跨越流体通道5104的宽度和/或储器5100的宽度的至少一个侧面，例如一个侧面或两个侧面。至少一个侧面可以(各自)是至少75％线性的。
第二通孔5102可以包括跨越流体通道5104的宽度和/或储器5100的宽度的至少一个侧面，例如一个侧面或两个侧面。至少一个侧面可以(各自)是至少75％线性的。
第一通孔5101和第二通孔5102可以具有这样的形状，当所述流体通道5104和所述储器5100包含导电流体并且电流通过所述流体通道5104时，至少5％、至少6％、至少7％、至少10％或至少20％的所述电流在第一通孔5101与第二通孔5102之间通过所述储器5100。
图51C和图51D示出了储器5110的另一实施方式的两个视图。储器5110可以位于本文所述的任何芯片设备上。储器5110可以具有细长或椭圆形横截面。储器5110可以被配置用于容纳一定体积的洗脱缓冲液，如本文所述。在ITP运行完成后，靶核酸可以驻留在该体积内，如本文所述。储器5110可以包含第一通孔或孔口5111和第二通孔或孔口5112。两个通孔5111、5112中的每一个可以连接至流体设备的底层上的流体通道。第一通孔5111和第二通孔5112可以穿透芯片表面，并与位于储器5110下方的流体通道连通，如本文所述。例如，流体通道可以是本文所述的洗脱通道。第一通孔5111和第二通孔5111可以在储器5110内的相同平面上。第一通孔5111和第二通孔5111可以由垂直门5113分离，垂直门5113高于通孔5111、5112的平面。垂直门5113可以用于将靶核酸向上驱动至储器5110中。这可以促进本文所述的浮力作用，并且有助于将靶核酸从通道提升到储器5110中。在一些情况下，ITP可以在比仅通过浮力作用(不借助垂直门5113)将靶核酸提升到储器中所需的驱动电流更低的驱动电流下执行。第一通孔5111和第二通孔5112可以通常彼此对准，并且与流体通道的纵轴对准，使得经由第二通孔5112向通道中的流体施加将流体沿通道推向第一通孔5111，如本文所述。第二通孔5112可以用于创建与高压电极的流体连接和电连接。
例如，第一通孔5111可以具有D形横截面，其具有由垂直门5113之一限定的直壁。或者，第一通孔5111可以具有椭圆形形状。或者，第一通孔5111可以是圆形的。第一通孔5111可以具有本领域普通技术人员期望的任何形状。
例如，第二通孔5112可以具有D形横截面，其具有由垂直门5113之一限定的直壁。或者，第二通孔5112可以具有椭圆形形状。或者，通孔5112可以是圆形的。第二通孔5112可以具有本领域普通技术人员期望的任何形状。
第一通孔5111可以具有在约100um至约3mm的范围内的直径。第一通孔5111可以具有约1.2mm的直径。
第一通孔5111可以具有小于约1.5mm，例如小于约1mm的最大尺寸。
第二通孔5112可以具有在约100um至约3mm的范围内的直径。第一通孔5111可以具有约1.2mm的直径。
第二通孔5112可以具有小于约1.5mm，例如小于约1mm的最大尺寸。
第一通孔5111可以是细长的通孔，其穿透芯片表面以将储器5110耦合至通道。例如，第一通孔5111可以是圆柱形的，如本文所述。例如，第一通孔5111可以具有在约1mm至约3mm的范围内的从通道到储器5110的高度。
第二通孔5112可以是细长的通孔，其穿透芯片表面以将储器5110耦合至通道。例如，第二通孔5112可以是圆柱形的，如本文所述。
垂直门5113可以具有大于第一通孔5111的通道上方的高度的通道上方的高度。
垂直门5113可以具有大于第二通孔5112的通道上方的高度的通道上方的高度。
储器5110可以包含圆形横截面。或者，储器5110可以包含细长的或椭圆形的横截面。
储器5110可以包含细长形状，例如椭圆形形状，具有约7mm的最大直径(即，长度)和约3.4mm的最小直径(即，宽度)。
储器5110可以具有不大于约20mm、不大于约15mm、不大于约10mm或大于10mm的高度。例如，储器5110可以具有约6mm的高度。或者，储器5110可以具有在约8mm至约10mm的范围内的高度。
在一些实施方式中，储器5110下方的通道可以包含如图50A1所示的断裂，并且第一通孔5111和第二通孔5112可以与通道的第一终止端和第二终止端流体连通和/或电连通，如本文所述。第一通孔5111和第二通孔5112可以定位在储器5110内的不同高度处。第一通孔5111可以在储器中比第二通孔5112更低的位置处进入储器5110。第一通孔5111和第二通孔512可以间隔台阶或门5113，如本文所述。
储器5110可以由具有不大于25mm、不大于15mm、不大于10mm或大于10mm的高度的壁限定。储器5110可以具有约6mm的高度。储器5110可以具有在约8mm至约10mm的范围内的高度。
第一通孔5111和第二通孔5112可以具有在约0.2mm2至7mm2范围内的面积。第一通孔5111可以具有在约1mm2至约2.75mm2的范围内的面积。例如，第二通孔5102可以具有在约0.8mm2至约1.5mm2的范围内的面积。
通孔5111、5112可以具有基本相同的形状。通孔5101、5102可以具有不同的形状。
第一通孔5111可以具有正方形、矩形、椭圆形的形状，或者在通道的宽度或储器5110的宽度的方向上具有细长的方向。
第二通孔5112可以具有正方形、矩形、椭圆形的形状，或者在通道的宽度或储器5110的宽度的方向上具有细长的方向。
通孔5111、5112可以沿通道的纵轴布置。
第一通孔5111可以具有约1.2mm的最大距离(即，长度)。
第二通孔5112可以具有约1.2mm的最大距离(即，长度)。
第一通孔5111与第二通孔5112之间的储器5110的体积可以不大于约2.5ml、1ml或0.5ml。第一通孔5111与第二通孔5112之间的储器5110的体积可以为约0.1mL。
每个通孔5111、5112的至少一部分可以在所述流体通道的所述宽度上与流体通道基本共同延伸。
第一通孔5111可以包括跨越流体通道的宽度和/或储器5110的宽度的至少一个侧面，例如一个侧面或两个侧面。至少一个侧面可以(各自)是至少75％线性的。
第二通孔5112可以包括跨越流体通道的宽度和/或储器5110的宽度的至少一个侧面，例如一个侧面或两个侧面。至少一个侧面可以(各自)是至少75％线性的。
第一通孔5111和第二通孔5112可以具有这样的形状，当所述流体通道和所述储器5110包含导电流体并且电流通过所述流体通道时，至少5％、至少6％、至少7％、至少10％或至少20％的所述电流在第一通孔5111与第二通孔5112之间通过所述储器5110。
图51E示出了储器设计5110与参考设计5150之间的核酸停留时间的比较。停留时间通过施加的电流和储器内的液体体积来衡量，以产生体积停留电荷，单位为C/uL。与没有门的参考设计5150(n＝8)相比，来自门设计5110(n＝2)的体积停留电荷增加了四倍以上。图51F示出了参考设计5150的横截面，其具有没有任何内部结构的牵伸立式圆柱。参考设计5150基本类似于图50B中描述的储器。
图52A示出了流体储器5200的另一个实施方式。储器5200可以位于本文所述的任何芯片设备上。储器5200可以具有圆形横截面。储器5200可以被配置用于容纳一定体积的洗脱缓冲液，如本文所述。在ITP运行完成后，靶核酸可以驻留在该体积内，如本文所述。储器5200可以包括第一通孔或孔口5201和第二通孔或孔口5202。两个通孔5201、5202中的每一个可以连接至流体设备的底层上的流体通道。第一通孔5201和第二通孔5202可以穿透芯片表面，并且与位于储器5200下方的流体通道连通，如本文所述。例如，流体通道可以是如本文所述的洗脱通道。第一通孔5211和第二通孔5211可以开放到储器5200内的不同平面上。第一通孔5201可以是椭圆形通孔5201，其尺寸使得移液管端头可以容易地定位，以从设备的通道可靠地回收流体。第一通孔5201和第二通孔5202可以通常彼此对准，并且与流体通道的纵轴对准，使得经由第二通孔5202向通道中的流体施加将流体沿通道推向第一通孔5201，如本文所述。第二通孔5202可以用于创建与高压电极的流体连接和电连接。如图52B所示，可以将移液管端头5203插入第一通孔5201中，直至移液管端头与第一通孔5201的一个或多个壁之间的干涉防止在限定的耦合位置处的进一步插入。可以限定耦合位置，以确保流体设备的流体体积与移液管端头的入口孔之间不受限制的路径。可以通过将接触点最小化为两个点5204来减小缩回力。如图52C所示，第一通孔5201的主轴和副轴的尺寸可以设置成使得当达到耦合位置时，在移液管端头5203周围保持流体路径5205。
例如，第一通孔5201可以具有椭圆形形状。或者，第一通孔5201可以是圆形的。第一通孔5201可以具有本领域普通技术人员期望的任何形状。
例如，第二通孔5202可以具有椭圆形形状。或者，第二通孔5202可以是圆形的。第二通孔5202可以具有本领域普通技术人员期望的任何形状。
第一通孔5201可以具有在约100um至约3mm的范围内的直径。
第一通孔5201可以具有小于约1.5mm，例如小于约1mm的最大尺寸。
第二通孔5202可以具有在约100um至约3mm的范围内的直径。
第二通孔5202可以具有小于约1.5mm，例如小于约1mm的最大尺寸。
第一通孔5201可以是细长的通孔，其穿透芯片表面以将储器5200耦合至通道。例如，第一通孔5201可以是圆柱形的，如本文所述。例如，第一通孔5201可以具有在约1mm至约3mm的范围内的从通道到储器5200的高度。
第二通孔5202可以是细长的通孔，其穿透芯片表面以将储器5200耦合至通道。例如，第二通孔5202可以是圆柱形的，如本文所述。
第二通孔5202可以具有大于第一通孔5201的通道上方的高度的通道上方的高度。
储器5200可以包含圆形横截面。或者，储器5200可以包含细长的或椭圆形的横截面。
在一些实施方式中，储器5200下方的通道可以包含如图50A1所示的断裂，并且第一通孔5201和第二通孔5202可以与通道的第一终止端和第二终止端流体连通和/或电连通，如本文所述。第一通孔5201和第二通孔5202可以定位在储器内的不同高度处。第一通孔5201可以在储器中比第二通孔5102更低的位置处进入储器5200。第一通孔5201和第二通孔5202可以通过本文所述的台阶或平台5206分离。
储器5200可以是圆形的。储器5200可以具有约5.3mm的直径。
储器5200可以由具有不大于25mm、不大于15mm、不大于10mm或大于10mm的高度的壁限定。储器5200可以具有约6mm的高度。储器5200可以具有在约8mm至约10mm的范围内的高度。
第一通孔5201和第二通孔5202可以具有在约0.2mm2至7mm2的范围内的面积。第一通孔5201可以具有在约1mm2至约2.75mm2的范围内的面积。例如，第二通孔5202可以具有在约0.8mm2至约1.5mm2的范围内的面积。
通孔5201、5202可以具有基本相同的形状。通孔5201、5202可以具有不同的形状。
第一通孔5201可以具有正方形、矩形、椭圆形的形状，或者在通道的宽度或储器5200的宽度的方向上具有细长的方向。
第二通孔5202可以具有正方形、矩形、椭圆形的形状，或者在通道的宽度或储器5200的宽度的方向上具有细长的方向。
通孔5201、5202可以沿通道5003的纵轴布置。
第一通孔5201可以具有约1.75mm的最大距离(即，长度)和约1.3mm的最小距离(即，宽度)。
第二通孔5202可以是具有约1.2mm的直径的相对圆形。第二通孔5202可以被成形为使电场均匀地分布在储器5200上。
第二通孔5202可以通过储器5200中的平台5126进入储器，平台5126定位在第一通孔5201进入储器5200的点上方约1mm至约6mm。
第一通孔5201与第二通孔5202之间的储器5200的体积可以不大于约2.5ml、1ml或0.5ml。第一通孔5201与第二通孔5202之间的储器5200的体积可以是约0.1mL。
每个通孔5201、5202的至少一部分可以在整个所述流体通道的所述宽度上与流体通道基本共同延伸。
第一通孔5201可以包括跨越流体通道的宽度和/或储器5200的宽度的至少一个侧面，例如一个侧面或两个侧面。至少一个侧面可以(各自)是至少75％线性的。
第二通孔5202可以包括跨越流体通道的宽度和/或储器5200的宽度的至少一个侧面，例如一个侧面或两个侧面。至少一个侧面可以(各自)是至少75％线性的。
第一通孔5201和第二通孔5202可以具有这样的形状，当所述流体通道和所述储器5200包含导电流体并且电流通过所述流体通道时，至少5％、至少6％、至少7％、至少10％或至少20％的所述电流在第一通孔5201与第二通孔5202之间通过所述储器5200。
图52D示出了用于流体体积回收的具有圆形第一通孔5201移液管接口(n＝2)的储器5200与具有椭圆形第一通孔5201接口(n＝2)的储器的比较。圆形通孔设计可以作为对照，其中移液管端头不会被限制在精确的耦合位置。在一些实施方式中，本公开内容提供了具有椭圆形通孔接口5201的流体储器5200，该椭圆形通孔接口5201可以允许移液管的精确定位以使流体排空最大化。流体储器5200可以并入更大的流体设备中。可以通过在插入最终耦合位置后对移液管端头的约束来实现定位。通孔5201的椭圆形几何形状可以允许流体无围绕移液管端头不受限制的流动，并且可以减小使移液管端头从其耦合位置缩回所需的力。通过将移液管端头与储器通孔5201之间的接触限制到两个点5204的设计，可以使缩回力最小化。最小化的缩回力降低了在缩回时干扰流体设备位置的风险。
图53A示出了示例性的流体储器5301。储器5300可以基本类似于储器5200，但具有圆形边缘5302，其可以有利于向第一通孔提取部位5301的排放。图53B描绘了储器5300的另一视图。图53C示出了用于流体体积回收的具有带角的内部边缘的储器(例如，储器5200)与具有带圆角的内部边缘5304的储器(例如，储器5300)之间的比较。
图53D示出了示例性洗脱储器5310的俯视图。图53E示出了洗脱储器5310的截面图。储器5310可以位于本文所述的任何芯片设备上。储器5310可以具有细长或椭圆形的横截面。储器5310可以配置成容纳一定体积的洗脱缓冲液，如本文所述。在ITP运行完成后，靶核酸可以驻留在该体积内，如本文所述。储器5310可以包含第一通孔或孔口5311和第二通孔或孔口5312。两个通孔5311、5312中的每一个可以连接至流体设备的底层上的流体通道5313。第一通孔5311和第二通孔5312可以穿透芯片表面，并且与位于储器5310下方的流体通道5313连通，如本文所述。例如，流体通道5313可以是如本文所述的洗脱通道。第一通孔5311和第二通孔5311可以在储器5310内的相同平面上。第一通孔5311的尺寸可以设置成使得移液管端头可以容易地定位，以从所述设备可靠地回收流体。例如，第一通孔5311可以包括导壁5314，其被配置用于引导将移液管端头朝向通道5313放置。导壁5314可以被配置用于约束移液管端头的取向和位置，以使移液管端头与通道5313适当对准。例如，导壁5314可以具有位于通道5313处的较窄区域5315和位于装载储器5300的周围空气的入口通道处的较宽区域5316。较宽部分5316和较窄部分5315可以具有D形横截面。导壁5314可以在较宽部分5316与较窄部分5315之间以被配置用于将移液管引导至通道5313的角度逐渐变细。
第一通孔5311和第二通孔5312可以通常彼此对准，并且与流体通道5313的纵轴对准，使得经由第二通孔5312向通道5313中的流体施加将流体沿通道5313推向第一通孔5311，如本文所述。第二通孔5312可以用于创建与高压电极的流体连接和电连接。
例如，第一通孔5311可以具有D形横截面。或者，第一通孔5311可以具有椭圆形形状。或者，第一通孔5311可以是圆形的。第一通孔5311可以具有本领域普通技术人员期望的任何形状。
例如，第二通孔5312可以具有D形横截面。或者，第二通孔5312可以具有椭圆形形状。或者，第二通孔5312可以是圆形的。第二通孔5312可以具有本领域普通技术人员期望的任何形状。
第一通孔5211可以具有在约100um至约3mm的范围内的直径。
第一通孔5211的较宽部分5316可以具有在约100um至约3mm的范围内的直径。
第一通孔5211的较窄部分5315可以具有在约100um至约3mm的范围内的直径。
第一通孔5311可以具有小于约1.5mm，例如小于约1mm的最大尺寸。
导壁5314可以在较宽部分5316与较窄部分5315之间以配置用于将移液管引导至通道5313的角度逐渐变细。导壁5314可以以约60度至约90度范围内的角度逐渐变细。
第二通孔5312可以具有在约100um至约3mm的范围内的直径。
第二通孔5312可以具有小于约1.5mm，例如小于约1mm的最大尺寸。
第一通孔5311可以是细长的通孔，其穿透芯片表面以将储器5310耦合至通道。例如，第一通孔5311可以如本文所述逐渐变细。例如，第一通孔5311可以具有在约1mm至约3mm的范围内的从通道到储器5310的高度。
第二通孔5312可以是细长的通孔，其穿透芯片表面以将储器5310耦合至通道。例如，第二通孔5312可以是圆柱形的，如本文所述。
储器5310可以包含圆形横截面。或者，储器5310可以包含细长的或椭圆形的横截面。
在一些实施方式中，储器5310下方的通道5313可以包含如图50A1所示的断裂，并且第一通孔5311和第二通孔5312可以与通道5313的第一终止端和第二终止端流体连通和/或电连通，如本文所述。第一通孔5311和第二通孔5312可以定位在储器5310内的不同高度处。第一通孔5311可以在储器中比第二通孔5312更低的位置处进入储器5310。第一通孔5311和第二通孔5312可以通过本文所述的台阶或平台分离。
储器5310可以包括细长形状，例如椭圆形形状，其具有约7mm的最大直径(即，长度)和约3.4mm的最小直径(即，宽度)。
储器5310可以由具有不大于25mm、不大于15mm、不大于10mm或大于10mm的高度的壁限定。储器5310可以具有约6mm的高度。储器5310可以具有在约8mm至约10mm的范围内的高度。
第一通孔5311和第二通孔5312可以具有在约0.2mm2至7mm2的范围内的面积。第一通孔5311可以具有在约1mm2至约2.75mm2的范围内的面积。例如，第二通孔5312可以具有在约0.8mm2至约1.5mm2的范围内的面积。
通孔5311、5312可以具有基本相同的形状。通孔5311、5312可以具有不同的形状。
第一通孔5311可以具有正方形、矩形、椭圆形的形状，或者在通道5313的宽度或储器5310的宽度的方向上具有细长的方向。第一通孔5311可以是D形的。
第二通孔5312可以具有正方形、矩形、椭圆形的形状，或者在通道5313的宽度或储器5310的宽度的方向上具有细长的方向。
通孔5311、5312可以沿通道5313的纵轴布置。
第一通孔5311可以具有约1.75mm的最大距离(即，长度)和约1.3mm的最小距离(即，宽度)。
第二通孔5312可以是具有约1.2mm的直径的相对圆形。第二通孔5312可以被成形为使电场均匀地分布在储器5310上。
第一通孔5311与第二通孔5312之间的储器5310的体积可以不大于约2.5ml、1ml或0.5ml。第一通孔5311与第二通孔5312之间的储器5200的体积可以是约0.1mL。
每个通孔5311、5312的至少一部分可以在所述流体通道5313的所述宽度上与流体通道5313基本共同延伸。
第一通孔5311可以包括跨越流体通道5313的宽度和/或储器5310的宽度的至少一个侧面，例如一个侧面或两个侧面。至少一个侧面可以(各自)是至少75％线性的。
第二通孔5312可以包括跨越流体通道5313的宽度和/或储器5310的宽度的至少一个侧面，例如一个侧面或两个侧面。至少一个侧面可以(各自)是至少75％线性的。
第一通孔5311和第二通孔5312可以具有这样的形状，当所述流体通道和所述储器5310包含导电流体并且电流通过所述流体通道时，至少5％、至少6％、至少7％、至少10％或至少20％的所述电流在第一通孔5311与第二通孔5312之间通过所述储器5310。
在一些实施方式中，本公开内容提供了具有圆形内部边缘的流体储器，该圆形边缘使在从通孔提取流体向通孔的排放最大化。圆形边缘通过减少在储器的水平底板与垂直壁之间需要润湿的流体体积来使从储器的流体回收最大化。此外，圆形边缘使储器内部的润湿的表面积最小化，提高了流体的回收。
可以闭合流体设备上的通道。例如，耦合至机械构件的机械致动器可用于施加压力以完全或部分地闭合通道(例如，通过通道的变形)。可以从ITP通道闭合洗脱储器以限定固定的洗脱体积。通道闭合可导致流动减少或流动完全阻塞。通道闭合可导致流体流动阻力增加。在一些情况下，通道闭合可将流体阻力增加至少2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。
图12A示出了示例性机械构件1200，其可用于施加压力以闭合或至少部分地闭合流体设备1210的通道1201，流体设备1210包含多个平行的通道(例如，图6C的包含八个独立的平行通道的设备)。机械构件1200可包含具有齿1202的梳状结构，齿1202与芯片的八个通道中的每个通道中的两个位置1204、1205对齐，如图12B所示。可以通过齿1202施加机械压力以永久地或塑性地闭合或至少部分地闭合通道1201，从而限制、减少或防止液体流入或流出洗脱储器1203并控制洗脱体积。至少部分地闭合通道1201可增加对通道1201与洗脱储器1203之间的流体流动的阻力。可将机械构件1200耦合至机械致动器，该机械致动器生成由机械构件1200的齿1202施加到通道1201的力。机械构件1200可包含杨氏弹性模量大于通道1201的杨氏弹性模量的材料。机械构件1200的一个或多个齿1202可被配置为加热通道1201。机械构件1200的一个或多个齿1202可以热耦合至加热器或加热元件。机械构件1200可任选地包含加热器或加热元件。可任选地通过齿1202施加热量以永久地或塑性地闭合通道1201。可以将一个或多个齿1202加热至大于一个或多个通道1201的至少一个壁的玻璃化转变温度的温度。图12C示出了机械构件1200的十六个齿1202如何与芯片1210上的十六个位置1204、1205(每个通道两个位置)对齐。每个齿1202可被配置为向通道1201递送机械压力，以使通道1201的至少一个壁塑性变形。每个通道1201与机械构件1200接触并在第一闭合位置1204和第二闭合位置1205处塑性变形，以隔离洗脱储器容积并增加通道1201与储器1203之间的流体阻力。在一些情况下，齿1202可以将机械压力施加到储器1203上游的通道位置1204。在一些情况下，齿1202可以将机械压力施加到储器1203和通道1201相遇的接点。在一些情况下，齿1202可以将机械压力施加到接点1205，在那里储器与缓冲通道相遇以防止储器1203与缓冲储器之间的流体连通。
在一些情况下，机械构件1200可包含每个通道一个齿1202，其与第一闭合位置1204对准。例如，图5A中所示的通道不包含连接到洗脱储器的缓冲通道或储器，并因此可能不需要在洗脱储器之外的第二闭合位置1205。在一些情况下，机械构件1200被配置为在一个或多个位置处闭合芯片1210上的每个通道1201。在一些情况下，机械构件1200被配置为使芯片1210上的一个或多个通道1201打开，使得芯片1210上的仅一部分通道1201得以闭合。
机械构件1200可以通过齿1202施加每通道至少0.25lbs的力。机械构件1200的每个齿1202可以向通道1201施加至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4或5磅的力。
图54A示出了示例性机械构件1220，其可用于施加压力以闭合或至少部分地闭合流体设备1210的通道1201，流体设备1210包含多个平行的通道(例如，图6C包含八个独立的平行通道的设备)。机械构件1220可包含类似于机械构件1200的脊状结构，但没有齿。脊状结构可以在两个位置1204、1205处横向延伸并压缩芯片的八个通道中的每个通道，如图54B所示。可以通过脊1222施加机械压力以永久地或塑性地闭合或至少部分地闭合通道1201，以便限制、减少或防止液体流入或流出洗脱储器1203并控制洗脱体积。至少部分地闭合通道1201可增加对通道1201与洗脱储器1203之间的流体流动的阻力。可将机械构件1220耦合至机械致动器1213，机械致动器1213生成由机械构件1220的脊1222施加到通道1201的力。机械构件1220可包含杨氏弹性模量大于通道1201的杨氏弹性模量的材料。机械构件1220的脊状结构1222可被配置用于加热通道1201。机械构件1220的脊状结构1222可以热耦合至加热器或加热元件。机械构件1220可任选地包含加热器或加热元件。可任选地通过脊状结构1222施加热量以永久地或塑性地闭合通道1201。可以将脊状结构1222加热至高于一个或多个通道1201的至少一个壁的玻璃化转变温度的温度。图54C示出了机械构件1220的脊1222如何与芯片1210上的十六个位置1204、1205(每个流体通道两个位置)对齐。脊1222可被配置为向通道1201递送机械压力，以使通道1201的至少一个壁塑性变形。每个通道1201与机械构件1220接触并在第一闭合位置1204和第二闭合位置1205处塑性变形，以隔离洗脱储器体积并增加通道1201与储器1203之间的流体阻力。在一些情况下，脊结构1222可以将机械压力施加到储器1203上游的通道位置1204。在一些情况下，脊结构1222可以将机械压力施加到储器1203和通道1201相遇的连接件。在一些情况下，脊结构1222可以将机械压力施加到连接1205，在那里储器与缓冲通道相遇以防止储器1203与缓冲储器之间的流体连通。
图54D示出了耦合至脊状结构1220以闭合通道的机械致动器的分解组件装配图。该组装可以是独立装配，或者可以作为本文所述的任何仪器的子装配并入。该设计可以被配置为模块化的，并且可以适应包括齿或脊的不同的构件结构设计，或者本领域普通技术人员将显而易见的替代结构。
在一些实施方式中，可以通过停止施加到设备的一个或多个通道的电场来触发本文所述的任何机械构件以闭合一个或多个通道。
图55描绘了β原型和生产仪器的气动控制框图。
图56A-图56B、图57和图58A-图58C示出了在不使用热或压力引起的流体设备的塑性变形的情况下，用于闭合通道的替代机构。物理构件可以通过施加膜来闭合或部分地闭合流体设备的通道，该膜为流体设备上的芯片储器提供密封。所述机构可以在施加或不施加机械压力的情况下，使用膜的粘附或自修复来闭合或部分地闭合通道，而不引起芯片设备或材料的变形。所述机构可以将恒定的力和/或压力被动地(例如，通过施加固定的机械载荷)施加到流体设备的流体储器。
图56A-图56B示出了示例性机械构件5600，其可用于闭合或至少部分地闭合流体设备5605的储器5604，流体设备5605包括多个平行的通道(例如，流体设备中的8个平行通道)。机械构件5600可以包括顺应式结构5602，其与连接到流体设备中的单个通道的一系列储器(例如，5个储器)对齐。洗脱储器5603有意保持向大气开放，以允许在机械构件5600闭合或部分地闭合其他五个储器5604时提取(例如，通过移液)在流体设备5605中处理过的材料。可以将机械压力施加到顺应式结构1502以临时闭合或至少部分地闭合储器5604，从而限制、减少或防止液体流入或流出洗脱储器5603并控制洗脱体积。至少部分地闭合储器5604可增加对样品/缓冲液储器5604与洗脱储器5603之间的流体流动的阻力。
顺应式结构5602可以包括或类似于PCR薄膜密封或膜。PCR薄膜密封是一种类型的一次性膜，可以粘合施加于流体储器以密封它们并防止在连接的通道中流动。可以通过施加机械压力来改善粘合过程。可以施加机械压力以不对储器中的流体施加压力，从而防止或最小化通道闭合期间芯片内的液体流动。PCR薄膜/膜可以代表用于通道闭合的低成本、一次性的选择，其可以减少交叉污染，所述交叉污染有时可能在芯片之间重复施加相同的膜(即可重复使用的膜)时发生。
顺应式结构5602可以包括或类似于顺应式或自修复膜密封件。顺应式或自修复膜密封件是一种类型的一次性或可重复使用的膜，其可以在有或没有机械压力的情况下将施加在流体储器上以密封它们并防止或减少所连接通道中的流动。这样的密封的一种类型是顺应式橡胶垫圈材料。该橡胶密封构件可以是一次性的或可重复使用的。可重复使用的橡胶密封构件可能需要在使用之间使用兼容的清洁溶剂清洁膜材料，以防止或减少使用之间的交叉污染的风险。顺应式橡胶密封可以被施加固定的机械装载或压力。可以施加机械压力以不对储器中的流体不施加压力，从而防止或最小化通道闭合期间芯片内的液体流动。
图57示出了示例性机械构件5700，其可用于施加压力以闭合或至少部分地闭合流体设备5705的储器5704，流体设备5705包含多个平行的通道。机械构件5700可以包括与流体设备上的打开的缓冲液或样品储器对齐的承载结构5701和顺应式结构5702。流体设备上的洗脱储器5703有意地保持向大气开放，以允许在机械构件闭合或部分地闭合其他五个储器5704时提取在流体设备5705中处理过的材料。机械压力可以由刚性结构5701施加至顺应式结构5702，以临时闭合或至少部分地闭合储器5704，从而限制、减少或防止液体流入或流出洗脱储器5703并控制洗脱体积。至少部分地闭合储器5704可增加对样品/缓冲液储器5704与洗脱储器5703之间的流体流动的阻力。
图58A-图58C示出了示例性通道闭合器，其具有橡胶密封构件和机械致动器，以提供用于密封的机械载荷。图58A示出了通道闭合设备5800的侧视图的图像，其包括顺应式橡胶密封构件5801和用于施加机械载荷5802的结构以闭合或至少部分地闭合流体设备的储器5803。如本领域普通技术人员将理解的，可以采用各种材料(例如聚氨酯、硅树脂、乙烯树脂)、硬度计(超软至软，或30OO-50硬度计)和厚度(例如，0.05”至0.25”)。在一个示例中，橡胶可以是具有400OO的硬度计和0.060”的厚度的聚氨酯。橡胶构件5801可以被配置为覆盖流体设备上的除洗脱储器5805外的所有储器5803。橡胶构件5801可以被安装到平坦的固体支撑件5804(例如，塑料、玻璃或金属，如铝)，以向芯片储器5801提供平坦的密封表面。可以通过机械致动器将机械载荷5802(诸如约0至约2kg)施加到平坦支撑件5804，以进一步压缩顺应式橡胶构件5801并提供对芯片储器5803的密封。备选地或组合地，固体支撑元件5804(例如，加重的固体支撑件)可用于将机械载荷被动地施加到橡胶构件5801。
图58B和图58C示出了橡胶构件5801的两种示例性配置。图58B示出了一个示例，其中橡胶膜5801被配置成仅与流体设备顶部的储器5803的顶部特定地接口(而不是与设备顶部的每个结构接口)。图58C示出了一个示例，其中橡胶膜5801被配置为单层片或层，并且通常与除洗脱储器5805之外的设备顶部的所有结构接口。
流体设备上的通道(例如，样品制备区、等速电泳区)可具有足够大的宽度、高度或直径，使得污染物如包埋材料(例如，石蜡)可沉积在通道壁上，同时仍留有足够的空间使流体在通道内流动。在一些情况下，流体设备上的通道的宽度、高度或直径小于或等于20毫米(mm)、19mm、18mm、17mm、16mm、15mm、14mm、13mm、12mm、11mm、10mm、9mm、8mm 7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、0.9mm、0.8mm、0.7mm、0.6mm、0.5mm、0.4mm、0.3mm、0.2mm或0.1mm。在一些情况下，流体设备上的通道的宽度、高度或直径为至少0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm或20mm。在一些情况下，流体设备上的通道的宽度在约1mm至约3.8mm的范围内。在一些情况下，流体设备上的通道的高度在约0.1mm至约1.2mm的范围内。
流体设备上的样品通道可以具有在约10um至约2mm的范围内，例如在约400um至约1.2mm的范围内的高度。在一些情况下，流体设备上的一个或多个样品通道可以具有在由以下值中的任两个为边界的范围内的高度：10um、20um、30um、40um、50um、60um、70um、80um、90um、100um、110um、120um、130um、140um、150um、160um、170um、180um、190um、200um、200um、210um、220um、230um、240um、250um、260um、270um、280um、290um、300um、310um、320um、330um、340um、350um、360um、370um、380um、390um、400um、410um、420um、430um、440um、450um、460um、470um、480um、490um、500um、510um、520um、530um、540um、550um、560um、570um、580um、590um、600um、610um、620um、630um、640um、650um、660um、670um、680um、690um、700um、710um、720um、730um、740um、750um、760um、770um、780um、790um、800um、810um、820um、830um、840um、850um、860um、870um、880um、890um、900um、910um、920um、930um、940um、950um、960um、970um、980um、990um、1000um、1010um、1020um、1030um、1040um、1050um、1060um、1070um、1080um、1090um、1100um、1110um、1120um、1130um、1140um、1150um、1160um、1170um、1180um、1190um、1200um、1210um、1220um、1230um、1240um、1250um、1260um、1270um、1280um、1290um、1300um、1310um、1320um、1330um、1340um、1350um、1360um、1370um、1380um、1390um、1400um、1410um、1420um、1430um、1440um、1450um、1460um、1470um、1480um、1490um、1500um、1510um、1520um、1530um、1540um、1550um、1560um、1570um、1580um、1590um、1600um、1610um、1620um、1630um、1640um、1650um、1660um、1670um、1680um、1690um、1700um、1710um、1720um、1730um、1740um、1750um、1760um、1770um、1780um、1790um、1800um、1810um、1280um、1830um、1840um、1850um、1860um、1870um、1880um、1890um、1900um、9110um、1920um、1930um、1940um、1950um、1960um、1970um、1980um、1990um和2000um。
流体设备上的前导电解质缓冲液通道可以具有在约10um至约1mm的范围内，例如小于约600um的高度。在一些情况下，流体设备的一个或多个前导电解质缓冲液通道可以具有在由以下值中的任两个为边界的范围内的高度：10um、20um、30um、40um、50um、60um、70um、80um、90um、100um、110um、120um、130um、140um、150um、160um、170um、180um、190um、200um、200um、210um、220um、230um、240um、250um、260um、270um、280um、290um、300um、310um、320um、330um、340um、350um、360um、370um、380um、390um、400um、410um、420um、430um、440um、450um、460um、470um、480um、490um、500um、510um、520um、530um、540um、550um、560um、570um、580um、590um、600um、610um、620um、630um、640um、650um、660um、670um、680um、690um、700um、710um、720um、730um、740um、750um、760um、770um、780um、790um、800um、810um、820um、830um、840um、850um、860um、870um、880um、890um、900um、910um、920um、930um、940um、950um、960um、970um、980um、990um和1000um。
流体设备上的洗脱通道可以具有在约10um至约1mm的范围内，例如小于约600um的高度。在一些情况下，流体设备的一个或多个洗脱缓冲液通道可以具有在由以下值中的任两个为边界的范围内的高度：10um、20um、30um、40um、50um、60um、70um、80um、90um、100um、110um、120um、130um、140um、150um、160um、170um、180um、190um、200um、200um、210um、220um、230um、240um、250um、260um、270um、280um、290um、300um、310um、320um、330um、340um、350um、360um、370um、380um、390um、400um、410um、420um、430um、440um、450um、460um、470um、480um、490um、500um、510um、520um、530um、540um、550um、560um、570um、580um、590um、600um、610um、620um、630um、640um、650um、660um、670um、680um、690um、700um、710um、720um、730um、740um、750um、760um、770um、780um、790um、800um、810um、820um、830um、840um、850um、860um、870um、880um、890um、900um、910um、920um、930um、940um、950um、960um、970um、980um、990um和1000um。
在一些情况下，流体设备上的通道的长度为至少约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm、200mm、210mm、220mm、230mm、240mm、250mm、260mm、270mm、280mm、290mm、300mm、310mm、320mm、330mm、340mm、350mm、360mm、370mm、380mm、390mm、400mm、410mm、420mm、430mm、440mm、450mm、460mm、470mm、480mm、490mm或500mm。在一些情况下，流体设备上的通道的长度小于或等于约500mm、490mm、480mm、470mm、460mm、450mm、440mm、430mm、420mm、410mm、400mm、390mm、380mm、370mm、360mm、350mm、340mm、330mm、320mm、310mm、300mm、290mm、280mm、270mm、260mm、250mm、240mm、230mm、220mm、210mm、200mm、190mm、180mm、170mm、160mm、150mm、140mm、130mm、120mm、110mm、100mm、90mm、80mm、70mm、60mm、50mm、45mm、40mm、35mm、30mm、25mm、20mm、19mm、18mm、17mm、16mm、15mm、14mm、13mm、12mm、11mm、10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm或1mm。
流体设备上的通道可具有足够大的宽度、高度或直径，以容纳较大的样品体积。在一些情况下，流体设备上的通道具有大于其高度的宽度，以减少由于通道中的焦耳加热引起的温度升高。在一些情况下，流体设备上的通道的宽度与高度之比为至少2:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。在一些情况下，流体设备上的通道的宽度与高度之比为至多2:1、5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。在一些情况下，流体设备上的通道的横截面面积小于约0.1mm2、0.2mm2、0.3mm2、0.4mm2、0.5mm2、0.6mm2、0.7mm2、0.8mm2、0.9mm2、1mm2、1.1mm2、1.2mm2、1.3mm2、1.4mm2、1.5mm2、1.6mm2、1.7mm2、1.8mm2、1.9mm2、2mm2、2.1mm2、2.2mm2、2.3mm2、2.4mm2、2.5mm2、2.6mm2、2.7mm2、2.8mm2、2.9mm2、3mm2、3.1mm2、3.2mm2、3.3mm2、3.4mm2、3.5mm2、3.6mm2、3.7mm2、3.8mm2、3.9mm2、4mm2、4.1mm2、4.2mm2、4.3mm2、4.4mm2、4.5mm2、4.6mm2、4.7mm2、4.8mm2、4.9mm2、5mm2、6mm2、7mm2、8mm2、9mm2、10mm2、11mm2、12mm2、13mm2、14mm2或15mm2。在一些情况下，流体设备上的通道的横截面面积大于约0.1mm2、0.2mm2、0.3mm2、0.4mm2、0.5mm2、0.6mm2、0.7mm2、0.8mm2、0.9mm2、1mm2、1.1mm2、1.2mm2、1.3mm2、1.4mm2、1.5mm2、1.6mm2、1.7mm2、1.8mm2、1.9mm2、2mm2、2.1mm2、2.2mm2、2.3mm2、2.4mm2、2.5mm2、2.6mm2、2.7mm2、2.8mm2、2.9mm2、3mm2、3.1mm2、3.2mm2、3.3mm2、3.4mm2、3.5mm2、3.6mm2、3.7mm2、3.8mm2、3.9mm2、4mm2、4.1mm2、4.2mm2、4.3mm2、4.4mm2、4.5mm2、4.6mm2、4.7mm2、4.8mm2、4.9mm2、5mm2、6mm2、7mm2、8mm2、9mm2、10mm2、11mm2、12mm2、13mm2、14mm2或15mm2。在一些情况下，流体设备上的通道具有小于约1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm或600μm的用于散热的最小长度尺度。在一些情况下，流体设备上的通道具有大于约1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μm、550μm或600μm的用于散热的最小长度尺度。
在一些情况下，流体设备上的通道的总体积为至少约1微升(μL)、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、150μL、175μL、200μL、225μL、250μL、275μL、300μL、350μL、400μL、450μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1毫升(mL)、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、85mL、90mL、95mL或100mL。在一些情况下，流体设备上的通道的总体积为至多约1微升(μL)、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、150μL、175μL、200μL、225μL、250μL、275μL、300μL、350μL、400μL、450μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1毫升(mL)、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、85mL、90mL、95mL或100mL。
流体设备上的样品通道可以具有在约10uL至约1mL的范围内，例如在约50uL至约500uL的范围内的体积。在一些情况下，流体设备上的一个或多个样品通道具有在由以下值中的任两个为边界的范围内的体积：10uL、20uL、30uL、40uL、50uL、60uL、70uL、80uL、90uL、100uL、110uL、120uL、130uL、140uL、150uL、160uL、170uL、180uL、190uL、200uL、200uL、210uL、220uL、230uL、240uL、250uL、260uL、270uL、280uL、290uL、300uL、310uL、320uL、330uL、340uL、350uL、360uL、370uL、380uL、390uL、400uL、410uL、420uL、430uL、440uL、450uL、460uL、470uL、480uL、490uL、500uL、510uL、520uL、530uL、540uL、550uL、560uL、570uL、580uL、590uL、600uL、610uL、620uL、630uL、640uL、650uL、660uL、670uL、680uL、690uL、700uL、710uL、720uL、730uL、740uL、750uL、760uL、770uL、780uL、790uL、800uL、810uL、820uL、830uL、840uL、850uL、860uL、870uL、880uL、890uL、900uL、910uL、920uL、930uL、940uL、950uL、960uL、970uL、980uL、990uL和1000uL。
流体设备上的样品通道可以具有小于约1mL，例如小于约500ul，例如小于约200uL的体积。在一些情况下，流体设备上的一个或多个样品通道的体积可以小于约10uL、20uL、30uL、40uL、50uL、60uL、70uL、80uL、90uL、100uL、110uL、120uL、130uL、140uL、150uL、160uL、170uL、180uL、190uL、200uL、200uL、210uL、220uL、230uL、240uL、250uL、260uL、270uL、280uL、290uL、300uL、310uL、320uL、330uL、340uL、350uL、360uL、370uL、380uL、390uL、400uL、410uL、420uL、430uL、440uL、450uL、460uL、470uL、480uL、490uL、500uL、510uL、520uL、530uL、540uL、550uL、560uL、570uL、580uL、590uL、600uL、610uL、620uL、630uL、640uL、650uL、660uL、670uL、680uL、690uL、700uL、710uL、720uL、730uL、740uL、750uL、760uL、770uL、780uL、790uL、800uL、810uL、820uL、830uL、840uL、850uL、860uL、870uL、880uL、890uL、900uL、910uL、920uL、930uL、940uL、950uL、960uL、970uL、980uL、990uL或1000uL。
流体设备上的前导电解质缓冲液通道可以具有在约10uL至约1mL的范围内的体积。在一些情况下，流体设备上的一个或多个前导电解质缓冲液通道可以具有在由以下值中的任两个为边界的范围内的体积：10uL、20uL、30uL、40uL、50uL、60uL、70uL、80uL、90uL、100uL、110uL、120uL、130uL、140uL、150uL、160uL、170uL、180uL、190uL、200uL、200uL、210uL、220uL、230uL、240uL、250uL、260uL、270uL、280uL、290uL、300uL、310uL、320uL、330uL、340uL、350uL、360uL、370uL、380uL、390uL、400uL、410uL、420uL、430uL、440uL、450uL、460uL、470uL、480uL、490uL、500uL、510uL、520uL、530uL、540uL、550uL、560uL、570uL、580uL、590uL、600uL、610uL、620uL、630uL、640uL、650uL、660uL、670uL、680uL、690uL、700uL、710uL、720uL、730uL、740uL、750uL、760uL、770uL、780uL、790uL、800uL、810uL、820uL、830uL、840uL、850uL、860uL、870uL、880uL、890uL、900uL、910uL、920uL、930uL、940uL、950uL、960uL、970uL、980uL、990uL和1000uL。
流体设备上的前导电解质缓冲液通道可以具有小于约1mL，例如小于约500ul的体积。在一些情况下，流体设备上的一个或多个前导电解质缓冲液通道的体积可以小于约10uL、20uL、30uL、40uL、50uL、60uL、70uL、80uL、90uL、100uL、110uL、120uL、130uL、140uL、150uL、160uL、170uL、180uL、190uL、200uL、200uL、210uL、220uL、230uL、240uL、250uL、260uL、270uL、280uL、290uL、300uL、310uL、320uL、330uL、340uL、350uL、360uL、370uL、380uL、390uL、400uL、410uL、420uL、430uL、440uL、450uL、460uL、470uL、480uL、490uL、500uL、510uL、520uL、530uL、540uL、550uL、560uL、570uL、580uL、590uL、600uL、610uL、620uL、630uL、640uL、650uL、660uL、670uL、680uL、690uL、700uL、710uL、720uL、730uL、740uL、750uL、760uL、770uL、780uL、790uL、800uL、810uL、820uL、830uL、840uL、850uL、860uL、870uL、880uL、890uL、900uL、910uL、920uL、930uL、940uL、950uL、960uL、970uL、980uL、990uL或1000uL。
流体设备上的洗脱通道可以具有在约10uL至约1mL的范围内的体积。在一些情况下，流体设备上的一个或多个洗脱通道可以具有在由以下值中的任两个为边界的范围内的体积：10uL、20uL、30uL、40uL、50uL、60uL、70uL、80uL、90uL、100uL、110uL、120uL、130uL、140uL、150uL、160uL、170uL、180uL、190uL、200uL、200uL、210uL、220uL、230uL、240uL、250uL、260uL、270uL、280uL、290uL、300uL、310uL、320uL、330uL、340uL、350uL、360uL、370uL、380uL、390uL、400uL、410uL、420uL、430uL、440uL、450uL、460uL、470uL、480uL、490uL、500uL、510uL、520uL、530uL、540uL、550uL、560uL、570uL、580uL、590uL、600uL、610uL、620uL、630uL、640uL、650uL、660uL、670uL、680uL、690uL、700uL、710uL、720uL、730uL、740uL、750uL、760uL、770uL、780uL、790uL、800uL、810uL、820uL、830uL、840uL、850uL、860uL、870uL、880uL、890uL、900uL、910uL、920uL、930uL、940uL、950uL、960uL、970uL、980uL、990uL和1000uL。
流体设备上的洗脱通道可以具有小于约1mL，例如小于约500ul的体积。在一些情况下，流体设备上的一个或多个洗脱通道的体积可以小于约10uL、20uL、30uL、40uL、50uL、60uL、70uL、80uL、90uL、100uL、110uL、120uL、130uL、140uL、150uL、160uL、170uL、180uL、190uL、200uL、200uL、210uL、220uL、230uL、240uL、250uL、260uL、270uL、280uL、290uL、300uL、310uL、320uL、330uL、340uL、350uL、360uL、370uL、380uL、390uL、400uL、410uL、420uL、430uL、440uL、450uL、460uL、470uL、480uL、490uL、500uL、510uL、520uL、530uL、540uL、550uL、560uL、570uL、580uL、590uL、600uL、610uL、620uL、630uL、640uL、650uL、660uL、670uL、680uL、690uL、700uL、710uL、720uL、730uL、740uL、750uL、760uL、770uL、780uL、790uL、800uL、810uL、820uL、830uL、840uL、850uL、860uL、870uL、880uL、890uL、900uL、910uL、920uL、930uL、940uL、950uL、960uL、970uL、980uL、990uL或1000uL。
在一些情况下，流体设备包括多于一个通道。通道可以以给定密度在流体设备中间隔开。在一些情况下，通道之间的边缘至边缘的距离为至少约0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.25mm、1.5mm、1.75mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm或10mm。在一些情况下，通道之间的边缘至边缘的距离为至多约0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.25mm、1.5mm、1.75mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm或10mm。通道的密度可被定义为通道的宽度与通道之间的空间(或距离)之比。在一些情况下，通道宽度与通道之间的距离之比为至少约2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1。
在一些情况下，微流体设备(例如，芯片)内的所有通道的总体积为1微升(μL)、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、150μL、175μL、200μL、225μL、250μL、275μL、300μL、350μL、400μL、450μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1毫升(mL)、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、85mL、90mL、95mL或100mL。在一些情况下，微流体设备(例如，芯片)内的所有通道的总体积为至多约1微升(μL)、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、150μL、175μL、200μL、225μL、250μL、275μL、300μL、350μL、400μL、450μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL、1毫升(mL)、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、11mL、12mL、13mL、14mL、15mL、16mL、17mL、18mL、19mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、50mL、55mL、60mL、65mL、70mL、75mL、80mL、85mL、90mL、95mL或100mL。
可以对流体设备的入口和/或出口进行布置并将其间隔开，使得它们与标准流体处理形式兼容。例如，可将入口和/或出口间隔开以与5”x3.33”滴定板上的孔对齐。设备可包含八个入口和/或出口，将其间隔开以对应于标准八端头移液器和/或尺寸为标准24-、48-或96-孔板中的八个孔。设备可包含十二个入口和/或出口，将其间隔开以对应于标准十二端头移液器和/或尺寸为标准96孔板中的十二个孔。设备可包含十六个入口和/或出口，将其间隔开以对应于标准十六端头移液器和/或尺寸为标准384孔板中的十六个孔。设备可包含二十四个入口和/或出口，将其间隔开以对应于标准二十四端头移液器和/或尺寸为标准384孔板中的二十四个孔。这可以使得能够更容易地将流体从这样的板处理到设备上，例如通过机器人移液器系统或其他多移液器。
包含本文公开的流体元件如流体和气动通道、端口、储器、毛细管屏障和/或流体回路的设备可以用于除等速电泳之外的目的。例如，在外部端口或储器上的压力施加可以用于使液体移动通过流体回路。此类设备可以与其他元件如机械阀组合，以控制液体的流动。被屏障(例如，毛细管隔离物)分隔的隔室可以用于进行生化反应，诸如扩增反应，如PCR，并且反应产物可以移至被屏障分隔的另一个隔室以进行后续处理。
可以使用台式系统或基站进行等速电泳。例如，图13A示出了用于在流体设备盒1301上进行样品制备和等速电泳的台式系统1300。可将流体设备盒装载到如图所示的台式系统上，并且具有匹配盖的盖子和控制器1302可降低到流体设备盒上。台式系统还可包括具有用于操作系统的用户界面(例如，触摸屏)的控制面板1303。
系统1300可以穿过接口组装件，所述接口组装件被配置为气动地、电地和/或流体地接收并接合流体设备。接口组装件可以包括钥匙或定向设备，以在仪器1300内适当地定向流体设备1301。接口组装件还可以包括一个或多个电极，当流体设备1301接合时，可以将该电极定位在各种设备储器中。接口组装件还可以包括气动管线，当设备接合时，所述气动管线可以与设备1301中的气动端口连通，如本文所述。系统1300可以包含如本文所述的电源，以向电极施加电流和/或电压。系统1300可以包含如本文所述的电子器件，以测量各种电极上的电压。系统1300可以包含一个或多个泵，以向本文所述的气动管线提供正气动压力或负气动压力。系统1300可以包含如本文所述的温度传感器，以测量设备1301中的流体回路中的确定位置处的温度。系统1300可包含光学组装件，所述光学组装件包含一个或多个光源，以将光传输至流体设备中的一个或多个确定的位置，并检测从流体设备发出的光，例如荧光，例如当设备1301中的荧光物质激发时，如本文所述。系统1300可以包含如本文所述的显示器，以显示系统的操作参数，诸如电压、温度、检测到的光、流体设备的接合、时间、处理阶段。系统1300可以通过诸如互联网的通信网络连接到远程服务器，通过远程服务器可以远程控制系统的操作，如本文所述。
负气动压力可以被施加到设备中的气动端口，以将一种或多种缓冲液或样品装载到如本文所述的设备1301的通道中。系统1300可以被配置用于施加在约0mpsi至约200mpsi的范围内，例如约10mpsi至约80mpsi的范围内的负气动压力。
图59A-图59C示出了用于在流体设备盒1301上执行等速电泳的示例性台式系统或仪器1300的图像。流体设备盒1301可以装载到仪器1300上的保持器1308上，并由歧管1307接合。系统可以包含盖1302，例如铰接歧管，其允许从仪器1300上装载和卸载流体设备盒1301。盖1302可以任选地促进设备1301与仪器1300的耦合。仪器1300可以包含歧管和/电极对准特征1303，以帮助将气动歧管1307和/或电极耦合至芯片1301上的正确位置。可以提供USB端口1304，以允许用户在一个或多个ITP运行之前、期间或之后访问由仪器生成的数据。仪器可以包括显示器1305，例如本文所述的LCD屏幕。所述仪器可以任选地包括具有集成冷却1306的机架。所述仪器可以任选地包括无源歧管返回机制1309，其可以用于手动访问芯片，例如在电力损失的情况下。所述仪器可以包含高压电源供应器1310、气动泵1311、热控制器(例如，冷却器或加热器)1312、处理器(例如，印刷电路板)1313、通道闭合器1314、光学检测系统1315和/或用于运行自动化的触发传感器(例如，红外传感器)1316，或其任何组合。
图60示出了可以显示给用户以指示和指导用户完成储器装载过程的示例性图像。例如，仪器可以向用户显示可视的和/或颜色编码的指令，所述指令指示哪些缓冲液进入哪些储器中，以及缓冲液应该以什么顺序装载到芯片中。芯片可以被配置为实现简单的从右到左或从左到右移液方案，以方便用户使用。例如，芯片可以配置为指导用户哪种颜色编码的指令，以从左到右方式装载储器，从洗脱缓冲液(EB)开始，继续到高浓度洗脱缓冲液(EBH)、前导电解质缓冲液(LE)、高浓度前导电解质缓冲液(LEH)，并以尾随电解质缓冲液(TEH)结束，如图所示。
图61示出了气动歧管1307，其可以促进微流体芯片与仪器的接合。气动芯片歧管1307可以包括气动泵或系统1311。气动芯片歧管1307可以任选地包括高压电子器件(例如，电源供应器1310)。所述仪器可以包括马达，其将歧管移动为与流体设备接合。压力可以维持流体、电和气动连接。
图62示出了仪器6200中芯片6201的横截面。仪器6200可以基本类似于本文所述的任何仪器(例如，仪器1300)。仪器6200可以包括歧管，所述歧管包含垫圈和被配置成耦合至芯片6201顶部的配合孔，以将芯片6201与仪器6200对准。仪器还可以包括低温冷却块6210(本文也称为热控制器)和/或用于芯片上核酸定量的光学检测系统6211，如本文所述。芯片6201可以基本类似于本文所述的任何芯片(例如，芯片3800)。例如，芯片6201可以包含样品储器6202、洗脱储器6203、洗脱缓冲储器6204、前导电解质储器6205、前导电解质缓冲储器6206和尾随电解质储器6207。仪器6200可以包含一个或多个电极6208，如本文所述。电极6208可以以固定的高度安设在仪器6200内，使得当仪器6200的盖闭合时，电极6208被正确地插入期望的储器中。在一些情况下，每次闭合仪器时，电极6208可以进入相应的储器。例如，电极6208可以位于尾随电解质储器6207、前导电解质缓冲储器6205和/或前导电解质缓冲储器6206中，使得电极不直接接触样品材料。电极可响应于来自传感器(例如，本文所述的电压、电流、电导率或温度传感器)的反馈被触发以改变或控制所施加的电场。芯片可以任选地包含一个或多个额外的储器6209，其中可以安设额外的电极6208。对于本领域普通技术人员而言将显而易见的是，可以根据期望改变电极的位置和电极的数目，以执行期望的ITP运行。
图63示出了垂直歧管运动机构，其包含用于对准和自动缩回运动的机械组装件设计。该图描绘了具有导螺杆的马达，该导螺杆可以驱动机构驱动进入由对准销指导的位置。在电源或软件故障的情况下，拉伸弹簧可以通过反向驱动马达来自动缩回机构。图63示出了具有导螺杆6302的马达6301，其可以驱动支架6303进入由对准销6304指导的位置。在电源或软件故障的情况下，拉伸弹簧6305可以通过反向驱动马达来自动缩回机构。行进的路径可以受到穿过线性轴承6307的轴杆6306的约束。垂直歧管运动机构可以位于控制铰接歧管运动的机构中。垂直歧管运动机构可以在芯片就位时在无法恢复的动力损失的情况下使仪器自动打开。这可以允许在运输维修之前将芯片取出。
图64示出了用于水平歧管运动机构的设计，其包括用于使用齿条和小齿轮进行水平运动的机械组装件设计。马达利用齿条和小齿轮沿导轨约束的路径驱动机构。该图示出了附接到小齿轮6402的马达6401，小齿轮6402可以沿导轨6405约束的路径驱动支架6404上的相应齿条6403。水平歧管运动机构可以位于控制铰接歧管的运动的机构上。这可以促进歧管向前和向后运动。
台式系统可包含压力控制器，该压力控制器提供压力以处理流体设备上的流体(例如，样品、缓冲液、试剂、酶溶液、电解质溶液)。台式系统可以接收压力反馈信号以调节或控制流体处理。流体处理可用于将流体装载到流体设备上(例如，试剂、缓冲液、样品)。流体处理可用于将流体(例如，试剂溶液)引入流体设备上的干燥通道中。可以使用例如电磁阀来调节压力。
台式系统可包含电极或电触点。电极可以是电路的一部分并且可以插入流体设备上的储器或其他开口中，以允许通过完成的电路在流体设备内施加电场。电触点可以耦合至流体设备(例如具有集成电极的流体设备)上的相应触点。
台式系统可包含一个或多个检测器或传感器，例如光检测器、反射传感器、红外(IR)检测器、电检测器、热传感器、流量传感器和压力传感器，包括本公开内容中进一步描述的检测器。光检测器可包括但不限于三轴点检测器、互补金属氧化物半导体(CMOS)检测器、电荷耦合器件(CCD)检测器、光电二极管光传感器、光敏电阻器、光电倍增管和光电晶体管。电检测器可包括电极或能够检测电压、电压差、电流、电荷或其他电特性的其他检测器。电检测器可用于检测提取或纯化的核酸带的通路，例如通过检测尾随电解质与前导电解质之间的界面处的电导率的变化。热传感器可包括红外(IR)传感器、探针温度传感器、热敏电阻、负温度系数(NTC)热敏电阻，电阻温度检测器(RTD)、热电偶、基于半导体的传感器等。
可以同时或独立地操作和控制所述一个或多个检测器或传感器。在一些情况下，单个通道可具有专用传感器，例如热传感器或电压传感器，其独立于专用于微流体设备上的其他通道的其他传感器操作。来自独立传感器的反馈可用于独立地控制设备上的一个或多个电场。例如，传感器可检测如本文所述的孔内电压随时间的变化，并且来自该传感器的反馈可以用于控制通道内的电流。第二传感器可以以类似但独立的方式作用于第二通道。在一些情况下，传感器可检测孔内电流随时间的变化，并且来自该传感器的反馈可以用于控制通道内的电压。
台式系统可包含一个或多个热控制器，其控制流体设备或流体设备的一部分上的温度。热控制器可包含组件，包括但不限于电阻加热器、基于流体的加热或冷却系统以及珀耳帖设备。热控制器可由包括但不限于金属(例如，铂，钛，铜，金)、碳和氧化铟锡(ITO)的材料制成。热控制器可包括温度传感器，其可用于监测受控温度并提供温度反馈以用于热控制。如本公开内容中进一步讨论的，热控制器可以与计算机控制系统一起使用。例如，温度传感器(例如，红外传感器)可用于监测芯片上通道中的温度变化。这种温度变化可以指示ITP过程中ITP带(例如，核酸带)的位置，该温差可归因于前导电解质与尾随电解质之间的电导率的变化。在一些情况下，热控制器在没有温度反馈的情况下操作。
图65描绘了具有热电冷却器设计的热管，用于将远离热电冷却器位置的区域保持在规定温度。图65示出了待通过较大的热接触6502冷却到特定温度的表面6501，热接触6502可以通向铜热管6503和散热器6504。可以通过热电冷却器6505和风扇6506提供冷却。铜热管6503和辅助散热器6504可以被配置为将表面6501冷却至规定温度，而无需使热电冷却器与表面6501直接相邻。
图66示出了用于在流体设备盒上进行自动化等速电泳和/或样品制备的另一示例性台式仪器1300。图66示出了β原型仪器1300的图，示出了待控制的流体设备或芯片1301的放置位置。仪器1300可以包含铰接歧管1302，其配置为允许流体设备1301的装载和卸载以及仪器1300与设备1301的耦合。仪器1300还可以包括用于对流体设备1301进行电磁歧管密封的冲击板1303。
本公开内容的技术(包括，例如，使用本文讨论的流体设备和/或台式系统)可以提供快速的处理时间。例如，可以制备包含核酸的样品(例如，去除包埋材料、组织破坏、细胞裂解、核酸解交联)并且具有提取或纯化的核酸以用于随后的分析、使用或储存。
检测和定量
本公开内容的技术可以采用一个或多个检测器。检测器可以集成到流体设备中或位于流体设备的外部。检测器可用于样品中核酸的定量，例如通过荧光测量或紫外(UV)辐射(例如，用于测量数量或纯度，诸如通过测量A260/A280)，或用于提供样品中核酸的定性测量。可以在位于流体设备上时(例如在纯化区(例如，ITP通道)或储器(例如，洗脱储器)内时)检测核酸。可以检测核酸的浓度(或基于已知体积中(诸如在本文所述的洗脱孔中)的量测量值进行计算)。可以诸如用染料标记核酸，并且可以通过检测器测量核酸的荧光强度并使用荧光强度定量存在的核酸(参见例如，图14)。可以在装载到流体设备上之前、在流体设备中或在从流体设备回收之后标记核酸。
使用检测器可以实现以高灵敏度或低检测限定量样品中的核酸。例如，可以在小于或等于约1000皮克/微升(pg/μL)、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、0.9pg/μL、0.8pg/μL、0.7pg/μL、0.6pg/μL、0.5pg/μL、0.4pg/μL、0.3pg/μL、0.2pg/μL或0.1pg/μL的检测限下检测核酸(例如，在等速电泳通道中在线检测)。可以在小于或等于约1000皮克(pg)、100pg、10pg、1pg或0.1pg的检测限下检测核酸(例如，在等速电泳通道中在线检测)。
使用检测器可以能够鉴定或定量样品中的核酸。例如，诸如核酸扩增(包括，例如，PCR、实时PCR和逆转录PCR)、杂交(包括，例如，荧光原位杂交(FISH)和Q-FISH)和测序的技术可用于鉴定样品中核酸内特定序列的存在或不存在，并任选地进行定量。
检测器可用于控制核酸提取或纯化操作。例如，检测器可以检测通过等速电泳浓缩的核酸带。当浓缩的核酸到达设备内的某个位置时，可以结束该过程(例如，可以关闭电场)，并且可以从设备中回收提取或纯化的样品。
检测器可包括但不限于光检测器和电检测器、热传感器和压力传感器(例如，压力传感器)。光检测器可包括但不限于三轴点检测器、互补金属氧化物半导体(CMOS)检测器、电荷耦合器件(CCD)检测器、光电二极管光传感器、光敏电阻器、光电倍增管和光电晶体管。光检测可以通过与光电二极管检测配对的LED照明来实现。电检测器可包括电极或能够检测电压、电压差、电流、电荷或其他电特性的其他检测器。例如，电检测器可用于检测提取或纯化的核酸带的通路。
可以用一种或多种核酸染料，例如荧光插入染料标记核酸。可以用以下一种或多种插入染料标记核酸：溴化乙锭、碘化丙啶、DAPI、7-AAD、YOYO-1、DiYO-1、TOTO-1、DiTO-1、BOBO-1、POPO-1、YO-PRO-1、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、
Figure GDA0003654970080001931
Green I、
Figure GDA0003654970080001932
Green II、SYTOTM 9、SYTOTM 13、
Figure GDA0003654970080001933
Figure GDA0003654970080001934
吖啶橙等。对于本领域的普通技术人员将显而易见，可以基于期望的检测位置、检测方法和/或其中DNA可用于后续ITP的下游过程来选择荧光染料。
图67示出了各种核酸结合染料对核酸质量的峰面积响应图，以评估每种染料在ITP期间和/或之后用于在线(即，芯片上)核酸定量的可能的可行性。背景减除的峰面积响应被绘制为输入核酸质量(以ng为单位)的函数，并显示在对数-对数图上。对于0.01ng、0.1ng、1ng、10ng、100ng和1000ng的核酸输入质量，评估样品中的
Figure GDA0003654970080001941
SytoTM 13和添加LE的样品中的SytoTM13。只有一种候选染料，即
Figure GDA0003654970080001942
在低于1μg(1000ng)的核酸输入质量表现出线性响应。SytoTM 13响应的一些非线性可以通过在ITP期间将染料从DNA剥离来解释。除了样品外，向LE添加染料恢复了核酸输入质量与峰面积之间的线性关系。
Figure GDA0003654970080001943
对评估的所有核酸输入质量均具有较高的背景和非线性响应。所有测试的染料在高输入质量下失去线性(未示出)。将染料添加到ITP系统以进行在线定量的优选实施方式是(1)将插入染料添加到LE而不是样品(例如，PicoGreen、Syto 9、Syto 13或EvaGreen染料)或(2)将染料添加到样品和LE(例如，PicoGreen、Syto 9、Syto 13或EvaGreen染料)，或任选地(3)将染料仅添加到样品(例如，PicoGreen和EvaGreen染料)。
图68示出了各种核酸结合染料对核酸质量的峰宽响应图，其可以例如用于定量ITP系统中的核酸量。可以测量峰的几个特征，以计算通过检测器的核酸量。传统的色谱方法考虑峰高和/或面积(例如，如图67所示)。假设荧光的生成与存在的核酸的质量成线性比例，这些方法中的任一种都会产生与核酸的质量成线性的响应。如果潜在关系不是线性的，则峰面积或峰高与核酸质量之间将没有根本关系。在这样的情况下，即使在响应在根本上是非线性的情况下，固定信号值处的峰宽也可以显示与核酸质量的自然对数线性成比例。图68所示的数据表明了当染料SytoTM 13存在于样品和LE中，或仅存在于LE中时，其峰宽与核酸输入之间的这种对数线性关系。不同于图67所示的峰面积，SytoTM的两种条件均显示测得的峰宽与核酸的输入质量之间的线性关系，这可用于ITP带的质量的芯片上定量。
图69A-图69C描绘了与PCR的不兼容性。在存在和不存在Promega
Figure GDA0003654970080001951
的情况下，使用等速电泳纯化gDNA，Promega
Figure GDA0003654970080001952
的浓度根据经验确定，以确保直至5ug DNA(在225ul总样品体积中为1x)的荧光强度线性。然后将回收的洗出液进行连续稀释(“df”＝稀释系数)，并使用Qiagen qBiomarker MRef测定(图69A)运行qPCR以测试与基于插入剂(SYBR Green I)的qPCR的兼容性，并使用BioRad RPP30 HEX(图69B)和BioRadRPP30 FAM测定(图69C)运行qPCR以测试与基于Taqman探针的qPCR的兼容性。使用10mMTris-Cl pH 8.0进行稀释。对于所有样品，qBiomarker Mref测定的稀释校正产率均相似，这与基于插入剂的qPCR中缺乏染料诱导的抑制相符。然而，在两种基于Taqman探针的qPCR测定中，Quantifluor样品均观察到稀释校正产率的下降，这表明Quantifluor抑制了基于Taqman探针的qPCR。
图70描绘了PicoGreen与Qubit dsDNA测定的兼容性。ThermoFisher Qubit dsDNA分析是一种基于荧光的DNA定量测定，其广泛用于许多下游应用之前。在35ul洗出液体积中将三种不同浓度的纯化gDNA与PicoGreen混合至5.7x的最终浓度，在通过微流体等速电泳芯片进行DNA纯化的一种实现中，估计的最大浓度需要确保在5ng-5ug的DNA输入的动态范围内荧光的线性。使用Qubit dsDNA广谱测定对没有染料对照的样品进行定量。来自有染料和无染料样品的可比定量支持PicoGreen与Qubit dsDNA测定缺乏干扰。
图71描绘了Syto13与Qubit dsDNA测定的兼容性。在35ul总体积中将两种不同浓度的纯化gDNA与Syto13混合至5.7x的最终浓度，在通过微流体等速电泳芯片进行DNA纯化的一种实现中，估计的最大浓度需要确保在5ng-5ug的DNA输入的动态范围内荧光的线性。使用Qubit dsDNA高灵敏度测定对有染料和无染料对照的样品进行定量，来自有染料和无染料的样品支持Syto13与Qubit dsDNA测定缺乏干扰。
图72A-图72B描绘了PicoGreen与PCR的兼容性。将各种DNA浓度的纯化基因组DNA分别以0.0057x、0.057x、0.57x、5.7x和28.4x或57x的浓度与PicoGreen混合，最终体积各自为100ul。使用KAPA hgDNA定量和QC测定(图72A)通过qPCR运行样品以测试与基于插入剂(SYBR Green I)的qPCR的兼容性，并且使用BioRad RPP30FAM qPCR(图72B)运行样品以测试与基于Taqman探针的qPCR的兼容性。在28.4x和57x反应中观察到基线升高，导致Ct值延迟。然而，含有5.7x或更少的反应的Ct值相似，这支持PicoGreen与两类qPCR测定在至多5.7x浓度下的兼容性。
图73A-图73C描绘了Syto13与PCR的兼容性。在存在和不存在Syto13的情况下使用等速电泳纯化gDNA，Syto13的浓度根据经验确定以确保直至5ug DNA(在225ul总样品体积中为1x)的荧光强度线性度。然后将回收的洗出液进行连续稀释(“df”＝稀释系数)，并使用Qiagen qBiomarker Mref测定(图73A)运行qPCR以测试与基于插入剂(SYBR Green I)的qPCR的兼容性，并使用BioRad RPP30HEX(图73B)和BioRad RPP30 FAM测定(图73C)运行qPCR以测试与基于Taqman探针的qPCR的兼容性。使用10mM Tris-Cl pH8.0进行稀释。在每种测定中稀释校正产率相似，支持Syto13与两类qPCR测定的兼容性。
图74描绘了PicoGreen与基于扩增子的测序文库制备的兼容性。IlluminaTruSight Tumor 15是一种基于多重PCR的测序文库制备测定，其被设计用于在实体瘤中经常突变的15个基因的靶向富集。从gDNA制备TruSight 15测序文库，将其与PicoGreen以1x和4.4x浓度混合，总体积为298.5ul。(4.4x是在通过微流体等速电泳芯片二次实现DNA纯化实施中，确保在5ng-5ug的DNA输入的动态范围内的荧光线性所需的估计最大浓度。)还制备了对照文库(无染料)。对这三个文库进行条形码编码，然后使用Illumina测序技术进行测序，并对测序数据进行下采样，以对三种条件的覆盖进行标准化。显示了两个PicoGreen文库的Bland-Altman相关图。还显示了每个文库的统计指标。在文库之间观察到最高水平测序指标的轻微的覆盖偏差或的差异。
图75示出了Syto13与基于扩增子的测序文库制备的兼容性。在存在和不存在Syto13的情况下，使用等速电泳纯化gDNA，样品浓度通过经验确定以确保直至5ug的DNA饱和度。然后使用回收的洗出液生成TruSight 15测序文库。还制备了对照文库(无染料)。对文库进行条形码编码并使用Illumina测序技术测序。然后使用原始读数来计算253个靶标中每一个的标准化覆盖。显示了Bland-Altman相关图。还显示了文库的统计指标。文库之间未观察到偏差。
图76A-图76B和图78描绘了PicoGreen与全基因组测序文库制备的不兼容性。KAPAHyperPlus在gDNA片段的末端修复和加A之前使用片段酶来酶促剪切gDNA，从而生成全基因组测序文库。然后将加A的基因组片段连接到测序衔接子，随后进行PCR扩增并使用AMPure磁珠技术进行纯化。图76A-图76B示出了片段长度指标，其使用Agilent’s BioAnalyzerDNA高灵敏度测定来针对全基因组KAPA HyperPlus文库进行确定，所述文库在不具有PicoGreen和具有4x、1x和0.5x浓度的PicoGreen情况下使用等速电泳由纯化的gDNA制备。模式片段长度(左)和凝胶图像(右)显示，具有PicoGreen的纯化样品比对照更长，而4xPicoGreen样品的长度是对照的近2x。图78示出了通过Qubit dsDNA高灵敏度测定的文库定量。在PicoGreen存在下纯化的样品表现出与对照样品相当的产率。
图77A-图77B和图79描绘了Syto13与下一代测序文库制备的兼容性。KAPAHyperPlus在gDNA片段的末端修复和加A之前使用片段酶来酶促剪切gDNA，从而生成全基因组测序文库。然后将加A的基因组片段连接到测序衔接子，随后进行PCR扩增并使用AMPure磁珠技术进行纯化。图77A-图77B示出了片段长度指标，其使用Agilent’s BioAnalyzerDNA高灵敏度来针对全基因组KAPA HyperPlus文库进行确定，所述文库在存在和不存在Syto13情况下使用等速电泳由纯化的gDNA制备。模式片段长度(左)和凝胶图像(右)显示，具有Syto13的纯化样品仅比对照(无Syto13)和在1x Syto13存在下的纯化样品稍长。图79示出了通过Qubit dsDNA高灵敏度测定的文库定量。在Syto13存在下纯化的样品表现出与对照样品相当的产量。
图80A-图80D描绘了Syto13与全外显子组下一代测序文库制备的兼容性。AgilentSureSelect XT技术是一种基于杂交捕获的技术，其被设计用于通过溶液相杂交至超长cRNA诱饵来靶向富集的感兴趣基因组区域。由于在具有和不具有Syto13的情况下生成的全基因组文库在片段长度方面显示较小的差异，因此使用AMPure XP磁珠对文库进行双侧大小选择，然后使用SureSelect XT Exome V6进行全外显子组靶标富集。随后使用Illumina测序技术对全外显子库进行测序。然后使用原始读数来计算每个靶标的标准化覆盖。显示了每个文库的比对读取百分比、Q20高质量比对读取百分比和MAPQ>＝20比对百分比(图80A-图80C)，以及通过组合(n＝2)Bland-Altman分析确定的平均比例差的箱形图(图80D)。相对于对照，在75％和100％饱和Syto13文库中均观察到覆盖偏差。
图81示出了描述用于光检测器的光信号处理算法的框图。例如，由光检测器获取的原始光信号可以在每个泳道处被测量为光电二极管电流。任选地，各个电流读数可以由处理器(例如，在固件中)求和以提高读数的信噪比(SNR)，然后在将读数记录到运行数据文件中。可以使用固件中存储的仪器特定参数对总和值进行固件中的泳道与泳道变化的校正。
在步骤8101中，可以将标准化信号记录到数据文件中。
在步骤8102中，可以从标准化信号减除基线，以便近似和校正光学基线的时间偏移。基线可以代表系统的一些缺陷，如模拟电子器件中的DC偏移、来自芯片和光学组件的自发荧光背景、杂散光、标准化模型中的误差以及/或者温度影响。这些影响中的任一种、组合或全部可以随时间变化。然而，预计它们的变化应比通过光学检测器的荧光带更慢。因此，可以单独或组合使用两种技术来估计峰的基线。在第一种技术中，可以使用时间窗口远大于峰宽的中值滤波器。这样的技术可以提供易于实现的策略，其可以产生非线性基线。然而，在一些情况下，该第一种技术可以生成可影响基线值的峰，从而可能使数据偏斜。用于估计峰基线的第二种技术包括在峰之前使用数据的线性回归，以便在峰窗口期间创建基线的线性模型。尽管在至少一些情况下，与其他技术相比，该技术的实现可能会略微难以实现，但该技术可能具有更加稳健的益处。
在步骤8103中，可以校正芯片和/或系统内的串扰程度。由于光学子装配内部和芯片内的光散射，可以在相邻检测器上记录来自其他泳道的材料的荧光。为了对此进行校正，可以表征每个仪器和/或芯片模型的串扰程度。这可以允许将从所有八个通道同时记录的强度解卷积为每个泳道产生的“真实”强度。
在步骤8104中，随后可以通过选择每个通道光信号的时间窗口内的最大值来确定峰位置。
在步骤8105中，可以测量峰的几个特征，以便计算通过检测器的核酸的量。传统的色谱方法通常考虑记录的荧光信号的峰高和/或面积。假设荧光的生成与存在的核酸质量成线性比例，这些方法中的任一种都可以产生与核酸质量成线性的响应。如果潜在关系不是线性的，那么峰面积或峰高与核酸质量之间没有根本关系。即使响应在根本上是非线性的，固定信号值处的峰宽也可以与核酸质量的自然对数成线性比例。可以计算三个峰特征(即宽度、高度和/或面积)的任何组合或全部。如果可以从对峰面积的线性响应或对峰宽的对数线性响应构建基本模型，则可以为每种仪器确定校准模型，并将其存储在系统存储器中。所述模型可以使用一个或两个特征来以可能的最低不确定性确定核酸的质量。在无法建立基本关系的情况下，可以以高密度收集校准数据并将其作为查找表存储在系统存储器中。
在步骤8106中，查找表上的点之间的线性插值可以允许在表征的测量范围内计算和估计核酸质量。
图82示出了用于照明和检测与染料结合的样品的荧光的机械光学组装件设计的图。该设计是台式控制器仪器中的预定子装配。机械外壳1400含有光学组件，当在平面1402处施加光源时，该光学组件将激发光引导通过样品平面1401，并在检测平面1403处捕获样品荧光。
图83示出了实现样品结合的染料荧光的激发和来自样品结合染料荧光的发射光捕获的光路。显示光源通过空间滤波器1412并进入使光准直的透镜1413。然后，光穿过光谱滤波器1410，此后较小百分比的光被涂层玻璃1414反射，占主要百分比的其余的光穿过涂层玻璃1414。反射的光路向下行进通过光扩散器1408并到达反馈传感器检测平面1405。该光被用作反馈回路，以帮助在软件中校准和标准化检测算法。穿过的光继续到达第二玻璃平面1416，在该处光被反射向上穿过透镜1415然后到达样品/染料平面。一旦光到达样品结合的染料并激发染料，光被穿过透镜1415和光谱滤波器1409发射回来。然后，光继续到达透镜1407，在透镜1407处聚焦，并穿过空间滤波器1406到达检测平面1404处的电光传感器。
运行结束触发
当使用ITP纯化样品时，在样品ITP区处于洗脱位置(例如，通道或储器)时准确地停止施加电流可能是重要的。本公开内容提供了用于评估ITP区位置的技术，其可用于触发纯化运行的结束。这些技术可包括驱动电压的测量、电导率的测量和温度的测量。
图15示出了ITP通道1500的示意图，其中驱动电极放置在缓冲的洗脱电极(EH)储器1501和缓冲的前导电解质(LEH)储器1502中，并且接地电极放置在缓冲的尾随电解质(TEH)储器1503中。电导率检测器(例如，电容耦合的非接触电导检测器(C4D))电极1504可放置在芯片外部，诸如在洗脱储器1505附近，如图的左侧所示。该通道还可包含前导电解质储器1506和样品储器或注入点1507。气体端口由通道的最左侧和最右侧边缘上的小圆圈表示。气体端口可用于自动地将流体从附接的储器装载或引导到通道中，例如使用真空或施加的压力。
图84A-图84F示出了用于可以如何验证(即检查连续性)由图15的通道1500中的电极创建的电路的控制方案。在用户输入样品之前(如图84A所示)，或者在将样品输入通道8402(例如，经由直接注入)之后(如图84B-图84C所示)，可以在用缓冲液启动通道期间检测电连续性。图84A示出了位于缓冲洗脱电极(EH)储器(即，图15的1501)与缓冲前导电解质(LEH)储器(即，图15的1502)中的高压电极之间的电路路径8401。被测试的电路未穿过样品通道8402，因此可以在样品装载之前验证限定路径8401的通道中的装载。如果启动失败，在装载样品前测试路径8401可以在一些情况下阻止用户将样品输入样品通道8402中。图84B示出了位于缓冲洗脱电极(EH)储器(即，图15的1501)与缓冲尾随电解质(TEH)储器(即，图15的1503)中的高压电极之间的电路路径8403。图84C示出了位于缓冲前导电解质(LEH)储器(即，图15的1502)和缓冲尾随电解质(TEH)储器(即图15的1503)中的高压电极之间的电路路径8404。
图84D示出了用于检测通道(例如，图15的通道1500)是否具有电连续性的方法的示意图。在步骤8411中，可以激活感兴趣的电极对。可以在一对电极处设置拉电流和灌电流。灌电流可以从接地电极获取，该电极将灌入所有可用电流。或者，两个电极可以由电流控制电路来致动。例如，可以将该电路设置成供应至少10μA。备选地或组合地，可以使用电压控制。例如，可以将拉电极上的电压设置为至少10V。可以测量沿路径的电极电压差(步骤8412)和总电流流动(步骤8413)。在微流体通道中的流体连接破坏的情况下，试图供应恒定电流的电子电路可能无法实现其目标，因此可以进行实际电流的测量。在步骤8414中，可以采用电压与电流的比率来确定通道电阻。在步骤8415中，可以使电阻经受阈值以确定通道连续性。在一些情况下，可以在超时之前连续地或几乎连续地检查电阻，以使电流能够一旦在电阻下降到预定阈值以下时就失活。或者，可以在整个分离过程中测量电阻，并且可以通过检测预定数目的时间点高于阈值来确定连续性故障。在步骤8416中，可以向用户报告故障事件以及/或者可以由仪器禁用通道或电极。在ITP期间，关闭装载不良的通道可以防止损坏相邻通道和/或仪器本身。图84E示出了来自单个通道中的成功连接8417随后是失败连接8418的示例性电流迹线。图84F示出了来自单个通道中的成功连接8417随后是失败连接8418的示例性电压迹线。
用于测量ITP带的位置的一种方法是测量通道(诸如驱动电极与接地电极之间)的电压或电阻。在具有超过两个电极的系统中，可以在任何一对电极之间进行该测量。由于驱动电泳的电压也是测量电压，因此可以容易地进行该测量。在整个纯化过程中，电压可以随着尾随离子填充通道而增加。然而，洗脱储器可具有大的横截面，因此对总体阻力的贡献可能很小。因此，该区域中缓冲液电导率的变化可能不会强烈地影响整个通道阻力，并且当ITP区进入洗脱储器时，电压可能停止上升。这可以用作停止施加电流和结束运行的信号。
为了评估该电压变化，可以计算电压的导数，例如如图16所示。可以使用Lanzcos微分方法来抑制高频噪声。可以为导数设置阈值，并且当导数超过阈值时，进行触发。在一些情况下，引入额外的触发器可以提高控件的稳健性。例如，图16示出了四个触发点。在一些情况下，这些触发器中只有两个触发器用于改变驱动电流(例如，触发器1和4)，而其他触发器(例如，触发器2和3)用于标记运行中的时间点，这可以改善触发器4的定时。图17示出了图16中的电压的导数分析，其中箭头表示用于选择触发点的导数阈值。
图16示出了来自测量驱动电压的示例数据。每条垂直线代表一个触发点。两条线代表两个电极，即相对于接地电极，EH和LEH储器中的电极。点A、B、C和D对应于ITP区处于图15中标记的相应位置(A、B、C和D；分别标记为1508、1509、1510和1511)的时间。在一些情况下，通道中的每个位置的电导率均可影响整体驱动电压，这可能使评估洗脱储器附近发生的情况变得更加困难。
用于检测ITP带的位置的第二种方法是进行电导率的局部测量。这可以使用电容耦合的非接触电导检测器(C4D)来完成。该方法可以使用高频交流电通过通道壁并耦合至电解质。这种局部测量可以在洗脱储器本身进行。该技术可以减少或消除与在整个通道上进行的测量相关联的模糊性。在该技术中，一旦在洗脱储器电导率检测器中观察到电导率的变化，就可以选择运行结束触发，例如如图18所示。
可以用置于洗脱通道下方的电极进行C4D检测。使电极面积最大化可以降低必要的驱动频率。例如，可以使用约100kHz至约10MHz的驱动频率，其中电极接触垫为约0.2mm2至约50mm2。C4D传感器可以用电子组件(包括电阻器、电容器、二极管桥和高频运算放大器)以及高频信号源(如来自直接数字合成器)实现。图19示出了C4D传感器实施方式的示例性示意图。
用于检测ITP带的位置的第三种方法是对洗脱储器附近的温度进行局部测量。该测量可以用包括热电偶或红外温度传感器的温度传感器进行。传感器可放置在洗脱储器附近的通道下方，并且可随时间监测温度。当较低迁移率的尾随离子取代较高迁移率的前导离子(例如ITP区的LE-TE界面)时，通道中的电场可能增加，并且温度可能升高。在等速电泳过程中，较低迁移率的尾随电解质离子和较高迁移率的前导电解质离子可在等速电泳界面处相遇。ITP界面可包含在前导电解质离子与尾随电解质离子之间浓缩的样品核酸。温度升高可以检测较高迁移率的前导离子与较低迁移率的尾随离子之间的ITP界面的存在，并因此也表明它们之间存在核酸。这种温度升高可以为1-10℃。
图20A和图20B示出了使用热成像相机的示例性温度测量结果。这些图像显示随着尾随离子进入通道，温度明显升高。图20A示出了使用热成像相机拍摄的ITP通道的温度图；通道的方向与图15中的相同。图20B示出了图20A中的光标1的位置处的温度随时间的图。在约450秒时，ITP界面和尾随离子进入该区域，导致温度增加。该温度上升可被检测到，并用作改变施加到通道的电流的触发信号。
可以在洗脱储器处或附近的检测位置处测量温度(例如，如图21中所示)。在一些情况下，检测位置可位于距离洗脱储器至少约5mm处。在一些情况下，检测位置可位于距离洗脱储器至少约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm或25mm处。在一些情况下，检测位置可以位于距离洗脱储器至多约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm或25mm处。在一些情况下，温度传感器可位于距离洗脱储器至少约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm或25mm处。在一些情况下，温度传感器可位于距离洗脱储器至多约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm或25mm处。
当感测到温度变化时，温度传感器可以触发电流的变化。在一些情况下，检测到的温度变化在约0.2℃至约5℃的范围内。在一些情况下，检测到的温度变化为至少约0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃。在一些情况下，检测到的温度变化为至多约0.2℃、0.3℃、0.4℃、0.5℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃。
在一些情况下，在一个或多个触发点处检测ITP区(例如通过电压监测、电导率测量和/或温度感测)可以使台式控制器改变施加到微流体芯片的电流。可以在检测时或在预定延迟之后立即施加该改变。ITP区的检测可触发电流的减少、增加或消除。例如，在点C1510处检测ITP区可触发电流的减少，以便增加ITP区在通向洗脱储器的通道中的停留时间。备选地或组合地，在位于洗脱储器处或附近的点D1511处检测ITP区可触发电流的消除，以便将ITP区(和核酸)或其一部分定位在洗脱储器、孔或通道或芯片的区域内。在一些情况下，ITP区的检测可在预定量的时间之后触发电流的变化。例如，检测位置(例如1504或光标1的位置)可以以已知距离定位在洗脱储器处或附近，使得可以针对给定电流计算ITP区在检测位置与洗脱储器之间行进所需的时间。控制器可以预先确定行进时间，并且在检测位置处检测ITP区可在预定量的时间之后触发电流的延迟消除。在一些情况下，在特定检测位置处检测ITP区可提供ITP区的时空关系，这可以导致比其他感测方法更精确的触发。
在一些情况下，在触发点处检测ITP区可以使施加到微流体芯片的电流改变方向或路径。例如，可以触发电流反转，使得ITP区反转通道内的行进方向。在另一个实例中，可以触发系统以停止在第一对电极之间施加电流并开始向第二对电极施加电流以沿着不同的路径驱动离子流。例如，通道可以是“y形的”，其中第一通道通向两个侧通道，这两个侧通道在不同方向上从第一通道分隔开。最初可以分别在连接到第一通道和第一侧通道的第一电极与第二电极之间驱动电流。在不中断电流的情况下，ITP区可以从第一通道行进到第一侧通道。在第一通道与两个侧通道之间的连接处检测ITP区可触发第一电极和第二电极停止驱动电流，并且分别连接到第一通道和第二侧通道的第三电极和第四电极开始驱动电流。然后，ITP区将从第一通道行进到第二通道。在一些情况下，第一电极和第三电极是相同的电极。以这种方式，触发可以使电流改变，使得ITP区的路径沿着通道改变。
在一些情况下，可以使用本文所述的检测方法的任何组合来检测ITP带的位置。
在一些实施方式中，可以通过测量通道的电压或电阻并结合对洗脱储器附近的温度进行局部测量来检测ITP带的位置。可以如本文所述测量电压。例如，可以在整个ITP运行期间测量电压。在一些情况下，可以监测电压，并且可以将电压的变化或电压导数的变化用作触发来改变驱动电流，如本文所述。备选地或组合地，电压的变化或电压导数的变化可用于标记运行中的时间点，以改善后续触发的时机，如本文所述。例如，第一电压变化可以指示ITP带已到达样品通道与前导电解质通道之间的毛细管屏障，其可以用于标记运行中的时间点并改善总体触发。第二电压变化可以指示ITP带已到达图40中所示的LE通道的变窄(即，收缩)部分。第二电压变化可以在预定的时间量之后触发驱动电流的变化。例如，第二电压变化可以触发驱动电流以从前导电解质缓冲孔和尾随电解质孔中的电极(如图84C所示)切换到洗脱缓冲孔和尾随电解质孔中的电极(如图84B所示)。可以在预定的时间量之后关闭前导电解质缓冲储器中的电极。或者，可以在预定的时间量之后反转前导电解质缓冲储器中的电极的极性。在一些实施方式中，预定的时间量可以被配置为与到达图40中所示的集成定量区域的ITP带一致。在切换电极对之间的驱动电流后，可以如本文所述测量温度。例如，可以将红外温度传感器置于洗脱储器附近的通道下方，如本文所述和如图40所示。如本文所述，温度传感器可以被配置用于监测传感器处随时间的温度。由于施加到通道的电场和离子的离子强度，ITP界面处的离子之间可能会产生温差。ITP界面可以包含在前导电解质离子与尾随电解质离子之间浓缩的样品核酸。温度升高可以检测在较高迁移率的前导离子与较低迁移率的尾随离子之间的ITP界面的存在，因此也指示它们之间核酸的存在。当用温度传感器检测到温度升高时(例如，如图91A-图91B所示)，可以在预定的时间量(可以对应于IR传感器与洗脱储器之间的距离)之后去除电流，如本文所述。然后可以从洗脱储器洗脱纯化的核酸，并任选地用于如本文所述的进一步处理。
在一些实施方式中，施加在流体设备上的电流可以在ITP带中的核酸分析物与尾随电解质之间的界面处生成第一温差。尾随电解质由于其较低的离子强度可以比ITP带中的核酸更热。施加在流体设备上的电流可以在ITP带中的核酸分析物与前导电解质之间的界面处生成第二温差。前导电解质可以比ITP带中的核酸温度更低。温度传感器可以被配置用于检测较冷的前导电解质与ITP带之间的温差，并随后检测ITP带与较热的尾随电解质之间的温差。
在至少一些情况下，施加在流体设备上的电流可以在分析物与尾随电解质之间的界面处生成第一温度。施加在流体设备上的电流可以在分析物与前导电解质之间的界面处生成第二温度。可以在流体设备上施加电流，使得第一温度与第二温度之间的温差足以在其间生成热效应(例如，以足够高的电流以生成热效应)。当洗脱储器下方的通道内(例如，在两者之间的孔口处)的电流停止时，该热效应可以足以对ITP带产生浮力效应，并促进ITP的核酸经由孔口进入洗脱储器。
纯化的样品的进一步处理和使用
提取或纯化的核酸可用于测序、基因型分型、突变或多态性的分析、基因表达水平的分析、疾病诊断、疾病预测、细胞学分类、父本或系谱分析或建议的治疗方式的指示。
在优选的实施方式中，提取或纯化的核酸(例如，DNA、RNA)可用于扩增反应如PCT反应中。在一些情况下，提取或纯化的核酸可用于扩增反应，包括但不限于环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、滚环扩增(RCA)、切口酶扩增反应(NEAR)、PCR、逆转录PCR、实时PCR、定量PCR(qPCR)、数字PCR和甲基化特异性PCR。
提取或纯化的核酸可用于测序反应，包括Maxam-Gilbert测序、链终止测序(例如，Sanger测序)、鸟枪测序、焦磷酸测序、桥式PCR、菌落测序、聚合酶克隆(polony)测序、合成测序、离子半导体测序、纳米孔测序、纳米球测序、连接测序、杂交测序和单分子实时测序。
提取或纯化的核酸可用于蛋白质结合测定，诸如DNA足迹测定。例如，DNA酶(例如，DNA酶I)可用于随机切割感兴趣的DNA分子。本公开内容的技术可用于将消化的DNA与DNA酶分离，从而防止进一步消化。在一些情况下，可以在流体设备外进行DNA酶消化，随后可以将样品装载到流体设备上进行纯化。在其他情况下，可以在流体设备上进行DNA酶消化，并且一旦进行消化，就可以在流体设备上纯化核酸。
样品如固定或包埋样品(例如，FFPE样品)可用于纵向研究、全基因组关联研究和跨群体的其他大规模分析。
垂直或柱状ITP
诸如本文所讨论的平面ITP装置设计可以利用水平空间来使ITP带行进。为了以高通量处理样品，诸如在96孔板格式中，在给定足迹(如9mm×9mm足迹)中安装整个ITP分离系统对于样品可能是有利的。这样做的一种方法是增加系统的高度以适应更多的样品体积。这可以提供将总样品体积增加到毫升范围并且仍然以合理的运行时间处理样品的选项。
在一些情况下，减少或防止重力驱动的流动和/或浮力流过这样的系统可能是重要的。在不混合电解质的情况下组装ITP所需的电解质区也可能是重要的。
垂直或柱状ITP系统可包含若干ITP台阶，其中每个台阶包含在底部具有凝胶(例如，琼脂糖)或类似材料的柱(例如，塑料)。凝胶可具有高电导率。每个台阶均可通过在凝胶顶部引入电解质来制备。凝胶可以减缓或阻止液体流动。为了形成柱，可以在顶部用尾随电解质并在底部用前导电解质堆叠各台阶。然后可以通过系统驱动电流。可以通过将柱去堆叠并移出来回收纯化的分析物。
图22A示出了垂直(或柱状)ITP设置的示例性示意图。垂直ITP设备可以包括具有安设在其内部通道内的多个凝胶塞的柱。凝胶塞可以被配置成接收本文所述的一种或多种缓冲液或样品流体的空间分离。每个凝胶塞和每个空间都可以构成垂直ITP柱的台阶。每个台阶的凝胶塞可以包括凝胶材料，其可以支撑添加到凝胶塞上方的空间中的水(例如，水性电解质溶液或样品体积)的重量。每个凝胶塞可以支撑安设在其上方的自由溶液。例如，垂直ITP设备可以包含五个台阶。第一台阶可以包含尾随电解质缓冲液和被配置用于支撑尾随电解质缓冲液的第一凝胶塞。位于第一台阶下方的第二台阶可以包含如本文所述的样品或分析物以及第二凝胶塞。位于第二台阶下方的第三台阶可以包含前导电解质缓冲液和第三凝胶塞。位于第三台阶下方的第四台阶可以包含洗脱缓冲液和第四凝胶塞。位于第四台阶下方的第五台阶可以包含高浓度前导电解质缓冲液和第五凝胶塞。当将电场施加到垂直ITP设备时，分析物可以在重力方向上从第二台阶通过第二凝胶塞迁移到第三台阶(前导电解质缓冲液)，通过第三凝胶塞，向下进入第四台阶(洗脱缓冲液)。关于在通道内执行的ITP，可以将分析物压缩到ITP带中，如本文所述。ITP柱的横截面面积可为大约9mm×9mm。这样的系统可以被配置用于处理具有大约9mm×9mm的横截面柱面积的样品。本领域普通技术人员根据需要可以将该设计按比例放大，例如放大到96个样品(柱)，其中整个装置尺寸符合标准微量滴定板。图22B示出了用DNA ITP带建立的垂直ITP的示例性图像。这些台阶为：尾随电解质高(TEH)、样品、前导电解质(LE)和前导电解质高(LEH)。ITP区正在向下移动通过系统。该图像未显示作为分析物的最终目的地的洗脱阶段(E，图22A中示出)
计算机控制系统
本公开内容提供了被编程为实现本公开内容的方法的计算机控制系统。图13B示出了计算机系统1304，其被编程或以其他方式进行配置以控制样品制备、样品提取或纯化或检测。计算机系统1304可以调节本公开内容的提取、纯化和检测过程的多个方面，例如施加压力或电场、热控制、检测、定量、反馈以及开始或结束过程。计算机系统1304可以是用户的电子设备或相对于电子设备位于远程的计算机系统。该电子设备可为移动电子设备。
计算机系统1304包括中央处理单元(CPU，本文也称为“处理器”和“计算机处理器”)1305，其可以是单核或多核处理器，或者用于平行处理的多个处理器。计算机系统1304还包括存储器或存储器位置1310(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元1315(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1320(例如，网络适配器)以及外围设备1325，诸如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1310、存储单元1315、接口1320和外围设备1325通过诸如主板的通信总线(实线)与CPU 1305通信。存储单元1315可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储器)。计算机系统1304可借助于通信接口1320可操作地耦合至计算机网络(“网络”)1330。网络1330可以是互联网、因特网和/或外联网，或与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络1330为电信和/或数据网络。网络1330可包括一个或多个计算机服务器，该计算机服务器可支持分布式计算，诸如云计算。在一些情况下，网络1330借助于计算机系统1304可实现对等网络，这可以使得耦合至计算机系统1304的设备能够起到客户端或服务器的作用。
CPU 1305可执行一系列机器可读指令，该计算机可读指令可体现在程序或软件中。该指令可存储在诸如存储器1310的存储位置中。该指令可针对CPU 1305，CPU 1305随后可编程或以其他方式配置CPU 1305以实现本公开内容的方法。由CPU 1305执行的操作的示例可包括提取、译码、执行和回写。
CPU 1305可以是诸如集成电路等电路的一部分。系统1304的一个或多个其他组件可包括在电路中。在一些情况下，该电路为专用集成电路(ASIC)。
存储单元1315可存储文件，诸如驱动程序、文库和保存的程序。存储单元1315可存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统1304可包括一个或多个附加数据存储单元，所述附加数据存储单元位于计算机系统1304外部，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统1304通信的远程服务器上。
计算机系统1304可通过网络1330与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1304可与用户的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板型PC(例如，
Figure GDA0003654970080002101
iPad、
Figure GDA0003654970080002102
Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，
Figure GDA0003654970080002103
iPhone、支持Android的设备、
Figure GDA0003654970080002104
)或个人数字助理。用户可经由网络1330访问计算机系统1304。
如本文所述的方法可通过机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现，该机器可执行代码存储在计算机系统1304的电子存储位置上，例如在存储器1310或电子存储单元1315上。机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用过程中，该代码可由处理器1305执行。在一些情况下，可从存储单元1315检索该代码并将其存储于存储器1310上以备由处理器1305访问。在一些情况下，可排除电子存储单元1315，而将机器可执行指令存储于存储器1310上。
所述代码可被预编译并配置用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或可在运行期间被编译。该代码可以用编程语言提供，可选择该编程语言以使该代码能够以预编译或即时编译(as-compiled)的方式执行。
本文提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统1304，可体现在编程中。本技术的多个方面可以被认为是“产品”或“制品”，其一般为在一种类型的机器可读介质上携带或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式。机器可执行代码可存储在诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘的电子存储单元上。“存储”型介质可包括计算机的任何或全部有形存储器、处理器等，或其相关联模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。该软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络进行通信。这样的通信，例如，可使软件能够从一个计算机或处理器加载到另一计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可承载软件元素的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如跨本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路而使用的。携载这类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用的，除非受限于非暂时性有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，机器可读介质如计算机可执行代码可以采用许多形式，包括但不限于：有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机中的任何存储设备等，例如可用于实现如附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括导线，该导线包括计算机系统内的总线。载波传输介质可采用电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信过程中生成的那些电信号或电磁信号或者声波或光波。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、顺应式盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、任何其他具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣盒、传送数据或指令的载波、传送这样的载波的电缆或链路，或者计算机可从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质形式中的许多可以参与将一个或多个指令的一个或多个序列载送至处理器以供执行。
计算机系统1304可包括电子显示器535或与其通信，电子显示器535包含用于提供例如操作参数(例如，处理时间、温度、场强)、核酸定量信息或其他信息的用户界面(UI)1340。UI的示例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。
本公开内容的方法和系统可通过一种或多种算法来实现。算法可在由中央处理单元1305执行时通过软件实现。例如，该算法可以调节热控制器、计算核酸定量、控制过程功能以及开始或结束过程。
试剂盒
本公开内容提供了可用于进行等速电泳过程的试剂盒。通常，此类试剂盒包含本文提供的微流体设备和一种或多种缓冲液。缓冲液可包括任意组合的一种或多种样品缓冲液、一种或多种前导电解质缓冲液、一种或多种尾随电解质缓冲液、一种或多种裂解缓冲液和/或一种或多种洗脱缓冲液。在一些情况下，该试剂盒可包括一种或多种酶(例如，RNA酶、DNA、核酸酶、蛋白酶(proteases)、蛋白酶(proteinases)、聚合酶)。缓冲液可以在单独的管中提供。在一些情况下，微流体设备预装载有一种或多种缓冲液。该试剂盒可包括关于操作设备和/或处理样品的一套说明书。
实施例
实施例1-从FFPE样品中提取DNA
获得来自人类患者的FFPE样品。在无核酸酶的蒸馏水或去离子水中用80mM NaOH、11mM DTT和0.5％v/v Igepal CA-630制备1.1X碱性水性缓冲溶液(溶液A1)。在无核酸酶的蒸馏水或去离子水中用776mM HCl和100mM Tris碱或Trizma碱制备10X猝灭溶液(溶液A2)。还提供了商购可获得的蛋白酶K溶液和RNA酶。或者，可在无核酸酶的蒸馏水或去离子水中制备具有0-80mM NaCl、5-10mM DTT和0.1-0.5％v/v IGEPAL CA-630的中性缓冲(例如，pH约7.0至约8.0)的5-50mM Tris-HCl溶液。
将FFPE切片或卷形物(scroll)添加至1.5-2.0mL微量离心管中。将175μL的溶液A1添加至该管中。将该管内容物在50-99.9℃下温育1-20分钟(在一些情况下，将该管内容物在95-99.9℃下温育5-20分钟)以使样品脱蜡。将20μL的溶液A2添加至该管中以猝灭溶液A1并获得pH约为7-8.25的缓冲溶液。或者，可将FFPE切片或卷形物在195μL的猝灭或中性缓冲液(例如，pH约7.0至约8.0)中在50-80℃下温育1-30分钟以使样品脱蜡。可以使用的其他脱蜡方案包括(1)用二甲苯处理样品，随后在室温下用96％-100％乙醇洗涤一次或多次，随后对组织进行干燥；(2)将样品在升高的温度(例如，50-100℃)下在约pH 7至约pH 8.25的缓冲水溶液中温育1-30分钟；(3)将样品在升高的温度(例如，50-100℃)下在碱性水溶液中温育1-30分钟，随后猝灭至pH约7至约8.25的缓冲溶液；或(4)将样品在升高的温度(例如，50-100℃)下在矿物油中温育1-30分钟。
将5μL的蛋白酶K溶液添加至脱蜡的样品溶液中至最终浓度为400-1000μg/mL(通常为600-700μg/mL)，并且最终体积为200μL。然后将溶液在约56℃下温育15-60分钟。任选地，将溶液在80-90℃下进一步温育2-60分钟。任选地，将3μL的RNA酶A(或约50-200μg/mLRNA酶A)添加至溶液中。然后将溶液冷却至室温，并将FFPE裂解物装载到流体设备上以供进一步处理，如通过等速电泳(ITP)。
实施例2-DNA提取产率的比较
使用台式控制器装置提取DNA，以使流体设备中的等速电泳自动化，其来自(i)作为PCR后清理的qPCR缓冲液(图3，三角形数据点)和(ii)细胞培养裂解物(图3，正方形数据点)，其中使用qPCR计算产率。提供了公布的使用传统固相萃取柱的DNA产率数据(SPE；图3，菱形数据点)以供比较。图3示出了DNA产率相比于输入DNA质量。用于等速电泳的前导电解质缓冲液包含具有44mM HCl的88mM Tris。将尾随电解质装载到尾随电解质储器中，尾随电解质包含具有0.3M己酸和0.6M MOPS的1.2M Tris。在包含10mM Tris和5.6mM HCl的第二前导电解质缓冲液(样品缓冲液)中制备细胞裂解物样品。对于约10-2纳克(ng)至约103ng的输入DNA质量，以约60％至约90％的产率从人Jurkat细胞培养裂解物中提取DNA。将细胞在包含40mM NaOH的水溶液中裂解1分钟，随后用缓冲的酸性溶液以1:1的体积比进行猝灭，以使最终的细胞裂解物样品加至pH 8的具有5.6mM HCl和20mM NaCl的10mM Tris。在细胞裂解物样品体积内添加蛋白酶K至最终浓度为400μg/ml，并在56℃下温育10分钟。然后将裂解的样品置于室温并装载到流体设备上进行等速电泳。对于约10-1ng至约103ng的输入DNA质量，以约90％至约100％的产率进行掺入包含10mM Tris-HCl pH 8的缓冲液中的基因组DNA(使用商用SPE试剂盒从人Jurkat细胞中预纯化)的提取。
与传统的SPE柱试剂盒相比，本文使用的等速电泳方法和装置允许更高的产率。这可能是由于具有指定的裂解化学的更高的芯片外裂解效率，随后使用等速电泳更有效地回收核酸。与标准柱相比，本文所述的等速电泳方法和装置可提供核酸样品与芯片表面的较低吸附，和/或流体设备内比柱更低的死体积。本文所述的等速电泳方法和装置可以基于长度和/或序列实现偏差较少的或无偏差的核酸回收，这也可以提供更高效率的回收。所进行的掺入基因组DNA样品具有非常高的回收率(产率)，这可表明由于等速电泳过程本身，等速电泳几乎没有系统的样品损失(而细胞裂解物样品可具有其他导致效率损失的因素，诸如所使用的裂解化学，可对其进行改进以获得更高的产率)。
实施例3-交联核酸和非交联核酸的分离
将包含交联和非交联核酸的脱蜡和裂解的小鼠FFPE组织样品(如实施例1中所述处理的)装载到流体设备上以供用前导电解质和尾随电解质进行等速电泳。如实施例1中所述对样品进行裂解，并在前导电解质溶液中制备至最终浓度为具有5.6mM HCl的10mMTris。前导电解质包含具有70mM HCl的140mM Tris。尾随电解质包含具有比HEPES更高的有效迁移率量值的作为间隔离子的具有0.5M己酸的2.1M Tris与具有较低有效迁移率量值的作为离子的0.7MHEPES的混合物。在等速电泳过程中，具有较高有效迁移率量值的非交联核酸聚焦在己酸区之前和前导电解质区之后。交联核酸和样品污染物聚焦在己酸区之后，并且在HEPES区之前或之内，这取决于交联程度以及它们的有效迁移率量值。图23示出了在两小时(上部)或过夜(下部)消化以从DNA中去除交联蛋白质之后在等速电泳通道中进行DNA分离的两个图像。将蛋白酶K以700μg/ml的最终浓度添加至脱蜡的裂解组织中(猝灭至pH8.2)以用于消化。交联DNA出现在通道的左端，被间隔离子与通道右端处的可扩增的非交联DNA分开。图23中的图示出了对于两小时2301和过夜2302消化，DNA信号的强度相比于通道中的位置。
实施例4-从肺和肝脏FFPE样品中提取和纯化DNA
获得福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的小鼠肺和肝脏样品(例如，Zyagen)。处理七对FFPE切片(1cm×1cm×5-10μm)，其中每对中的一个切片通过装置上的等速电泳处理，并且一个切片通过不同方法(Promega ReliaPrep FFPE DNA试剂盒)处理以供比较。用于等速电泳的前导电解质缓冲液包含具有44mM HCl的88mM Tris。将尾随电解质装载到尾随电解质储器中，尾随电解质包含具有0.3M己酸和0.6M MOPS的1.2M Tris。通过在pH 8.0的具有10mM DTT、72mM NaCl和0.5％IGEPAL CA-630的10mM Tris-HCl缓冲液中于80℃下温育大约1分钟使样品脱蜡，随后用蛋白酶K在相同溶液中于56℃下处理60分钟。然后将消化的样品在90℃下温育15分钟。通过将200μL的预处理的样品混合物(包括包埋和FFPE组织碎片)分配到流体设备的样品入口中，对来自每对切片的一个样品进行ITP。使用Promega的ReliaPrep FFPE gDNA试剂盒，根据制造商的方案提取每对中的另一个切片。图24A示出了具有来自FFPE样品的DNA的流体设备上的两个相邻ITP通道的图像，用插入染料标记以供可视化。用qPCR对从样品中提取的DNA进行定量。图24B示出了对于七个样品对中的每一个，以纳克(ng)为单位定量的经提取的DNA。对于每一对，较暗的左侧条显示ITP的结果，而较亮的右侧条显示ReliaPrep试剂盒的结果。最左边的两个样品对是人肝脏样品，其余五个样品对是人肺样品。对于所有七个样品对，通过ITP提取的可扩增核酸的量显著高于(通常是可扩增产率的约1.5至8倍)通过ReliaPrep试剂盒提取的核酸的量。
实施例5-基于ITP的核酸定量
对使用ITP的核酸定量进行测试并与qPCR比较。使用RNA酶P人类参考基因测定(ABI)在整个样品量范围内进行比较。从50次qPCR运行中生成标准或校准曲线(每次以5个数量级浓度重复10次)，并用于对该DNA量范围的qPCR测量不确定度进行定量。
使用标准试剂盒(例如，Invitrogen PureLink基因组DNA试剂盒)从4百万个Jurkat细胞中提取DNA。对于装置上的ITP，使用pH12.7NaOH溶液将Jurkat细胞在芯片外裂解2分钟，使用盐酸和Tris碱溶液猝灭至pH 7.5-8的缓冲溶液，随后用蛋白酶K在pH 8和56℃下处理10分钟。
通过ITP处理预纯化的DNA，并通过荧光强度在ITP通道中进行定量。用于等速电泳的前导电解质缓冲液包含具有44mM HCl的88mM Tris。将尾随电解质装载到尾随电解质储器中，尾随电解质包含具有0.3M己酸和0.6M MOPS的1.2M Tris。在包含具有5.6mM HCl的10mM Tris的前导电解质缓冲液(样品缓冲液)中制备样品。图14示出了与已知DNA样品质量相比，从DNA测量的荧光强度的滴定曲线，并且在从0.4皮克(pg)至约106pg的七个数量级上是线性的。图14的左上插图示出了ITP通道中250ng DNA的图像。图14的右下插图示出了在ITP通道中在250pg、2.5ng、25ng和250ng DNA下，ITP提取的DNA的对数尺度上的点检测器荧光信号强度。
实施例6-在ITP提取和纯化中没有偏差
以三种浓度(1ng/μL，正方形数据点；10ng/μL，菱形数据点；100ng/μL，三角形数据点)和五种浓度比(总富含GC与富含AT的比率为0.1至10)制备具有63％A-T含量(37％G-C含量，HEX标记)的合成100碱基标记的DNA寡核苷酸和具有68％G-C含量的DNA寡核苷酸(FAM标记)的混合物。从处理之前和之后获得的荧光读板器测量值计算比率。图4A示出了输出富含GC与富含AT的比率与用于ITP处理的输入富含GC与富含AT的比率的比较，表明ITP过程中没有偏差。
使用来自Experion 12k DNA分析试剂盒(BioRad)的电泳图峰的积分信号，在处理之前和之后测量来自1kb DNA梯(New England Biosciences)的寡核苷酸混合物的长度。对于装置上的ITP(图4B，顶部)、Qiagen QiaAmp柱试剂盒(图4B，中间)和InvitrogenPureLink柱试剂盒(图4B，底部)，比较处理之前和之后样品中的大小分布。用于等速电泳的前导电解质缓冲液包含具有44mM HCl的88mM Tris。将尾随电解质装载到尾随电解质储器中，尾随电解质包含具有0.3M己酸和0.6M MOPS的1.2M Tris。在包含具有5.6mM HCl的10mMTris的前导电解质缓冲液(样品缓冲液)中制备样品。对于每次比较，顶行显示回收的输出级分中的大小分布，底行显示样品中的初始大小分布。
实施例7-细胞裂解物核酸的芯片外或芯片上蛋白酶K消化
图25A示出了装载有用染料染色以供可视化的核酸(来自人细胞的RNA提取和蛋白水解消化物)的单通道ITP芯片的图像。左侧2501是在样品缓冲液中装载200μg/mL蛋白酶K之前芯片外处理的样品的ITP带，而右侧2502是未用蛋白酶K处理过的样品。用于等速电泳的前导电解质缓冲液包含具有50mM HCl的100mM Tris。将尾随电解质装载到尾随电解质储器中，尾随电解质包含具有1M己酸和1M MOPS的1.8M Tris。在包含具有5.6mM HCl的10mMTris的前导电解质缓冲液(样品缓冲液)中制备样品。图25B示出了装载有用染料染色以供可视化的核酸(来自人细胞的RNA提取和蛋白水解消化物)的单通道ITP芯片的图像。左侧2501是在前导电解质中芯片上用200μg/mL蛋白酶K处理过的样品的ITP带，而右侧2502是未用蛋白酶K处理过的样品。在这两种情况下，用蛋白酶K处理的样品展现出更紧密的ITP带，其代表与蛋白质无关联的核酸(较高的有效迁移率量值)，而未用蛋白酶K处理过的样品展现出模糊带，其代表与可变量的蛋白质相关联的核酸(较低的有效迁移率量值)。
实施例8-使用芯片外裂解和芯片上ITP纯化从人细胞中提取RNA
图26A示出了在DNA消化的情况下，从细胞裂解物(Jurkat细胞)中提取和纯化RNA的过程中，芯片通道中RNA ITP带2601的图像。图26B示出了在没有DNA消化的情况下，从细胞裂解物(Jurkat细胞)中提取和纯化RNA的过程中，芯片通道中总核酸ITP带2602的图像。用于等速电泳的前导电解质缓冲液包含具有50mM HCl的100mM Tris。将尾随电解质装载到尾随电解质储器中，尾随电解质包含具有1M己酸和1M MOPS的1.8M Tris。在包含具有5.6mMHCl的10mM Tris的前导电解质缓冲液(样品缓冲液)中制备样品。图26C和图26D分别示出了对于图26A和图26B中所示的样品，RNA质量电泳图(使用BioRad Experion进行测量)的图。细胞裂解和DNA酶消化在pH 8的缓冲溶液中进行，该缓冲溶液含有7M尿素、2M硫脲和如本文所述的非离子表面活性剂。这些结果证明了在有或没有DNA消化的情况下制备高质量的RNA。
实施例9-使用ITP和200μl芯片装置提取裂解的全血
图27A示出了与小鼠全血的柱(菱形，Qiagen QiaAmp)提取相比，ITP(正方形)的DNA产量(ng)作为起始样品中全血体积百分比的函数的结果。图27B示出了在芯片上裂解的小鼠全血的ITP纯化过程中ITP带2401中的总核酸的图像。用于等速电泳的前导电解质缓冲液包含具有130mM HCl的260mM Tris。将尾随电解质装载到尾随电解质储器中，尾随电解质包含具有0.5M己酸和0.7M MOPS的2.1M Tris。在包含具有5.6mM HCl的10mM Tris的前导电解质缓冲液(样品缓冲液)中制备样品。
图27C和图27D示出了ITP芯片通道的白光和荧光重叠图像，显示了在ITP纯化50体积％的全血裂解物2702之前和之后，血红素从样品通道和来自洗脱通道的前导电解质(或分离)通道2703以及储器2704中的血液样品中的物理分离。用绿色染料对纯化的核酸进行染色以供在洗脱孔中可视化。图27C示出了ITP之前的芯片(装载在芯片中的血液裂解物和ITP缓冲液；洗脱孔中的纯缓冲液且没有DNA)。图27D示出了ITP后的芯片(装载在芯片中的血液裂解物和ITP缓冲液；洗脱孔中的纯缓冲液和DNA)。图27E示出了ITP纯化后的芯片，其中芯片通道的白光图像显示了血红素从样品孔2705和来自洗脱通道的前导电解质(或分离)通道以及单通道芯片装置中的储器2706中的血液样品(50体积％血液)中的物理分离。图27F示出了ITP纯化后的芯片，其中芯片通道的白光图像显示了血红素从样品孔2705和来自洗脱通道的前导电解质(或分离)通道以及单通道芯片装置中的储器2706中的血液样品(25体积％血液)中的物理分离。
实施例10-使用芯片外裂解和芯片上ITP纯化从培养的人癌细胞中提取高分子量DNA
图28示出了与培养的人Jurkat细胞的固相提取(SPE；虚线，Qiagen MagAttract)相比，ITP(实线)的高分子量DNA纯化的结果，其作为具有比给定长度(Kb)更短的片段的纯化样品中DNA质量的百分比。在含有具有5.6mM HCl的10mM Tris和0.2％v/v IGEPAL CA-630的缓冲裂解溶液中在芯片外进行细胞裂解。将缓冲溶液配置成裂解细胞并减少裂解过程中DNA的机械破坏。在裂解溶液中裂解细胞沉淀物(pellets)，并采用反转且慢速(自动移液器)、宽孔端头移液(例如，Rainin200μl宽孔端头)轻轻混合，以帮助裂解物的均质化。将最终浓度为500μg/ml的蛋白酶K添加至裂解物中，并在60℃下温育20分钟。用具有44mM HCl的88mM Tris作为前导电解质和具有0.3M己酸和0.6M MOPS的1.2M Tris作为尾随电解质对裂解物进行ITP。与基于珠子的PSE试剂盒相比，基于ITP的纯化导致2至3倍的平均DNA片段长度，部分原因是由于在提取过程中由于缺乏固相组分或高剪切力(例如来自离心)而与SPE相比在等速电泳过程中DNA的机械剪切减少。与产生平均长度约为75Kb的DNA的SPE纯化相比，ITP纯化的DNA具有约175Kb的平均DNA长度(即50％的DNA质量含有大于约175Kb的DNA片段)。通过ITP提取的DNA质量的60％以上含有大于150kB的平均片段长度。相比于SPE方法，ITP产生至少约三倍的其大小至少为150kB的DNA片段。
实施例11-使用机械构件闭合通道
图29A示出了包含8个闭合通道的流体设备。如图12B所示，通过利用图12A的梳状机械构件将150℃的温度和30磅的压力(在所有16个位置上；即每齿1.875磅)施加到仪器上1秒钟，每个通道在两个位置2902、2902处永久闭合。图29B示出了第二通道闭合位置2902与每个通道的洗脱储器2903相邻的放大微观视图。图29C示出了作为施加到芯片上的力的函数计算的闭合百分比。在没有流体装载到通道中的情况下评估通道闭合的程度。通过施加恒定压力并测量通过通道的空气流速来测量闭合。评估了五个芯片。菱形指示从第一闭合位置2901获得的闭合数据，而三角形指示从第二闭合位置2902获得的闭合数据。在没有施加力的情况下，通道打开或大部分打开。在设备上10磅的力足以闭合大部分通道，而设备上30磅的力反复闭合全部或几乎全部通道。图29D示出了用电导率仪测量电导率以确定通道是否闭合的结果。芯片储器和通道装载有如图12A-12D或图15所述的ITP缓冲液(前导电解质、用于缓冲的高浓度前导电解质、尾随电解质、洗脱缓冲液、用于缓冲的高浓度洗脱缓冲液和不含生物样品的样品缓冲液)。使用机械构件闭合通道，随后将洗脱储器2903中的流体移液出该储器并收集。测量洗脱液的电导率，并与原始(预装载的)洗脱缓冲液(最初装载在芯片中的相同缓冲液)的电导率的测量值进行比较。如果通道闭合足以在洗脱储器2903与通道之间的第一通道关闭位置2901和在将洗脱储器2903连接到洗脱缓冲储器的通道内(通过洗脱缓冲通道；未示出)的第二通道关闭位置2902处提供流体阻力，则预期测量流体的电导率将与原始洗脱缓冲液相同。对于完全闭合的通道，洗脱体积的电导率(在不进行ITP的情况下)可以等于单独的洗脱缓冲液的电导率，表明在收集过程中没有流体或离子的转移。测试了四种情况——没有闭合(完全开放的通道)，第一个闭合位置2901闭合(部分关闭)，两个位置2901、2902闭合(完全闭合)，或者具有每个储器但洗脱储器用薄膜密封件密封。在薄膜密封件的情况下，通道没有通过机械构件物理变形，而是通过操作者施加的薄膜密封，以便增加对流体流动的阻力。来自部分闭合的通道的洗脱体积与完全闭合的通道相比显示出增加的电导率。用薄膜密封件密封非洗脱储器与完全闭合的通道相比也得以增加，但通常仍小于2x洗脱缓冲液的电导率。然而，这些电导率水平远低于从没有通道闭合的洗出液所获得的电导率。
图85示出了在利用用于闭合通道的齿状构件结构和机械致动器闭合通道之后，在从洗脱孔吸移出之前(左侧-分析物材料8502在8个芯片洗脱储器中清晰可见)和之后(右侧-分析物材料8502不那么清晰可见，如8个独立芯片洗脱储器中的映像8503所示)来自通道中的荧光染色分析物材料8501的基于荧光的成像的反差图像。通道中的荧光染色分析物材料8501在洗脱过程期间没有移动，这表明通道闭合器阻止了洗脱过程期间的流动。
图86示出了在使用用于闭合通道的PCR薄膜膜密封方法进行通道闭合之后，在从洗脱孔吸移出之前(左侧-分析物材料8602在8个芯片洗脱储器中清晰可见)和之后(右侧-分析物材料8602在8个单独的芯片洗脱储器中不那么清晰可见，表明其已被移除)来自通道中的荧光染色分析物材料8601的基于荧光的成像的反差图像。通道中的荧光染色分析物材料8601在洗脱过程期间没有移动，这表明通道闭合器阻止了洗脱过程期间的流动。
实施例12-使用脊状机械构件闭合通道
图87A示出了通过使用电导仪来测量从芯片吸移出洗脱储器的洗脱材料的电导率(即，洗脱液体积中所含离子的电导率)而获得的电导率数据。使用一次性PCR薄膜(即，对芯片的流体储器的膜启用的顶部密封件)或脊状通道将非洗脱孔密封，如图54A所示。与2x洗脱缓冲液相比，对非洗脱孔的密封导致孔的部分闭合和更高的电导率。仍然与PCR薄膜密封件相比，从脊通道闭合器密封的芯片收集的洗出液的电导率水平更低，这表明已获得通道的完全或接近完全闭合。图87B示出了在使用用于闭合通道的脊状构件结构和机械致动器闭合通道之后，在从洗脱孔中吸移出之前(左侧-材料在8个芯片洗脱储器中清晰可见)和之后(右侧-材料在8个单独的芯片洗脱储器中不那么清晰可见)，来自洗脱储器中的荧光染色分析物材料8701的基于荧光的成像的反差图像。
实施例13-使用带有橡胶密封构件和机械致动器的通道闭合器闭合通道
表2示出了从用图58A中所述的设备闭合的流体设备通道回收的洗脱材料收集的电导率数据。8通道流体芯片上的每个通道均装载有ITP缓冲液(每个通道5个缓冲液孔)和样品(每个通道1个样品孔)。洗脱缓冲液为具有0.002％Tween 20的10mM Tris HCl pH7.5。通过应用带有橡胶密封构件和机械致动器的通道闭合器来闭合通道。在ITP完成后，使用手动移液管从8个洗脱储器移取50ul的材料。用电导仪测量每种洗出液的电导率，并将其与纯(未使用/未装载)洗脱缓冲液的电导率进行比较。预计在通道闭合足以在通道闭合位置处提供流体阻力的情况下，所测量的流体的电导率将与原始洗脱缓冲液相同。预计部分闭合的通道将导致电导率比(测量/纯缓冲液)在约1与约2之间，优选的电导率比的值在约1至约1.5的范围内。使用橡胶密封构件和机械致动器闭合通道导致8个通道中的6个完全闭合，而另2个通道部分闭合。
表2
Figure GDA0003654970080002231
实施例14-电压测量和运行结束触发
图30示出了使用驱动电压的测量来触发一个通道中的电流的减小或消除的示例性实例。包含8个通道的流体设备在每个通道中装载有ITP缓冲液(包含具有44mM HCl的88mM Tris的前导电解质缓冲液、用于缓冲的高浓度前导电解质、包含具有0.3M己酸和0.6MMOPS的1.2M Tris的尾随电解质缓冲液、包含具有5.6mM HCl的10mM Tris的洗脱缓冲液、用于缓冲的高浓度洗脱缓冲液)。制备包含使用本文所述方法裂解的50,000个永生化人细胞的样品，并将其装载到每个通道中。通过每个通道驱动900μA穿过通道持续1900秒来进行预洗脱等速电泳分离。在1900秒3001之后，减小电流并且向每个通道施加250μA以将核酸驱动到洗脱储器中。在开始等速电泳后100秒，开始使用驱动电极上的电压作为数据源的信号处理3002。所示的顶线表示电压，而底线表示电压的导数。使用两个触发器来改变驱动电流(分别对应于图16中描述的触发器1和4，在位置C和D处)。可以通过监测电压导数中的峰值或最大值来检测进入洗脱储器或通道的低电导率离子(例如样品离子或尾随电解质)。在第一触发点(触发器1)3001处接通电流以将核酸引导至包含洗脱缓冲液的通道中，并且此后不久开始信号处理3002。随着核酸进入洗脱储器，在触发点3 3003处检测到第一次增加，并且随着尾随电解质开始进入洗脱储器，在触发点4 3004处检测到第二次增加。在触发点43004处检测到第二次增加之后移除电流，以便将样品核酸在洗脱孔中定位或分离。
实施例15-温度感测和运行结束触发
图21示出了使用红外热传感器来触发一个通道中电流的减少或消除的示例性温度测量结果。包含8个通道的流体设备在每个通道中装载有ITP缓冲液(包含具有44mM HCl的88mM Tris的前导电解质缓冲液、用于缓冲的高浓度前导电解质、包含具有0.3M己酸和0.6M MOPS的1.2M Tris的尾随电解质缓冲液、包含具有5.6mM HCl的10mM Tris的洗脱缓冲液、用于缓冲的高浓度洗脱缓冲液)。制备包含使用本文所述方法裂解的50,000个永生化人细胞的样品，并将其装载到每个通道中。通过每通道驱动900μA穿过通道持续1900秒来进行预洗脱等速电泳分离。在1900秒之后，减小电流并且向每个通道施加250μA以将核酸驱动到洗脱储器中。在开始等速电泳后100秒，使用由TMP007红外温度传感器收集的温度数据进行信号处理。在洗脱储器2106附近(其中心距离洗脱孔2106大约4.5mm)的洗脱通道中的位置2105处检测温度。温度传感器位于流体通道的底表面下方大约1mm至3mm处。温度传感器可处于距离洗脱储器2106大约4.5mm的中心(其边缘距离洗脱储器约3.55mm至约5.45mm)。温度传感器被配置为检测由于通道中的电泳焦耳加热引起的温度变化。每个通道体积的电泳焦耳热耗散可以与恒定电流下的电导率成反比。在等速电泳过程中，当ITP区移动经过通道时，较低电导率的离子(尾随电解质)可以置换较高电导率的离子(前导电解质)。温度传感器可以感测移动经过检测位置2105的ITP区，以及随着ITP区域移动的离子位移，作为检测位置处的通道内的温度升高。
顶线显示检测位置2105处的温度，而底线显示温度的导数。针对高导数实时监测温度，以便检测较低电导率的缓冲区。垂直线指示监控过程中何时发生关键事件。从左到右，第一条线2101指示电流接通的时间，而第二条线2102指示此后不久信号处理的开始。第三条线2103指示第一次检测到温度导数的增加，而第四条线2104指示第二次检测到温度导数的增加，此时停止电流并且禁用电压，从而使电压落在储器中并使核酸在洗脱储器中定位或分离。
实施例16-温度感测和运行结束触发
图88A-图88F示出了使用红外热传感器来触发一个通道中电流的减少或消除的示例性温度测量结果。图88A示出了通过如图21中定位的红外传感器随时间监测的通道内的温度。垂直线指示监测期间何时发生关键事件。两次温度上升8801和8802分别用于确定何时开始信号处理和何时结束运行，如图21所示。图88B示出了图88A的温度数据的一阶导数值。一阶导数的两个峰8803和8804对应于图88A中的事件8801和8802。基于峰检测算法来鉴别两个事件的识别。为了评估一阶导数，将温度数据收集为时间窗口内的连续时间组。在每个时间窗口内，由低阶多项式函数拟合数据。然后根据多项式拟合来计算一阶导数。为了抑制该信号中的噪声，使用广义似然比检验(GLRT)。数据也符合恒定温度的零假设。图88C示出了数据减去拟合8806和数据减去零假设8805的残差，将其进行比较以产生似然比。使用该比值的函数8807来缩放导数。结果是，在其中零假设具有与最佳拟合线相当的残差的区域，导数降低到接近零。在零假设与最佳拟合相比是较差拟合的区域，导数得以维持。为了检测一阶导数的峰值，使用了算法来追踪导数的最大值。在当前值下降到预定最大值以下的某个百分比时，检测/记录峰值。导数峰值被配置成满足预定的阈值，以消除检测到噪声峰值的可能性。然后将处理后的数据提供给触发算法，该触发算法基于上述峰检测方法主动搜索两个一阶导数峰的出现。在成功检测到两个峰后，提取过程结束，并且触发算法停止。如本领域普通技术人员将理解的，可以使用与本文仅关于温度所描述的方法和算法相似的方法和算法对温度附加地或替代地检测电压。
图88D示出了所使用的触发过程的框图。核酸提取过程开始于分离步骤(步骤8811)。仪器被配置成等待预定的时间量(步骤8812)，然后触发洗脱步骤(步骤8813)。然后由算法指示仪器等待第二时间段(步骤8814)，然后开始信号处理以搜索IR温度信号的第一导数峰(步骤8815)。一旦找到第一导数峰，算法开始搜索第二导数峰(步骤8816)。一旦检测到第二导数峰，触发完成，并且通过停止通道内的电压/电流流动来完成洗脱步骤(步骤8817)。如果没有检测到第一或第二导数峰，则将算法配置为超时(步骤8818和8819)。
图88E示出了核酸提取过程的成功触发。在洗脱储器8821中由触发算法停止核酸的ITP浓缩带8822。温度迹线和电压迹线均根据预期在接近过程结束时显示典型两步上升(8823和8824)。图88F示出了失败的触发运行。大部分核酸8825移动通过期望的停止位置(洗脱储器8826)，然后停止在更下游(右侧)的储器中。相应的温度和电压迹线未显示典型的两步上升。在每条迹线中仅正确地显示了一个上升步骤。在发现第一导数峰之后，触发算法超时，并且未能触发运行结束，从而导致核酸8825超过了其目标储器8826。
尽管在本实施例中使用了温度迹线，但触发算法还可以仅依赖于电压迹线或者一起的电压和温度迹线以执行触发。
实施例17-样品中的慢迁移率离子改善通过毛细管屏障
图89A示出了在样品(在该情况下为在前导电解质中制备的样品)与前导电解质缓冲液之间的毛细管屏障8901，如图10A所示。在一些情况下，这样的毛细管屏障8901可以在(基于ITP的)提取过程期间捕获核酸。为了促进核酸通过这样的毛细管屏障8901，将较慢量级的迁移率的离子添加到样品中，以干扰核酸的积累(例如，在到达可能会阻止带通过的毛细管屏障8901之前添加到紧密聚焦的ITP带中)。这种干扰导致核酸形态的变化，并使核酸能够通过毛细管屏障8901而不损失核酸样品。图89B比较了添加慢速离子(14mM3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS))8902的核酸样品与对照8903(即，不添加慢速离子的相同样品)的通过。具有慢离子的样品成功通过了屏障。相反，对照通道8903示出了捕获在毛细管屏障8901处的核酸8904(被染色以使得其在ITP期间在通道中可视化)。图89C显示了在提取过程中稍后的某个时候的核酸形态。由于在对照通道中毛细管屏障导致的核酸捕获，因此与添加了MOPS的样品8902相比，对照样品8903在通道中包含更长的核酸“尾部”8905，如果在ITP过程停止时未形成明显的ITP带(或如果样品仍被捕获在毛细管屏障附近)，且将样品从洗脱孔洗脱，则可能导致在更下游的核酸损失，如本文所述。
实施例18-液-液界面移位以改善通过毛细管屏障
图89D示出了在前导电解质缓冲液与洗脱缓冲液之间的毛细管屏障8911。在一些情况下，毛细管屏障8911可以在洗脱过程期间(ITP期间)捕获核酸(NA)。为了促进通过，我们通过调节储器中的液体头部高度来调节前导电解质缓冲液与洗脱缓冲液之间的液-液界面位置，如图43和图44所述。图89E示出了调节缓冲液界面8912的示例。我们在洗脱缓冲液中掺入了荧光染料以使界面可视化。上方泳道8910示出了其中界面8912远离洗脱储器8913移动至屏障8911右侧的情况。下方泳道8920示出了其中界面8912朝向洗脱储器8913移动至屏障8911左侧的情况。当核酸从前导电解质缓冲液转变到洗脱缓冲液时，核酸的体积膨胀以适应离子强度变化，如本文所述。当这种膨胀发生在毛细管屏障8912通过之前(例如，在8910所示的位置)，一些核酸由于毛细管屏障可以允许通过的体积限制而被捕获。然而，当这种膨胀发生在毛细管屏障8912通过之后(例如，在8920所示的位置)，NA可以保持紧凑的形状，并且在无任何损失的情况下通过。图89F示出了如何通过调节界面8912位置来促进或妨碍核酸在毛细管屏障8911上的通过。上方泳道8910具有在毛细管屏障8911右侧的缓冲界面8912，并且下方泳道8920具有在毛细管屏障8911左侧的界面8912。一些核酸被捕获在上方泳道8910中的毛细管屏障8911处，而在下方泳道8920中的屏障8911处未观察到核酸，而是在洗脱储器8913中发现了核酸。
实施例19-在8通道流体设备中同时进行ITP
图31A、图31B、图31C和图31D示出了在流体设备的8个通道中同时进行等速电泳的结果。使用台式控制器装置从细胞培养裂解物中提取DNA，以在单片、8通道流体设备中使等速电泳自动化。将含有具有44mM HCl和0.002％吐温20的88mM Tris的前导电解质缓冲液装载到每个通道的前导电解质储器中。将包含具有0.3M己酸的1.2M Tris和具有0.002％吐温20的0.6M MOPS的尾随电解质装载到每个通道的尾随电解质储器中。每个通道的样品在包含具有5.6mM HCl与0.002％吐温20的10mM Tris的第二种前导电解质缓冲液(例如样品缓冲液)中制备。每种样品包含细胞裂解物。每个样品的人COLO 320细胞总数表示100,000个二倍体基因组当量。使细胞沉淀，并在包含40mM NaOH的裂解溶液中芯片外裂解2分钟，随后以1:1的体积比用缓冲的酸性溶液进行猝灭，以使最终的细胞裂解物样品加至pH 8的具有5.6mM HCl和20mM NaCl的10mM Tris。在细胞裂解物样品体积内添加蛋白酶K至最终浓度为400μg/ml。在200μg/ml的最终浓度下用RNA酶A处理8个样品中的4个，并使之在室温下静置2分钟。然后将全部八个样品在56℃下温育10分钟。然后将裂解的样品置于室温并装载到微流体设备上的单独的八个样品储器/通道中(用通道A至H表示)，以备进行等速电泳。将未用RNA酶A处理的四个样品装载到通道B、D、F和H中。将用RNA酶A处理的四个样品装载到通道A、C、E和G中。用RNA酶A处理的样品含有额外的缓冲液离子以实现最佳的RNA酶活性，因此在固定电流(ITP条件)下代表更高离子强度或更高电导率的样品，与未用RNA酶处理的样品相比产生不同的电压数据迹线。通道A至H的独立电路控制允许电压信号和反馈控制以用于设备的每个不同通道的自动控制和结束运行触发。图31A示出了在设备的样品通道区域中的8个样品的每一个中具有聚焦DNA 3101的ITP带的显微照片。DNA3101的ITP带响应于所施加的电场在通道内迁移。ITP带首先沿箭头3102所指示的方向远离尾随电解质储器。然后ITP带3101穿过180°低色散转向，并响应于所施加的电场沿相反方向(相对于芯片)3103继续朝向洗脱储器经过通道。图31B示出了对于8个通道中的每个通道在固定电流下随时间的独立电压信号数据。图31C示出了具有来自通过独立控制的基于运行结束电压的触发在洗脱储器中洗脱的样品的聚焦DNA 3101的相同8个ITP带的显微照片(该图像表示在电场自动关闭的情况下运行结束)。图31D是用于图31B中所示的触发的电压跟踪(监视)的放大部分。将每个通道的电流独立地施加到通道，并且独立地监测每个通道的电压，以便独立于每个其他通道触发施加到每个通道的电场的变化(在这种情况下停止)。
实施例20-芯片外裂解效率
图90A-图90C示出了如图32A所述进行裂解的三种不同细胞系的裂解效率。图90A示出了COLO320细胞的裂解效率。在悬浮细胞和贴壁细胞的混合物中培养COLO320细胞。图90B示出了GM24385细胞的裂解效率。GM24385细胞悬浮培养。图90C示出了H2228细胞的裂解效率。H2228细胞被培养为贴壁细胞。在图90A-图90C中的每个图中，收获细胞，并如本文所述裂解滴定量的细胞输入。图90A-图90C示出了将基于输入细胞数的理论产率与通过QubitdsDNA测定测量的观察产率相关联的散点图。校正细胞输入的倍性(COLO320＝2.27N；GM24385＝2Nl H222＝3.74N)，并且基于每细胞6.6pg DNA的假设来计算理论产率。图90A示出COLO320细胞的R2值为0.9407，图90B示出GM24385细胞的R2值为0.99997，并且图90C示出H2228细胞的R2值为0.98917，表明在类型的细胞和样品量的范围内，细胞输入与产率之间较强的线性关系(ITP之前)。
实施例21-温度感测和运行结束触发
图91A-图91B示出了使用红外热传感器来触发通道之一中的电流的减小或消除的示例性温度测量结果。该芯片是基本类似于图38所示的8通道芯片。图91A示出了在洗脱储器9102内的紧密带中的在ITP运行结束时成功停止的ITP带9101。图91B示出了由如图40定位的红外传感器随时间监测的每个通道内的温度。箭头9103指示ITP带9101到达红外传感器位置的时间。
实施例22-用于运行结束触发的电压和温度感测
图92A示出了所使用的样品通道到LE通道触发过程的框图。核酸提取过程始于分离步骤(步骤9201)。然后由算法指示仪器等待第一时间段(步骤9202)，然后开始信号处理，以搜索在样品通道与LE通道之间的毛细管屏障处的电压信号的第一导数峰(步骤9202)。一旦找到第一导数峰(步骤9203)，该算法就开始搜索在LE通道内的毛细管屏障后变窄的通道处的电压信号的第二导数峰。或者，如果未找到电压信号的第一导数峰，仪器将在第二时间段后超时(步骤9205)，并且算法将开始搜索电压信号的第二导数峰(步骤9204、9211)。
图92B示出了作为时间的函数，在样品通道与LE通道之间的毛细管屏障处的第一触发位置处的电压9206、电压导数9207和测量误差9208的迹线。
图92C示出了所使用的LE通道触发过程的框图。指示仪器搜索第二导数峰(步骤9204、9211)。算法指示仪器开始信号处理，以搜索在LE通道内的毛细管屏障后的变窄处的第二导数峰(如图40所示)(步骤9212)。一旦检测到第二导数峰，指示仪器开始使用通道的洗脱分支内的IR传感器搜索温度的第一导数峰(步骤9213、9221)。或者，如果未找到电压信号的第二导数峰，仪器将在第三时间段后超时(步骤9214)，并且算法将开始搜索温度的第一导数峰(步骤9213、9221)。
图92D示出了作为时间的函数，在LE通道内的毛细管屏障后的变窄处的第二触发位置处的电压9215、电压导数9216以及测量误差9217的迹线。
图92E示出了所使用的洗脱触发过程的框图。然后由算法指示仪器等待第四时间段，然后再开始信号处理(步骤9213、9221)，以搜索洗脱分支中温度信号的第一导数峰(步骤9222)。一旦找到第一导数峰，算法开始搜索洗脱分支中温度信号的第二导数峰(步骤9223)。或者，如果未找到温度的第一导数峰，仪器将在第五时间段后超时(步骤9224)。一旦检测到第二导数峰，触发完成，并且通过停止通道内的电压/电流流动来完成洗脱步骤(步骤9225)。如果未检测到第二导数峰，则将算法配置为在第六时间段后超时(步骤9226)。
图92F示出了在通道的洗脱分支内的温度触发位置处的电压9227、电压导数9228以及测量误差9229的迹线。
如本文所用，“一个”、“一种”和“该”可以包括复数的指示物，除非清楚地并明确地限定于一个指示物。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“或”用于指代非排他性的，或者诸如“A或B”包括“A但不B”、“B但不A”以及“A和B”。如本文所用，除非另有说明，否则术语“或”意指“和/或”。
除非另有说明，否则本文所用的术语“约”是指高于或低于该术语修饰的值不大于10％的值。例如，术语“约-20℃”意指-22℃至-18℃的范围。作为另一个实例，“约1小时”意指54分钟至66分钟的范围。
除非另有指示，否则本文所用的术语“基本”是指该术语所修饰的值上下不超过30％的值。例如，术语“基本-20℃”指-26℃至-14℃的范围。
除非另有指示，否则本文所用的术语“约”是指该术语所修饰的值上下不超过10％的值。例如，术语“约-20℃”指-22℃至-18℃的范围。作为另一示例，“约1小时”指54分钟至66分钟的范围。
除非另有指示，否则本文所用的术语“基本平坦”是指主要在一个平面内延伸而不是成形的表面，例如至少70％线性的表面。
除非另有指示，否则本文所用的术语“基本平行”是指很大程度上在与该术语所修饰的平面相同的方向上延伸的平面，例如与平行于该术语所修饰的值的平面轴偏移不超过30°的平面。例如，术语“基本平行于表面”指在平行于表面的平面的30°以内的平面。
除非另有指示，否则本文所用的术语“基本垂直”是指相对于在很大程度上垂直于(即，沿相对90°的平面)该术语所修饰的平面延伸的平面，例如与垂直于该术语所修饰的值的平面轴偏移不超过30°的平面。例如，术语“基本垂直于表面”指在垂直于表面的平面的30°以内的平面。
除非另有指示，否则本文所用的术语“与...相对对准”是指很大程度上与该术语所修饰的值在相同的方向延伸的值，例如沿与该术语所修饰的值轴偏离不超过30°的轴。例如，术语“与纵轴相对对准”指沿着在纵轴的30°以内的轴延伸。
尽管本文中已经示出并描述了本发明的优选实施方式，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方式仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将会想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本发明实施方式的各种替代方案可用于实施本发明。旨在以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (30)

1.一种包含等速电泳(ITP)回路的流体设备，所述ITP回路包括：
第一通道，其包括间隔开的第一毛细管屏障和第二毛细管屏障；
第一装载储器，该第一装载储器经由所述第一通道中的第一孔口与所述第一通道流体连通，其中所述第一孔口定位在所述第一毛细管屏障与所述第二毛细管屏障之间，以允许经由所述第一孔口进入所述第一通道的第一液体沿所述第一通道在一个方向上流动并停滞在所述第一毛细管屏障处，并且沿所述第一通道在另一方向上流动并停滞在所述第二毛细管屏障处；
一个或多个气动通道，该一个或多个气动通道在一个或多个气动端口处开口并与每个所述毛细管屏障连通；
具有第一面和第二面的基底，其中所述第一面包括多个储器，该多个储器包含所述第一装载储器和所述一个或多个气动端口，并且所述第二面包括多个通道，该多个通道包含所述第一通道，其中所述多个储器经由所述基底中的通孔与所述多个通道连通；
覆盖所述第二面的材料层，从而形成闭合的通道；以及
覆盖所述第一面的至少一部分并包含通孔的盖，所述通孔通过垫圈与所述第一面中的端口连通。
2.根据权利要求1所述的流体设备，其中经由所述第一孔口进入所述第一通道的所述第一液体沿着一路径流动到所述第一毛细管屏障或第二毛细管屏障，所述第一毛细管屏障或第二毛细管屏障比所述第一通道的宽度更长。
3.根据权利要求1所述的流体设备，其中经由所述第一孔口进入所述第一通道的所述第一液体流动，使得所述第一液体的弯液面停滞在所述第一毛细管屏障或所述第二毛细管屏障处，或停滞在所述第一毛细管屏障和所述第二毛细管屏障两者处。
4.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述第一毛细管屏障被配置和布置成在将第一破裂压力施加到一个或多个分支流体回路时被液体破坏，并且所述第二毛细管屏障被配置和布置成在将第二破裂压力施加到所述一个或多个分支流体回路时被所述液体破坏，其中所述第一破裂压力和所述第二破裂压力相等。
5.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述第一毛细管屏障被配置和布置成在将第一破裂压力施加到一个或多个分支流体回路时被液体破坏，并且所述第二毛细管屏障被配置和布置成在将第二破裂压力施加到所述一个或多个分支流体回路时被所述液体破坏，其中所述第一破裂压力大于所述第二破裂压力。
6.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述第一毛细管屏障和所述第二毛细管屏障中的一者或两者是悬崖毛细管屏障。
7.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述第一毛细管屏障和所述第二毛细管屏障中的一者或两者是平台毛细管屏障。
8.根据权利要求7所述的流体设备，其中所述平台毛细管屏障被配置和布置成使得在所述第一液体停滞在所述平台毛细管屏障处后并且在第二液体在另一方向上流向所述平台毛细管屏障并与所述第一液体相对地停滞在所述平台毛细管屏障处后，在所述第一液体与所述第二液体之间形成气隙。
9.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述ITP回路包含与所述第一通道流体连通的第二通道，并且所述第一毛细管屏障被配置和布置成在第二液体沿所述第二通道流动时停滞所述第二液体的流动，使得在所述第一毛细管屏障处在所述第一液体与所述第二液体之间形成液-液界面。
10.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述流体设备还包括具有第一面和第二面的基底，其中所述第一面包括多个储器，该多个储器包含所述第一装载储器，并且所述第二面包括多个通道，该多个通道包含所述第一通道，其中所述多个储器经由所述基底中的通孔与所述多个通道连通。
11.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述ITP回路还包括第二装载储器和第二通道，其中所述第二装载储器经由第二孔口与所述第二通道流体连通，并且所述第二通道包括第三毛细管屏障，其中所述第三毛细管屏障被配置和布置成利用毛细管力在所述第三毛细管屏障处停滞液体的弯液面沿所述第二通道的流动。
12.根据权利要求11所述的流体设备，其中所述ITP回路还包括经由第三孔口与第三通道流体连接的第三装载储器，其中所述第三通道与所述第二装载储器流体连接，其中所述第三通道包括定位在所述第二孔口与所述第三孔口之间的第四毛细管屏障。
13.根据权利要求12所述的流体设备，其中所述第一通道或第一装载储器包含样品缓冲液；所述第二通道或第二装载储器包含第一前导电解质缓冲液；或者所述第三通道或第三装载储器包含第二前导电解质缓冲液。
14.根据权利要求12所述的流体设备，还包含与所述第一通道流体连通且与所述第一毛细管屏障相邻的第四通道或第四装载储器，其中所述第四通道或第四装载储器包含尾随电解质缓冲液。
15.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述ITP回路包括在洗脱连接件与第一洗脱储器连接的洗脱通道。
16.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述ITP回路包括第一前导电解质缓冲液储器，该第一前导电解质缓冲液储器通过缓冲通道与第二前导电解质缓冲液储器连接，其中所述缓冲通道包含在一界面处相遇的第一前导电解质缓冲液和第二前导电解质缓冲液，一平台毛细管屏障位于该界面处。
17.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述第一毛细管屏障或所述第二毛细管屏障或这两者与空气通道相邻，该空气通道包含收窄件。
18.根据权利要求1所述的流体设备，还包含至少两个额外的ITP回路，每个额外的ITP回路包括等速电泳(ITP)分支，该等速电泳(ITP)分支包含第一装载储器和第一通道，其中所述第一装载储器经由第一连接件与所述第一通道流体连通，并且所述第一通道包括定位在所述第一连接件的任一侧的第一毛细管屏障和第二毛细管屏障，并且其中所述第一毛细管屏障被配置和布置成利用毛细管力在所述第一毛细管屏障处停滞液体的弯液面沿所述第一通道的流动，并且所述第二毛细管屏障被配置和布置成利用毛细管力在所述第二毛细管屏障处停滞所述液体的另一弯液面的流动。
19.根据权利要求1所述的流体设备，还包含至少五个额外的流体回路，每个额外的回路包括等速电泳(ITP)分支，该等速电泳(ITP)分支包含第一装载储器和第一通道，其中所述第一装载储器经由第一连接件与所述第一通道流体连通，并且所述第一通道包括定位在所述第一连接件的任一侧的第一毛细管屏障和第二毛细管屏障，并且其中所述第一毛细管屏障被配置和布置成利用毛细管力在所述第一毛细管屏障处停滞液体的弯液面沿所述第一通道的流动，并且所述第二毛细管屏障被配置和布置成利用毛细管力在所述第二毛细管屏障处停滞所述液体的另一弯液面的流动。
20.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述第一装载储器是样品储器，该样品储器被一可去除材料闭合。
21.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述一个或多个气动端口相对于所述基底的头部高度短于所述第一装载储器。
22.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述盖还包含定位在端口中的通孔之间的多孔、透气、疏水的材料。
23.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述第一通道是深度小于2mm或者体积为10μL至1ml的样品通道。
24.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述第一装载储器包含(a)在所述第一装载储器与所述基底邻接的区域中的圆锥形截面，以及(b)穿透所述基底的圆柱形通孔。
25.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述第一装载储器包括(a)在一端的用于环境空气的入口通道，以及(b)在所述第一装载储器的另一端穿透所述基底的孔口，其中所述第一装载储器具有截头圆锥形形状，其中所述截头圆锥形形状的较宽区域定位在用于环境空气的所述入口通道处，而较窄区域定位在穿过所述基底的所述第一孔口处。
26.根据权利要求1所述的流体设备，其中所述基底上的所述气动端口以1μm至1mm的深度插入到所述基底的所述第一面的表面中，或者以0μm至2mm的高度从所述基底的所述第一面的表面突出。
27.一种装载根据权利要求1所述的流体设备的方法，其中所述流体设备还包含第二通道或第二装载储器、第三通道或第三装载储器、第四通道或第四装载储器、第五通道或第五装载储器或第六通道或第六装载储器，并且所述方法包括将不同的缓冲液装载到所述第一通道或第一装载储器、所述第二通道或第二装载储器、所述第三通道或第三装载储器、所述第四通道或第四装载储器、所述第五通道或第五装载储器或所述第六通道或第六装载储器中。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述流体设备包含第一通道，该第一通道包括与一第二通道相邻的平台毛细管屏障，并且所述缓冲液的所述装载包括：将第一缓冲液装载到所述第一通道或储器中以及将第二缓冲液装载到所述第二通道或储器中；向所述流体设备施加第一正气动压力或第一负气动压力，使得第一缓冲液和第二缓冲液停滞在所述平台毛细管屏障内的斜坡基部，其中所述第一正气动压力或所述第一负气动压力的所述施加包括以固定的增量增大或减小所述第一正气动压力或所述第一负气动压力。
29.根据权利要求28所述的方法，还包括向所述流体设备施加第二正气动压力或第二负气动压力，使得所述第一缓冲液和所述第二缓冲液沿所述平台毛细管屏障的任一侧的斜坡流动，其中所述第二正气动压力或所述第二负气动压力的所述施加包括以固定的增量增大或减小所述第二正气动压力或所述第二负气动压力。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一缓冲液和所述第二缓冲液停滞在所述平台毛细管屏障的平台处且在它们之间具有气隙，所述气隙位于所述平台毛细管屏障的所述平台的上方或下方，并且所述方法还包括向所述流体设备施加第三正气动压力或第三负气动压力，使得第一液体和第二液体进入所述气隙，从而使得在所述平台毛细管屏障的所述平台的上方或下方的所述第一缓冲液与所述第二缓冲液之间形成液-液界面。
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