CN101460835A - 用于等电聚焦的分离设备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于分离、尤其是用于利用其中pH改变的方向被反向的“pH反向区域”的等电聚焦中的设备。

Description

用于等电聚焦的分离设备

技术领域

本发明涉及用于分离、尤其是用于生物分子的等电聚焦的设备领域。

背景技术

在生物分子的分离中，尤其是可能包含大量生物分子的样品的分离中，已知为等电聚焦(isoelectric focusing)的技术被广泛使用。在该分离技术中，使用大量具有限定pH的生物分子例如蛋白质，在该pH处生物分子是电中性的，而在该pH之下和之上生物分子带电。

通常，等电聚焦在具有连续改变的pH的设备中进行，尽管其中pH阶式改变的设备已经在例如WO 2004/036204 A2和US 20050150769中提出，在此以引用的方式将其内容加入本文。

然而，尤其是对于设计为以提供更加自动化的分离的分离设备，需要使生物分子在分离后所具有的位置是被限定的以易于分离的样品自动化读取。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种用于分离的设备，尤其是用于等电聚焦的分离设备，其中对于大多数应用，可以实现更加自动化的分离以及对分离样品的读取。

所述目的通过如本发明权利要求1所述的设备实现。相应地，提出用于分离、尤其是用于等电聚焦中的设备，其包含多个沿分离方向彼此相邻地设置的区域，所述设备包含至少一个pH反向区域(pH sink region)，在该pH反向区域中，pH值是恒定的或者与pH值增加或者降低的至少一个相邻区域相比，具有斜率符号不同的曲线。

应该注意到，在本发明的意义上，术语“分离”应作最广意义上的理解，并指和/或包括尤其是以下的一种或多种：

-通过吸收性差异用于分离混合物的方法，

-其中通过液体或者气体夹带的化学混合物被分离为各个组分的方法，这是作为溶质在静止的液相或固相周围或之上流动时溶质的不同分布的结果，

-用于分离物质混合物的各种技术，基于对于两种不同的介质，物质的相对亲和性的差异，一种(流动相)运动流体和另一种(静止相或吸附剂)多孔固体和/或凝胶和/或涂布于固体支持体上的液体，

-源于外力，特别是外部场和/或pH，如等电聚焦影响下不同的带电和/或质量的分离技术。

需要理解的是本发明的设备可以用于但不限于分离生物分子化合物，如但不限于核酸和相关化合物(例如，DNA、RNA、寡核苷酸或其类似物、PCR产物、基因组DNA、细菌人工染色体、质粒等)，蛋白质和相关化合物(如多肽、肽、单克隆或多克隆的抗体、可溶的或结合的受体、转录因子等)，抗原、配体、半抗原、碳水化合物和相关化合物(例如，多糖、低聚糖等)，细胞片段，如细胞膜片段、细胞器、完整细胞、细菌、病毒、原生质等。

通过使用所述设备，对于大多数应用，能够实现至少一种的如下优点：

-归因于提供有pH反向区域，生物分子将基本上不出现在该pH反向区域。这使得实现更好的自动化，因为设备中的区域，尤其是生物分子在进行分离后存在的设备的分离区域被限定了，这在大多数应用中使得易于分析自动化，

-由于该原因，该设备可以更好地安装在自动分析设备中，其例如可以应用在用于高筛选(screening)和高处理能力(throughput)分析的芯片上，

-因为存在很好限定的区域(pH反向区域)，其中基本上不出现生物分子，所述设备使得能够非常有效率地处理所有的生物分子，例如实现在分离通道中分离几乎100％的初始分析物材料以用于进一步分析或者实现非常有效率的分析，因为pH反向区域使得各传感器元件与分离区域匹配(并使pH反向区域和传感器的较不敏感区，即各个传感器元件之间的区域对齐)，

-对于本发明中的广范围的应用，具有等电聚焦点甚至非常接近的在一起的生物分子能够有效率地被分离(在单步设备中)，没有或者仅不显著的分析物材料的损失，

-本发明的设备可应用于广范围的应用，尤其是用于2D分离技术，

-本发明的设备实现在广范围内的应用，使得临床诊断工具非常有效，其甚至对于非常少量的分析物也是快速和可靠的。在这样的应用中，分析物的体积通常是有限的(例如患者的血样)。而且，分析时间是非常关键的参数。即使非常少量的专用蛋白质(或者例如标识某一病原体的其它分子)必须被检测，

-本发明的设备使得广范围的应用以在单次运行中进行定量分析。

根据本发明的一个优选实施方式，所述设备包含多个pH反向区域。

根据本发明的一个优选实施方式，所述设备包含顺次的区域，其中pH反向区域之后是分离区域，分离区域尤其是指和/或包括其中在分离后可以存在生物分子的区域。

应该注意到，根据本发明内的大多数应用，分离区域中的pH的斜率将在符号上不同于在pH反向区域中的斜率。

根据本发明不同的优选实施方式，所述设备包含顺次的区域，其中pH反向区域之后是过渡区域，然后是分离区域，其中在本发明的意义上，过渡区域尤其是指和/或包括在分离方向上紧跟pH反向区域设置并在分离时基本不含分析物的区域。

应该注意到，在该过渡区域中，pH的斜率在符号上可以不同于在pH反向区域的斜率(尽管这不是必须的)；但是，引入该过渡区域已经显示在本发明内的广范围的应用中可进一步提高本发明内的广范围的应用中的分离质量，因为pH反向区域的长度可以降低。

在本发明内的大多数应用中，在存在所述过渡区域的情况下，在过渡区域中的pH的斜率在符号上将不同于在pH反向区域中的斜率。

根据本发明的一个优选实施方式，pH反向区域的长度为两个相邻的分离区域的长度的平均值的≥2％和≤200％。这对于本发明中的大多数应用实现紧凑设计。

应该注意到，术语“相邻”并不必然意味着pH反向区域在两个分离区域之间是直接相邻的，因为如上所述在pH反向区域和分离区域之间还可以有过渡区域。

根据本发明的一个优选实施方式，pH反向区域的长度是两个相邻的分离区域的长度的平均值的≥5％和≤100％。

根据本发明的一个优选实施方式，pH反向区域的长度是两个相邻的分离区域的长度的平均值的≥10％和≤50％。

根据本发明的一个优选实施方式，pH反向区域的长度(在等电聚焦过程中在生物分子流动的方向)是≥1μm和≤500μm。这对于本发明中的大多数应用实现紧凑设计。

根据本发明的一个优选实施方式，pH反向区域的长度是≤100μm。

根据本发明的一个优选实施方式，pH反向区域的长度是≤50μm。

应该注意到，根据本发明的一个优选实施方式，在设备中存在数个pH反向区域的情况中，pH反向区域的长度可以相等或者基本相等，根据另一优选实施方式，pH反向区域的长度彼此不同。

应该注意到，根据本发明的一个优选实施方式，分离区域的长度可以相等或者基本相等，根据另一实施方式，分离区域的长度彼此不同。

根据一个优选实施方式，在各个单一的分离区域中的pH的差值(pH增加或者降低的梯度的最大值减去最小值(highest minus lowest pH increasingor decreasing gradient))是≥0.05和≤4.0。

根据一个优选的实施方式，在各个单一的分离区域中的pH的差值(pH增加或者降低的梯度的最大值减去最小值)是≥0.1和≤2.0。

根据一个优选的实施方式，在各个单一的分离区域中的pH的差值(pH增加或者降低的梯度的最大值减去最小值)是≥0.1和≤1.0。

根据本发明的一个优选实施方式，对于所有的分离区域，在分离区域中的pH的平均差值相等或者基本相等，而根据本发明的另一优选实施方式，对于不同的分离区域，分离区域中的pH的平均差值不同。

根据本发明的一个优选实施方式，对于所有的pH反向区域，在pH反向区域中的pH平均差值是相等或者基本相等的，而根据本发明的另一优选实施方式，对于不同的pH反向区域，在pH反向区域中的pH的平均差值是不同的。

根据本发明的一个优选实施方式，所述设备包含至少一个开始区域，其设置在pH反向区域和分离区域两者之前(根据分离方向)。

在实践中已经表明，这样的开始区域可以提高分离质量。

根据本发明的一个优选实施方式，在分离之后，pH反向区域基本不含分析物。

术语“基本上”是指和/或包括样品中的所有分析物小于3重量％，优选小于1重量％，更加优选小于0.1重量％。

根据本发明的一个优选实施方式，具有pH反向区域位于两个相邻的分离区域之间的具有增加(或者降低)的pH的所述相邻分离区域的数量是≥2和≤100。

对于广泛围的应用，这实现在单次运行中进行分析。

根据本发明的一个优选实施方式，具有pH反向区域位于两个相邻的分离区域之间的具有增加(或者降低)的pH的所述相邻分离区域的数量是≥20。

根据本发明的一个优选实施方式，具有pH反向区域位于两个相邻的分离区域之间的具有增加(或者降低)的pH的所述相邻分离区域的数量是≥50。

根据本发明的一个优选实施方式，所述区域设置在基底材料中，所述基底材料包含由至少一种双官能团的单体和至少一种多官能团(f>2)的单体聚合形成的聚丙烯酸系材料。

根据一个实施方式的所述单体选自如下的范围以使得由其形成的聚合物易于吸水以形成膨胀介质。

根据本发明的一个实施方式，丙烯酸系单体选自丙烯酰胺，尤其是异丙基丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、丙烯酸、羟乙基丙烯酸酯、乙氧基乙氧基乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酸或者其混合物。

根据本发明的一个实施方式，多官能团的丙烯酸系单体是双丙烯酰基和/或三丙烯酰基和/或四丙烯酰基和/或五丙烯酰基单体。

根据本发明的一个实施方式，多官能团单体选自N，N-亚甲基二丙烯酰胺、二乙二醇二丙烯酸酯、三乙二醇二丙烯酸酯、四乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯、三丙二醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯或者其混合物。

根据本发明的一个优选实施方式，多官能团丙烯酸系单体混合物包含至少一种pH设定单体(pH setting monomer)。

根据本发明的一个优选实施方式，所述至少一种pH设定单体选自丙烯酸、缓冲剂的丙烯酸氨基衍生物或者其混合物。在实践中已经表明这些材料最适于本发明中的广范围的应用。

根据本发明的一个优选实施方式，所述设备包含至少一个pH设定层以调节pH反向区域和分离区域中的pH。

根据本发明的一个优选实施方式，pH设定层包含选自如下的材料：聚合有机酸(例如丙烯酸或者丙烯磺酸)、聚合有机胺、吡啶或者其混合物。在实践中已经表明这些材料最适于本发明中的广范围的应用。

根据本发明的一个优选实施方式，所述区域设置在基底材料中，所述基底材料包括聚碳水化合物材料，尤其包括3，6-去水半乳糖和D-半乳糖。

根据本发明的一个优选实施方式，所述设备还包含自动分析器和多个pH反向区域，其中pH反向区域和/或分离区域的宽度适合于自动分析器的形状。

根据本发明的一个优选实施方式，自动分析器是CCD摄像机。CCD摄像机是用于记录图像的传感器，由包含连接或者耦合的电容器(像素)阵列的集成电路组成。在外电路的控制下，每个电容器可以转移其电荷至其相邻的一个电容器或者其它电容器，从而最终提供初始给每一个像素充电的光强度的信息。电容器阵列形成例如以水平行ph和竖直列pv组成的1280 x1024像素的矩阵。

根据本发明的一个优选实施方式，自动分析器包含至少一种选自如下的传感器：光学传感器、磁传感器、电传感器、电容传感器。在广范围的应用中，这些传感器已经在实践中得以确认。

根据本发明的一个优选实施方式，pH反向区域和/或分离区域的宽度适于包含分离通道和/或分离方向的分离介质。

所述分离介质例如公开在EP 05111940中，在此以引用的方式加入本文中。

本发明还涉及产生分离区域、pH反向区域和/或过渡区域的方法，其包括以下步骤：

a)提供具有逐渐增加和/或降低的pH的第一分离区域，

b)通过增加pH设定装置，尤其是实现pH设定层，在分离区域中引入pH反向区域和/或过渡区域。

根据本发明的一个优选实施方式，通过选择两种缓冲剂，尤其是溶于丙烯酰胺中的丙烯酰胺基缓冲剂，优选地具有亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，并沿分离区域连续改变缓冲剂之间的比例而提供分离区域。

优选地，分离区域以如下方式制造，将在丙烯酰胺溶液中的丙烯酰胺缓冲剂梯度流延至交联为塑性支撑薄膜的平板凝胶中，洗去形成分离区域的凝胶，以除去聚合副产物并且之后凝胶被干燥以存储。在分离区域中的任何点上的pH可以通过在该位置交联为凝胶的缓冲剂混合物确定。

根据一个优选实施方式，步骤b)通过印刷，优选喷墨印刷酸性和/或碱性分子至分离区域的选择的部分上，优选地以条纹的形式而提供。

根据另一个优选实施方式，步骤b)如下提供，即通过首先在分离区域中加入光酸产生剂然后通过透过灰度掩模照射分离区域引入pH反向区域和/或过渡区域，从而导致区域中的pH变化，其中所述掩模是可渗透的。

本发明还涉及产生分离区域、pH反向区域和/或过渡区域的方法，包括：选择两种缓冲剂，尤其是溶于丙烯酸胺中的丙烯酰氨基缓冲剂，优选地具有亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，并连续改变缓冲剂之间的比例以产生分离区域、pH反向区域和/或过渡区域。

这避免了上述方法中的步骤b)，并且因此在本发明的广范围的应用中的应用；但是，已经表明，本方法是更加有利的以提供更加平滑的pH-梯度斜率，而上面的方法更适用于引入pH更陡的斜率。

根据本发明的设备可以用于广泛的体系和/或应用中，其中的一种或多种是：

-用于分子诊断的生物传感器，

-在复杂生物混合物，如血液或唾液中快速和灵敏地测定蛋白质和核酸，

-用于化学、医药学或分子生物学的高处理量的筛选设备，

-用于原位测试(医院中)、用于中心实验室或科研中的诊断，用于例如在犯罪学中对于DNA或蛋白质的测试设备，

-对于心脏病学、传染病和肿瘤学、食物和环境诊断的用于DNA或蛋白质诊断的工具，

-用于组合化学的工具，

-分析设备。

前述组分、权利要求书中的组分以及在上述实施方式中描述的本发明的所用的组分不限于尺寸、形状、材料选择和技术观点，相关领域中已知的选择标准可以不受限制地运用。

附图说明

本发明目的的其它细节、特征、特性和优点将在从属权利要求、附图和下述的附图解释和实施例中说明，以举例的方式显示了本发明分离介质和设备的几个优选实施方式。

图1显示根据本发明的第一实施方式的设备的分离区的示意性的顶部视图；

图2显示根据本发明的第二实施方式的设备的分离区的示意性的顶部视图；

图3显示根据本发明的第三实施方式的沿分离方向的pH梯度的示意性的图表；

图4显示根据本发明的第四实施方式的沿分离方向的pH梯度的示意性的图表；和

图5显示根据本发明的第五实施方式的沿分离方向的pH梯度的示意性的图表。

图1显示根据本发明的第一实施方式的设备1的分离区的示意性顶部视图。在该分离区中，分离区域10和pH反向区域20交替地沿分离方向排列(其在图1中从左至右)。如示意性地由“pH”曲线表明的，pH在分离区域10中升高，而在pH反向区域20中降低。

设备1还包含开始区域30，其中样品在分离之前被注入。

结果是，在进行分离之后，生物分子将不存在于pH反向区域20中，而仅存在于分离区域10中。

应该注意到，在图1中，pH反向区域20和分离区域10的宽度有些类似；但是，在大多数应用中，情况将会不同，pH反向区域20的宽度与分离区域10的宽度相比小很多。

应该进一步注意到，在图1中，一些pH值会在设备1的分离区中“双次”出现或者甚至多次出现。但是，本领域技术人员将容易明白这没有问题，在于归因于存在分离方向的事实，对于每个pH仅有一个其中生物分子将“结束”的位置。

为了提高分离的质量，应当注意到，尤其是当分离技术是等电聚焦时，可以施加外部电场(在附图中没有示出)。

图2显示根据本发明的第一实施方式的设备1的分离区的示意性顶部视图。该设备适于2D分离并包含分离区域10和pH反向区域，其适于在壁40和通道50之间(adapted to walls 40 and channels 50 in between)。该结构例如从EP 05111940已知，其内容在此以引用的方式加入本文。

在该实施方式中的样品被注入开始区域30(用“X”标识)。然后，进行基于pH的第一分离，例如等电聚焦，其中在该实施方式中分离方向是从右到左，也就是与图1的设备相反。

结果，样品中的所有分析物将布置在通道之前，因为分离区域10适于壁40(adapted to the walls 40)。在第二步的分离中(其例如可以是SDS-PAGE)，分析物可以仅在通道50内部移动，其允许对于广范围的应用具有高得多的分离度。

还应当注意到，根据另一优选实施方式(在附图中没有示出)，通道可以具有类似“井”状的结构。类似于此的结构例如在EP 05111940中公开并对于本发明的广范围的应用具有用光学和/或机械传感器的很大程度的可读性。

图3显示根据本发明的第三实施方式的沿分离方向(其用“x”表示)的pH梯度的示意性图表。

在图3中，可以清楚地看出，沿着从左到右的分离方向，连续设置分离区域10、pH反向区域20和过渡区域25，之后是下一个分离区域10。

应该注意到，在图3中，尽管pH反向区域的长度与分离区域相比相当短，由于存在过渡区域25，没有或者基本没有生物分子的区域的长度与分离区域的长度的比例为约20％。

图4显示根据本发明的第四实施方式的沿分离方向(其用“x”表示)的pH梯度的示意性图表，图5显示根据本发明的第五实施方式的沿分离方向(其用“x”表示)的pH梯度的示意性图表。

在图4-5的实施方式中，pH曲线是相同的，但是，在图4中，分离方向是从左到右，而在图5中，其是从右到左，也就是，在相反方向。

在图4和5中，也可以清楚地看出，沿着分离方向，连续地设置分离区域10、pH反向区域20和过渡区域25，之后是下一个分离区域10。但是，在图4的实施方式中，没有或者基本没有生物分子的区域(也就是区域20和25)的长度与图5的相比长很多，其表明在本发明中通过改变分离方向有可能很大程度上改变分离条件。

上述具体实施方式中的组成和特性的特定结合仅是示例性的，在此可以用其它的教导互换和替换这些教导，并且本发明还包括通过引用加入本文的专利/申请。在不背离本发明的精神和范围下，本领域技术人员会认识到在此描述的各种改变、改进和其它的实施方式。因此，前述的说明书仅是示例性的而不是限制性的。本发明的范围由权利要求书及其等同内容所限定。而且，本说明书中所用的附图标记并不限制本发明的范围。

Claims (10)

1.用于分离、尤其是用于等电聚焦中的设备，其包含多个沿分离方向彼此相邻设置的区域，所述设备包含至少一个pH反向区域，在该pH反向区域中，pH值是恒定的或者与pH值增加或者降低的至少一个相邻区域相比，具有斜率符号不同的曲线。

2.如权利要求1所述的设备，其中，所述设备包含顺次的区域，其中pH反向区域之后是分离区域，分离区域尤其是指和/或包括在所述分离之后其中可以存在生物分子的区域。

3.如权利要求1或2所述的设备，其中，所述设备包括顺次的区域，其中pH反向区域之后是过渡区域，随后是分离区域，其中在本发明意义上的过渡区域尤其是指和/或包括沿分离方向紧跟在pH反向区域之后提供并在分离后基本不含分析物的区域。

4.如权利要求1-3中任一项所述的设备，其中，所述pH反向区域的长度是两个相邻的分离区域的长度的平均值的≥5％和≤100％。

5.如权利要求1-4中任一项所述的设备，其中，在各个单一的分离区域中的pH的差值(pH增加或降低的梯度的最大值减去最小值)是≥0.05和≤4.0。

6.如权利要求1-5中任一项所述的设备，其中，所述设备包含至少一个设置在所述pH反向区域和所述分离区域两者之前(根据所述分离方向)的开始区域。

7.如权利要求1-6中任一项所述的设备，其中，所述区域设置在基底材料内，所述基底材料包含由至少一种丙烯酸系单体和至少一种多官能团的丙烯酸系单体聚合形成的聚丙烯酸系材料。

8.如权利要求1-7中任一项所述的设备，其中，所述多官能团丙烯酸系单体包含至少一种pH设定单体。

9.如权利要求1-8中任一项所述的设备，其中，所述设备还包含自动分析器和多个pH反向区域，其中所述pH反向区域的宽度适合于所述自动分析器的形状。

10.包含如权利要求1-9中任一项所述的设备的体系，其用于如下一种或多种应用中：

-用于分子诊断的生物传感器，

-在复杂的生物学混合物如血液或唾液中快速且灵敏地检测蛋白质和核酸，

-用于化学、药物学或分子生物学的高处理量的筛选设备，

-用于原位测试(在医院中)、用于中心实验室或科学研究中的诊断，用于例如在犯罪学中对于DNA或蛋白质的测试设备，

-对于心脏病学、传染病和肿瘤学、食物和环境诊断的用于DNA或蛋白质诊断的工具，

-用于组合化学的工具，

-分析设备。

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