CN111135110B - 含有人参皂苷rg3的皮肤外用剂组合物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有人参皂苷Rg3的皮肤外用剂组合物的应用，该组合物将人参皂苷Rg3作为有效成分，并能够提供改善抗头屑的效果。

Description

含有人参皂苷RG3的皮肤外用剂组合物的应用
相关申请
本申请是申请号为201710971175.0、申请日为2014年4月24日、优先权日为2013年4月24日、发明名称为“含有人参皂苷RG3的皮肤外用剂组合物”的中国发明专利申请的分案申请，其中，申请号为201710971175.0的申请是申请号为201480032940.7、申请日为2014年4月24日、优先权日为2013年4月24日、发明名称为“含有人参皂苷RG3的皮肤外用剂组合物”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种含有人参皂苷Rg3的组合物的应用，该组合物能够提供改善粉刺和皮肤过敏效果、皮肤收紧及毛孔收缩效果，并且还能够提供改善皮肤气色效果、促进头发生长、改善白发、抗头屑及防腐效果。
背景技术
人类的皮肤作为人体一次防御膜而能够起到从温度和湿度的改变、紫外线、公害物质等外部环境的刺激中保护体内器官的功能，皮肤随着年龄的增长由内在因素和外在因素产生变化。即，内在因素为降低用于调节新陈代谢的各种分泌物的分泌量、降低免疫细胞功能和细胞活性，从而导致使活体所需的免疫蛋白质和生体结构蛋白质的生物合成减少。外在因素为由臭氧层的破坏导致增加太阳光线中到达地表的紫外线含量，并随着环境污染的进一步深化而增加自由基和活性有害氧等，从而使得皮肤产生多种变化，即，皮肤厚度变薄、增加皱纹，并且不仅导致降低弹力而且皮肤血色也变暗、经常发生皮肤过敏，并且增加斑点、雀斑以及老年斑，并且使得气色变差、皮肤肤色变暗。
为了防止由这种皮肤内在及外在因素导致的皮肤状态产生变化以维持健康皮肤状态，以往中为了改善皮肤状态而做出了如下的努力，即，通过将从已知的各种动物、植物、微生物等中获得的生理活性物质添加到化妆品而使用。
人参皂苷(Ginsenoside)称为人参所具有的皂苷，其中皂苷在化学上是称为配糖体(glycoside)的化合物的一种。人参皂苷是为了与其他植物的皂苷进行区分而以从人参(ginseng)分离的配糖体(glyco-side)为含义附上的名称。人参皂苷普遍可以命名为人参皂苷Rx(ginsenoside-Rx)等。在此，“R”的含义是根(Radix或者Root)，“x”根据薄层色谱(TLC)上所显示的斑点(spot)的移动距离(Rf值)从下侧沿上侧依次命名为o、a、b、c、d、e、f、g和h等。人参皂苷以中枢神经系统为首对内分泌系统、免疫系统、代谢系统等带来影响，从而对身体功能调节发挥多种效果。至今为止从高丽人参(包括红参)中分离鉴定出30多种以上的人参皂苷，并且陆续揭开了各个人参皂苷的药理作用。这种人参皂苷表现出相似的作用或相反的作用。例如，作为典型皂苷PPD的人参皂苷，G-Rb1对中枢神经系统表现出抑制效果，作为典型皂苷PPT的G-Rg1对中枢神经系统具有促进效果。
人参皂苷根据皂苷糖苷配基(aglycon)的结构可以分为以下三种，即，二醇型人参皂苷(Panaxadiol-type Ginsenosides：Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3)、三醇型人参皂苷(Panaxatriol-type Ginsenosides：Re、Rf、Rgl、Rg2)、齐墩果酸型人参皂苷(Oleanolic acid-type Ginsenosides)等。人参根中的二醇型皂苷含量最多，其为48％-60％，其次三醇型皂苷含量占30％-35％，并且人参根中含有微量齐墩果酸型皂苷。
作为在对这种人参进行蒸参过程中生成的少量人参皂苷的一种，有关Rg3的药理学作用具有以下口服用药理作用相关的专利，即，有抑制癌细胞转移作用、血小板凝聚抑制作用和抗血栓作用、血管舒张作用、实验性肝损伤抑制作用、抗癌剂的抗药抑制作用等。但是目前还没有对于将人生皂苷Rg3作为有效成分的组合物具有如下效果的报告，即该组合物能够改善粉刺和皮肤过敏效果、皮肤收紧及毛孔收缩效果、改善皮肤气色效果、促进头发生长、改善白发、抗头屑及防腐效果。
发明内容
技术课题
对此，本发明人发现了人生皂苷Rg3能够提供改善粉刺和皮肤过敏效果、皮肤收紧及毛孔收缩效果，提供改善皮肤气色效果、促进头发生长、改善白发、抗头屑及防腐效果，并完成了本发明。
由此，本发明的目的在于提供一种含有人参皂苷Rg3的皮肤外用剂组合物，该皮肤外用剂组合物能够提供改善粉刺和皮肤过敏效果、皮肤收紧及毛孔收缩效果，并且还能够表现出改善皮肤气色效果、促进头发生长、改善白发、抗头屑及防腐效果。
课题解决方法
为了达到上述目的，本发明提供一种含有人参皂苷Rg3作为有效成分的皮肤外用剂组合物，该组合物为用于改善粉刺的组合物。
另外，本发明提供一种含有人参皂苷Rg3作为有效成分的皮肤外用剂组合物，该组合物为用于改善皮肤气色和肤色的组合物。
另外，本发明提供一种含有人参皂苷Rg3作为有效成分的皮肤外用剂组合物，该组合物为用于收缩毛孔的组合物。
另外，本发明提供一种含有人参皂苷Rg3的皮肤外用剂组合物，该组合物为用于促进头发生长的组合物。
另外，本发明提供一种含有人参皂苷Rg3的皮肤外用剂组合物，该组合物为用于防止白发的组合物。
另外，本发明提供一种含有人参皂苷Rg3的皮肤外用剂组合物，该组合物为抗头屑的组合物。
另外，本发明提供一种含有人参皂苷Rg3的皮肤外用剂组合物，该组合物用作天然防腐剂。
发明效果
本发明的组合物含有人参皂苷Rg3而能够提供改善粉刺和皮肤过敏效果、皮肤收紧及毛孔收缩效果，并能够提供改善皮肤气色效果、促进头发生长、改善白发、抗头屑及防腐效果。
具体实施方式
根据本发明的组合物含有作为有效成分的人参皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3)。
本发明使用的人参皂苷Rg3具有以下化学式1的结构。
化学式1
Figure BDA0002367777780000041
本发明的人参皂苷Rg3可以从植物中提取，也可以使用根据本领域公知的方法来合成，也可以为市场上销售的人参皂苷Rg3。另外，人参皂苷Rg3可以从人参提取物中获得。此时，并没有特别限制所使用的人参种类，可以采用水参、红参、白参、太极参、参须
Figure BDA0002367777780000051
等。另外，所述人参提取物不仅包括从人参浸出、调取而获得的浸出液，而且还包括再次对部分浸出液或者整个浸出液进行浓缩而获得的浓缩物，或者还可以包括对所述浓缩液再次进行干燥而制造的包含于沉滞、煎煮、酊剂、流体精华和人参中以发挥主要效果的化学物质，当然，也可以包括植物本身，可以使用茎、根、叶子、花、果实等人参的所有部位的提取物，而并不限定于某个特定部位的提取物。另外，对于从人参提取物中提取人参皂苷Rg3的方法可以采用公知的方法。
具体地，通过本领域公知的方法从人参中利用水或有机溶剂制备人参提取物后，从该人参提取物中分离所述人参皂苷Rg3。本发明使用的有机溶剂可以从乙醇、甲醇、丁醇，乙醚，乙酸乙酯，氯仿以及这些有机溶剂和水的混合溶液组成的组中选择，并且优选采用80％的乙醇。此时，提取温度优选为10-80℃，可以提取3-24小时。当脱离所述提取温度和提取时间范围时，可能会降低提取效率或者产生成分的变化。
优选地，本发明的组合物中所含的所述人参皂苷Rg3的含量在组合物的总含量中占0.001-50重量％。这是由于当所述有效成分的含量未达到0.001重量％时，由所述成分引起的功效和效果微弱，当超过50重量％时导致产生皮肤安全性或剂型
Figure BDA0002367777780000052
上的问题。
本发明的组合物可以用作能够改善粉刺的皮肤外用剂组合物，该皮肤外用剂组合物能够提供抗菌效果，特别是对粉刺致病菌的抗菌效果优良，并且提供抗炎效果。
本发明的组合物可以用作能够改善气色和肤色的皮肤外用剂组合物，在将该皮肤外用剂组合物使用于皮肤上时，通过扩张毛细血管且促进血液循环，从而能够将营养成分顺畅地供给至皮肤，抑制皮肤老化而具有优越的气色及肤色改善效果。
本发明的组合物可以用作能够收缩毛孔、调节皮脂并改善皮肤过敏的皮肤外用剂组合物，在将该皮肤外用剂组合物使用于皮肤上时，能够抑制过度分泌的皮脂，通过促进活性氧的去除和胶原蛋白的合成而能够收缩毛孔，并且通过减少发炎因子的表现而具有优越的抑制皮肤过敏的效果。
本发明的组合物可以用作能够促进头发生长的组合物，该组合物通过促进使得休止期的头发周期过渡到生长期的头发周期，从而不仅具有能够促进头发生长和新发生长的效果，而且还具有能够使现有的头发健康生长的效果，并且提供预防且抑制头发从头皮脱落的现象或头发稀疏、变细现象。
本发明的组合物可以用作防止产生白发的组合物，该组合物通过增加黑色素细胞的MIFT的表达而使得黑色素细胞活性化并促进黑色素的合成，从而能够预防白发的产生，并提供促进诱发黑发产生的效果。
本发明的组合物可以用作抗头屑的皮肤外用剂组合物，该组合物能够有效地排出积累于头发和头皮上的毒素而净化头皮，并且抑制头皮屑芽孢杆菌的增殖和生长而预防头皮炎症反应，另外具有优越的抑制活性氧的产生和作用的抗氧化功效而镇定并强化头皮，从而提供强化原始的防御能力的效果。
本发明的组合物可以用作天然防腐剂组合物，该组合物由于含有天然成分，从而提供优越的防腐效果和对人体无害的效果。
根据本发明的组合物可以含有在化妆品学或皮肤科学上被许可的介质或者基质而成剂型化。该组合物作为适合于局部用的所有剂型，例如可以提供为溶液、凝胶、固体、糊状无水生成物
Figure BDA0002367777780000061
在液相中分散油相而获得的乳液、悬浊液、微乳液、微胶囊、微颗粒球或者离子型(脂质体)和非离子型的囊泡分散剂的形式，或者也可以提供为面霜、化妆水、护肤乳、粉底、软膏、喷雾或遮瑕膏的形式。此外，还可以使用泡沫(foam)状或者进一步含有压缩的推进剂的气溶胶组合物的形式。这些组合物能够通过本领域中通常的方法而制造。
特别是，本发明的皮肤外用剂组合物用于防止头屑、育发
Figure BDA0002367777780000071
或者防止白发时，可以以用于头皮和头发的组合物的形式使其剂型化，而并不特别限定剂型，例如，可以剂型化为生发剂、头发营养化妆水、头皮护理液、头发护理液、洗发水、护发素、头发乳或者头皮和头发兼用护理液等。
另外，根据本发明的组合物可以含有脂肪物质、有机溶剂、溶解剂、浓缩剂、凝胶化剂、软化剂、抗氧化剂、悬浮剂、稳定剂、发泡剂(foaming agent)、芳香剂、表面活性剂、水、离子型或非离子型柔化剂、填充剂、金属离子封锁剂
Figure BDA0002367777780000073
螯合剂
Figure BDA0002367777780000072
保鲜剂、维生素、阻断剂、湿润剂、精油、染料、颜料、亲水性或亲油性活性剂、脂质囊泡或者与通常用于化妆品中的任意其他成分相同且在化妆品学或皮肤科学领域通常使用的辅助剂。加入的所述辅助剂的量为化妆品学或皮肤科学领域中普遍使用的量。
另外，本发明的组合物为了增加皮肤改善效果而可以含有促进皮肤吸收的物质。
实施例
以下，通过实验例和剂型例对本发明的结构和效果进行更具体地说明。但是，这些试验例和剂型例仅为用于帮助理解本发明而提供的例子，本发明的范畴和范围并不限定于下述例子。
[参考例1]准备人身皂苷Rg3
为了试验本发明的组合物的功效而使用的人身皂苷Rg3是从AMBO研究所
Figure BDA0002367777780000074
购买的。
[剂型例1和比较剂型例1]
根据以下表1的组成通过通常的方法制造了营养面霜(单位：重量％)。
表1
Figure BDA0002367777780000081
[试验例1]改善气色效果
为了评价根据本发明的化妆品组合物的促进皮肤血液循环效果，利用LDPI(LaserDoppler Perfusion Imager；periscan PIM II，Perimed(stochholm，Sweden))测定了皮肤中的血液循环程度。LDPI广为人知的是作为测定皮肤中的血液循环的设备且为目前所使用的设备，其是一种不仅能够测定皮肤毛细血管中的血液速度和量、而且还能够测定小动脉和小静脉中的流动的非常灵敏的设备。
在恒温恒湿室内利用皂洗完脸后适应了30分钟，并利用LDPI测定了初始值。首先，利用LDPI测定了30名平时手脚凉的女性的额头以下部分的初始血流量。之后对被实验者使用一周的所述剂型例1和比较剂型例1，从而将测定出的血流量与所述初始测定值进行比较而得出的结果(皮肤血流量变化)在以下表2中示出。
表2
Figure BDA0002367777780000091
从所述表2的结果中能够得出，根据本发明的化妆品组合物相比于不含有人参皂苷Rg3的比较剂型例1显著增加了皮肤血流量，并且通过这种血液循环的促进而能够确认到改善了气色。这最终表明根据本发明的含有人参皂苷Rg3的化妆品组合物能够有效传递皮肤的营养成分，并抑制且滞延皮肤的老化。
[试验例2]改善肤色效果
为了得知所述剂型例1和比较剂型例1的改善肤色效果，对30名的被实验者分别使用(晚1次/日涂覆，总共1周)后，利用Facial Stage DM-3(Moritex，Japan)设备评价了肤色改善程度。肤色改善率利用皮肤的明度测定值和颜色测定值来判断皮肤的明度变化值和颜色变化值，并且其结果在以下表3中示出。明度变化值和颜色变化值大表示改善了肤色。
表3
Figure BDA0002367777780000092
从所述表3的结果中能够确定，根据本发明的不含有人参皂苷Rg3的比较剂型例1没有表现出改善肤色的功效，反面，含有有效成分的人参皂苷Rg3的剂型例1中使用后的肤色比使用前改善很多。
[试验例3]收缩毛孔效果
1.通过促进胶原蛋白生物合成的收缩毛孔的效果
通过比较根据本发明的人参皂苷Rg3与TGF-β，从而测定促进胶原蛋白生物合成的效果。首先，在24孔板(well)的每个孔中接种(seeding)105个成纤维细胞(fibroblast)，并培养成细胞成长至90％的程度。利用无血清DMEM培养基培养24小时之后，将溶于无血清培养基中的本发明的人参皂苷Rg3和TGF-β分别处理成10ng/ml，并在CO2培养基中培养了24小时。取出上述溶液的上层液，并采用I型前胶原ELISA试剂盒(procollagen type(I)；#MK101，TAKARA(Shiga,Japan))观察前胶原(procollagen)的增减与否。其结果在表4中示出，胶原蛋白的合成能力与设定为100的该未处理组进行了对比。
表4
试验物质 胶原蛋白合成能力(％)
未处理组 100
TGF-β 183.5
人参皂苷Rg3 197.2
从所述表4的结果中能够确定，根据本发明的人参皂苷Rg3比阳性对照组的TGF-β显示出更高水平的优良的胶原蛋白合成能力。由此，能够确定根据本发明的人参皂苷Rg3能够通过增加毛孔周围的胶原蛋白生成量而收缩变大的毛孔。
2.收缩毛孔效果
为了得知剂型例1和比较剂型例1的收缩毛孔效果，进行了如下评价。选择毛孔大的被试验者男女20名，分成两组且每组10人，各个组每天分别在脸上涂覆共4周的剂型例1和比较剂型例1的营养霜。收缩毛孔效果判断通过对试验前和4周后分别进行照相并由专家用肉眼评价而实现。其结果在以下表5中示出(评价等级：0-完全没有收缩；5-收缩很多)。
表5
试验物质 评价等级
剂型例1 3
比较剂型例1 0
从所述表5的结果中能够确定，比较剂型例1中无收缩毛孔效果，但是在剂型例1的情况显示出能够用肉眼确定程度的收缩毛孔效果，从而根据本发明的人参皂苷Rg3具有优良的减小毛孔大小的效果。
[试验例4]抑制皮脂分泌效果
1.通过抑制5α-还原酶活性而抑制皮肤过度分泌的效果
为了确定抑制5α-还原酶活性的效果，测定HEK293-5αR2细胞中[14C]睾甾酮转化为[14C]双氢睾酮(DHT:dihydrotestosterone)的比率。HEK293细胞中转染p3×FLAG-CMV-5αR2，并将其加入到24孔板中且在每个孔内加入2.5×105个细胞(Park et al.，2003，JDS.Vol.31，pp.191-98)而进行了培养。第二天，更换成添加有酶基质和抑制剂的新的培养基。培养基的基质采用了0.05μCi[14C]睾甾酮(Amersham Pharmacia biotech，UK)。
为了确定抑制5α-还原酶活性的程度，加入人参皂苷Rg3并在37℃、5％的CO2的培养基中培养了2小时。此时，将未加入人参皂苷Rg3的培养液用作阴性对照组，将加入有非那雄胺(finasteride)的培养液用作阳性对照组。之后，提取培养液，并利用800μl的乙酸乙酯提取类固醇，之后分离上部的有机溶剂层并对其进行烘干，之后重新采用50μl的乙酸乙酯溶解剩余的残留物，将其在硅塑料板硅胶60F254(Silica plastic sheet kieselgel 60F254)上以乙酸乙酯-核酸(1:1)作为溶剂进行展开。
在空气中干燥塑料样品，之后采用了巴斯系统以用于测定同位素的含量，其中，将干燥的塑料样品和X光胶片一同加入到巴斯盒子中，经一周后测定留存于胶片上的睾甾酮和双氢睾酮的同位素含量，之后根据下述数学式1和数学式2分别计算出转换率和抑制率，其结果在以下表6中示出。
数学式1
Figure BDA0002367777780000121
数学式2
Figure BDA0002367777780000122
表6
试验物质 转换率(％) 抑制率(％)
阴性对照组 48 -
阳性对照组 27.6 42.5
人参皂苷Rg3 16.3 66.0
从所述表6的结果中能够确定，5α-还原酶将睾甾酮转化为双氢睾酮并与细胞内的容纳体蛋白质结合而进入到核内，使得皮脂腺细胞活性化并促进分化，从而5α-还原酶起到在皮脂腺内过度分泌皮脂的作用，而通过人参皂苷Rg3能够有效抑制5α-还原酶的活性，从而阻断睾甾酮转化为双氢睾酮，并且显示出具有比能够抑制5α-还原酶活性的公知的非那雄胺更优良的抑制效果。由此，人参皂苷Rg3通过有效抑制5α-还原酶的活性而能够抑制皮脂的过度分泌。
2.抑制皮脂分泌效果
为了得出上述剂型例1和比较剂型例1的抑制皮脂分泌的效果，进行了如下评价。选择认为皮脂分泌多的被实验者男女30名，并每天在脸部皮肤中指定的部位上涂覆4周的剂型例1和比较剂型例1的营养面霜。皮脂减少效果的判断通过使用皮脂量测量仪(Sebumeter SM810，C+K Electronic Co.，德国)分别测定经过两周后和经过四周后的平均皮脂减少率(％)而实现，其结果在以下表7中示出。
表7
Figure BDA0002367777780000131
从所述表7的结果中能够确定，根据本发明的含有作为有效成分的人参皂苷Rg3的剂型例1比不含有该人参皂苷Rg3的比较剂型例1更有效地抑制皮脂的过度分泌。
[剂型例2和比较剂型例2-3]
根据以下表8中示出的成分和含量(重量％)制备了剂型例2和比较剂型例2-3。具体说明如下，即，剂型例2配合人参皂苷Rg3，比较剂型例2完全不含有用于改善粉刺皮肤的有效成分，比较剂型例3作为判断抗菌能力的基准的标准物质而含有多用作粉刺治疗剂的红霉素(erythromycin)。
剂型例2和比较剂型例2-3的制造方法如下。完全溶解以下表8的A中的成分，并在另外的溶解槽中完全溶解B中的成分，之后，将B添加到A中进行混合溶解。在此，将C中的成分按照表8中记载的配合比例进行添加而混合均匀后过滤，从而制造出本组合物。
表8
Figure BDA0002367777780000141
[试验例5]对粉刺菌的抗菌能力试验
采用通过所述剂型例2和比较剂型例2-3的组成而制备的各个化妆品组合物，对作为粉刺致病菌的痤疮丙酸杆菌(ATCC 6919：培养基-BHI液体培养基(broth))进行了抗菌能力试验。
对粉刺菌的抗菌能力试验方法如下。
(1)准备试验菌液
采用了通过将痤疮丙酸杆菌在BHI液体培养基中接种而进行厌氧培养的培养基。
(2)准备稀释溶液
在15ml的BHI液体培养基(pH6.8)或者LB液体培养基(pH4.5)中添加0.15ml的所述试验菌液而进行充分混合，并将其溶液用作稀释溶液。
(3)准备样品
将由剂型例2和比较剂型例2-3制备的化妆品组合物原液直接用作样品。
(4)抗菌能力试验
1)在96孔的细胞培养板(96well plate)中加入符合初始浓度的样品并分别加入稀释溶液至总量为200μl。
2)充分混合第一行的混合液之后，提取100μl的混合液加入到第二行进行充分混合，之后再次提取100μl加入到第三行的形式执行二倍稀释(double dilution)。
3)在32℃下静置培养24小时和48小时后，判断菌是否增殖成悬浊的程度，并将菌无增殖的最小浓度确定为MIC(最小抑菌浓度，Minimum Inhibitory Concentration)值。如果混合液浑浊而很难判断菌是否增殖时，需要通过显微镜观察确认。
针对粉刺菌的抗菌能力试验结果在以下表9中示出。MIC换算成包含于剂型中的有效成分的浓度而进行标记。
表9
项目 pH 痤疮丙酸杆菌
剂型例2 5.7 >48ppm
比较剂型例2 5.7 最高浓度(无抗菌能力)
比较剂型例3 5.7 >100ppm
从所述表9的结果中能够确定，MIC中ppm浓度越小则可以表示对粉刺菌的抗菌能力越有效的物质，在剂型例2的情况与采用公知的作为粉刺治疗剂的红霉素的比较剂型例3相比，ppm浓度显著减小，因此，含有人参皂苷Rg3的组合物对试验菌具有更优秀的抗菌能力。
[试验例6]抑制脂质合成(Lipogenesis)的试验
将作为活鼠的成纤维细胞系(fibroblast cell line)的3T3-L1细胞以1×105细胞/孔的量附着在6孔培养板(culture plate)上，该6孔培养板中装有含有胎牛血清(FBS，fetal bovine serum)的DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium，GIBCO BRL，生命科技公司)培养基。经过2天后更换新的DMEM(含有10％的FBS)培养基而再次培养2天。之后，通过含有1μg/mL的胰岛素(insulin)、0.5mM的IBMX和0.25μM的地塞米松(dexamethasone)的DMEM(含有10％的FBS)，再次诱导上述培养的细胞进行分化，并使用50μM的人参皂苷Rg3和咖啡因处理，经过2天后，再次更换成含有胰岛素的DMEM而培养5天。经过5天后，再次更换成正常培养基(DMEM，含有10％的FBS)，观察培养至上述细胞变成脂肪细胞形态。
为了评价人参皂苷Rg3抑制脂肪细胞内蓄积脂肪的效果，利用上述已分化的3T3-L1脂肪细胞进行了苏丹III染色(S4136，sigma-aldrich)。在常温下将脂肪细胞用4％的多聚甲醛(pH为7.2)固定于磷酸盐缓冲液中，之后用PBS(phosphate buffered saline)对其进行水洗，之后用苏丹III染色后照相，从而通过肉眼进行了比较。对照组仅使用了未添加试验物质或比较物质的培养基，作为其他比较组使用50μM的咖啡因处理。抑制脂肪蓄积的程度通过将染色程度分为+++、++、+、-而划分等级。此时，越趋于+++，其表示染色程度越大。其结果在以下表10中示出。
表10
样品 抑制率％
对照组 +++
比较组 +
人参皂苷Rg3 -
从上表10的结果中能够得知，本发明中所使用的人参皂苷Rg3不仅使脂肪细胞内蓄积的脂肪含量少，并且相比于公知的作为抑制脂质合成的物质的咖啡因更具有优良的抑制脂质合成的效果。由此，通过抑制脂质的合成而减少皮脂，从而能够抑制粉刺的产生。
[试验例7]改善粉刺、减少皮脂分泌以及有无刺激的试验
将有粉刺的30名试验者以每组10名分成3组，使各个组中相应的被试验者分别使用1个月的由上述剂型例2、比较剂型例2-3制备的化妆品组合物。改善粉刺的尺度设定为1分至5分，其中，1分表示“没有”，3分表示“一般”，5分表示“非常好”。其试验结果在以下表11中以10名的平均分数标记。
粉刺消失时期以判断消失的日期作为基准，粉刺复发采用“有无”并以1个月后的结果作为基准。皮脂分泌的减少设定为1分至5分，其中，1分表示“没有”，3分表示“一般”，5分表示“非常好”。其试验结果在以下表11中以10名的平均分数标记。有无皮肤刺激通过(有刺激反应的人数)/(总试验者数)表示。
表11
Figure BDA0002367777780000171
从所述表11中能够得知，剂型例2与比较剂型例2相比粉刺没有再复发，整体上对改善粉刺具有优良的效果。另外，在含有抗菌能力标准物质的比较剂型例3的情况显示出改善粉刺的效果，但是使用过程中对皮肤刺激大，因此不适合长期使用，而根据本发明的组合物显示出由于无刺激而也适合长期使用。
[剂型例3和比较剂型例4]
利用以下表12的组成制造了洗发水。具体地，在净化水中添加表面活性剂和乙二醇二硬脂酸酯，并加热至80℃而均匀地溶解后，通过搅拌缓慢地冷却至40℃，在上述混合物中投入根据本发明的有效成分和防腐剂、粘度调节剂、香料和头发调理剂进行混合，通过搅拌冷却至室温，从而完成了制备。
表12
成分(重量％) 剂型例3 比较剂型例4
十二烷基醚硫酸铵 10 10
聚氧乙烯十二烷基醚硫酸铵 5 5
椰油酰胺丙基甜菜碱 2 2
乙二醇双硬脂酸酯 1.5 1.5
椰油酰基单乙醇胺 0.8 0.8
人参皂苷Rg3 5.0 -
聚季铵盐-10 0.2 0.2
蓝色1号 0.0002 0.0002
黄色4号 0.0001 0.0001
对羟基苯甲酸甲酯 0.1 0.1
香料 0.8 0.8
柠檬酸 0.1 0.1
聚二甲基硅氧烷 1.0 1.0
水 至100 至100
[试验例8]减少头屑效果试验
选择19-35岁的24名头屑较多的男性，并以每组12名分成两组，对各个组分别通过以下方式使用1个月的剂型例3和比较剂型例4的洗发水，然后测定了头屑减少率。
在试验开始前用普通一般的洗发水洗发后，采集经过2天累积的头屑，并将采集的头屑的重量与通过各个剂型例3和比较剂型例4的洗发水以两天一次地洗发而完成试验后将经过2天累积的头屑的重量进行了比较和评价。此时，累积的头屑通过真空吸入装置直接从头皮上采集，并根据以下数学式3求出头屑减少率，其结果在以下表13中示出。
数学式3
Figure BDA0002367777780000181
表13
Figure BDA0002367777780000191
从所述表13的结果中能够得知，含有人参皂苷Rg3的剂型例3的情况表现出优良的抗头屑的效果。
[试验例9]防止头皮瘙痒症的效果试验
选择25-45岁感觉头皮发痒较严重的24名男女，以每组12名分成两组，并分别使用剂型例3和比较剂型例4的洗发水且以每3日一次地使用2周后，通过防止头皮瘙痒效果为评价基准而进行评价，其结果在以下表14中示出。
[评价基准]
非常优秀-5分
优秀-4分
一般-3分
不好-2分
非常不好-1分
表14
分类 剂型例3 比较剂型例4
头皮的瘙痒症去除效果 4.3 2.3
从所述表14的结果中能够得知，含有人参皂苷Rg3的剂型例3的情况对防止头皮瘙痒症的效果更加优良。
[试验例10]增加钾离子通道活性的效果评价
作为脱发治疗剂的米诺地尔是公知的有潜力的线粒体钾离子通道开放剂(KATPchannel opener)，其是用于治疗雄性激素脱发的代表性药物。为了评价这种米诺地尔的机制，采用了以下试验方法：在用于形成头皮真皮的成纤维细胞中，使用堵塞KATP通道的甲苯磺丁脲(SIGMAALDRICH，T0891)处理而抑制细胞增殖，之后再次打开钾离子通道而恢复细胞增殖。
为了评价本组合物的作为KATP通道开放剂的功能，本发明中使用了作为成纤维细胞的NIH3T3(Mouse embryonic fibroblast cell line)细胞株。该细胞株是将从NIH瑞士小鼠胚胎(Swiss mouse embryo)中分离的成纤维细胞利用3T3实验方法(
Figure BDA0002367777780000201
protocol)进行自然永生化的细胞株。在所述细胞株中加入含有10％的FBS的DMEM(GibcoBRL,Gaithersburg，MD，美国)，并在5％的CO2、维持37℃的培养器中培养了24小时。将NIH3T3加入到96孔板中，并在37℃的培养器中培养了24小时后，使用2.5mM的甲苯磺丁脲处理，10分钟后将分别使用作为阳性对照组的10μM的米诺地尔处理、使用浓度各为2.5ppm、5ppm和10ppm的人参皂苷Rg3处理。经药物处理48小时后，使用WST-1试剂盒(Roche)测定细胞增殖能力。结果在以下表15中示出。
表15
分类 细胞增殖能力(％)
未处理对照组(Control) 100
米诺地尔 132
人参皂苷Rg3(2.5ppm) 114
人参皂苷Rg3(5ppm) 123
人参皂苷Rg3(10ppm) 129
从所述表15的结果中能够确定，在处理了人参皂苷Rg3的情况恢复了成纤维细胞的增殖，并且细胞增殖能力依赖于处理的人参皂苷Rg3的浓度而增加，在将人参皂苷Rg3处理成10ppm的情况下细胞增殖恢复成处理米诺地尔时的水平。
[试验例11]人参皂苷Rg3的促进黑色素生成的效果试验
在RPMI培养基中添加5％的胎牛血清、100IU的青霉素G和0.2μM的TPA而成的培养基中，将黑色素细胞(melan-a)在24孔微量滴定板(24-well microtiter plate)中分株成50,000细胞/孔。第二天，在分株的细胞中使用作为试验物质的人参皂苷Rg3处理，该人参皂苷Rg3的最终浓度为10ppm或者50ppm，作为阴性对照组使用0.1％的DMSO处理，作为阳性对照组使用100μM的IBMX处理，之后在37℃的温度下培养了3天。培养后，用PBS洗涤孔并分别加入100μl的1N NaOH而溶解细胞内的黑色素。利用酶标仪(microplate reader)在405nm中测定溶解的黑色素的吸光度(Synergy2，BioTek(VT，USA))。人参皂苷Rg3的促进黑色素生成效果与对照组进行比较而得出的结果在以下表16中示出。
表16
样品 黑色素合成量(％)
DMSO(0.1％) 100
IBMX(100μM) 120
人参皂苷Rg3(10ppm) 110
人参皂苷Rg3(50ppm) 120
从所述表16的结果中能够得知，人参皂苷Rg3促进黑色素的合成而增加黑色素生成，从而表现出优良的促进黑色素生成的效果。
[试验例12]人参皂苷Rg3的促进黑素细胞中MITF和酪氨酸酶(tyrosinase)表达的效果
利用501mel的细胞株在6孔微量滴定板(6-well microtiter plate)中分株成500,000细胞/孔，在各个孔中，作为阴性对照组使用0.1％的DMSO处理，作为阳性对照组使用100μM的IBMX处理，作为试验组使用10ppm的人参皂苷Rg3处理，从而在37℃的温度下培养了24小时、48小时、72小时之后获得了蛋白质。利用MITF和酪氨酸酶抗体对由此获得的蛋白质进行了蛋白质印迹。蛋白质的提取和蛋白质印记通过通常技术人员使用的标准方法实现。蛋白质印迹后的结果与设定成100的阴性对照组的值进行比较后在以下表17中示出。
表17
Figure BDA0002367777780000221
从表17的结果中能够确定，人参皂苷Rg3能够增加黑素细胞中的MITF和酪氨酸酶蛋白质的表达。
[试验例13]人参皂苷Rg3的抗菌能力评价
为了评价人参皂苷Rg3的抗菌能力进行了抗菌试验。具体试验方法如下。
试验中所使用的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株在胰化蛋白大豆培养基(Tryptic Soy Broth)中进行培养，而白色念珠菌(Candida albicans)、黑曲霉(Aspergillus niger)菌株利用纱布在沙氏液体培养基(Sabouraud's Dextrose Broth)中进行培养。将培养液在各个培养基中稀释成1/100(白色念珠菌稀释成1/10)，将该稀释液用作试验菌液。黑曲霉是将制造成2×108cfu/ml的孢子悬浮液用作试验菌液。
在15ml的各个培养基中添加0.15ml的试验菌液而充分混合的溶液用作稀释溶液。
在96孔板(96well plate)的第一行中分别加入16μl的10ppm的人参皂苷Rg3和184μl的稀释溶液。在剩余孔中加入100μl的稀释溶液。将第一行的混合液充分混合后，取100μl加入到第二行中并充分混合，之后取100μl加入到第三行中，通过上述方法分别稀释两倍。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)在32℃的恒温槽中进行了培养，而白色念珠菌(Candidaalbicans)、黑曲霉(Aspergillus niger)在25℃的恒温槽中进行了培养。
48小时之后，通过悬浮度和显微镜确认菌的增殖与否，并确定最小抑制浓度(MIC)，其结果在以下表18中示出。
表18
Figure BDA0002367777780000231
从所述表18的结果中能够确定，人参皂苷Rg3对多种菌株表现出抗菌能力，由此能够预测到人参皂苷Rg3可以用作组合物中的天然防腐剂或者抗菌剂。

Claims (1)

1.含有人参皂苷Rg3作为唯一的有效成分的皮肤外用剂在制备抗头屑的化妆品组合物中的应用。
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