CN111172097A - 一种猪瘟弱毒病毒的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种维持原代或传代细胞系单层的培养方法，其特征在于，培养所用的细胞培养维持液中添加DMSO与IBMX。验证表明DMSO和IBMX同时添加至细胞培养维持液中，能够显著提高长时间后的细胞活性，最佳在连续收获16代次(65d)后仍能保持较好的细胞活性。本发明的培养方法能够有效用于弱毒疫苗尤其是猪瘟弱毒疫苗，具有较高有应用价值。

Description

一种猪瘟弱毒病毒的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域和兽医领域，具体涉及一种兽用活疫苗的生产方法，更具体涉及猪瘟弱毒病毒的培养方法。
背景技术
牛睾丸原代细胞是一种用来培养猪瘟病毒的原代细胞。该方法用于繁殖猪瘟病毒，具有免疫原性好、病毒收获滴度高等特点，且正常培养可连续收获5代次以上，是目前猪瘟疫苗生产企业最常用的生产方法。现有牛睾丸细胞培养方法中，大部分公司为无添加细胞生长调节剂或者只添加二甲基亚砜的方法进行培养，这些细胞培养方法会出现细胞生长周期短、细胞死亡过快，造成收获的各代次差异过大，从而影响疫苗质量。牛睾丸原代细胞常规培养方法虽然具有诸多优点，但在现有技术下，全国每年因生产猪瘟疫苗所消耗的牛睾丸达70万对，过程费时费力，对牛群伤害巨大，因此研究出可以延长原代细胞生长周期，减少收获病毒各代次间的差异，增加每批次收获量极为重要。
二甲基亚砜(DMSO)是一种含硫有机化合物，常用于细胞冻存、医药生产、有机合成等多种领域。DMSO对细胞膜中的脂质和脂蛋白有稳定作用，可减少冻存及解冻对细胞的伤害。而3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)是一种非特异性cAMP和cGMP磷酸二酯酶抑制剂，已应用于医学及科研的多个领域。体外培养细胞中加入IBMX，抑制cGMP磷酸二酯酶活性，胞内cGMP浓度升高，促进老化细胞凋亡，维持培养细胞动态平衡。
发明内容
目前尚没有报道将上述两种物质用于维持原代或传代细胞系单层的培养方法之中，本发明通过研究发现两者添加于培养所用的细胞培养维持液中具有极其显著的效果，最终完成本发明。
本发明的目的在于提供维持原代或传代细胞系单层的培养方法，从而解决现在牛睾丸细胞生长周期短、细胞生长状态差等问题，并基于此提供猪瘟弱毒疫苗株的培养方法，以解决猪瘟收获批次与质量不稳定等问题。
本发明首先提供一种维持原代或传代细胞系单层的培养方法，其特征在于，培养所用的细胞培养维持液中添加DMSO与IBMX。
优选地，添加DMSO与IBMX的量分别为：0.1％(V/V)-2.0％(V/V)、10ug/L-1000mg/L，优选添加量为：0.5％(V/V)-1.5％(V/V)、100ug/L-100mg/L，更优选的添加量为：更优选的添加量为：1.5％(V/V)DMSO+10ug/L IBMX、1.0％(V/V)DMSO+100ug/L IBMX、0.5％(V/V)DMSO+1000ug/L IBMX。
进一步地，所述原代细胞为犊牛睾丸细胞、犊牛肾细胞，所述传代细胞系选自：BT细胞系、猪睾丸传代细胞系、Vero细胞、猪肾传代细胞系。
培养所用的细胞培养维持液优选选自：水解乳蛋白-汉克氏液、a-MEM、DMEM、1640、M199。
在一些实施方式中，所述细胞系的培养方式为单层贴壁培养、微载体悬浮培养或固定化培养。
本发明另一方面还提供一种猪瘟弱毒疫苗的培养方法，其包括下述步骤：
(1)如上述的方法培养细胞系；
(2)将猪瘟活疫苗生产种毒接种培养好的传代细胞系。
进一步还包括：
(3)将猪瘟弱毒疫苗株进行病毒增殖，进行多次收获；
任选还包括：
(4)在收获的病毒液中加入冻干保护剂和抗生素进行配苗、冷冻干燥，即得猪瘟弱毒疫苗。
优选地，步骤(2)中接种生产种毒之前使用0.025％胰蛋白酶处理细胞单层后，用生产种毒以感染剂量0.1-0.5MOI接种。
在一些实施方式中，步骤(2)中猪瘟病毒生产维持液含有二甲基亚砜(DMSO)，优选含量为0.1-2.0％(V/V)二甲基亚砜。
进一步地，步骤(2)中将猪瘟活疫苗生产种毒以感染剂量0.1-0.5MOI接种到培养好的传代细胞系上进行培养，接种5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液，收获超过15次。
优选地，步骤(4)中采用兔体热检测或免疫荧光方法测定增殖病毒的毒价时，每个收获批次病毒含量达到或超过20万兔体热单位或6.0*105FAID50/ml。
在一个具体实施方式中，所述猪瘟弱毒疫苗株是：CVCCAV1412。
本发明的有益效果在于：本发明研究表明DMSO添加浓度0.1％(V/V)-2.0％(V/V)，IBMX添加量10ug/L-1000mg/L能够显著提高长时间后的细胞活性。尤其在最佳效果时，在连续收获16代次(65d)后仍能保持较好的细胞活性。研究DMSO与IBMX对牛睾丸细胞及其他传代细胞的影响兔体热检测结果表明，维持液中添加的各剂量DMSO与IBMX均能有效延长病毒收获次数，且对病毒免疫原性基本无影响。最佳组在连续收获24次后仍完全合格，表明本发明的方法能在有效提高牛睾丸细胞收获次数的同时仍能保持收获的病毒的质量，为最优的细胞生长调节剂添加培养浓度。此外，检测结果显示经DMSO与IBMX配置的维持液对使用水解乳蛋白-汉克氏液、a-MEM、DMEM、1640、M199维持液培养的CEF、BT、ST、Vero、PK-15单层细胞仍具有效果，可显著提高细胞维持单层与存活时间，且对猪瘟病毒在BT、ST、Vero、PK-15细胞系上的繁殖无明显影响。
附图说明
图1长满单层的牛睾丸细胞。
图2第32d的无调节剂组细胞。
图3第32d添加浓度为1.0％(V/V)(DMSO)+100ug/L(IBMX)的细胞。
图4第65d添加浓度为1.0％(V/V)(DMSO)+100ug/L(IBMX)的细胞。
图5接种种毒后82日CEF。
图6第38日死亡凋零CEF细胞凋零大部分细胞细胞脱落(方瓶)。
图7接种种毒后82日BT细胞。
图8接种种毒后82日ST细胞。
图9接种种毒后82日Vero细胞。
图10接种种毒后82日PK15细胞。
具体实施方式
实施例1：DMSO浓度与IBMX工作浓度的选定
1)细胞的传代与培养：制备牛睾丸原代细胞，待牛睾丸原代细胞长满单层后，胰酶-EDTA细胞分散液消化传代，一比五进行传代。加细胞生长液于
37℃继续培养，形成良好单层时，用于实验；
2)细胞维持单层活性时间：步骤1)中长满单层的牛睾丸细胞弃去生长液，更换为添加细胞生长调节剂的维持液，按照下表DMSO与IBMX产生作用的区间进行进行交互选择。此后每4日更换一次相同的维持液，连续培养32日与64日，观察细胞状态。其中，如图1所示长满单层的牛睾丸细胞。
表1细胞生长调节剂工作浓度
Figure BDA0002364670060000041
3)步骤2)培养的细胞分别在32日(与65日(即8、16代次)在显微镜下观察细胞状态。图2所示为第32d的无调节剂组细胞；图3所示为第32d添加浓度为1.0％(V/V)(DMSO)+100ug/L(IBMX)的细胞；图4所示为第65d添加浓度为1.0％(V/V)(DMSO)+100ug/L(IBMX)的细胞。
将状态非常好的标记为“+++”、状态较好的标记为“++”、状态尚可的标记为“+”、勉强可用的标记为“±”、无法使用的细胞标记为“-”(表2)。
表2不同浓度的DMSO与IBMX对细胞活性的影响(32d/65d)
Figure BDA0002364670060000051
4)表2结果表明，DMSO添加浓度从0.1％(V/V)-2.0％(V/V)，IBMX从10ug/L-1000mg/L均能显著提高长时间后的细胞活性。其中IBMX最佳浓度为100ug/L-100mg/L，DMSO最佳浓度为0.5％(V/V)-1.5％(V/V)，DMSO与IBMX混合添加培养的细胞中，以添加浓度为1.5％(V/V)(DMSO)+10ug/L(IBMX)、1.0％(V/V)(DMSO)+100ug/L(IBMX)、0.5％(V/V)(DMSO)+1000ug/L(IBMX)效果最佳，在连续收获16代次(65d)后仍能保持较好的细胞活性。
实施例2：猪瘟病毒制苗用毒培养
1)细胞的传代与培养：制备牛睾丸细胞，待牛睾丸原代细胞长满单层后，胰酶-EDTA细胞分散液消化传代，一比五进行传代。加细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于实验；
2)猪瘟病毒毒液的繁殖：将猪瘟病毒在牛睾丸细胞上进行传代，生产种毒以感染剂量0.1-0.5MOI接种在步骤1)长满单层的牛睾丸细胞上，按照实施例1的最佳添加浓度DMSO+IBMX(1.0％(V/V)+100ug/L)、1.0％DMSO、1000ug/L IBMX更换维持液，第五日进行第一次收获，随后每4日收获一次并更换相同的维持液，将收获的猪瘟病毒悬液采用兔体交互免疫试验检测免疫原性。
3)上述所用营养液的配方是：92％DMEM液、5-8％犊牛血清，pH值调整为7.2-7.4。上述所用维持液的配方是：95％DMEM液、3.5-5％犊牛血清、加步骤2)中的添加剂，pH值调整为7.2。
4)兔体交互免疫实验：将步骤2)中收获的病毒中的3、6、9、12、15、18、21、24代收获的病毒液用兔体温法检测猪瘟兔化弱毒，将病毒液用生理盐水稀释20万倍后耳静脉接种1.5-3.0Kg家兔，观察是否产生特异性体温升高(表3)。
表3兔体热检测结果
Figure BDA0002364670060000061
5)步骤4)兔体热检测结果表明，维持液中添加的各剂量DMSO与IBMX均能有效延长病毒收获次数，且对病毒免疫原性基本无影响。其中同时添加1.0％DMSO+100ug/L IBMX的组在连续收获24次后仍完全合格，表明该浓度能在有效提高牛睾丸细胞收获次数的同时仍能保持收获的病毒的质量，为最优的细胞生长调节剂添加培养浓度。
实施例3：传代细胞系的筛选与应用
分别制备鸡成纤维细胞(以下CEF)、BT、ST、Vero、PK-15的长满单层细胞，接种猪瘟兔化弱毒株，使用适用的水解乳蛋白-汉克氏液、a-MEM、DMEM、1640、M199培养液配置含犊牛血清3.5-5.0％、加实施例1中的细胞生长调节剂1.0％DMSO+100ug/L IBMX配制而成的维持液。至37℃继续培养，随后每3-5日收获更换一次维持液，观察细胞维持单层与活力，并对每代次的病毒进行检测。镜下观察含DMSO与IBMX的维持液可显著提高细使用水解乳蛋白-汉克氏液、a-MEM、DMEM、1640、M199维持液培养的CEF、BT、ST、Vero、PK-15细胞维持单层与存活时间，接种猪瘟病毒82日后单层细胞仍稳定、致密，未见细胞重叠(图5为接种种毒后82日CEF；图6为第38日死亡凋零CEF细胞凋零大部分细胞细胞脱落(方瓶)；图7为接种种毒后82日BT细胞；图8为接种种毒后82日ST细胞；图9接种种毒后82日Vero细胞；图10为接种种毒后82日PK15细胞。)。由此可见，未添加DMSO与IBMX的对照组CEF细胞在接种第38日大部分细胞死亡脱落，其他对照组细胞镜下见多出呈复层；实验组CEF、BT、ST、Vero、PK-15细胞系上收获25批次(接种后第82日)，仍能收获免疫原性良好的猪瘟病毒，对照组细接种后16日(Vero细胞)到底38日(BT细胞)开始无兔体热反应，表明无病毒繁殖。
表4兔体热检测结果
Figure BDA0002364670060000071
以上对本发明的实施例进行了详细说明，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何在本发明揭露的技术范围内，所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种维持原代或传代细胞系单层的培养方法，其特征在于，培养所用的细胞培养维持液中添加DMSO与IBMX。
2.如权利要求1所述的维持传代细胞系单层的培养方法，其特征在于，添加DMSO与IBMX的量分别为：0.1％(V/V)-2.0％(V/V)、10ug/L-1000mg/L，优选添加量为：0.5％(V/V)-1.5％(V/V)、100ug/L-100mg/L，更优选的添加量为：1.5％(V/V)DMSO+10ug/L IBMX、1.0％(V/V)DMSO+100ug/L IBMX、0.5％(V/V)DMSO+1000ug/L IBMX。
3.如权利要求1或2所述的维持传代细胞系单层的培养方法，其特征在于，所述原代细胞为犊牛睾丸细胞、犊牛肾细胞，所述传代细胞系选自：BT细胞系、猪睾丸传代细胞系、Vero细胞、猪肾传代细胞系。
4.如权利要求1或2所述的维持传代细胞系单层的培养方法，其特征在于，培养所用的细胞培养维持液选自：水解乳蛋白-汉克氏液、a-MEM、DMEM、1640、M199。
5.按照权利要求1或2所述的维持传代细胞系单层的培养方法，其特征在于：所述细胞系的培养方式为单层贴壁培养、微载体悬浮培养或固定化培养。
6.一种猪瘟弱毒疫苗的培养方法，其包括下述步骤：
(1)如权利要求1至5任一项所述的方法培养细胞系；
(2)将猪瘟活疫苗生产种毒接种培养好的传代细胞系。
7.如权利要求6所述的猪瘟弱毒疫苗的培养方法，其特征在于：进一步还包括：
(3)将猪瘟弱毒疫苗株进行病毒增殖，进行多次收获；
任选还包括：
(4)在收获的病毒液中加入冻干保护剂和抗生素进行配苗、冷冻干燥，即得猪瘟弱毒疫苗。
8.如权利要求6所述的猪瘟弱毒疫苗的培养方法，其特征在于：步骤(2)中接种生产种毒之前使用0.025％(V/V)胰蛋白酶处理细胞单层后，用生产种毒以感染剂量0.1-0.5MOI接种。
9.如权利要求6所述的猪瘟弱毒疫苗的培养方法，其特征在于：步骤(2)中猪瘟病毒生产维持液含有二甲基亚砜(DMSO)，优选含量为0.1-2.0％(V/V)二甲基亚砜。
10.如权利要求6所述的猪瘟弱毒疫苗的培养方法，其特征在于：步骤(2)中将猪瘟活疫苗生产种毒以感染剂量0.1-0.5MOI接种到培养好的传代细胞系上进行培养，接种5日作第一次收获换液，以后每隔4日收获换液，收获超过15次。
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