CN111346222B - 一种鼠疫减毒活疫苗干粉剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鼠疫减毒活疫苗干粉剂的制备方法。本发明提供的鼠疫减毒疫苗干粉剂的制备方法，包括：将鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株、冻干保护剂(脱脂乳、海藻糖、肌醇、右旋糖酐‑40、甘油、尿素)、储藏保护剂(谷氨酸钠和硫脲组)、分散剂(亮氨酸和泊洛沙姆)和去离子水混合，得到含有菌体的混合液；真空冷冻干燥。利用本发明方法所得到的鼠疫减毒疫苗干粉片状固体，含水量低，吸湿能力弱，利于保存和运输，水溶解性好，为下一步可吸入减毒活疫苗的干粉化制备和干粉气溶胶给药提供了可行性。

Description

一种鼠疫减毒活疫苗干粉剂的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种鼠疫减毒活疫苗干粉剂的制备方法。
背景技术
鼠疫是由鼠疫耶尔森菌引起的自然疫源性疾病，通常在啮齿动物之间流行，偶尔能引起人间流行。鼠疫传播属于国际检疫传染病，也是我国《传染病法》规定的甲类传染病之首。我国一直对鼠疫进行严密的监控，尤其是鼠疫的自然疫源地，防止鼠疫在我国的传播。鼠疫起病急、病程短、死亡率高、传染性强、容易引起人群中大规模传播。特别是败血性鼠疫和肺鼠疫，如果不加治疗，病死率为30％-100％。鼠疫潜伏期较短，一般为1-6天，但个别病例可达8-9天。对于疫区从事野外工作的人或猎杀、剥食旱獭的猎人、牧民接触染疫动物可能性大，感染的可能性高于一般人群。因此对于疫区的居民，疫苗接种是非常重要的保护手段。
但传统的经皮或经肌肉注射接种，与直接肺部免疫接种相比，缺乏呼吸道和肺部黏膜免疫应答，对气溶胶吸入感染的免疫保护效果较差，因此肺部免疫接种被认为是针对气溶胶感染的重要免疫途径。研究表明粉剂较液剂能引发更强的黏膜免疫反应，原因可能是液态疫苗被递送入肺后很快被黏膜系统的清除运动排出体外，而干粉疫苗被递送入肺后在局部的黏附力较好，从而延缓了黏膜对其清除速度。气溶胶化的疫苗干粉经肺吸入免疫接种后不仅诱导全身免疫应答，通常还可诱导传统免疫接种途径欠缺的呼吸道和肺部黏膜免疫应答，因而相比于传统免疫接种，干粉疫苗对吸入感染防护效果可起到更好或相等的作用。
目前国内外的研究中，对于鼠疫减毒活疫苗的干粉制备仍没有相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物活性较好，适合长期保存且便于携带的鼠疫减毒疫苗干粉剂，并为后续可吸入减毒活疫苗的干粉化制备和干粉气溶胶给药奠定基础。
第一方面，本发明要求保护一种鼠疫减毒疫苗干粉剂的制备方法。
本发明所要求保护的鼠疫减毒疫苗干粉剂的制备方法，可包括如下步骤：
(A1)将鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株、冻干保护剂、储藏保护剂、分散剂和去离子水混合，得到含有菌体的混合液。
所述冻干保护剂由脱脂乳、海藻糖、肌醇、右旋糖酐-40、甘油、尿素组成；所述储藏保护剂由谷氨酸钠和硫脲组成；所述分散剂由亮氨酸和泊洛沙姆组成。
(A2)将(A1)所得含有菌体的混合液进行真空冷冻干燥，得到鼠疫减毒疫苗的干粉制剂。
在所述混合液中，所述脱脂乳、所述甘油和所述泊洛沙姆的体积配比为1：1：0.1。
在所述混合液中，所述海藻糖、所述肌醇、所述右旋糖酐-40、所述尿素、所述谷氨酸钠、所述硫脲和所述亮氨酸的质量配比可为：6：0.5：0.5：0.1：0.5：0.5：0.5。
进一步地，在所述混合液中，所述脱脂乳的体积百分含量可为0.5％，所述海藻糖的质量百分含量可为6.0％，所述肌醇的质量百分含量可为0.5％，所述右旋糖酐-40的质量百分含量可为0.5％，所述甘油的体积百分含量可为0.5％，所述尿素的质量百分含量可为0.1％，所述谷氨酸钠的质量百分含量可为0.5％，所述硫脲的质量百分含量可为0.5％，所述亮氨酸的质量百分含量可为0.5％，所述泊洛沙姆的体积百分含量可为0.05％。
进一步地，在所述混合液中，所述鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株的含量需大于109CFU/mL，具体如(2～4)×109CFU/ml。
在步骤(A2)中，所述真空冷冻干燥可为程序性真空冷冻干燥；所述程序性真空冷冻干燥可按照如下程序进行：
(a1)一次干燥：真空设置为220mTorr，板层温度-35℃，冷阱-80℃，干燥48小时；
(a2)一次干燥结束后，将板层温度更改为-15℃，进行二次干燥，干燥12h。
在本发明的具体实施方式中，所述程序性真空冷冻干燥具体是在程序性真空冷冻干燥机(如Advantage实验室冻干机，型号为SP Scientific，XL)中进行的。在进行前文所述程序性真空冷冻干燥步骤(a1)前，还可包括将所述程序性真空冷冻干燥机预冻至少一个小时(板层设置温度为﹣40℃)的步骤。
进一步地，步骤(A2)中，将(A1)所得含有菌体的混合液进行真空冷冻干燥前还可包括将(A1)所得含有菌体的混合液进行预冷冻的步骤。
更进一步地，所述预冷冻可为4℃预冻3h，后转入-20℃冷冻24小时。
第二方面，本发明要求保护用于制备鼠疫减毒疫苗干粉剂的赋形剂溶液。
本发明要求保护的用于制备鼠疫减毒疫苗干粉剂的赋形剂溶液，可由冻干保护剂、储藏保护剂、分散剂和去离子水混合而成。
其中，所述冻干保护剂由脱脂乳、海藻糖、肌醇、右旋糖酐-40、甘油、尿素组成；所述储藏保护剂由谷氨酸钠和硫脲组成；所述分散剂由亮氨酸和泊洛沙姆组成。
在所述赋形剂溶液中，所述脱脂乳、所述甘油和所述泊洛沙姆的体积配比为1：1：0.1。
在所述赋形剂溶液中，所述海藻糖、所述肌醇、所述右旋糖酐-40、所述尿素、所述谷氨酸钠、所述硫脲和所述亮氨酸的质量配比可为：6：0.5：0.5：0.1：0.5：0.5：0.5。
进一步地，所述赋形剂溶液可以工作液或母液形式存在。
在所述工作液中，所述脱脂乳的体积百分含量可为0.5％，所述海藻糖的质量百分含量可为6.0％，所述肌醇的质量百分含量可为0.5％，所述右旋糖酐-40的质量百分含量可为0.5％，所述甘油的体积百分含量可为0.5％，所述尿素的质量百分含量可为0.1％，所述谷氨酸钠的质量百分含量可为0.5％，所述硫脲的质量百分含量可为0.5％，所述亮氨酸的质量百分含量可为0.5％，所述泊洛沙姆的体积百分含量可为0.05％。
所述母液的组成与所述工作液的浓缩液相同，相当于各组分的浓度在上述基础上同时增大若干倍，如2×母液或10×母液等，使用时再进行稀释(如以去离子水进行稀释)。
第三方面，本发明要求保护前文第二方面所述的赋形剂溶液在制备鼠疫减毒疫苗干粉剂中的应用。
在本发明的具体实施方式中，所述鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株具体为鼠疫菌201株。
在本发明的具体实施方式中，所述脱脂乳可按照包括如下步骤的方法制备得到：鲜牛奶(如市售三元牌袋装鲜牛奶)离心(如4℃下8000×g离心10min)后，弃去上层油脂和下层沉淀，将中间层脱脂乳转至新的离心管(本步骤可共进行3次)。然后将中间层脱脂乳在沸水中煮沸1h，室温放置。在接下来的三天，每天将中间层脱脂乳在沸水中煮沸一小时。最后，4℃下8000×g离心10min，弃去上层残留油脂和下层残留沉淀，将中间层脱脂乳转至新的离心管，得到的脱脂乳溶质体积百分比为10％。
实验证明，利用本发明方法所得到的鼠疫减毒疫苗干粉片状固定，含水量低，吸湿能力弱，利于保存和运输，水溶解性好，为下一步可吸入减毒活疫苗的干粉化制备和干粉气溶胶给药提供了可行性。
附图说明
图1为程序性真空冷冻干燥法制备的样品和普通冷冻干燥法制备的样品。A为程序性真空冷冻干燥法制备的样品；B为普通冷冻干燥法制备的样品。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
海藻糖二水合物(sigma，T0167)、肌醇(sigma，17508)、右旋糖酐-40(sigma，31389)、甘油(sigma，G2025)、尿素(sigma，U5378)、谷氨酸钠盐水合物(sigma，G5889)、硫脲(阿拉丁，T112514)、亮氨酸(sigma，L8912)、泊洛沙姆(sigma，P5556)、BHI培养基(BD，237500)、血平板(陆桥，PB001)。
脱脂乳按照如下步骤制备：市购三元牌袋装鲜牛奶(保质期很短，购买最近日期生产的，现购现用)。4℃下8000×g离心10min，弃去上层油脂和下层沉淀，将中间层脱脂乳转至新的离心管，本步骤共进行3次。然后转至玻璃杯，在沸水中煮沸1h，室温放置。在接下来的三天，每天将中间层脱脂乳在沸水中煮沸一小时。最后，4℃下8000×g离心10min，弃去上层残留油脂和下层残留沉淀，将中间层脱脂乳转至新的离心管，得到的脱脂乳溶质体积百分比为10％。
Advantage实验室冻干机(SP Scientific,XL)；冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司，FD-1B-50)。
鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株鼠疫菌201株：即记载于“Zhang Q,et al.Yersiniapestis biovar Microtus strain 201,an avirulent strain to humans,providesprotection against bubonic plague in rhesus macaques.Hum VaccinImmunother.2014；10(2):368-77.doi:10.4161/hv.27060.Epub 2013 Nov 13.”一文中的“Microtus strain 201”。在符合生物安全的前提下，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。
实施例1、鼠疫减毒疫苗干粉剂的制备
一、鼠疫菌的培养
供试菌株为鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株鼠疫菌201株。
(1)活化：甘油菌种接种于20ml的BHI肉汤中，26℃下200rpm培养36h(平台期，OD600＝2.5以上)。不可以放到4℃，直接使用。
(2)预培养：甘油菌种接种于20ml的BHI肉汤中，26℃下200rpm培养36h(平台期，OD600＝2.5以上)。不可以放到4℃，直接使用。
(3)正式培养：100倍稀释转接于20ml的BHI肉汤中，26℃下200rpm培养至OD600＝1.0(10～12h)。后转入37℃下200rpm培养至OD600＝1.6～1.8(3～4h)。将第三代菌液转移至37℃摇床200rpm培养3h，此时菌体处于对数期中期(OD600＝1.6～1.8，菌密度>108CFU/ml)。
(4)收集菌液至250ml无菌离心瓶中，3000g离心10min集菌，弃培养基上清液，用赋形剂溶液30ml(现配)吹打菌体，混匀后，转入50ml EP管中再次离心(转速时间同上)。离心后弃上清液，并用赋形剂定容到20ml并继续吹打混匀液体，同时吸出1ml用以计数。
其中，赋形剂溶液的配方如下：由冻干保护剂、储藏保护剂、分散剂和去离子水混合而成。所述冻干保护剂由脱脂乳、海藻糖、肌醇、右旋糖酐-40、甘油、尿素组成；所述储藏保护剂由谷氨酸钠和硫脲组成；所述分散剂由亮氨酸和泊洛沙姆组成。在所述赋形剂溶液中，所述脱脂乳的体积百分含量为0.5％。所述海藻糖的质量百分含量为6.0％。所述肌醇的质量百分含量为0.5％。所述右旋糖酐-40的质量百分含量为0.5％。所述甘油的体积百分含量为0.5％。所述尿素的质量百分含量为0.1％。所述谷氨酸钠的质量百分含量为0.5％。所述硫脲的质量百分含量为0.5％。所述亮氨酸的质量百分含量为0.5％。所述泊洛沙姆的体积百分含量为0.05％。余量为去离子水。
(5)对步骤(4)取出的1ml液体进行梯度稀释(5倍稀释)，选7、8、9、10梯度进行血平板计数。平板在26℃培养2天后，计数不同稀释度的菌落数，计算出实际菌量。此步骤目的是为了计算步骤(4)定容后20ml菌液浓度，培养2天是因为该菌生长缓慢，需要两天才能长到肉眼可见。此处观测的菌落数是由于菌落数是有原菌液中一个细菌长成。具体计算原理是：将梯度稀释的菌液取出10μl进行血平板培养。培养后可得10μl菌液中细菌数量。乘100可得1ml菌液中细菌数量(5倍稀释，稀释到7,8,9,10梯度时，菌落数比较适中，便于计算)。
——质控：梯度稀释后涂板培养计数，测定菌悬液中菌体密度。鼠疫菌201株：>109CFU/ml，>107CFU/mg总溶质。
(6)步骤(4)离心后对菌液充分混匀，得到含有菌体的混合液。将所述混合液4℃预冷至少3h，后转入﹣20℃预冻24h。
经步骤(5)计算，可知该步骤所得含有菌体的混合液中，鼠疫菌201株的含量为2～4×109CFU/ml。余量为所述赋形剂溶液。
二、真空冷冻干燥
将两份步骤一(6)处理后的含有菌体的混合液，分别按照如下两种方法进行真空冷冻干燥。
方法一(程序性真空冷冻干燥)：
(1)运行Advantage实验室冻干机的手动模式，放置样品前对机器预冻至少一个小时(板层设置温度为﹣40℃)。
(2)将预冻24h的样品(即步骤一处理后的含有菌体的混合液)放入程序冻干机，运行手动模式48h。(真空设置为220mTorr，板层温度﹣35℃，冷阱﹣80℃)。
(3)48h后，调整板层温度为﹣15℃，运行12h。
(4)收集干粉并称量得到干粉质量，取出部分粉体称量后进行梯度稀释，选7、8、9、10梯度进行血平板计数。平板在26℃培养2天后，计数不同稀释度的菌落数，计算出实际菌量数以及冻干前后的质量百分比。
——质控：梯度稀释后涂板培养计数，鼠疫菌201株：>109CFU/ml，>107CFU/mg总溶质。
方法二(普通真空冷冻干燥)：
(1)运行普通冻干机，放置样品前对机器预冻至少一个小时，冷阱温度-40℃。
(2)将预冻24h的样品(即步骤一处理后的含有菌体的混合液)放入普通冻干机，运行手动模式72h(机器极限真空，冷阱﹣40℃)。
(3)运行完毕后收集干粉，取出部分粉体进行梯度稀释，选7、8、9、10梯度进行血平板计数。平板在26℃培养2天后，计数不同稀释度的菌落数，计算出实际菌量。
——质控：梯度稀释后涂板培养计数，鼠疫菌201株：>109CFU/ml，>107CFU/mg总溶质。
程序性真空冷冻干燥法制备的样品和普通冷冻干燥法制备的样品如图1所示。可见两样品均为片状固体，硬度较低易于研磨，含水量低，吸湿能力弱，利于保存和运输，水溶解性好，为下一步可吸入减毒活疫苗的干粉化制备和干粉气溶胶给药提供了可行性。
结果显示：
1、存活率计算
(1)将准备预冻的样品，充分混匀赋形剂后取出50μl进行梯度稀释，求出其冻干前浓度C1。记录预冻样品体积V1。冻干流程结束后，计算冻干后干粉质量为m1。
(2)将制备好的干粉均匀取出部分称重，质量为m2。对其进行复溶，复溶体积为V2。
(3)复溶样品充分溶解后，取出50μl进行梯度稀释，求出其冻干后浓度C2。
(4)由此可得：m冻干前质量浓度(CFU/mg)为
Figure BDA0002443814050000061
(5)由此可得：m冻干后质量浓度(CFU/mg)为
Figure BDA0002443814050000062
(6)存活率为：
Figure BDA0002443814050000063
两种真空冷冻干燥法所得冻干粉中鼠疫菌201株的存活率如表1所示。
表1两种真空冷冻干燥法所得冻干粉中鼠疫菌201株的存活率
Figure BDA0002443814050000064
2、含水量测定
用仪器热重分析仪(DISCOVERY，美国TA公司)检测两种真空冷冻干燥法所得冻干粉的含水量。
结果如表2所示。
表2两种真空冷冻干燥法所得冻干粉的含水量
制备方法 含水量
普通冷冻干燥法 1.858％
程序性真空冷冻干燥法 3.730％
通过存活率结果发现，本发明所选用的赋形剂溶液配方可以很好满足冻干目的，制备出冻干后活性较高的鼠疫减毒疫苗干粉样品。通过两种方法评定，程序性真空冷冻干燥法存活率为94.6％，普通冷冻干燥法存活率为79.6％。程序性真空冷冻干燥法活性高出15个百分点作用，能更好的满足样品制备条件。
含水量测定发现，两种方法样品含水量都极低，能够满足储藏和后续可吸入干粉制备条件。
对比例1、不同配方赋形剂溶液效果评价
本发明最初共实验了四种配方的赋形剂溶液(如表3)，该制备方法用的是普通冷冻干燥法。所对应得配比和上文中一样，例如泊洛沙姆为体积比，脱脂乳为体积比，甘油为体积比，其余为质量比。实验操作方法同前文。
表3本发明四种赋形剂溶液配方以及普通冷冻干燥法效果验证
Figure BDA0002443814050000071
Figure BDA0002443814050000081
注：该表格中所示四种配方均用普通冷淡干燥法重复三次以上。
首先,运用普通冷冻干燥的方法。对四种配方保护性进行比较，通过实验数据发现配方二和四存活率较好(见表3和表4)。
然后，进一步在配方二和配方四的基础上，对原有普通冷冻干燥的方法进行改进。采用程序性真空冷冻干燥法(见前文)，发现运用该方法，使得两种配方下减毒菌的活性有了更进一步提升(表4)。
表4本发明四种赋形剂溶液的程序性真空冷冻干燥法效果验证
Figure BDA0002443814050000082

Claims (8)

1.一种鼠疫减毒疫苗干粉剂的制备方法，包括如下步骤：
(A1)将鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株、冻干保护剂、储藏保护剂、分散剂和水混合，得到含有菌体的混合液；
所述冻干保护剂由脱脂乳、海藻糖、肌醇、右旋糖酐-40、甘油、尿素组成；
所述储藏保护剂由谷氨酸钠和硫脲组成；
所述分散剂由亮氨酸和泊洛沙姆组成；
(A2)将(A1)所得含有菌体的混合液进行真空冷冻干燥，得到鼠疫减毒疫苗的干粉制剂；
在所述混合液中，所述脱脂乳的体积百分含量为0.5％，所述海藻糖的质量百分含量为6.0％，所述肌醇的质量百分含量为0.5％，所述右旋糖酐-40的质量百分含量为0.5％，所述甘油的体积百分含量为0.5％，所述尿素的质量百分含量为0.1％，所述谷氨酸钠的质量百分含量为0.5％，所述硫脲的质量百分含量为0.5％，所述亮氨酸的质量百分含量为0.5％，所述泊洛沙姆的体积百分含量为0.05％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述混合液中，所述鼠疫耶尔森菌减毒疫苗株的含量大于109CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(A2)中，所述真空冷冻干燥为程序性真空冷冻干燥；所述程序性真空冷冻干燥按照如下程序进行：
(a1)一次干燥：真空设置为220mTorr，板层温度-35℃，冷阱-80℃，干燥48小时；
(a2)一次干燥结束后，将板层温度更改为-15℃，进行二次干燥，干燥12h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(A2)中，将(A1)所得含有菌体的混合液进行真空冷冻干燥前还包括将所述含有菌体的混合液进行预冷冻的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述预冷冻为4℃预冻3h，后转入-20℃冷冻24小时。
6.用于制备鼠疫减毒疫苗干粉剂的赋形剂溶液，由冻干保护剂、储藏保护剂、分散剂和水混合而成；
所述冻干保护剂由脱脂乳、海藻糖、肌醇、右旋糖酐-40、甘油、尿素组成；
所述储藏保护剂由谷氨酸钠和硫脲组成；
所述分散剂由亮氨酸和泊洛沙姆组成；
在所述赋形剂溶液中，所述脱脂乳、所述甘油和所述泊洛沙姆的体积配比为1：1：0.1；
在所述赋形剂溶液中，所述海藻糖、所述肌醇、所述右旋糖酐-40、所述尿素、所述谷氨酸钠、所述硫脲和所述亮氨酸的质量配比为：6：0.5：0.5：0.1：0.5：0.5：0.5。
7.根据权利要求6所述的赋形剂溶液，其特征在于：所述赋形剂溶液以工作液或母液形式存在；
在所述工作液中，所述脱脂乳的体积百分含量为0.5％，所述海藻糖的质量百分含量为6.0％，所述肌醇的质量百分含量为0.5％，所述右旋糖酐-40的质量百分含量为0.5％，所述甘油的体积百分含量为0.5％，所述尿素的质量百分含量为0.1％，所述谷氨酸钠的质量百分含量为0.5％，所述硫脲的质量百分含量为0.5％，所述亮氨酸的质量百分含量为0.5％，所述泊洛沙姆的体积百分含量为0.05％；
所述母液的组成与所述工作液的浓缩液相同。
8.权利要求6或7所述的赋形剂溶液在制备鼠疫减毒疫苗干粉剂中的应用。
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