CN111307971A - 一种无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法 - Google Patents
一种无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法，分别采用高效液相色谱法测定二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚的含量；采用紫外分光光度法测定总多糖；以制首乌各成分含量为标准，建立科学、完善的无肝毒性制首乌饮片质量检测方法及其标准。本发明的质量检测方法操作简单，重复性好，专属性较强，能够有效保障药材的安全性、有效性、可靠性。
Description
技术领域
本发明属于药物质量检测技术领域，具体涉及一种无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法。
背景技术
何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，是著名的生熟异治中药。历代本草对其安全性问题鲜有论述，仅在《本草汇言》中首次提出了何首乌“生用有毒，炮制减毒”，临床通过使用制首乌来避免生首乌可能导致的毒性损伤。
近年来国内外使用何首乌导致的肝损伤问题引发极大关注，包括服用生何首乌、制何首乌、含何首乌的复方、中成药或保健食品等。国内外文献报道有关何首乌肝损害病例约150例。2006年，英国和澳大利亚药监部门先后发布了何首乌肝损害警告信息；2013年，我国药监部门也发布了含首乌制剂肝损害警示。正所谓“千年何首乌，今朝肝毒性”，何首乌的安全性受到广泛质疑。临床应用中发现，服用《中国药典》规定剂量范围内的生首乌与制首乌均可导致肝损伤。
在历代本草中，应用何首乌未见中毒的记载，而当前何首乌中毒事件频发，这应是相当数量的炮制品的炮制方法未达到炮制减毒的目的。据本草记载，传统的何首乌炮制方法较为复杂，复杂的炮制工艺的确起到了去毒的作用保障了何首乌的用药安全。传统“九制法”与现行规范工艺存在较大差异，主要体现在，传统炮制工艺重视很多细节，包括去皮、炮制禁忌、蒸晒次数、蒸的汁水、炮制辅料等，现代工艺在简化的过程中并没有足够重视上述细节，难以全面体现工艺参数的改变对制首乌肝毒性的影响。
何首乌应用广泛，据统计我国含首乌的中成药约500种，保健食品约200种。如果何首乌肝毒性的问题解决不好，将严重影响何首乌及相关产品的临床用药安全，并可能对中药国际声誉和产业健康发展带来巨大的不利影响。而现有的质量检测方法及其标准多适用于对传统炮制工艺得到的产品进行检测，不包括对肝毒性的检测，且针对采用非传统工艺炮制的制首乌产品其检测结果可能存在较大的缺漏，从而容易导致何首乌中毒的情况发生。如制何首乌炮制工艺及其炮制终点判断方面，药典中以饮片外观作为依据，以二苯乙烯苷不得少于0.70％和游离蒽醌含量不得少于0.10％作为质量控制指标，但存在如下问题：何首乌生品中的二苯乙烯苷质量分数一般在1.0％～3.5％，制何首乌规定其含量不得少于0.70％，这就意味着生品不经过炮制加工，其含量同样符合制何首乌的国家标准。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术中存在的不足，提供一种无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法，针对采用新工艺炮制的无肝毒性制首乌饮片建立质量标准检测方法，对全面提升制首乌的饮片质量和临床安全用药有重要意义。
本发明采用的技术方案如下：
一种无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法，包括：
分别测定无肝毒性制首乌饮片中的二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚和总多糖的含量；
所述无肝毒性制首乌饮片由以下操作制得：将何首乌切片，在100-140kPa于110-120℃蒸煮，分别收集蒸制何首乌与药汁，将蒸制何首乌烘干，再将药汁拌入烘干的何首乌片中，直至药汁完全吸尽。
进一步地，采用高效液相色谱法测定无肝毒性制首乌饮片的二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚的含量：
1)分别配制0.4-0.6mg/mL二苯乙烯苷对照品溶液、0.6-0.8mg/mL大黄素甲醚对照品溶液、0.25-0.45mg/mL大黄素对照品溶液、0.01-0.02mg/mL大黄酚对照品溶液；
2)将0.1-0.3g无肝毒性制首乌饮片制成供试品溶液；
3)分别吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得；
采用紫外分光光度法测定无肝毒性制首乌饮片总多糖含量：
1)将无水葡萄糖制成对照品溶液；
2)取无水葡萄糖对照品溶液，加入5vt％苯酚溶液，再加入硫酸，置于98-100℃水浴加热，然后冰浴冷却，在483nm的波长处测定吸光度，绘制标准曲线；
3)将0.15-0.35g无肝毒性制首乌饮片制为供试品溶液；
4)用紫外分光光度法测定在483nm处的吸光度，计算样品中多糖含量，即可。
进一步地，采用高效液相色谱法测定无肝毒性制首乌饮片的二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚的含量：
1)分别配制0.5640mg/mL二苯乙烯苷对照品溶液、0.7700mg/mL大黄素甲醚对照品溶液、0.3100mg/mL大黄素对照品溶液、0.0198mg/mL大黄酚对照品溶液；
2)将0.2g无肝毒性制首乌饮片磨成粉末，加入8mL丙酮，室温超声提取3次，每次30min，滤液合并，然后加入丙酮定容至25mL后旋转蒸干溶剂，残渣用甲醇溶解，最后用0.45μm滤膜过滤即得供试品溶液；
3)分别吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得；其中，流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液梯度洗脱；检测波长：250nm、300nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；各成分色谱峰完全分离，各峰对称且峰形尖锐，理论板数按二苯乙烯苷计算不低于5000；
采用紫外分光光度法测定无肝毒性制首乌饮片总多糖含量：
1)将无水葡萄糖制成0.127mg/mL的对照品溶液；
2)分别取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.4mL无水葡萄糖对照品溶液，各加水补至2.0mL，加入5vt％苯酚溶液1mL，摇匀，再加入10mL硫酸，摇匀，置于99℃水浴加热15min，然后冰浴冷却5min，以相应试剂为空白，在483nm的波长处测定吸光度，绘制标准曲线；
3)将0.25g无肝毒性制首乌饮片磨成粉末，加入50ml石油醚于80℃下回流提取1h，过滤；在药渣中加入80vt％的乙醇50mL回流提取1h，过滤，重复2次；洗涤容器和药渣，洗涤液合并入滤液，冷却，定容至250mL，即得供试品溶液；
4)用紫外分光光度法测定在483nm处的吸光度，计算样品中多糖含量，即可。
进一步地，0.2-0.25g无肝毒性制首乌饮片中二苯乙烯苷含量不得大于0wt％，大黄素含量不得大于0.17wt％，大黄酚含量不得大于0.013wt％，大黄素甲醚含量不得大于0.046wt％，制首乌多糖含量不得小于29wt％。
进一步地，无肝毒性制首乌饮片由以下步骤制得：
S1.将何首乌切成厚度为0.8-1cm的片状，在100-140kPa于110-120℃蒸煮4-5h，分别收集蒸制何首乌与药汁；
S2.将S1所得蒸制何首乌在40-50℃烘干6-8h，得含水量为5-8wt％的何首乌片；
S3.将S1所得药汁拌入S2所得何首乌片中，直至药汁完全吸尽，即得。
进一步地，S1中将何首乌切成片状后置于黑豆汁中拌匀再进行蒸煮。
进一步地，黑豆汁由以下方式制得：按照黑豆与水的质量比为1:10-12向黑豆中加水，煮4-5h后取滤液，再按照豆渣与水的质量比为1:8-10向豆渣中再加水煮3-4h，再次取滤液，合并滤液即得。
进一步地，黑豆与何首乌的质量比为1:10-12。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
顺式二苯乙烯苷是造成肝毒性的主要成分，反式二苯乙烯苷在体内与大黄素存在相互作用，导致大黄素血药浓度急剧上升，产生严重的肝毒性反应；基于此，本发明根据指纹图谱及相关成分含量测定并对肝毒性进行了体内验证研究；
本发明检测方法通过采用高效液相色谱法测定了二苯乙烯苷、游离蒽醌及结合蒽醌的含量，随着炮制次数的增多，各成分含量变化呈现一定的规律性，二苯乙烯苷和结合蒽醌的含量均呈逐渐降低的趋势，而游离蒽醌的含量呈逐渐升高的趋势，且各成分含量与生品有较大差异，因此可以作为质量检测的指标性成分，以检测产品是否具有肝毒性；同时，本发明检测方法采用紫外分光光度法检测具有补血、保肝效果的制首乌多糖，将其作为质量检测标志物，以检测产品是否具有良好的药效。
本发明中新工艺炮制的无肝毒性制首乌饮片，通过在高压锅中以110-120℃蒸煮4-5h，再在在40-50℃烘干，大大降低了二苯乙烯苷含量，从而降低了肝毒性，将药汁拌入何首乌片中，在无肝毒性的情况下进一步增加了药效；通过本发明的质量检测方法，成分符合标准，无肝毒性且药效较好。
本发明的质量检测方法尤为适用于对采用新工艺制得的无肝毒性制首乌饮片进行检测，操作简单，重复性好，专属性高，不仅能够检测制首乌的有效成分，且从检测结果中能够判断产品是否具有肝毒性，弥补了现有检测方法对采用非传统工艺炮制的制首乌产品的检测结果中存在的缺漏，从而对何首乌的毒性进行全面有效检测，对于首乌制品的品质控制以及全面提高药用制首乌的质量有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为HPLC特征图谱测定结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
本发明较佳实施例提供的一种无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法，具体如下：
1)按照黑豆与水的质量比为1:10，向黑豆中加水，煮4h后取滤液，再按照豆渣与水的质量比为1:8向豆渣中再加水煮3h，再次取滤液，合并滤液得黑豆汁；
2)将何首乌切成厚度为0.9cm的片状，置于黑豆汁中拌匀再进行蒸煮，再置于高压锅内于115℃蒸煮4h，分别收集蒸制何首乌与药汁；
3)将2)所得蒸制何首乌在45℃烘干7h，得含水量为7wt％何首乌片；
4)将2)所得药汁拌入3)所得何首乌片中，45min后药汁完全吸尽，即得无肝毒性制首乌饮片；
二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚含量测定：
1)色谱柱：Sepax C18(5μm,4.6mm×250mm)；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液梯度洗脱；检测波长：250nm、300nm；柱温：30℃；流速：1mL/min。在上述条件下，各成分色谱峰完全分离，各峰对称且峰形尖锐，能准确测定无肝毒性制首乌饮片中二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚的含量。理论板数按二苯乙烯苷计算不低于5000。
2)分别精密称定二苯乙烯苷对照品、大黄素对照品、大黄素甲醚对照品、大黄酚对照品适量于10mL容量瓶中，加入70vt％甲醇，超声溶解后定容，配成0.5640mg/mL二苯乙烯苷对照品溶液、0.7700mg/mL大黄素甲醚对照品溶液、0.3100mg/mL大黄素对照品溶液、0.0198mg/mL大黄酚对照品溶液。
3)精密称取0.20g无肝毒性制首乌饮片磨成的粉末置于50mL锥形瓶中，加入丙酮8mL，室温超声提取3次，每次30min，滤液合并于25mL容量瓶，加入丙酮至刻度，摇匀，精密量取5mL提取液于50mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪上挥干溶剂，残渣用2mL甲醇溶解，0.45μm滤膜过滤即得供试品溶液。
4)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。
按干燥品计算，0.20g无肝毒性制首乌饮片中：
二苯乙烯苷含量为0wt％；大黄素含量为0.15wt％；大黄酚含量为0.012wt％；大黄素甲醚含量为0.041wt％；
多糖的含量测定如下：
1)取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成0.127mg/mL的溶液，即得对照品溶液。
2)精密量取无水葡萄糖对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.4mL，分别置10mL试管中，各加水补至2.0mL，精密加入5vt％苯酚溶液1mL，摇匀，精密加入硫酸10mL，摇匀，沸水浴加热15min，取出，冰浴冷却5min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0401)，在483nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
3)精密称取无肝毒性制首乌饮片磨成的粉末0.25g，加入50mL石油醚60-90℃回流提取1h，过滤，药渣挥干其中残存溶剂；药渣中加入80vt％的乙醇50mL回流提取1小时，过滤，重复2次，用热水对蒸馏烧瓶和得到的药渣进行多次的洗涤，每次10mL，洗涤液合并入滤液，冷却，转移至250mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
4)用紫外分光光度法，同法操作，测定在483nm处的吸光度，计算样品中多糖含量。
0.25g无肝毒性制首乌饮片中，制首乌多糖含量为32wt％。
实验例1
分别精称取5份实施例中制得无肝毒性制首乌样品粉末0.50g，采用高效液相色谱法，测定各成分峰面积后计算含量，结果如下表1所示：
表1重复性试验结果
试验结果显示，各成分含量的相对标注差RSD均小于2％，说明该试验方法重复性良好。
分别于0h、4h、8h、12h、24h进样10μL，测定其峰面积，结果如下表2所示：
表2供试液稳定性考察
实验结果显示，各成分峰面积RSD均小于2％，说明供试品液在24h内稳定。
加样回收率计算公式如下：
取5份无肝毒性制首乌样品0.02g，加入二苯乙烯苷0.5460mg，混匀后进样，进样量10μL，计算回收率，结果如下表3所示：
表3二苯乙烯苷加样回收实验结果
试验结果显示，二苯乙烯苷5次加样回收试验的加样回收率在98.9％-102.10％之间，平均回收率为100.24％，RSD为1.27％，说明该方法可行。
取5份无肝毒性制首乌样品0.02g，加入大黄素0.3100mg，混匀后进样，进样量10μL，计算回收率，结果如下表4所示：
表4大黄素加样回收实验结果
试验结果显示，大黄素5次加样回收试验的加样回收率在99.52％-101.90％之间，平均回收率为102.0％，RSD为1.36％，说明该方法可行。
取5份无肝毒性制首乌样品0.02g，加入大黄素甲醚0.7700mg，混匀后进样，进样量10μL，计算回收率，结果如下表5所示：
表5大黄素甲醚加样回收实验结果
试验结果显示，大黄素甲醚5次加样回收试验的加样回收率在98.8％～101.0％之间，平均回收率为100.1％，RSD为1.05％，说明该方法可行。
取5份无肝毒性制首乌样品0.02g，加入大黄酚0.0198mg，混匀后进样，进样量10μL，计算回收率，结果如下表6所示：
表6大黄酚加样回收实验结果
试验结果显示，大黄酚5次加样回收试验的加样回收率在98.6％～101.2％之间，平均回收率为100.36％，RSD为1.62％，说明该方法可行。
实验例2
清蒸九制首乌炮制方法如下：
以竹刀刮去粗皮，米泔水浸一夜，切片，砂锅内蒸制，如此反复九次，第九次露晒后于烈日下暴晒至内外干透，既得清蒸九制首乌成品。将每一制的九制首乌药材烘干后打粉，过五号筛(80目)，装袋备用。
黑豆拌蒸制九制首乌制法如下：传统古法炮制
以竹刀刮去粗皮，米泔水浸一夜，切片，用黑豆以水泡过砂锅内铺豆一层，首乌一层，层层铺尽蒸之豆熟取出，去豆晒干，如此九次乃用。每一制首乌药材样品的编号及来源见表1，将每一制的九制首乌药材烘干后打粉，过五号筛(80目)，装袋备用。
分别采对实施例中制得的无肝毒性制首乌、清蒸九制首乌(清九制)与黑豆拌蒸制九制首乌(黑九制)中的二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚含量测定。结果如下表7所示。说明对传统清蒸九制首乌、黑豆拌蒸制九制首乌以及本发明制得的无肝毒性制首乌，通过本发明质量检测方法检测，均能符合无肝毒性标准。
表7样品含量测定结果(n＝3)
实验例3
精密量取无水葡萄糖对照品溶液1mL，置10mL具塞试管中，加水补至2.0mL，照标准曲线制备项下的方法，依法测定吸光度，连续测定6次，记录吸光度值，计算吸光度值的RSD为0.67％，结果表明，仪器精密度良好。
取6份无肝毒性制首乌的粉末0.5g，测定吸光度值，计算总多糖含量，结果表明，多糖含量的RSD为1.93％，结果表明，方法重复性良好。
取6份无肝毒性制首乌粉末0.25g，加水200mL，加热回流2h，放冷，转移至250mL量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，分别置15mL离心管中，精密加入无水乙醇8mL，摇匀，冷藏1h，取出，离心10min，弃去上清液，沉淀加80％乙醇洗涤2次，每次8mL，离心，弃去上清液，向沉淀中加入无水葡萄糖对照品溶液0.85mg/mL，1.0mL，再以2mol/L的硫酸5mL溶解，转移至25mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液并依测定项下的方法对样品进行测定，计算葡萄糖回收率。样品回收率为96.8％，RSD值为1.87％。
准确称量生首乌和无肝毒性制首乌的多糖测试样品11.3mg、12.2mg，依次加入50mL量瓶中，滴加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。分别精密量1ml，加入具塞试管，根据前述吸光度测定方法，定容至2mL。向具塞试管中加入配置好的显色液5mL，静置10min，水浴加热30min，取出，快速冷却至室温，用蒸馏水加显色剂作为空白对照，用紫外分光光度法，测定483nm处的吸光度，结果如下表8所示：
表8供试液吸光度测定
根据f＝m/CV计算换算因素。(m：多糖样品质量(μg)；C：多糖浓度(μg/ml)；V：稀释后溶液体积)。计算得换算因素为：f何首乌＝2.401，f无肝毒性制首乌＝1.825。
用紫外分光光度法，测定在483nm处的吸光度，计算样品中多糖含量。
表9样品中多糖含量
结果表明，无肝毒性制首乌中多糖含量显著高于生首乌，研究表明无肝毒性制首乌多糖具有补血、保肝等多种活性，可作为无肝毒性制首乌的质量标志物。
实验例4
进行HPLC特征图谱测定，测定结果如图1所示，其中，S1：生首乌；S2：无肝毒性制首乌；S3：黑豆九制首乌；R：生成对照图谱。
由中药色谱指纹图谱相似度评价软件，得到生首乌、无肝毒性制首乌和黑豆制九制首乌的相似度，结果如下表10所示：
表10相似度评价
生首乌与无肝毒性制首乌相似度度为73.9％，与黑豆九制首乌相似度为12.6％，黑豆制首乌与清蒸制首乌相似度为17.1％。
实验例5
采用生首乌、无肝毒性制首乌及药典法制首乌进行对比研究，实验选择SD大鼠，针对何首乌临床报道的肝毒性的特征，选择水提物，着眼于胆汁郁积及炎症性损伤指标，对生首乌潜在肝毒性进行研究，深入的评价炮制对生、制首乌的肝毒性的差异影响。
SD大鼠分别灌胃生、制首乌药材水提物30,15,7.5g.kg-1(按生药量计)，每天一次，连续28天。28天后观察一般状况，体重变化，检测血浆中生化中肝功能相关指标(AST，ALP，TBIL等)。实验结果如表11-14所示：
表11连续给药28天对大鼠体重的影响
注：与正常组比较#P＜0.05，##P<0.01
表12连续给药28天对大鼠胆汁生化指标的影响
注：与正常组比较#P＜0.05，##P<0.01
实验结果表明：与正常对照组比，制首乌对大鼠胆汁生化指标ALB、TCHO、TBIL、无显著影响。
表13连续给药28天对大鼠血清生化指标的影响
注：与正常组比较#P＜0.05，##P<0.01
表14连续给药28天对大鼠血清生化指标的影响
注：与正常组比较#P＜0.05，##P<0.01
实验结果表明：与正常对照组比，制首乌对大鼠血清生化指标ALB、TCHO、TBIL、GGT、ALT、AST、BUN、ALP无显著影响。
何首乌的肝毒性的发生存在个体差异，发生率相对较低，且往往在临床治疗剂量发生肝损害，因而考虑何首乌的肝损害类似于特异质肝损害。基于此，本研究采用特异质肝损伤模型，进行生首乌和不同炮制方法所得制首乌肝毒性差异的研究。
采用无毒剂量的脂多糖(LPS)制备内毒素特异质大鼠模型，模型大鼠和正常大鼠均灌胃给予生首乌、两种制首乌的水提取物30,15,7.5g.kg-1(按生药量计)，观察一般状况，体重变化，检测血浆中生化中肝功能相关指标(AST，ALP，TBIL等)。实验结果如表15-18所示：
表15连续给药28天对特异质肝损伤大鼠体重的影响
注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较#P＜0.05，##P<0.01
表16连续给药28天对特异质肝损伤大鼠胆汁生化指标的影响
注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较#P＜0.05，##P<0.01
实验结果表明：与正常对照组比，制首乌对大鼠胆汁生化指标ALB、TCHO、TBIL、GGT无显著影响；与模型组相比，各项指标显著改善。
表17连续给药28天对特异质肝损伤大鼠血清生化指标的影响
注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较#P＜0.05，##P<0.01
表18连续给药28天对特异质肝损伤大鼠血清生化指标的影响
注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与正常组比较#P＜0.05，##P<0.01
实验结果表明：与正常对照组比，制首乌对大鼠血清生化指标ALB、TCHO、TBIL、GGT、ALT、AST、BUN、ALP无显著影响；与模型组相比，各项指标显著改善。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法，其特征在于，包括：
分别测定无肝毒性制首乌饮片中的二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚和总多糖的含量；
所述无肝毒性制首乌饮片由以下操作制得：将何首乌切片，在100-140kPa于110-120℃蒸煮，分别收集蒸制何首乌与药汁，将蒸制何首乌烘干，再将药汁拌入烘干的何首乌片中，直至药汁完全吸尽。
2.根据权利要求1所述的无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法测定无肝毒性制首乌饮片的二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚的含量：
1)分别配制0.4-0.6mg/mL二苯乙烯苷对照品溶液、0.6-0.8mg/mL大黄素甲醚对照品溶液、0.25-0.45mg/mL大黄素对照品溶液、0.01-0.02mg/mL大黄酚对照品溶液；
2)将0.1-0.3g无肝毒性制首乌饮片制成供试品溶液；
3)分别吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得；
采用紫外分光光度法测定无肝毒性制首乌饮片总多糖含量：
1)将无水葡萄糖制成对照品溶液；
2)取无水葡萄糖对照品溶液，加入5vt％苯酚溶液，再加入硫酸，置于98-100℃水浴加热，然后冰浴冷却，在483nm的波长处测定吸光度，绘制标准曲线；
3)将0.15-0.35g无肝毒性制首乌饮片制为供试品溶液；
4)用紫外分光光度法测定在483nm处的吸光度，计算样品中多糖含量，即可。
3.根据权利要求2所述的无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱法测定无肝毒性制首乌饮片的二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚的含量：
1)分别配制0.5640mg/mL二苯乙烯苷对照品溶液、0.7700mg/mL大黄素甲醚对照品溶液、0.3100mg/mL大黄素对照品溶液、0.0198mg/mL大黄酚对照品溶液；
2)将0.2g无肝毒性制首乌饮片磨成粉末，加入8mL丙酮，室温超声提取3次，每次30min，滤液合并，然后加入丙酮定容至25mL后旋转蒸干溶剂，残渣用甲醇溶解，最后用0.45μm滤膜过滤即得供试品溶液；
3)分别吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得；其中，流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液梯度洗脱；检测波长：250nm、300nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；各成分色谱峰完全分离，各峰对称且峰形尖锐，理论板数按二苯乙烯苷计算不低于5000；采用紫外分光光度法测定无肝毒性制首乌饮片总多糖含量：
1)将无水葡萄糖制成0.127mg/mL的对照品溶液；
2)分别取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.4mL无水葡萄糖对照品溶液，各加水补至2.0mL，加入5vt％苯酚溶液1mL，摇匀，再加入10mL硫酸，摇匀，置于99℃水浴加热15min，然后冰浴冷却5min，以相应试剂为空白，在483nm的波长处测定吸光度，绘制标准曲线；
3)将0.25g无肝毒性制首乌饮片磨成粉末，加入50ml石油醚于80℃下回流提取1h，过滤；在药渣中加入80vt％的乙醇50mL回流提取1h，过滤，重复2次；洗涤容器和药渣，洗涤液合并入滤液，冷却，定容至250mL，即得供试品溶液；
4)用紫外分光光度法测定在483nm处的吸光度，计算样品中多糖含量，即可。
4.根据权利要求1所述的无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法，其特征在于，所述0.2-0.25g无肝毒性制首乌饮片中二苯乙烯苷含量不得大于0wt％，大黄素含量不得大于0.17wt％，大黄酚含量不得大于0.013wt％，大黄素甲醚含量不得大于0.046wt％，制首乌多糖含量不得小于29wt％。
5.根据权利要求1所述的无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法，其特征在于，所述无肝毒性制首乌饮片由以下步骤制得：
S1.将何首乌切成厚度为0.8-1cm的片状，在100-140kPa于110-120℃蒸煮4-5h，分别收集蒸制何首乌与药汁；
S2.将S1所得蒸制何首乌在40-50℃烘干6-8h，得含水量为5-8wt％的何首乌片；
S3.将S1所得药汁拌入S2所得何首乌片中，直至药汁完全吸尽，即得。
6.根据权利要求5所述的无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法，其特征在于，所述S1中将何首乌切成片状后置于黑豆汁中拌匀再进行蒸煮。
7.根据权利要求6所述的无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法，其特征在于，所述黑豆汁由以下方式制得：按照黑豆与水的质量比为1:10-12向黑豆中加水，煮4-5h后取滤液，再按照豆渣与水的质量比为1:8-10向豆渣中再加水煮3-4h，再次取滤液，合并滤液即得。
8.根据权利要求6或7所述的无肝毒性制首乌饮片的质量检测方法，其特征在于，所述黑豆与何首乌的质量比为1:10-12。
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