CN111362927A

CN111362927A - 界面靶向型线粒体探针及其制备方法和应用

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Publication number: CN111362927A
Application number: CN202010292603.9A
Authority: CN
Inventors: 徐景坤; 张革; 刘芳; 李斐; 张新新
Original assignee: Jiangxi Science and Technology Normal University
Current assignee: Jiangxi Science and Technology Normal University
Priority date: 2020-04-16
Filing date: 2020-04-16
Publication date: 2020-07-03

Abstract

本发明公开了一种界面靶向型线粒体探针及其制备方法和在活细胞和组织中的应用，属于线粒体荧光探针技术领域。上述界面靶向型线粒体探针结构式如下：

其化学名称为：(E)‑4‑(2‑(7‑二乙氨基‑香豆素)乙烯基)‑1‑十二烷基吡啶碘盐；命名为：CVP‑12。本发明的界面靶向型线粒体探针具有免洗特性、高选择性、良好的生物相容性、优越的膜通透性和较低的细胞毒性，在生物标记领域具有良好的应用前景。

Description

界面靶向型线粒体探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及线粒体荧光探针技术领域，特别是指一种界面靶向型线粒体探针及其制备方法和在活细胞和组织中的应用。

背景技术

作为细胞内半自主的细胞器，线粒体不但可以为细胞提供能量，还参与细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，且可以调控细胞生长和细胞周期。所以线粒体功能紊乱会造成多种疾病，例如帕金森氏病和老年痴呆症。一般来说功能紊乱的线粒体靠自噬来清除，以达到保持细胞健康的目的。因此，检测线粒体动态以及线粒体自噬过程对于我们了解微观生理变化以及线粒体相关的疾病有重要帮助。

开始，人们利用电子显微镜和放射性同位素标记蛋白来观察线粒体，但是这些方法不适用于活细胞。为了解决这一问题，具有简单操作、高灵敏度和可实时观测性质的荧光方法出现了。接着，大量的荧光探针被开发出来用来成像线粒体和追踪其自噬过程。传统的线粒体探针含有阳离子盐，通过静电作用靶向线粒体。但是这类探针极易受线粒体膜电位(MMP) 影响，也就是说MMP一旦变化，这类探针很容易从线粒体上脱离，无法继续追踪线粒体。后来研究者们在探针上引入苄氯，利用苄氯跟线粒体蛋白上的巯基反应使得探针能够长久的附着在线粒体上以达到长期追踪线粒体的目的。但是，这类探针必须反应掉线粒体的蛋白质，这会对线粒体或者说细胞造成伤害，也无法真正用于活细胞。因此，设计一种可靠的靶向策略用于构建可长期追踪线粒体及其自噬过程的探针，并以此阐明分子结构与靶向之间的关系具有很大的创新性，这对于推动荧光探针在实际中的应用具有至关重要的意义。

专利CN109293632A公开了一种含十二碳烷基链的非反应型线粒体追踪荧光探针及其在标记或显示线粒体在细胞中分布，和在线粒体自噬观测中的应用；所述荧光探针是咔唑吡啶盐类化合物。该荧光探针能够在正常的活细胞中染色线粒体，尤其是在线粒体膜电位降低或消失时，仍然可以固定在线粒体上，表明该探针能够追踪线粒体的动态变化。该探针也具有较好的双光子性质，能够用于深层组织成像。该探针具有低毒性，并能够实时追踪线粒体自噬的动态过程。但因制备的咔唑吡啶盐类化合物具有较高的荧光背景，在进行荧光观察之前需要进行洗涤，以此获得较好的细胞成像。

发明内容

为解决现有技术中的不足，本发明提供一种界面靶向型线粒体探针及其制备方法和在活细胞和组织中的应用，本发明的界面靶向型线粒体探针具有免洗特性、高选择性、良好的生物相容性、优越的膜通透性和较低的细胞毒性，在生物标记领域具有良好的应用前景。

为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：

一方面，本发明提供一种界面靶向型线粒体探针，所述界面靶向型线粒体探针结构式如下：

其化学名称为：(E)-4-(2-(7-二乙氨基-香豆素)乙烯基)-1-十二烷基吡啶碘盐；命名为：CVP-12。

另一方面，本发明还提供一种界面靶向型线粒体探针的制备方法，包括：

步骤1：7-二乙氨基-香豆素的合成：利用4-(二乙氨基)水杨醛和丙二酸二乙酯反应生成7-二乙氨基-香豆素；

步骤2：7-二乙氨基-香豆素-3-甲醛的合成：将上述步骤1制备的7- 二乙氨基-香豆素与POCl₃反应，然后层析分离得到7-二乙氨基-香豆素-3- 甲醛；

步骤3∶1-十二烷基-4-甲基吡啶碘盐的合成：利用4-甲基吡啶与1-碘十二烷反应得到1-十二烷基-4-甲基吡啶碘盐；

步骤4：CVP-12的合成：将步骤2制备的7-二乙氨基-香豆素-3-甲醛与步骤3制备的1-十二烷基-4-甲基吡啶碘盐通过Knoevenagel反应得到之中产物。

进一步的，所述步骤1具体为：将4mmol 4-(二乙氨基)水杨醛和10 mmol丙二酸二乙酯溶于30mL无水乙醇，加入1mL哌啶；上述混合物在80℃搅拌6h；然后除去乙醇，加入20mL浓盐酸和20mL冰醋酸；然后将上述溶液在120℃下搅拌回流10h，冷却至室温后，倒入50mL 冰水；随后，用1.0mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH至5.0；将混合物过滤后得到固体，然后将固体溶于少量二氯甲烷中；然后再加入大量正己烷萃取得到产物。

进一步的，所述步骤2具体为：将三颈烧瓶置于0℃冰浴中，加入 10mL DMF，然后滴加POCl₃，搅拌30min；然后将0.43g 7-二乙氨基- 香豆素溶于10mL CHCl₃，上述溶液转移至烧瓶中。将烧瓶置于油浴中， 75℃回流12h；用二氯甲烷溶解得到的棕色溶液；通过柱层析法分离得到最终产物。

进一步的，所述步骤3具体为：将10mmol 4-甲基吡啶和10mmol 1- 碘十二烷溶于20mL甲苯中；产生淡黄色粉末沉淀时，混合物在120℃ 下加热12小时；反应结束后，将产物加入二氯甲烷完全溶解，然后向混合物中倒入大量石油醚，生成大量白色固体即为产物。

进一步的，所述步骤4具体为：将1mmol 1-十二烷基-4-甲基吡啶碘盐溶于乙醇中，加入1mmol 7-二乙氨基-香豆素-3-甲醛，充分搅拌，然后加入8滴哌啶，溶液逐渐变红色，回流反应12小时，通过柱层析法分离得到红色固体即为界面靶向型线粒体探针。

本发明选择量子产率高和光学稳定性好的香豆素作为荧光团；吡啶盐的选择是为了使分子靶向线粒体，并且吡啶盐类化合物光稳定性很好；为了快速染色、长期追踪线粒体而不受MMP的影响，引入了C12长烷基链，通过界面作用增强分子与线粒体的结合力；然后通过Knoevenagel反应得到最终产物-一种吡啶盐类化合物。

上述吡啶盐类化合物的制备反应式如下：

再一方面，本发明还提供一种上述界面靶向型线粒体探针在标记或显示线粒体在活细胞和组织中分布的应用。

优选的，所述活细胞为永生化细胞。

优选的，所述永生化细胞为HeLa和MCF-7细胞。

优选的，所述组织为骨骼肌组织。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

相对其他溶剂，本发明的吡啶盐类化合物在水中有低的荧光量子产率，这是聚集荧光猝灭(ACQ)效应导致的。CVP-12的这一物理特性对于降低细胞培养基或细胞质中的背景荧光是非常必要的，使得CVP-12能够免洗、高保真地成像细胞或组织中的线粒体。具有良好通透性的CVP-12 对线粒体进行染色不受MMP的影响，它可以实时、长期地追踪活细胞中的线粒体和线粒体自噬过程，并能成像组织中的四种线粒体。CVP-12成功证明了界面靶向模型是设计高选择性线粒体探针的有效策略。与其功能相近的线粒体荧光探针相比，本发明所述界面靶向型线粒体探针具有免洗特性、高选择性、良好的生物相容性、优越的膜通透性和较低的细胞毒性，在生物标记领域具有良好的应用前景。

本发明所述界面靶向型荧光探针可以在活细胞和组织中高选择性标记线粒体，并且不受MMP影响。为线粒体相关的病理学研究提供了快速、便捷、直观的生物检测试剂。也预示本发明所述分子作为界面靶向型线粒体荧光探针具有广泛的应用。

附图说明

图1：(a)CVP-12对活性HeLa细胞染色后的实时伪彩色图像；(b)探针CVP-12在肌肉组织中的Z-stack伪彩色图像；(c)单个肌肉组织相应的三维重建图像，显示不同线粒体的空间关系。λ_ex＝473nm，λ_em＝540-640 nm。

图2：用1μM CVP-12和200nM MTDR(商业化线粒体追踪红探针) 先后培养10min后的活性MCF-7和HeLa细胞的伪彩多色图像以及 CVP-12和MTDR在相应细胞中的共定位系数。CVP-12，λ_ex＝473nm，λ_em＝540-640nm；MTDR，λ_ex＝635nm，λ_em＝650-750nm。比例尺＝10μm。

图3：用1μM CVP-12和200nM MTDR先后培养10min后活的、经 CCCP处理的、固定的HeLa细胞的伪色多色图像。合并后的图像数字为 CVP-12和MTDR的共定位系数。CVP-12，λ_ex＝473nm，λ_em＝540-640nm； MTDR，λ_ex＝635nm，λ_em＝650-750nm。比例尺＝10μm。

图4：用5μM CVP-12和5μM Hoechst33342染色后骨骼肌组织中线粒体的形态图。骨骼肌组织在(a)20×、(b)40×、(c)60×放大倍数时的共焦荧光图像；(d)图(c)中框选部分的放大图。CVP-12，λ_ex＝473nm，λ_em＝ 540-640nm；Hoechst33342，λ_ex＝405nm，λ_em＝420-460nm。比例尺＝20 μm。

图5：(a)经10μM CCCP和7.5μM胃蛋白酶抑制剂处理后，用CVP-12 和LTDR(商业化溶酶体追踪红探针)染色HeLa细胞的不同时间点的共染图片。比例尺＝20μm；(b)活性HeLa细胞中CVP-12和LTDR在不同时间点的共定位系数图。

图6：(a)不同浓度的CVP-12和MTDR培养12小时后HeLa细胞的存活率；(b)用1μMCVP-12和200nM MTDR培养不同时间后HeLa细胞的存活率。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。

实施例及对比例中所用试剂及材料，如无特殊说明，均可经过商业途径得到。

本发明提供一种界面靶向型线粒体探针及其制备方法和在活细胞和组织中的应用，具体实施例如下。

实施例1

一种界面靶向型线粒体探针的制备方法，包括：

(1)7-二乙氨基-香豆素的合成：将4mmol 4-(二乙氨基)水杨醛(0.77g) 和10mmol丙二酸二乙酯(1.6g)溶于30mL无水乙醇，加入1mL哌啶。上述混合物在80℃搅拌6h。除去乙醇后，加入20mL浓盐酸和20mL 冰醋酸。将上述溶液在120℃下搅拌回流10h。然后将混合液冷却至室温，倒入50mL冰水。随后，用1.0mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH至5.0。将混合物过滤后得到固体，然后将固体溶于少量二氯甲烷中。再加入大量正己烷得到产物，产率90％。

(2)7-二乙氨基-香豆素-3-甲醛的合成：将三颈烧瓶置于0℃冰浴中，加入10mLDMF。滴加POCl₃，搅拌30min。然后将0.43g 7-二乙氨基- 香豆素溶于10mL CHCl₃，上述溶液转移至烧瓶中。将烧瓶置于油浴中， 75℃回流12h。用二氯甲烷溶解得到的棕色溶液。柱层析法分离得到最终产物，产率85％。

(3)1-十二烷基-4-甲基吡啶碘盐的合成：将10mmol 4-甲基吡啶(1mL) 和10mmol1-碘十二烷(2.96g)溶于20mL甲苯中。当有淡黄色粉末沉淀时，混合物在120℃下加热12小时。反应结束后，将产物加入二氯甲烷完全溶解。然后向混合物中倒入大量石油醚，生成大量白色固体，产率 85％。

(4)CVP-12的合成：将1mmol 1-十二烷基-4-甲基吡啶碘盐(0.389g) 溶于乙醇中，加入1mmol 7-二乙氨基-香豆素-3-甲醛(0.245g)，充分搅拌。加入8滴哌啶，溶液逐渐变红色。回流反应12小时，柱层析法分离得到红色固体，产率78％。

对上述制备的红色固体进行核磁检测，结果为：¹H NMR(400MHz，CDCl₃) 6(ppm)：8.84(d，J＝8.0Hz，2H)，8.22(d，J＝4Hz，1H)，8.12(d，J＝4.0Hz，2H)，7.86(d，J ＝4.0Hz，1H)，7.79(d，J＝16Hz，1H)，7.48(d，J＝8.0Hz，1H)，6.69(t，J＝8.0Hz，1H)， 6.52(s，1H)，4.68(t，J＝6.0Hz，2H)，3.485(q，J＝6.7Hz，4H)，1.99-2.06(m，2H)，1.35(d，J ＝20.0Hz，4H)，1.26-1.32(m，20H)，0.89(t，J＝6.0Hz，3H).¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)， δ(ppm)：160.42，156.83,154.61，152.36，146.47，143.37，138.41，130.93，123.98，122.45， 114.16，109.95，109.19，96.74，60.9，45.16，31.89，31.60，29.58，29.50，29.36，29.32，29.07，26.11，22.67，14.12，12.54.HRMS(m/z)：calculated 489.33；found：489.89.C₃₂H₄₅N₂O₂ ⁺，证明成功制备CVP-12。

实施例2细胞(HeLa和MCF-7)培养和染色

所有的细胞株都是在37℃ 5％CO₂的饱和湿度孵箱中培养。细胞株培养于内含10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素和链霉素的H-DMEM培养基中。将CVP-12溶解在DMSO溶液中配成浓度为0.1mM的储存液。活细胞染色实验，37℃下，在培养基中将生长于玻璃盖玻片中的培养细胞用1μM CVP-12染色10分钟，然后用荧光显微镜成像。

实施例3 CVP-12染色HeLa细胞和肌肉组织的膜通透性实验

对于外来的有机探针，由于膜结构对进入细胞的物质有严格的选择性，所以它们的自传递能力通常很弱。探针的膜通透性是成像细胞和组织的一个重要参数，本发明对CVP-12的通透性进行了测试。如图1a所示， CVP-12可3min成像线粒体，表明探针可在短时间内进入活性HeLa细胞。然后，本发明通过探针成像深度进一步测试了CVP-12在组织中的通透性。 30min后，通过组织光学切片获得图像(图1b)，并获得计算机生成的三维重建图像(图1c)。深度为52μm时仍可明显地检测到线粒体的荧光信号，并且没有背景噪音。以上结果表明，CVP-12在活细胞和组织中具有良好的通透性。

实施例4 CVP-12和MTDR对HeLa细胞/MCF-7细胞的复染实验

为了进一步确认CVP-12的选择性，本发明使用商业化的线粒体探针MTDR与CVP-12进行共定位实验。首先分别以DMSO为溶剂配置0.1mM MTDR和CVP-12的溶液。HeLa细胞先在0.2μM MTDR中染色10min，洗涤后然后再在1μM CVP-12中染色10min。不用洗涤直接在FV-1200荧光显微镜直接观察细胞。如图2所示，CVP-12的绿色(伪色)与MTDR的红色 (伪色)重叠良好，在MCF-7和HeLa细胞中的共定位系数分别为0.85和 0.91，说明CVP-12可以选择性成像活细胞中的线粒体。

实施例5 CVP-12和MTDR对活的/经CCCP处理的/固定的HeLa细胞的复染实验

MMP是线粒体功能的指标，其减少或消失会引起细胞功能障碍甚至死亡。据报道，具有阳离子盐结构的线粒体靶向探针高度依赖于MMP。为了鉴定CVP-12对线粒体的靶向能力，本发明测试了CVP-12在MMP降低时对线粒体的靶向性。活的HeLa细胞先用0.2μM MTDR预处理10min，再用1μM CVP-12处理10min，最后用20μM CCCP处理30min，通过FV-1200 共聚焦荧光显微镜观察细胞。MTDR是一种不受MMP影响的商业化线粒体探针，CCCP是一种质子载体，能够造成线粒体膜电位降低从而引起线粒体的迅速酸化。图3表明，无论MMP降低与否，CVP-12均可稳定定位线粒体。

当细胞被固定时，MMP将消失。因此，本发明研究了CVP-12在固定细胞中的染色能力，以验证当MMP消失时，探针可以定位于线粒体。活的HeLa细胞先用1μM CVP-12处理10min，再用0.2μM MTDR处理10min，然后用4％多聚甲醛处理30分钟，通过FV-1200共聚焦荧光显微镜观察细胞。如图3所示，CVP-12的染色结果与MTDR重叠，共定位系数为0.94，这表明当MMP消失时CVP-12仍然可以定位于线粒体。

实施例6 CVP-12在骨骼肌组织中高保真成像的实验

组织内的物质比细胞内的复杂得多，这使得组织难以可视化。从上述实验中可以看出，CVP-12对线粒体具有较强的靶向性。因此，本发明用 CVP-12染色组织来成像组织中的线粒体。直接取BALB/c小鼠骨骼肌组织，然后在H-DMEM中孵育，以备后续实验。室温下，在含10％胎牛血清(FBS) 的H-DMEM培养基中，用5μM CVP-12和5μM Hoechst 33342染色骨骼肌组织，不进行任何清洗，通过共聚焦显微镜观察线粒体形态。如图4所示，本发明可以清晰地识别出细微而规则的线粒体网状结构。也可以看到肌原纤维间(IMF)线粒体的管状形态，这与扫描电镜得到的形态一致。此外，还可以轻易地看到四种不同的线粒体形式，包括交叉纤维连接线粒体 (CFCM)、I带线粒体(IBM)、血管周线粒体(PVM)和纤维平行线粒体(FPM)，它们可以为骨骼肌的能量分配提供传导通路。因此，由于在水环境中的 ACQ效应，CVP-12可以高保真地成像组织中的线粒体。

实施例7 CVP-12染色HeLa细胞追踪线粒体自噬过程的实验

线粒体自噬在细胞生理过程中起着重要的作用，可以控制线粒体的数量和质量，维持细胞正常的功能。因此，利用CVP-12进行了生物成像实验，以测试其追踪线粒体自噬过程的能力。HeLa细胞先分别用1μM CVP-12和 0.2μM LTDR染色，然后用10μM CCCP和7.5μM胃蛋白酶抑制剂处理，开始线粒体自噬过程。记录不同时间点(0h、0.25h、0.5h、0.75h、1.0h、 1.5h、2.0h)的荧光图像(图5a)及相应的共定位系数(图5b)。利用共定位系数检测CVP-12和LTDR的重叠情况，实时观察线粒体自噬过程。从图6a可以看出，随着时间的增加，CVP-12的荧光图像与LTDR的荧光图像重叠良好。CVP-12与LTDR相应的共定位系数也从0.20增加到0.83(图5b)。高重叠度数据较好地证明细胞发生了自噬现象。值得注意的是，与其他线粒体自噬探针相比，该探针监测线粒体自噬不受MMP变化的影响。因此，根据上述结果，CVP-12可以在活细胞中原位实时跟踪线粒体自噬。

实施例8 CVP-12染色HeLa细胞的细胞毒性实验

细胞毒性对于合格的生物探针是必要的，特别是用于长程跟踪和成像的探针。本发明用MTT试剂检测CVP-12和MTDR的细胞毒性。如图6所示，用1.5μMCVP-12培养12h后，HeLa细胞的生存能力高于80％。然而用1.5 μMMTDR培养12h后，HeLa细胞的生存能力下降到40％。此外，本发明还研究了HeLa细胞在正常MTDR(200nM)和CVP-12(1μM)染色浓度下的生存能力。随着孵育时间的增长，用CVP-12(1μM)培养的HeLa细胞存活率不低于80％，远高于用200nMMTDR培养的存活率(图6b)。

综上可知，与MTDR相比，界面靶向型线粒体探针CVP-12具有免洗特性、高选择性、良好的生物相容性、优越的膜通透性和较低的细胞毒性，适合成像和跟踪活细胞中的线粒体。

以上是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种界面靶向型线粒体探针，其特征在于，所述界面靶向型线粒体探针结构式如下：

2.一种界面靶向型线粒体探针的制备方法，其特征在于，包括：

步骤2：7-二乙氨基-香豆素-3-甲醛的合成：将上述步骤1制备的7-二乙氨基-香豆素与POCl₃反应，然后层析分离得到7-二乙氨基-香豆素-3-甲醛；

步骤3：1-十二烷基-4-甲基吡啶碘盐的合成：利用4-甲基吡啶与1-碘十二烷反应得到1-十二烷基-4-甲基吡啶碘盐；

3.根据权利要求1所述的界面靶向型线粒体探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为：将4mmol 4-(二乙氨基)水杨醛和10mmol丙二酸二乙酯溶于30mL无水乙醇，加入1mL哌啶；上述混合物在80℃搅拌6h；然后除去乙醇，加入20mL浓盐酸和20mL冰醋酸；然后将上述溶液在120℃下搅拌回流10h，冷却至室温后，倒入50mL冰水；随后，用1.0mol/L的NaOH溶液调节溶液的pH至5.0；将混合物过滤后得到固体，然后将固体溶于少量二氯甲烷中；然后再加入大量正己烷萃取得到产物。

4.根据权利要求1所述的界面靶向型线粒体探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体为：将三颈烧瓶置于0℃冰浴中，加入10mL DMF，然后滴加POCl₃，搅拌30min；然后将0.43g 7-二乙氨基-香豆素溶于10mL CHCl₃，然后将溶液转移至烧瓶中，将烧瓶置于油浴中，75℃回流12h；用二氯甲烷溶解得到的棕色溶液；通过柱层析法分离得到最终产物。

5.根据权利要求1所述的界面靶向型线粒体探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3具体为：将10mmol 4-甲基吡啶和10mmol 1-碘十二烷溶于20mL甲苯中；产生淡黄色粉末沉淀时，混合物在120℃下加热12小时；反应结束后，将产物加入二氯甲烷完全溶解，然后向混合物中倒入大量石油醚，生成大量白色固体即为产物。

6.根据权利要求1所述的界面靶向型线粒体探针的制备方法，其特征在于，所述步骤4具体为：将1mmol 1-十二烷基-4-甲基吡啶碘盐溶于乙醇中，加入1mmol 7-二乙氨基-香豆素-3-甲醛，充分搅拌，然后加入8滴哌啶，溶液逐渐变红色，回流反应12小时，通过柱层析法分离得到红色固体即为界面靶向型线粒体探针。

7.权利要求1所述界面靶向型线粒体探针在标记或显示线粒体在活细胞和组织中分布的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述活细胞为永生化细胞。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述永生化细胞为HeLa和MCF-7细胞。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述组织为骨骼肌组织。