KR100963465B1

KR100963465B1 - 사포닌을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100963465B1
Application number: KR1020080013117A
Authority: KR
Inventors: 도재호; 김영숙; 고성룡; 손현주; 이승표
Original assignee: 주식회사 한국인삼공사; 주식회사 케이티앤지
Priority date: 2008-02-13
Filing date: 2008-02-13
Publication date: 2010-06-17
Also published as: KR20090087709A

Abstract

본 발명은 사포닌, 바람직하게는 인삼 또는 홍삼 추출물에 포함된 사포닌을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 유효성분으로 이용되는 사포닌은 치주질환의 예방 또는 치료 효능을 가지고, 상세하게는 염증관련 사이토카인(특히, IL-6 및 IL-8) 및 PGE₂ 생성에 관여하는 효소인 COX-2를 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효과, 세포 내 산화적 손상을 억제하는 우수한 항산화 효과 및 우수한 항균 효과에 의해 치주질환(잇몸질환)을 효과적으로 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 약제학적 조성물, 치약(toothpaste), 구강 치료용 및 구강 보호용 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

사포닌, 진세노사이드, 인삼, 홍삼, 치주질환

Description

사포닌을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 치료용 조성물{Composition for Treating of Gingival Disorders Comprising Saponin as an Active Ingredient}

본 발명은 사포닌을 유효성분으로 포함하는 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 사포닌, 바람직하게는 인삼 또는 홍삼 사포닌을 유효성분을 포함하여 세포독성 및 피부 부작용이 없고, 우수한 항염증, 항산화 및 항균 효과를 가지는 치주질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

치주질환은 치아주위 조직에서 일어나는 염증성 질환으로 특정 혐기성 그람음성 간균의 과잉 증식으로부터 시작되어 잇몸의 결합조직 파괴와 비가역적 골 흡수로 이어진다. 병의 진행과정은 세균과 이에 대한 숙주(사람) 방어 반응이 상호적으로 작용하여 이루어지며 병원균에서 나오는 유해 물질과 병원균에 대한 숙주의 방어 반응 중 세포에서 지속적으로 다양한 종류의 사이토카인(cytokine)이 많은 양으로 분비되어 치주조직의 파괴가 일어나게 된다. 이러한 사이토카인으로는 인터루킨-1β(IL-1β), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 종양괴사인자(TNF-α) 및 프라스타글란딘 E₂(PGE₂) 등이 있다.

그람음성균으로부터 분비되는 리포폴리사카리드(LPS)는 전염증유도물질에 강력하게 작용하여 다수의 숙주 유발 염증과정을 일으킨다. 특히, 에그리가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.A.)의 LPS는 국소급성치주염의 중요 원인 물질로 결합조직 파괴와 골 흡수 과정에 참여하는 것으로 알려져 있다. LPS는 치주조직의 치주인대세포와 치은섬유아세포에도 자극물질로 작용하여 치주조직의 염증에 관여하게 된다.

치주인대(periodontal ligament)는 구강에서 석회화 조직인 뼈(alveolar bone)와 치아의 시멘트질(cementum) 사이에 위치하는 치밀 결합조직으로 치아를 유지시켜주고 경조직의 구조적 특성을 유지시키는데 중요한 기능을 한다. 또한 생체 내에서의 인접 뼈와 시멘트질의 수복과 재생에도 관여하는 것으로 알려져 있다(McCulloch CAG, Periodontology 2000 1:16-25(1993)).

치주인대 세포는 동종의 세포들만으로 구성된 것이 아니라 표현형과 기능이 상이한 여러 아개체(subpopulation)의 세포로 이루어져 있는데 일부 세포는 높은 알칼리성 인산분해효소 활성, 부갑상선호르몬에 대한 반응성, 뼈유사 기질 폴리펩타이드의 생산 및 석회화 결절의 형성과 같은 뼈와 시멘트질을 형성하는 세포의 전구세포의 특징을 보인다(Cho MI et al., Calcif Tissue Int 50:459-467(1992); Goseki et al., Mech Ageing Dev 91:171-183(1996); Kawase et al., Bull Kanagawa Dent Coll 18:135-141(1990); McCulloch & Bordin, J Periodontal Res 26:144-154(1991)).

치은섬유아세포(gingival fibroblast)는 외부 환경에 가장 먼저 반응하는 치 은조직의 구성세포로서 외부 자극 없이 조직의 재생과 수복이 가능하다. 재생과정은 피부 근육의 재생과는 다르게 발생학적 재생에 가깝다.

최근 치주질환의 예방 및 치료법의 경향을 보면 전통적으로 이루어져 왔던 바이오필름의 기계적 제거가 역시 가장 효과적으로 인정받고 있으나 그 외에도 다양한 약물치료의 병행으로 좋은 효과를 거두었다는 보고가 계속 되고 있다. 섬유아세포의 염증반응 조절은 치주염의 진행을 예방하고 제어하는 한 방법으로 소개되어 있으며 이 세포에 작용하는 다양한 약물들의 효과에 관한 연구가 계속 이루어지고 있다.

인삼의 학명은 Panax ginseng C.A. Meyer로 오랫동안 동아시아 여러 나라에서 건강 증진 및 질병 치료를 위해 사용되어 왔다. 일반적으로 진세노사이드(ginsenoside) 및 이의 대사 물질이 인삼 추출물의 주 약리 효과를 내는 것으로 생각되어지고 있다. 지금까지 밝혀진 인삼의 작용은 면역력 증진, 항염 효과, 진통 효과, 지혈 작용 또는 심혈관계 개선 등 다양한 분야에서 효과가 입증되고 있다. 특히, 항염 효과에 대해서는 진세노사이드-Rh1에 의한 항염 및 항알러지 기능, 진세노사이드-Rb1에 의한 TNF-α의 감소, 진세노사이드-Rg1에 의한 면역 기능 증대, 및 인삼추출물에 의한 포스포리파제 2 기능 저하 및 호중구(neutrophil) 수의 감소 등이 보고 된 바 있다.

최근 Rhule등의 보고에 의하면 대식세포를 LPS로 자극하고 중국 인삼(Panax notoginseng) 추출액을 농도 별로 처리하는 경우 농도에 따라 유의한 수준으로 TNF-α와 IL-6의 분비량이 줄어든다고 한다. PGE₂ 생성에 관여하는 COX-2와 IL-1β mRNA의 발현 역시 인삼 처리에 따라 줄어들었다. TNF-α 생성의 경우 LPS 자극 전 인삼 처리를 24시간 전에 하거나 동시에 하는 경우 효과가 있었으나 LPS 자극 후 8시간 뒤에 인삼 처리를 하는 경우 효과가 나타나지 않았다. 또한 성분 투여를 위해 진세노사이드-Rb1 및 Rg1으로 처리하는 경우 TNF-α 생성 감소는 일어났으나 정도는 추출액에 비해 약한 것으로 나타났다.

본 발명에서는 LPS로 자극한 치주인대세포와 치은섬유아세포에 인삼 또는 홍삼 사포닌을 처리하여 염증물질인 IL-6, IL-8 및 COX-2의 분비에 미치는 영향을 알아보았다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 병원균에서 나오는 유해물질 및 병원균에 대한 숙주의 방어 반응 중 분비되는 다량의 사이토카인의 의해 치주조직의 파괴로 일어나는 염증성 질환인 치주질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 치주질환을 일으키는 염증 유도물질로 자극된 치주조직(치주인대세포 및 치은섬유아세포)에서 사포닌(특히, 인삼 또는 홍삼 사포닌)이 염증물질인 인터루킨-6, -8 및 COX-2의 발현 억제를 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 치주질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 사포닌(saponin)을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 병원균에서 나오는 유해물질 및 병원균에 대한 숙주의 방어 반응 중 분비되는 다량의 사이토카인의 의해 치주조직의 파괴로 일어나는 염증성 질환인 치주질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 치주질환을 일으키는 염증 유도물질로 자극된 치주조직(치주인대세포 및 치은섬유아세포)에서 사포닌(특히, 인삼 또는 홍삼 사포닌)이 염증물질인 인터루킨-6, -8 및 COX-2의 발현을 억제함을 확인하였다.

본 발명에서 유효성분으로 이용되는 사포닌은 콩, 파, 더덕, 도라지, 미나리, 마늘, 양파, 영지버섯, 은행(식물), 칡, 인삼 또는 홍삼에 포함된 사포닌을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 인삼 또는 홍삼 추출물에 포함되어 있는 사포닌을 이용한다.

본 명세서에서 용어 “인삼”은 고려삼(Panax ginseng), 회기삼(P. quiquefolius), 전칠삼(P. notoginseng), 죽절삼(P. japonicus), 삼엽삼(P. trifolium), 히말라야삼(P. pseudoginseng), 베트남삼(P. vietnamensis) 및 미국삼 (Panax quinquefolium)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 인삼은 고려삼(Panax ginseng)이다.

본 명세서에서 용어 “홍삼”은 증기 또는 태양-건조, 바람직하게는 증기를 통하여 인삼을 가열하여 제조된 것을 의미한다.

본 발명의 유효성분인 사포닌을 포함하는 인삼 또는 홍삼 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출 과정에서 의해 얻을 수 있는 추출물을 포함한다. 예를 들어, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에 틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트 또는 (h) 1,3-부틸렌글리콜을 추출용매로 하여 얻은 추출물이 인삼 또는 홍삼 추출물에 포함된다. 바람직하게는, 인삼 또는 홍삼 추출물은 물, 에탄올 또는 에탄올과 물의 혼합용매를 추출용매로 하여 얻은 것이며, 가장 바람직하게는 물을 추출용매로 하여 얻은 것이다.

한편, 본 발명의 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 인삼 또는 홍삼 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 또한, 본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 인삼 또는 홍삼 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명의 사포닌을 포함하는 인삼 또는 홍삼 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명에서 유효성분으로 이용되는 “사포닌”은 특별하게 다른 언급이 없는 한, 진세노사이드, 즉 인삼 사포닌과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 이용되는 “사포닌”은 바람직하게는, 인삼 또는 홍삼 고유의 진세노사이드를 의미한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 사포닌은 (a) 프로토파낙사디올계의 진세노사이드, 즉 진세노사이드 Ra1-3, Rb1-3, Rc, Rd, Rg3, Rh2, Ri, Rs1 및 Rs2, 말로닐-진세노사이드 Rb1-2, Rc 및 Rd; 그리고 (b) 프로토파낙사트리올계의 진세노사이드, 즉 진세노사이드 Re, Rf, Rg1-2 및 Rh1이다.

본 발명에서 이용되는 사포닌은, 분리 및 정제된 형태의 사포닌을 이용할 수 있지만, 바람직하게는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물에 포함되어 있는 진세노사이드이다. 즉, 사포닌을 포함하는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물을 본 발명에서 이용할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “치주질환” 또는 “잇몸 질환”은 동일한 의미로 사용된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유효성분으로 이용되는 사포닌은 진세노사이드-Rg1, -Re, -Rf, -Rh1, -Rg2, -Rb1, -Rc, -Rb2, -Rd, -Rg3 및 -Rh2로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 진세노사이드이고, 보다 바람직하게는 진세노사이드-Rg1, -Re, -Rf, -Rh1, -Rg2, -Rb1, -Rc, -Rb2, -Rd, -Rg3 및 -Rh2의 혼합물이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 사포닌은 프로토파낙사디올계(Protopanaxadiol; PD) 사포닌이 인리치먼트(enrichment)된 것이고, 보다 바람직하게는 프로토파낙사디올계 사포닌은 진세노사이드-Rb1, -Rc, -Rb2, -Rd, -Rg3 및 -Rh2로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 진세노사이드이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 프로토파낙사디올계 사포닌이 인리치먼트된 사포닌의 프로토파낙사디올(PD)계 사포닌 대 프로토파낙사트리올(Protopanaxatriol; PT)계 사포닌의 함량비(PD/PT)는 1.6-4.0이다.

상기 프로토파낙사디올(PD)계 사포닌 및 프로토파낙사트리올(Protopanaxatriol; PT)계 사포닌의 함량 그리고 함량비를 언급하면서 사용되는 용어 PD는 Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg3 및 Rh2를 의미하며, PT는 Rg1, Re, Rf, Rh1 및 Rg2를 의미한다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 상기 프로토파낙사디올계 사포닌은 사포닌 총 중량을 기준으로 하여 60-80 중량%이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 혼합물에 포함된 진세노사이드-Rb1, -Rg1 및 -Rh1의 함량은 진세노사이드 총 중량에 대하여 20-30 중량%이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명 유효성분의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 본 발명 유효성분의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 치주질환의 치료 효능을 가지며, 상기 조성물은 치약(toothpaste), 구강청정용 조성물 또는 구강보호용 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “치주질환 예방 또는 치료용 조성물”은 “구강보호용 조성물(composition for tooth and mouth care)”또는 “구강청정용 조성물(composition for tooth and mouth cleaning)”로 대체될 수 있다.

본 발명의 사포닌은 잇몸 조직의 섬유아세포의 생리활성을 촉진하고 신속한 잇몸 상처의 치유를 통하여 손상된 잇몸 조직을 재생시킴으로써, 치주질환을 치료 또는 예방할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해서 치료 또는 예방되는 치주질환은 잇몸 염증이다. 상세하게는, 염증관련 사이토카인(특히, IL-6 및 IL-8) 및 PGE₂ 생성에 관여하는 효소인 COX-2를 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효과, 세포 내 산화적 손상을 억제하는 우수한 항산화 효과 및 우수한 항균 효과에 의해 치주질환(잇몸질환)을 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유효성분으로 이용되는 사포닌은 전체 조성물을 기준으로 하여 0.01-70.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.1-50.0 중량%, 가장 바람직하게는 5-20.0 중량%이다. 유효성분인 사포닌의 중량이 0.01 중량% 미만인 경우에는 그 효과가 나타나기 어렵고, 70.0 중량%를 초과하는 경우에는 함량 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하고, 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명의 조성물은 사포닌, 바람직하게는 인삼 또는 홍삼 추출물에 포함된 사포닌을 유효성분으로 포함한다.

(ⅱ) 본 발명의 유효성분으로 이용되는 사포닌은 치주질환의 예방 또는 치료 효능을 가지고, 상세하게는 염증관련 사이토카인(특히, IL-6 및 IL-8) 및 PGE₂ 생성에 관여하는 효소인 COX-2를 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효과, 세포 내 산화적 손상을 억제하는 우수한 항산화 효과 및 우수한 항균 효과에 의해 치주질환(잇몸질환)을 효과적으로 치료할 수 있다.

(ⅲ) 본 발명의 조성물은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 약제학적 조성물, 치약(toothpaste), 구강 치료용 및 구강 보호용 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 사포닌, 바람직하게는 인삼 또는 홍삼 추출물에 포함된 사포닌을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 유효성분으로 이용되는 사포닌은 치주질환의 예방 또는 치료 효능을 가지고, 상세하게는 염증관련 사이토카인(특히, IL-6 및 IL-8) 및 PGE₂ 생성에 관여하는 효소인 COX-2를 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효과, 세포 내 산화적 손상을 억제하는 우수한 항산화 효과 및 우수한 항균 효과에 의해 치주질환(잇몸질환)을 효과적으로 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 약제학적 조성물, 치약(toothpaste), 구강 치료용 및 구강 보호용 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

시료

사포닌이 포함된 인삼 추출물 골드 베이스 또는 홍삼 추출물(KGC 제공)을 이용하였다. 본 발명에서 이용되는 홍삼 추출물 분획 사포닌은 사포닌(saponin, SA), 인삼 추출물 골드 베이스는 RG 1 및 홍삼추출물은 RG 2로 각각 명명하였다. 상기 본 발명의 인삼 또는 홍삼 추출물에 포함된 진세노사이드의 함량은 하기 표 1 내지 3에 기재된 바와 같다:

SA(Saponin, 홍삼 추출물 조사포닌)
수분함량	진세노사이드 함량(mg/crude saponin 100 mg)
2.50%	Rg1	Re	Rf	Rh1	Rg2	Rb1	Rc	Rb2	Rd	Rg3	Rh2	합계
2.50%	0.90	1.66	2.48	1.89	7.60	6.91	5.74	3.49	2.46	9.17	0.21	42.51

RG1(인삼 추출물 골드 베이스)
수분함량	진세노사이드 함량(mg/wet Ext g)
35.20%	Rg1	Re	Rf	Rh1	Rg2	Rb1	Rc	Rb2	Rd	Rg3	Rh2	합계
35.20%	1.32	2.56	1.28	0.65	2.34	7.90	5.89	5.03	2.41	3.16	3.09	35.63

RG2(홍삼 추출물)
수분함량	진세노사이드 함량(mg/wet Ext g)
32.20%	Rg1	Re	Rf	Rh1	Rg2	Rb1	Rc	Rb2	Rd	Rg3	Rh2	합계
32.20%	0.43	0.72	1.06	1.04	4.96	3.55	1.81	1.75	1.70	5.40	0.10	22.52

전체 진세노사이드는 HPLC/UV(203 nm)를 이용하여 정량화 하였다.

세포 배양

α-MEM(alpha-Minimum Essential Medium, GIBCO)에 10% 우 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함 된 배지에서 95% 공기, 5% CO₂ 및 37℃ 조건하에서 사람의 치주인대세포(서울대학교 세포주 은행)를 무균 적으로 배양하였다. 또한, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 10% 우 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함 된 배지에서 95% 공기, 5% CO₂, 37℃ 조건에서 치은섬유아세포(서울대학교 세포주 은행)를 배양하였다. 그런 다음, 2-3일 간격으로 배지를 갈아주고 세포가 세미컨플루언트(semiconfluent)하게 되면 0.125% 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 배양접시에서 부유시키고, 이어 세포 부유액을 모아 1200 rpm으로 10분간 원심분리를 하여 침전시킨 다음 세포침전물을 배지로 세포 부유액을 만들어 계대배양하였다. 6-8 계대의 세포를 선택하여 실험하였다. RNA를 추출하기 위해서 6 웰 플레이트에 1× 10⁵ 세포를 분주하고, MTS 실험을 하기 위해서 96 웰 플레이트에 3.3× 10³ 세포를 분주하였다. 각 실험에 사용하는 세포는 분주 후 세포가 안정하게 부착되어 증식할 수 있도록 이틀 동안 배양 하고, 세포 배양액을 1% 우 태아 혈청이 첨가된 배지로 교환해 준 다음 각 실험을 수행하였다.

에그리가티박터 액티노마이세템코미탄스( Aggregatibacter actinomycetemcomitans , A.A.)의 리포폴리사카리드( LPS ) 추출

A.A.(서울대학교 균주은행)를 1% 효모 추출물이 포함된 Todd-Hewitt broth에 37℃ 및 혐기성 상태(80% N₂, 10% H₂ 및 10% CO₂)에서 배양하였다. LPS 추출 키트를 이용하고 단백질분해효소 K와 가용화 침전 과정을 통해 단백질을 분해시키는 방법을 이용하여 LPS를 추출하였다. 추출한 LPS를 동결 건조한 후 정량하고 탈이온수에 녹인 다음 -20℃에 보관하였다.

A.A. LPS 의 생활성 확인

보통 LPS를 세포에 처리하게 되면 세포간 부착분자(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)가 발현하게 되는데 추출된 A.A.의 LPS는 FACS(fluorescence activated cell sorter) 분석을 통해 생활성을 확인하였다. 생활성을 측정하기 위해서 각 세포에 A.A. LPS를 100 ng/ml 및 E. coli LPS 10 ng/ml을 18시간 동안 처리하였다. 처리된 세포를 20 mM 트립신으로 떼어내고 원심 분리를 통해서 세포 펠릿만 얻어낸 다음 PBS로 부유시켰다. 각 부유물에 항-ICAM-1 래빗 다클론성 일차항체를 붙이고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. PBS로 세척 후에 항-래빗-FITC- 컨쥬게이티드 이차항체를 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시킨 다음, 다시 PBS로 세척하고 FACScan 유세포 분석기(BD FACSCant II)로 분석하였다.

소듐 나이트로프루사이드 ( SNP ) 및 A.A. LPS 의 처리

각 세포에 SNP(Sigma) 및 A.A. LPS를 처리하기 2시간 전에, 본 발명의 홍삼 사포닌계 추출물인 SA, RG 1 및 RG 2를 각 농도로 처리하였다. 산화질소(NO)를 만드는 물질로 SNP를 4.0 mM로 처리하고, A.A. LPS를 0 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖로 첨가하여 18시간 동안 반응시켰다.

MTS 분석을 이용한 세포증식도 평가

대사가 왕성한 세포에서 발현되는 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해서 MTS(3-(4,5-디메틸티아졸-2)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸리움, 분자내 염, Sigma)가 블루 수용성 산물인 포르마잔으로 바뀌게 되는 것을 측정하여 세포의 증식도를 확인하였다.

치주인대세포와 치은섬유아세포를 96 웰 플레이트에 배양하여 각 시료에 반응시키고, 4일 동안 배양 후 배지에 MTS 용액을 첨가하여 37℃에서 3시간 반응시킨 다음, 490 nm에서 마이크로플레이트 리더(Bio-Tek)를 이용하여 흡광도(OD) 값을 측정하였다.

RNA 수준에서의 분화 유전자 발현 확인

RNA 추출 키트를 이용하여, 각 시료 및 A.A. LPS를 처리한 치주인대세포의 RNA를 추출하고 추출된 RNA를 정량한 후에 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. A.A. LPS 처리에 의해 발현되는 사이클로옥시제네이즈 2(COX 2), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8) 및 GAPDH의 프라이머를 제작하여 합성된 cDNA의 RT-PCR을 수행하였다. 그런 다음, PCR 산물을 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동을 하고 EtBr 염색을 하였다.

구분	전방향 프라이머	역방향 프라이머
COX2	5'-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATTG-3'	5'-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3'
IL-6	5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3'	5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3'
IL-8	5'-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGCT-3'	5'-TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTCTC-3'
GAPDH	5'-CACTGACACGTTGGCAGTGG-3'	5'-CATGGAGAAGGCTGGGGCTC-3'

실험 결과

치주인대세포의 생존율 확인

우선 실험에 사용될 인삼 또는 홍삼 관련 시약의 농도 결정을 위하여 치주인대세포의 시료에 대한 반응을 알아보았다. 도 1에서 확인할 수 있듯이, MTS 분석을 이용하여 세 가지 인삼 또는 홍삼추출물(SA, RG 1 및 RG 2)을 농도별로 처리한 결과, SA는 100 ㎍/㎖ 이상에서 치주인대세포들의 생존율이 급격히 떨어졌고, RG 1은 1000 ㎍/㎖, RG 2는 750 ㎍/㎖ 이상에서 치주인대세포 생존율에 영향을 미치는 것을 알 수 있다.

SNP 자극에 대한 치주인대세포의 생존율 확인

또한, 외부 유해물질의 자극에 대해 치주인대세포를 보호하는 시약들의 농도를 살펴보았다. 소듐 나이트로프루사이드(SNP)는 산화 질소(NO) 생성물질로 과량 적용 시 세포들의 생존율이 낮아지게 된다. 도 2에서 볼 수 있듯이, 치주인대세포에 4 mM 처리 시 치주인대세포 생존율은 40% 이하로 떨어짐을 알 수 있다. 한편 미리 다양한 농도의 SA, RG 1 및 RG 2를 치주인대세포에 처리하고 4 mM의 SNP를 처리한 결과, 세포 생존율이 SA는 75 ㎍/㎖, RG 1은 500 ㎍/㎖ 및 RG 2는 750 ㎍/㎖에서 가장 좋은 결과를 나타냄을 알 수 있었다.

상기 실험 결과를 통하여, 치주인대세포 실험에 사용될 시약들의 농도를 SA는 60 ㎍/㎖, RG 1은 600 ㎍/㎖ 및 RG 2는 700 ㎍/㎖로 결정하였다. 또한 이 결과만으로도 본 발명의 사포닌이 포함된 인삼 또는 홍삼 추출물들이 유해자극에 대하여 치주인대세포를 보호하고 생존율을 높인다는 사실을 확인할 수 있었다.

LPS 유해 자극에 대한 생활성 확인

LPS 유해자극에 대한 인삼 추출물들의 치주인대세포 보호 기능은 먼저 가장 널리 사용되는 E.coli의 LPS를 이용하여 시행하였다. 결과는 보이지 않았으나, 결정된 농도의 인삼 또는 홍삼 추출물을 미리 처리하고 E. coli의 LPS를 처리하였을 때, 인삼추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 세포 생존율이 월등히 높은 것으로 나타났다. 그러나 치주염의 중요 원인균인 A.A.의 LPS에 대한 인삼추출물의 기능 파악이 본 발명의 주목적이므로 서울대학교 균주은행의 도움을 받아 A.A. LPS를 자체 제작하였다. 제작된 A.A. LPS의 효과 검증을 위하여 E. coli LPS 및 생활성을 비교하였다.

도 3에서 볼 수 있듯이, ICAM-1의 분비를 확인한 결과 유효한 것으로 나타남을 알 수 있었다. 또한, 도 4에서 확인할 수 있듯이, 일반적으로 이용되는 A.A. LPS의 농도인 1 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖로 치주인대세포를 처리한 뒤, 세포생존율은 처리하지 않은 대조군과 비교하여 유의한 차이를 보이지 않음을 알 수 있다. 이는 E. coli LPS에 비해 독성이 약하다는 의미와 함께, 사이토카인 분비 양에 있어 세포의 수는 무관하다는 것을 의미한다.

COX -2 및 사이토카인(인터루킨-6 및 8)의 발현유무 확인

SNP를 처리한 세포의 증식도 실험 결과 및 인삼추출물의 세포의 증식도 실험을 통해서 각 시료의 농도를 결정하고, A.A. LPS 1 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖를 처리 한 다음 효소 및 사이토카인의 발현을 RT-PCR로 확인하였다(도 5).

도 6에서 확인할 수 있듯이, COX-2는 세포의 PGE₂ 생성을 중개하는 효소로 치주인대세포에 LPS 처리 시 농도에 따라 생성되는 양이 증가하였다. 그러나 인삼 또는 홍삼 추출물을 LPS 처리 2시간 전에 미리 처리한 군에서는 생성되는 양이 LPS를 처리하지 않은 대조군에 비해 감소함을 알 수 있었다. 한편, 인삼 또는 홍삼 추출물의 종류에 따라 결과는 상이하게 나왔는데, SA와 RG 1의 경우 LPS의 농도가 1 ㎍/㎖일 때 COX-2의 생성을 크게 감소시켰으나 5 ㎍/㎖ 일 때는 크게 감소시키지 못함을 알 수 있었다. 반면 RG 2는 LPS의 농도가 1 ㎍/㎖인 경우와 5 ㎍/㎖인 경우 모두 비슷하게 COX-2의 생성을 감소시켰다.

도 7에서 확인할 수 있듯이, LPS 자극에 대한 IL-6의 치주인대세포의 생성 역시 처리하지 않은 대조군에 비해 증가하였으나 농도에 영향을 받지는 않음을 알 수 있다. 그러나 인삼 또는 홍삼 추출물을 LPS 처리 2시간 전에 미리 처리한 군에서는 생성되는 IL-6의 양이 LPS의 농도가 1 ㎍/㎖인 경우 매우 큰 폭으로 감소하였다. 또한, LPS의 농도가 5 ㎍/㎖ 일 때 역시 생성되는 IL-6의 양이 감소하는 것을 확인하였다. 결국 IL-6의 발현 유무와 관련하여, 세 종류의 시약에 따른 차이는 크지 않음을 알 수 있다.

도 8에서 볼 수 있듯이, LPS 자극에 대한 IL-8의 치주인대세포의 생성은 IL-6의 경우와 유사한 결과를 나타내었다. 그러나 인삼 또는 홍삼 추출물을 LPS 처리 2시간 전에 미리 처리한 군에서는 생성되는 IL-8의 양은 IL-6의 결과와는 달리 LPS의 농도가 1 ㎍/㎖인 경우보다 5 ㎍/㎖ 일 때 생성되는 양이 크게 감소하였다.

SNP 및 LPS 자극에 대한 치은섬유아세포의 생존율 확인

치은섬유아세포의 인삼 또는 홍삼 추출물에 대한 반응을 알아보았다. MTS 분석을 이용하여 세 가지 인삼 또는 홍삼 추출물(SA, RG 1 및 RG 2)을 농도별로 처리한 결과, 도 9에서 확인할 수 있듯이, SA 및 RG 1은 치주인대세포에 적용하였던 농도에서 세포생존율이 감소하는 것을 확인하였다. 그러나 RG 2에 대해서는 큰 변화를 보이지 않았다. 한편 SNP와 함께 처리한 경우 역시 세포생존율이 증가하여 치은섬유아세포에 대해서도 인삼 또는 홍삼 추출물이 세포 보호 기능을 하는 것을 알 수 있었다.

이러한 결과는 도 10에서 볼 수 있듯이, LPS 자극에 대한 실험에서도 유사하게 나타나 SA 및 RG 1을 처리하였을 때 세포생존율이 감소하였고 RG 2를 처리한 경우에는 세포생존율에 큰 차이가 나타나지 않음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 인간 치주인대세포에 본 발명의 유효성분인 SA, RG 1 및 RG 2를 처리한 후 MTS 분석을 통해서 세포에 미치는 시약의 독성을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다. 상기 SA는 홍삼 추출물의 사포닌 분획물, RG 1은 사포닌이 포함된 인삼 추출물 및 RG 2는 사포닌이 포함된 홍삼 추출물을 나타낸다.

도 2는 인간 치주인대세포에 본 발명의 유효성분인 SA, RG 1 및 RG 2를 각각 농도별로 처리한 후 세포 내 산화질소(NO)를 발생시키는 SNP(4 mM)를 반응시키고 18시간 후에 세포 독성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. 상기 SNP는 소듐 니트로프루사이드(sodium nitroprusside)를 나타낸다.

도 3은 추출된 A.A. LPS와, E.coli LPS를 FACS 분석하여 생활성을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다. 상기 A.A.는 에그리가티박터 액티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans, A.A.)을 나타낸다.

도 4는 치주인대세포에 A.A. LPS를 처리하고 4일 동안 배양 한 다음 세포 증식도를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 5는 RT-PCR을 이용하여 치주인대세포에 A.A. LPS를 처리하고 18시간 후 효소 COX-2 및 사이토카인의 발현 유무를 보여주는 사진이다.

도 6은 RT-PCR을 이용하여 치주인대세포에 A.A. LPS를 처리하고 18시간 후 COX-2의 발현 정도를 보여주는 사진 및 그래프이다.

도 7은 치주인대세포에 A.A. LPS를 처리하고 18시간 후 IL-6의 발현을 RT-PCR을 이용하여 확인한 결과를 보여주는 사진 및 그래프이다.

도 8은 치주인대세포에 A.A. LPS를 처리하고 18시간 후 IL-8의 발현 정도를 RT-PCR을 이용해서 확인한 결과를 보여주는 사진 및 그래프이다.

도 9는 치은섬유아세포에 본 발명의 유효성분인 SA, RG 1 및 RG 2를 각각 농도별로 처리하고 18시간 후 세포내 산화질소(NO)를 발생시키는 SNP(4 mM)시약을 반응시킨 후 세포 독성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 10은 치은섬유아세포에 A.A. LPS를 처리하고 본 발명의 유효성분인 SA, RG 1 및 RG 2의 각 농도에서 4일 동안 처리 후 세포의 증식도를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

Claims

프로토파낙사디올(PD)계 사포닌(saponin) 대 프로토파낙사트리올(Protopanaxatriol; PT)계 사포닌의 함량비(PD/PT)가 1.6-4.0인 사포닌을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방 또는 개선용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 사포닌은 인삼 또는 홍삼 추출물에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
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제 1 항에 있어서, 상기 프로토파낙사디올계 사포닌은 진세노사이드-Rb1, -Rc, -Rb2, -Rd, -Rg3 및 -Rh2로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 진세노사이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 프로토파낙사디올계 사포닌은 사포닌 총 중량을 기준으로 하여 60-80 중량% 인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1 항, 제 2 항, 제 6 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 (a) 사포닌의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항, 제 2 항, 제 6 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 치주질환의 치료 효능을 가지며, 상기 조성물은 치약(toothpaste), 구강청정용 조성물 또는 구강보호용 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.