CN111171043B - 一种银杏内酯b的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，具体涉及一种银杏内酯B的提取方法。该方法包括：(1)在酸性的条件下，将银杏叶与第一有机溶剂接触，并进行加热回流提取，得到银杏叶提取物；(2)在载体的存在下，将所述银杏叶提取物与第二有机溶剂接触，并进行加热回流以对银杏内酯B进行分离，然后固液分离得到液相；其中，所述载体为活性炭和/或氧化铝；(3)将所述液相与水混合，并分离得到有机溶剂层，然后减压浓缩至无有机溶剂，得到含有银杏内酯B的浓缩物；(4)将所述浓缩物溶解于第三有机溶剂中，并进行结晶处理，得到银杏内酯B的结晶物。该方法获得的银杏内酯B的收率和纯度均有所提高。

Description

一种银杏内酯B的提取方法

技术领域

本发明医药领域，具体涉及一种银杏内酯B的提取方法。

背景技术

在银杏内酯中银杏内酯B(BN52021)的活性生理活性最强，是迄今发现的最强的血小板活化因子拮抗剂，可在临床上用于治疗血栓、急性胰腺炎和心血管疾病，还可用于转移性癌症的治疗，对损伤神经元也有保护作用，同时具有抗氧化，延缓衰老的作用。银杏内酯b注射液成分单一明确，疗效显著，安全性好，市场接受度高，为不可多得的新型中药静脉注射剂型。银杏内酯b注射液功能主治化痰祛瘀，通脉舒络，用于治疗缺血性脑中风的痰瘀阻络证。目前，药用的银杏内酯B主要从银杏叶中提取。

CN104817570A涉及一种银杏内酯B的制备方法，该方法采用银杏叶为原料，用中高浓度乙醇进行多次回流提取，合并提取液，回收乙醇，上柱分离，以纯水、乙醇分别洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥后，用高浓度乙醇溶解，再过酸性氧化铝柱，高浓度乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩结晶，得到银杏总内酯粗品，向银杏总内酯粗品中加入纯水洗晶，30-90℃下搅拌溶解，过滤，收集滤饼，浓缩结晶，干燥，得干品，再向干品中加入中低浓度乙醇，重结晶，得银杏内酯B。

CN110627806A公开了一种银杏内酯B的提取方法，主要以乙醇为提取试剂对银杏叶进行三次回流提取，合并提取液，减压浓缩去乙醇，上柱分离，洗脱并浓缩获得银杏叶提取物，然后有机溶剂萃取，萃取液减压浓缩去溶剂，然后加入含水溶剂溶解，并进行冷藏结晶，固液分离后滤饼重复结晶3-4次，得到结晶I，每次结晶的母液合并后减压浓缩去溶剂，用同样的方法进行结晶，得到结晶II，然后将结晶I和结晶II合并获得银杏内酯B。

然而现有技术中获得银杏内酯B的方法所获得的银杏内酯B的收率和纯度还有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术从银杏叶中提取银杏内酯B的收率和纯度还有待进一步提高的问题，提供一种银杏内酯B的提取方法，该方法获得的银杏内酯B的收率和纯度均有所提高。

为了实现上述目的，本发明提供了一种银杏内酯B的提取方法，该方法包括：

(1)在酸性的条件下，将银杏叶与第一有机溶剂接触，并进行加热回流提取，得到银杏叶提取物；

(2)在载体的存在下，将所述银杏叶提取物与第二有机溶剂接触，并进行加热回流以对银杏内酯B进行分离，然后固液分离得到液相；其中，所述载体为活性炭和/或氧化铝；

(3)将所述液相与水混合，并分离得到有机溶剂层，然后减压浓缩至无有机溶剂，得到含有银杏内酯B的浓缩物；

(4)将所述浓缩物溶解于第三有机溶剂中，并进行结晶处理，得到银杏内酯B的结晶物。

优选的，通过添加柠檬酸获得所述酸性的条件。

优选的，所述载体为活性炭和氧化铝。

优选的，所述第二有机溶剂为乙酸乙酯/或乙酸甲酯。

优选的，所述结晶的方法包括如下阶段：

第一阶段：将待结晶物料在8-10℃的条件下结晶1-2小时；

第二阶段：将第一阶段产物在4-8℃的条件下结晶3-10小时；

第三阶段：将第二阶段产物在0-4℃条件下结晶8-12小时。

优选的，所述第一阶段在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速为100-300rpm。

优选的，在第二阶段结晶结束后，将40-70％的晶体分离，剩余物料进行第三段结晶。

优选的，所述第一阶段结晶和第二阶段结晶在乙酸乙酯的存在下进行，所述第三阶段结晶在乙酸乙酯和乙醇的存在下进行。

通过本发明的技术方案，可以获得如下的有益效果：

(1)通过先在酸性条件下对银杏叶提取获得银杏叶提取物，然后再在载体的存在下对银杏叶提取物再次纯化，一方面提高了银杏内酯B的浸出率，从而提高了其收率，再一方面提高了对银杏内酯B的纯化效果，从而提高了最终产品的纯度。

(2)由于本发明的方法可以提高银杏内酯B的浸出和纯化效果，因此，本发明可以在不进行柱分离和纯化的情况下进行银杏内酯B的提取，也能够达到可观的收率和纯度。

(3)由于本发明的方法可以提高银杏内酯B的浸出效果和纯化效果，因此，本发明可以在不使用有机溶剂反复提取银杏叶(也即仅进行1次提取)以获得银杏叶提取物以及反复进行结晶的情况下(也即，仅需要进行一次结晶)，也能够达到可观的收率和纯度。

(4)在本发明优选使用柠檬酸提供酸性条件的情况下，能够更为有效的将银杏叶中的银杏内酯B浸出，从而进一步增加银杏内酯B的收率和纯度。

(5)当所述载体优选为活性炭和氧化铝的混合载体的情况下，在进一步优选的，活性炭与氧化铝的重量比为5-15:1，和/或所述氧化铝为α-氧化铝的情况下，两者配合能够使得银杏内酯B能够更均匀快速的分散在第二有机溶剂中，从而对银杏内酯B的分离和纯化起到协同的作用，进一步提高其收率和纯度。

(6)当所述第二有机溶剂为乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合溶剂时，能够进一步提高银杏内酯B的收率和纯度。

(7)当采用本发明优选的分步结晶方法，进一步优选的，第一阶段在搅拌的条件下进行，在第二阶段结晶结束后，将部分晶体分离，或所述第一阶段结晶和第二阶段结晶在乙酸乙酯的存在下进行，所述第三阶段结晶在乙酸乙酯和乙醇的存在下进行，能够有效降低结晶母液中银杏内酯B的含量，从而可以避免再对母液进行反复结晶的操作，一方面简化了操作步骤，另一方面提高了银杏内酯B的收率和纯度。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供了一种银杏内酯B的提取方法，该方法包括：

(1)在酸性的条件下，将银杏叶与第一有机溶剂接触，并进行加热回流提取，得到银杏叶提取物；

(2)在载体的存在下，将所述银杏叶提取物与第二有机溶剂接触，并进行加热回流以对银杏内酯B进行分离，然后固液分离得到液相；其中，所述载体为活性炭和/或氧化铝；

(3)将所述液相与水混合，并分离得到有机溶剂层，然后减压浓缩至无有机溶剂，得到含有银杏内酯B的浓缩物；

(4)将所述浓缩物溶解于第三有机溶剂中，并进行结晶处理，得到银杏内酯B的结晶物。

根据本发明，步骤(1)中，在进行银杏叶提取物的制备之前，该方法还可以包括将银杏叶进行水洗至表面无尘，然后再进行粉碎。

根据本发明，尽管只要在酸性的条件下进行银杏叶提取物的制备即可实现本发明的目的，而对于其pH值没有特别的限制。但优选的，为了进一步提高银杏内酯B的收率和纯度，所述酸性条件的pH值为1-6，优选为3-5，例如，可以为3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5。

根据本发明，所述酸性条件的获得方式不受特别的限制，例如，可以直接将银杏叶与酸化的第一有机溶剂接触，也可以先将银杏叶进行酸处理，然后再与第一有机溶剂接触，此外，这两种方式可以同时进行。根据本发明一种优选的实施方式，先将酸加入到银杏叶中(相对于1g的银杏叶，酸的用量优选为3-5L)，进行浸煮(10-20min)，然后再加入酸化的第一有机溶剂，并进行加热回流提取，得到银杏叶提取物，其中，在该优选的实施方式下，浸煮过程中体系的pH值以及有机溶剂提取过程中的pH均优选在上述范围内。

根据本发明，可以通过添加常规的酸调节剂以获得所述酸性条件，例如，可以为但不限于盐酸、硫酸、醋酸和柠檬酸。但本发明的发明人在研究中发现，采用柠檬酸获得所述酸性条件，能够进一步提高最终银杏内酯B的收率和纯度。因此，优选的，通过添加柠檬酸获得所述酸性的条件。

根据本发明，尽管可以按照常规的方法再使用第一有机溶剂进行银杏叶的反复提取，但本发明的发明人发现，采用在酸性条件下的提取方式，优选按照如上的2步酸性条件提取的方法，能够有效的将银杏内酯B从银杏叶中提取出来，最终制备得到的银杏内酯B产品能够满足需求。因此，本发明的方法可以避免对银杏叶的反复提取，在1次第一有机溶剂提取接受后，通过固液分离，即可获得所述银杏叶提取物，在保障银杏内酯B最终收率和纯度的情况下，大大简化的了步骤，节约了成本。

根据本发明，所述第一有机溶剂可以为本领域常规的选择，优选的，所述第一有机溶剂为乙醇。其中，乙醇的浓度可以在较宽的范围内选择，优选的，所述乙醇的浓度为50-90体积％，更优选为70-80体积％。

根据本发明，所述第一有机溶剂的用量不受特别的限制，优选的，相对于1kg的银杏叶，所述第一有机溶剂的用量为5-15L，优选为，8-12L。

根据本发明，步骤(1)中所述加热回流的条件可以为本领域的常规选择，例如，温度可以为75-85℃，时间可以为2-3小时。

根据本发明，步骤(2)中，可以将第一有机溶剂提取并固液分离后的滤液直接在载体的存在下与第二有机溶剂接触，也可以将所述滤液加压浓缩以去除第一有机溶剂后的浓缩物在载体的存在下与第二有机溶剂接触。本发明优选后者，也即，在将所述银杏叶提取物与所述载体接触前，还可以包括将所述银杏叶提取物减压浓缩，以去除所述第一有机溶剂，例如，将90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％的第一有机溶剂去除。其中，所述减压浓缩的条件可以为常规的条件，例如，述减压浓缩的压力为-0.08MPa至-0.1MPa；减压浓缩的温度为45-65℃。

所述载体的存在可以增加银杏叶提取物在第二有机溶剂中的分散性，从而使得银杏内酯B更容易的溶解在第二有机溶剂中，此外，所述载体的存在，可以和第二有机溶剂进行很好的配合，更有针性地对银杏内酯B进行选择，从而提高其纯度。

尽管只要在活性炭或氧化铝作为载体的情况下，对银杏叶提取物中的银杏内酯B进行分离提取即可提高其提取效率，但优选的，当所述载体为活性炭和氧化铝的混合载体时，能够进一步提高银杏内酯B的收率和纯度。

优选的，所述活性炭和氧化铝的混合比例可以在较宽的范围内调整，优选的，所述活性炭的用量大于所述氧化铝的用量，更优选的，活性炭与氧化铝的重量比为5-15:1，优选为8-12:1，例如，8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1、10.5:1、11:1、11.5:1、12:1。

优选的，所述氧化铝为α-氧化铝。

根据本发明，所述载体的用量可以在较宽的范围内进行选择，优选的，相对于1重量份的银杏叶提取物，所述载体的用量为0.2-2倍，优选为0.5-0.8倍，例如，可以为0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍。

根据本发明，所述第二有机溶剂可以为本领域常规的能够分离银杏内酯B的有机溶剂，例如，可以为乙酸乙酯和/或乙酸甲酯。为了进一步提高银杏内酯B的收率和纯度，所述第二有机溶剂优选为乙酸乙酯和乙酸甲酯。其中，乙酸乙酯和乙酸甲酯的混合比例可以在较宽的范围内进行选择，优选，乙酸乙酯的用量大于乙酸甲酯的用量，更优选的，乙酸乙酯与乙酸甲酯的体积比为5-10:1，更优选为6-8:1。

根据本发明，所述第二有机溶剂的用量可以在较宽的范围内进行改变，优选的，相对于1g的银杏叶提取物，所述第二有机溶剂的用量为10-25ml，优选为15-20ml。

根据本发明，步骤(2)中所述加热回流的条件可以为本领域的常规选择，例如，温度可以为75-85℃，时间可以为0.5-2小时。

根据本发明，步骤(3)中，可以直接将所述滤液与水混合，也可以将所述滤液适当浓缩后再与水混合，本发明并没有特别的限制，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择。其中，优选的，将所述液相的固含量控制在0.02-0.1g/ml。

根据本发明，对步骤(3)中分离出的有机溶剂层进行减压浓缩的条件可以为常规的条件，例如，述减压浓缩的压力为-0.08MPa至-0.1MPa；减压浓缩的温度为45-65℃。

其中，所述减压浓缩至无有机溶剂是指基本上无有机溶剂，而非指绝对的不含有有机溶剂，例如，将90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、99.8％或100％的有机溶剂去除。

根据本发明，步骤(4)中，所述第三有机溶剂可以为常规的用于对银杏内酯B进行溶解并结晶的有机溶剂，例如，可以为但不限于乙酸乙酯、甲醇、乙醇等。

其中，所述第三有机溶剂的用量不受特别的限制，优选的，所述第三有机溶剂的用量为0.5-1.5倍体积的所述浓缩物体积。

根据本发明，所述结晶的条件可以不受特别的限制，可以为本领域常规的结晶条件，例如，在0-10℃的条件下结晶12-24小时。

根据本发明，尽管可以像现有技术一样，在对所述浓缩物进行结晶前，将其进行过柱处理，例如，过酸性氧化铝柱，然后再通过粗结晶、重结晶甚至对结晶母液进行结晶等反复结晶的方式进行结晶，以提高银杏内酯B的收率和纯度。但本发明的发明人发现，通过将结晶分为如下的3个阶段，在保证银杏内酯B纯度的情况下，可以避免过柱、反复结晶以及对结晶母液进行重复结晶的操作。因此，优选的，所述结晶的方法包括如下阶段：

第一阶段：将待结晶物料在8-10℃的条件下结晶1-2小时；

第二阶段：将第一阶段产物在4-8℃的条件下结晶3-10小时；

第三阶段：将第二阶段产物在0-4℃条件下结晶8-12小时。

能够理解的是，第一阶段的结晶温度大于第二阶段的结晶温度，第二阶段的结晶温度大于第三阶段的结晶温度。

通过如上的结晶方法，在第一阶段中，发明人发现，先在较高的温度下进行短时间的结晶，可以使得银杏内酯B优先少量析出，而其他杂质分子仍然停留在第三有机溶剂中。第二阶段中，在降低的温度下继续结晶，第一段结晶的少量银杏内酯B可以作为晶核有助于银杏内酯B的大量析出，而其它杂质分子无法有效析出。在第三阶段中，继续降低温度结晶，在第二阶段析出晶体的基础上，母液中的大部分银杏内酯B析出，基本没有给杂质的析出留下任何空间。

通常情况下，银杏内酯B的结晶均是在静置的条件下进行的，但本发明的发明人发现，所述第一阶段在搅拌的条件下进行能够进一步提高最终所得银杏内酯B的收率和纯度。其中，所述搅拌的转速为100-300rpm，例如，可以为100rpm、125rpm、150rpm、175rpm、200rpm、225rpm、250rpm、275rpm、300rpm。

根据本发明，为了进一步提高银杏内酯B的纯度和收率，优选的，在第二阶段结束后，且第三阶段开始前，优选将体系中40-70％的分离出，然后再在第三阶段的条件下进行结晶。

其中，所述第二阶段优选在静置的条件下进行。

其中，所述第三阶段优选在静置的条件下进行。

根据本发明，为了进一步提高银杏内酯B的纯度和收率，所述第一阶段结晶和第二阶段结晶在乙酸乙酯的存在下进行，所述第三阶段结晶在乙酸乙酯和乙醇(70-80体积％)的存在下进行。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例和对比例中：

银杏内酯B产品中银杏内酯B含量采用HPLC检测分析。

银杏内酯B的收率＝银杏内酯B产品重量g/银杏叶重量kg。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的银杏内酯B的制备方法

(1)将银杏叶称重后，水洗除尘，然后粉碎，加入pH值为4的柠檬酸溶液(料液比为1kg：4L)，并在搅拌的条件下进行浸煮15min，然后加入70％的乙醇溶液(料液比1kg：10L)80℃下加热回流提取2h，然后过滤除杂，得到滤液，并将所述滤液在-0.1MPa的压力以及55℃的条件下减压浓缩至无乙醇味，得到银杏叶提取物。

(2)将活性炭和α-氧化铝按照10:1的重量比混合后获得载体后加入到乙酸乙酯和乙酸甲酯(体积比7:1)的第二有机溶剂中，然后加入步骤(1)获得的银杏叶提取物，80℃下加热回流提取1h。其中，相对于1g的银杏叶提取物，所述载体的用量为0.6g，第二有机溶剂的用量为18ml。之后将物料进行过滤，获得银杏内酯B的粗提液，然后浓缩至固形物含量为0.05g/ml，获得浓缩物。

(3)相对于1体积份的浓缩物，向其中加入0.2体积份的蒸馏水，混合均匀并静置分层后，分离出有机溶剂层，然后在-0.1MPa的压力以及55℃的条件下减压浓缩至无有机溶剂味，得到含有银杏内酯B的浓缩物。

(4)将所述含有银杏内酯B的浓缩物溶于乙酸乙酯中，先在9℃以及180rpm的搅拌转速下结晶1.5h，然后降低温度值6℃，静置结晶7h，得到结晶物I，分离出50％结晶物I后，加入40％乙醇并将体系降温至2℃继续结晶10h，得到结晶物II，将结晶物II分离后与结晶物I合并，得到银杏内酯B结晶物。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的银杏内酯B的制备方法

(1)将银杏叶称重后，水洗除尘，然后粉碎，加入pH值为3的柠檬酸溶液(料液比为1kg：5L)，并在搅拌的条件下进行浸煮10min，然后加入75％的乙醇溶液(料液比1kg：12L)75℃下加热回流提取3h，然后过滤除杂，得到滤液，并将所述滤液在-0.1MPa的压力以及55℃的条件下减压浓缩至无乙醇味，得到银杏叶提取物。

(2)将活性炭和α-氧化铝按照8:1的重量比混合后获得载体后加入到乙酸乙酯和乙酸甲酯(体积比6:1)的第二有机溶剂中，然后加入步骤(1)获得的银杏叶提取物，75℃下加热回流提取1.5h。其中，相对于1g的银杏叶提取物，所述载体的用量为0.5g，第二有机溶剂的用量为20ml。之后将物料进行过滤，获得银杏内酯B的粗提液，然后浓缩至固形物含量为0.05g/ml，获得浓缩物。

(3)相对于1体积份的浓缩物，向其中加入0.2体积份的蒸馏水，混合均匀并静置分层后，分离出有机溶剂层，然后在-0.1MPa的压力以及55℃的条件下减压浓缩至无有机溶剂味，得到含有银杏内酯B的浓缩物。

(4)将所述含有银杏内酯B的浓缩物乙酸乙酯中，先在8℃以及150rpm的搅拌转速下结晶1h，然后降低温度值4℃，静置结晶4h，得到结晶物I，分离出40％结晶物I后，加入40％乙醇并将体系降温至0℃继续结晶8h，得到结晶物II，将结晶物II分离后与结晶物I合并，得到银杏内酯B结晶物。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的银杏内酯B的制备方法

(1)将银杏叶称重后，水洗除尘，然后粉碎，加入pH值为5的柠檬酸溶液(料液比为1kg：3L)，并在搅拌的条件下进行浸煮20min，然后加入80％的乙醇溶液(料液比1kg：8L)85℃下加热回流提取2.5h，然后过滤除杂，得到滤液，并将所述滤液在-0.1MPa的压力以及55℃的条件下减压浓缩至无乙醇味，得到银杏叶提取物。

(2)将活性炭和α-氧化铝按照12:1的重量比混合后获得载体后加入到乙酸乙酯和乙酸甲酯(体积比8:1)的第二有机溶剂中，然后加入步骤(1)获得的银杏叶提取物，85℃下加热回流提取0.5h。其中，相对于1g的银杏叶提取物，所述载体的用量为0.8g，第二有机溶剂的用量为15ml。之后将物料进行过滤，获得银杏内酯B的粗提液，然后浓缩至固形物含量为0.05g/ml，获得浓缩物。

(3)相对于1体积份的浓缩物，向其中加入0.2体积份的蒸馏水，混合均匀并静置分层后，分离出有机溶剂层，然后在-0.1MPa的压力以及55℃的条件下减压浓缩至无有机溶剂味，得到含有银杏内酯B的浓缩物。

(4)将所述含有银杏内酯B的浓缩物溶于乙酸乙酯中，先在10℃以及200rpm的搅拌转速下结晶1.5h，然后降低温度值8℃，静置结晶10h，得到结晶物I，分离出70％结晶物I后，加入40％乙醇并将体系降温至4℃继续结晶12h，得到结晶物II，将结晶物II分离后与结晶物I合并，得到银杏内酯B结晶物。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的银杏内酯B的制备方法

按照实施例1的方法进行银杏内酯B的制备，不同的是，将柠檬酸替换为等体积的盐酸。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的银杏内酯B的制备方法

按照实施例1的方法进行银杏内酯B的制备，不同的是，直接向银杏叶中加入等体积的柠檬酸和等体积的70％乙醇溶液，在80℃下加热回流提取2小时15分钟。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

对比例1

本对比例用于说明参比的银杏内酯B的制备方法

按照实施例1的方法进行银杏内酯B的制备，不同的是，不进行酸提的步骤，而是直接向银杏叶中加入相当于柠檬酸和70％乙醇体积的70％乙醇，在80℃下加热回流提取2小时15分钟。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

实施例6

本实施例用于说明本发明提供的银杏内酯B的制备方法

按照实施例1的方法进行银杏内酯B的制备，不同的是，将活性炭全部替换为α-氧化铝。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

实施例7

本实施例用于说明本发明提供的银杏内酯B的制备方法

按照实施例1的方法进行银杏内酯B的制备，不同的是，将α-氧化铝全部替换为活性炭。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

对比例2

本对比例用于说明参比的银杏内酯B的制备方法

按照实施例1的方法进行银杏内酯B的制备，不同的是，将活性炭和α-氧化铝替换为等量的硅藻土。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

对比例3

本对比例用于说明参比的银杏内酯B的制备方法

按照实施例1的方法进行银杏内酯B的制备，不同的是，将α-氧化铝替换为等量的硅藻土。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

实施例8

本实施例用于说明本发明提供的银杏内酯B的制备方法

按照实施例1的方法进行银杏内酯B的制备，不同的是，将乙酸甲酯替换为等量的乙酸乙酯。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

实施例9

本实施例用于说明本发明提供的银杏内酯B的制备方法

按照实施例1的方法进行银杏内酯B的制备，不同的是，第一阶段的结晶不在搅拌的条件下进行。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

实施例10

本实施例用于说明本发明提供的银杏内酯B的制备方法

按照实施例1的方法进行银杏内酯B的制备，不同的是，第二阶段结晶后不对结晶物I进行分离。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

实施例11

本实施例用于说明本发明提供的银杏内酯B的制备方法

按照实施例1的方法进行银杏内酯B的制备，不同的是，分离出结晶物I后，继续加入的是乙酸乙酯，而不是乙醇。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

实施例12

本实施例用于说明本发明提供的银杏内酯B的制备方法

按照实施例1的方法进行银杏内酯B的制备，不同的是，步骤(4)中，直接在2℃的条件下，在等量的乙酸乙酯和乙醇的存在下，静置结晶18.5h。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

实施例13

本实施例用于说明本发明提供的银杏内酯B的制备方法

(1)将银杏叶称重后，水洗除尘，然后粉碎，加入pH值为4的柠檬酸溶液(料液比为1kg：4L)，并在搅拌的条件下进行浸煮15min，然后加入70％的乙醇溶液(料液比1kg：10L)80℃下加热回流提取2h，然后过滤，滤渣继续在相同的条件下使用70％的乙醇提取2次，合并滤液，并将所述滤液在-0.1MPa的压力以及55℃的条件下减压浓缩至无乙醇味，加入纯化水(1kg银杏叶：3L纯化水)，静置，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱(D101)，纯化水洗柱去杂，70％乙醇洗脱至洗脱液颜色变淡得到银杏叶提取物。

(2)将活性炭和α-氧化铝按照10:1的重量比混合后获得载体后加入到乙酸乙酯和乙酸甲酯(体积比7:1)的第二有机溶剂中，然后加入步骤(1)获得的银杏叶提取物，80℃下加热回流提取1h。其中，相对于1g的银杏叶提取物，所述载体的用量为0.6g，第二有机溶剂的用量为18ml。之后将物料进行过滤，获得银杏内酯B的粗提液，然后浓缩至固形物含量为0.05g/ml，获得浓缩物。

(3)相对于1体积份的浓缩物，向其中加入0.2体积份的蒸馏水，混合均匀并静置分层后，分离出有机溶剂层，然后在-0.1MPa的压力以及55℃的条件下减压浓缩至无有机溶剂味，得到含有银杏内酯B的浓缩物。

(4)将所述含有银杏内酯B的浓缩物溶于乙酸乙酯中，过酸性氧化铝柱，用水饱和乙酸乙醋洗脱，收集洗脱液；洗脱液减压浓缩至无乙酸乙醋味，加适量乙醇使之溶解，再加水至使含醇量为70％，静置，使析出粗结晶，过滤，取粗结晶，烘干；粗结晶依次用乙醇重结晶3次和乙酸乙醋重结晶1次，得成品银杏内醋B化合物。计算银杏内酯B的收率和含量，结果如表1所示。

表1

	收率(g/kg)	含量(重量％)
			实施例1	0.60	99.8
实施例2	0.62	99.7
			实施例3	0.63	99.7
实施例4	0.55	99.6
			实施例5	0.50	99.5
对比例1	0.31	98.5
			实施例6	0.49	99.1
实施例7	0.53	99.4
			对比例2	0.35	98.2
对比例3	0.39	98.9
			实施例8	0.55	99.6
实施例9	0.56	99.3
			实施例10	0.54	99.1
实施例11	0.56	99.3
			实施例12	0.58	99.1
实施例13	0.49	99.9

由表1可以看出，本发明的方法制备银杏内酯B，可以获得较高的收率和纯度。在优选方案下，纯度和收率能够进一步提高。

测试例

按照中国药典2005版第二部附录IXI C药物稳定性试验，指导加速试验，测试如上实施例和对比例制备的银杏内酯B产品。

加速试验9个月后，实施例1-3和13所得产品纯度下降在0.5％以内，实施例4-12所得产品纯度下降在0.5-0.8％之间，而对比例下降大于1％。

由此可见，本发明提供的银杏内酯B制备的银杏内酯B中所含杂质对药物稳定性影响较小。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种银杏内酯B的提取方法，其特征在于，该方法包括：

（1）在酸性的条件下，将银杏叶与第一有机溶剂接触，并进行加热回流提取，得到银杏叶提取物；

（2）在载体的存在下，将所述银杏叶提取物与第二有机溶剂接触，并进行加热回流以对银杏内酯B 进行分离，然后固液分离得到液相；其中，所述载体为活性炭和α-氧化铝；

（3）将所述液相与水混合，并分离得到有机溶剂层，然后减压浓缩至无有机溶剂，得到含有银杏内酯B的浓缩物；

（4）将所述浓缩物溶解于第三有机溶剂中，并进行结晶处理，得到银杏内酯B的结晶物；

其中，步骤（1）中，通过添加柠檬酸获得所述酸性的条件，所述酸性条件的pH值为3-5；

所述第一有机溶剂为浓度为50-90体积%的乙醇；

其中，步骤（2）中所述第二有机溶剂为乙酸乙酯和乙酸甲酯；

其中，步骤（4）中，所述结晶的方法包括如下阶段：

第一阶段：将待结晶物料在8-10℃且搅拌的条件下结晶1-2小时，所述搅拌的转速为100-300rpm；

第二阶段：将第一阶段产物在4-8℃的条件下结晶3-10小时，在第二阶段结晶结束后，将40-70%的晶体分离，剩余物料进行第三阶段结晶；

第三阶段：将第二阶段剩余物料在0-4℃条件下结晶8-12小时；

其中，所述第三有机溶剂为乙酸乙酯和/或乙醇，所述第一阶段结晶和第二阶段结晶在乙酸乙酯的存在下进行，所述第三阶段结晶在乙酸乙酯和乙醇的存在下进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于1g的银杏叶，所述第一有机溶剂的用量为5-15g。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，活性炭与氧化铝的重量比为5-15:1。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其中，相对于1g的银杏叶提取物，所述载体的用量为0.2-2g。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，在将所述银杏叶提取物与所述载体接触前，还包括将所述银杏叶提取物减压浓缩，以去除所述第一有机溶剂。