CN109666056B - 达玛烷型皂苷元s及其提取方法及其医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种达玛烷型皂苷元S及其提取方法及其医药用途，属于医药领域。包括达玛‑24‑烯‑3α，6α，12β，20S‑四醇和达玛‑25‑烯‑3α，6α，12β，20S‑四醇。取林下山参须根上的疣状季节性不定根适量，加乙醇加热回流提取，提取液回收溶剂至干后，依次以D101大孔吸附树脂、硅胶柱层析、C₁₈反相硅胶开放柱或者中压制备柱分离，甲醇等有机溶剂重结晶。实验结果证明，达玛烷型皂苷元S对香烟烟雾暴露所致慢性阻塞性肺疾病实验模型小鼠的肺功能有保护作用。本发明的达玛烷型皂苷元S作为药物活性成分，为慢性阻塞性肺疾病的预防和治疗提供临床指导与依据，进而减轻患者痛苦，改善患者生活质量。

Description

达玛烷型皂苷元S及其提取方法及其医药用途

技术领域

本发明属于医药领域，尤其涉及达玛烷型皂苷元S及其提取方法及其在制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药物中的应用。

背景技术

慢性阻塞性肺疾病(COPD)，是一种以继发性气道阻塞和肺异常炎症反应为特征的慢性气道炎症性疾病，肺部特点表现为不完全可逆气流受限,常成进行性发展。临床主要表现咳嗽、咳痰、喘息、胸闷气短或呼吸困难等，该疾病发病率高，是世界范围内第三大致死疾病，雾霾天气与吸烟是慢性阻塞性肺疾病最主要的致病因素。目前尚无治疗的有效手段，临床上治疗的药物有β受体激动剂、支气管扩张剂、糖皮质激素、氨茶碱等，配合戒烟、氧疗、营养支持、呼吸肌功能锻炼。但是临床治疗存在如下问题：单纯戒烟并不能阻止气道慢性炎症的持续性发展；单纯吸入糖皮质激素抗炎效果不好，还会加重微血管损伤；氨茶碱的有效剂量与其中毒剂量非常接近等不能阻止或逆转的发展进程。因此需加强治疗该病的药物研究，为有效治疗该疾病提供科学参考。

现代药理研究表明人参蛤蚧散、参蛤益肺胶囊、人身补肺丸等中药复方对慢性阻塞性肺疾病有一定的缓解作用；人参提取物，和以人参提取物与多种中药单体组成的金水益肺方均可以改善香烟烟雾暴露导致的慢性阻塞性肺疾病。以上用于治疗慢性阻塞性肺疾病的药物中均含有人参，表明人参在治疗慢性阻塞性肺疾病方面有潜力。

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科Araliaxeae植物的根及根茎，是我国传统名贵中药。林下山参Panax Ginseng C.A.Meyer cv.Silvatica，又称籽海，是人为地把栽培参的种子撒播到山林自然的环境里，任其自然生长，没有其他人工干预，15年后才上山收取的半野生山参，生长若干年的林下参的质量可以和野山参相媲美。林下山参的生长年限长，质量优于栽培园参，在林下山参的须根上长有密密麻麻的疣状点，为季节性脱落的不定根残留，称为“珍珠疙瘩”，林下参须根上的‘“珍珠疙瘩”越多越密集，则代表着越长的生长年限和更好的药用价值。目前仅有对未见对“珍珠疙瘩”生物学特质的研究，确定其为季节性脱落的不定根残留，未见对其化学成分的研究。人参中主要含有皂苷类、糖类、挥发性成分、有机酸及其酯、蛋白质、酶类、甾醇及其苷、多肽类、含氮化合物、木质素、黄酮类、维生素类、无机元素等成分，其中主要有效成分为人参皂苷和人参多糖。研究报道指出参一胶囊，其主要成分为20(R)-人参皂苷Rg₃，能够增强COPD患者的免疫功能；人参皂苷Rg₁能够减轻香烟刺激引起的气道纤维化反应。目前单体人参皂苷直接用于治疗慢性阻塞性肺疾病的研究处于空白。

发明内容

本发明的目的在于提供达一种达玛烷型皂苷元S及其提取方法及其医药用途。

本发明采取的技术方案：

如下式的达玛烷型皂苷元S

其中R是2-甲基-1-丙烯基：

或R是2-甲基-2-丙烯基：

当R是2-甲基-1-丙烯基时：

化学名：达玛-24-烯-3α，6α，12β，20S-四醇

分子式：C₃₀H₅₂O₄

分子量：476.4

白色粉末，易溶于甲醇、乙醇、吡啶。TLC检测，10％H₂SO₄乙醇溶液为显色剂，105℃加热呈紫色；

当R是2-甲基-2-丙烯基时：

化学名：达玛-25-烯-3α，6α，12β，20S-四醇

分子式：C₃₀H₅₂O₄

分子量：476.4

白色粉末，易溶于甲醇、乙醇、吡啶。TLC检测，10％H₂SO₄乙醇溶液为显色剂，105℃加热呈紫色。

本发明达玛烷型皂苷元S的提取方法是：

取林下山参，收集须根上的疣状季节性不定根并粉碎，加3～5倍量的80～95％乙醇加热回流提取，每次2～4小时，共提取3～5次，合并提取液，回收溶剂至干，得提取物，以水使之混悬，加于D-101或者AB-8大孔吸附树脂柱中，先以水冲洗，再加30～45％乙醇洗脱，再加70～85％乙醇洗脱，收集70～85％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，再进行2～3次200-400目硅胶柱层析，洗脱剂：(三氯甲烷或二氯甲烷)：(乙醇或甲醇)＝(80～120)：(10～35)，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C₁₈反相硅胶开放柱或者中压制备柱分离，洗脱液为(甲醇或乙腈)：水＝(20～80)：(20～80)，减压回收至干，采用甲醇、乙醇、或者乙酸乙酯重结晶得达玛-24-烯-3α，6α，12β，20S-四醇，采用甲醇、乙腈或者三氯甲烷重结晶得达玛-25-烯-3α，6α，12β，20S-四醇。

优选为：

取林下山参，收集须根上的疣状季节性不定根并粉碎，加4倍量的85％乙醇加热回流提取，每次4小时，共提取3次，合并提取液，回收溶剂至干，得提取物，以水使之混悬，加于D-101大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加40％乙醇洗脱，再加85％乙醇洗脱，收集85％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，得提取物，再进行3次200-400目硅胶柱层析，洗脱剂：二氯甲烷：乙醇＝120:35，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C₁₈反相硅胶中压制备柱分离，洗脱液为甲醇：水＝40:80，减压回收至干，采用乙酸乙酯重结晶得达玛-24-烯-3α，6α，12β，20S-四醇，采用甲醇重结晶得达玛-25-烯-3α，6α，12β，20S-四醇。

本发明达玛烷型皂苷元S在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。

本发明用于制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药物时，其口服给药或胃肠外给药均是安全的。在口服情况下，其可以是任何常规形式给药，如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸、软胶囊、漂浮剂、口服液、悬浮液、糖浆、口腔含片、喷雾剂或气雾剂等；当该药物肠胃外给药时，可采取任何常规形式，例如注射剂：如静脉内注射、软膏剂、栓剂、经皮给药、吸入剂等。

本发明制备治疗慢性阻塞性肺疾病的药物时是由有效成分单体或有效成分与固体或液体的赋形剂一起构成的，这里使用的固体或液体赋形剂在本领域是众所周知的，下面举几个具体例子，固体制剂的赋形剂有乳糖、淀粉、浆糊精、碳酸钙、合成或天然硫酸铝、氯化镁、硬脂酸镁,碳酸氢钠、干燥酵母等液体制剂的赋形剂有水、甘油、丙二醇、单糖浆、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等软膏剂的赋形剂可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、木腊、液体石蜡、树脂、高级蜡等组合成的疏水剂或亲水剂。

目前未见到有关达玛烷型皂苷元S：达玛-24-烯-3α，6α，12β，20S-四醇和达玛-25-烯-3α，6α，12β，20S-四醇的提取方法及药物用途的报道，这两种化合物属于新化合物，属于首次分离得到；这两种化合物治疗慢性阻塞性肺疾病的新的药物用途属首次发现。采用达玛烷型皂苷元S进行了动物模型实验，实验结果证明，达玛烷型皂苷元S对香烟烟雾暴露所致慢性阻塞性肺疾病实验模型小鼠的肺功能有保护作用；对香烟诱导的COPD小鼠血清中促炎因子IL-6的表达有抑制作用，而对抑炎因子IL-10的表达有促进作用，从而减轻气道炎症；对香烟诱导的COPD小鼠肺部病理变化有逆转作用。

本发明的有益效果在于，新化合物达玛烷型皂苷元S，包括达玛-24-烯-3α，6α，12β，20S-四醇和达玛-25-烯-3α，6α，12β，20S-四醇。首次采用人参皂苷单体用于治疗慢性阻塞性肺疾病，具有疗效显著的特点，有效物质的剂量可以根据服用方式，病人的年龄和体重及病情严重程度和其它类似的因素而改变。

附图说明

图1是本发明化合物1的¹H NMR谱图；

图2是本发明化合物1的¹³C NMR谱图；

图3是本发明化合物1的HSQC谱图；

图4是本发明化合物1的HMBC谱图；

图5是本发明化合物1的¹H-¹H COSY谱图。

图6是本发明化合物1的NOESY谱图；

图7是本发明化合物1的MS谱图；

图8是本发明化合物2的¹H NMR谱图；

图9是本发明化合物2的¹³C NMR谱图；

图10是本发明化合物2的HSQC谱图；

图11是本发明化合物2的HMBC谱图；

图12是本发明化合物2的¹H-¹H COSY谱图；

图13是本发明化合物2的NOESY谱图；

图14是本发明化合物2的MS谱图；

图15(a)是本发明化合物1和2对模型小鼠肺功能中呼气容积的影响图，(n＝10，mean±SD)；

图15(b)是本发明化合物1和2对模型小鼠肺功能中的肺功能残气量的影响图，(n＝10，mean±SD)；

图15(c)是本发明化合物1和2对模型小鼠肺功能中气道阻力的影响图，(n＝10，mean±SD)；

图16(a)是本发明化合物1和2对模型小鼠血清中IL-6含量的影响图(n＝10，mean±SD)；

图16(b)是本发明化合物1和2对模型小鼠血清中IL-10含量的影响图(n＝10，mean±SD)。

具体实施方式

实施例1

取林下山参，收集须根上的疣状季节性不定根15kg并粉碎，加5倍量的95％乙醇加热回流提取，每次4小时，共提取5次，合并提取液，回收溶剂至干，得1483g提取物，以水使之混悬，加于D-101大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加45％乙醇洗脱，再加85％乙醇洗脱，收集85％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，得1194g提取物再进行3次400目硅胶柱层析，洗脱剂：三氯甲烷：甲醇＝100:30，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C₁₈反相硅胶中压制备柱分离，洗脱液为甲醇：水＝65:35，减压回收至干，采用乙酸乙酯重结晶得到达玛-24-烯-3α，6α，12β，20S-四醇2.4g，采用三氯甲烷重结晶得达玛-25-烯-3α，6α，12β，20S-四醇1.3g。

采用波谱学方法进行结构鉴定：

化合物1

HR-ESI-MS谱给出分子量为521.3880[M+HCOO]^－(计算值为521.3842，C₃₁H₅₃O₆)的准分子离子峰，结合¹H NMR、¹³C NMR谱确定分子式为C₃₀H₅₂O₄。

¹H NMR(600MHz,pyridine-d₅)给一个烯氢质子信号：δ5.30(1H,t,J＝6.3Hz)，中场未给出糖质子信号；高场给出8个甲基信号：δ0.81(3H,s),1.01(3H,s),1.11(3H,s),1.29(3H,s),1.39(3H,s),1.62(3H,s),1.65(3H,s),1.88(3H,s)；且Libermann-Burchard呈阳性，提示为人参皂苷元类化合物；H-6位质子信号出现在δ4.33(1H,m)，表明6位有-OH取代，提示可能为三醇型人参皂苷；与原人参三醇比较，该化合物A环上H-1、2、3、5的质子化学位移偏向低场：δ1.85和1.48(2H,m,H-1)，2.03和1.80(2H,m,H-2)，3.61(1H,d,J＝10Hz,H-3)，1.89(1H,m,H-5)；¹H NMR谱中还给出其他质子信号。

¹³C NMR(150MHz,pyridine-d₅)中共给出30个碳信号；C-7和C-8化学位移分别为δ47.6和41.4验证了该化合物为三醇型人参皂苷元的推断；δ126.6和131.1为两位烯碳的信号，提示连有两个甲基的C-24、25双键的存在；将该化合物的¹³C NMR数据与原人参三醇¹³CNMR数据相比较，结果表明除A环上C₁～C₅的化学位移存在差异外，二者的其余化学位移基本一致，提示该化合物A环上3位羟基构象与原人参三醇不一致；同时，根据文献报道的的规律：与3位β构型的达玛烷型人参皂苷相比，3位α构型的达玛烷型人参皂苷C_1～5的化学位移偏向高场，同时C _28～29的化学位移偏向低场，举例文献中化合物C_{1～5,28～29}的化学位移如下，[(20S,24S)-dammar-20,24-epoxy-3α,12β,25-triol:δ33.5(C-1),25.4(C-2),76.0(C-3),37.5(C-4),49.5(C-5),28.3(C-28),22.0(C-29)；(20R,24S)-dammar-20,24-epoxy-3β,12β,25-triol:δ39.0(C-1),27.5(C-2),78.9(C-3),39.0(C-4),55.9(C-5),28.0(C-28),15.4(C-29)；(20S,24R)-dammar-20,24-epoxy-3α,6α,12β,25-tetraol:δ34.9(C-1),26.5(C-2),77.4(C-3),39.1(C-4),56.2(C-5),32.6(C-28),22.8(C-29)；(20S,24R)-dammar-20,24-epoxy-3β,6α,12β,25-tetraol:δ39.4(C-1),28.1(C-2),78.4(C-3),40.4(C-4),61.9(C-5),31.9(C-28),16.5(C-29)]；该化合物C_{1～5,28～29}的化学位移如下，[δ35.0(C-1),26.8(C-2),77.6(C-3),39.3(C-4),56.3(C-5),32.8(C-28),23.1(C-29)]，表明3位为α构型；另外NOE谱中给出以下主要相关：H-3(δ3.61)/H-29(δ1.29),H-2a(δ2.03)；3-OH(δ5.58)/H-28(δ1.88)，表明3-OH与C-28位于六元环同侧，因此进一步判断C-3位为α构型。HMBC谱给出以下质子与碳信号的主要相关：δ_H 3.61(H-3)/δ_C 35.0(C-1),26.8(C-2),39.3(C-4),56.3(C-5),32.8(C-28),23.1(C-29)；δ_H 1.89(H-5)/δ_C 35.0(C-1),77.6(C-3),39.3(C-4),67.6(C-6),47.6(C-7),50.3(C-9),32.8(C-28),23.1(C-29)；δ_H 1.01(H-19)/δ_C 35.0(C-1),56.3(C-5),50.3(C-9),39.5(C-10)；δ_H 1.88(H-28)/δ_C 77.6(C-3),39.2(C-4),56.3(C-5),32.6(C-29)；δ_H 1.29(H-29)/δ_C 77.6(C-3),39.3(C-4),56.3(C-5),32.8(C-28)；该化合物其余部位的构型均与原人参三醇一致，故不作进一步讨论。根据HSQC、HMBC和¹H-¹H COSY谱图，对该化合物的碳氢信号进行全归属，数据见表1。

综合分析，鉴定化合物1为达玛-24-烯-3α，6α，12β，20S-四醇。经SciFinder检索未发现有关该化合物的文献报道，为一新化合物。

该化合物的¹H NMR谱、¹³C NMR谱、HSQC谱、HMBC谱、¹H-¹H COSY谱图、NOESY谱图、MS谱图分别见附图1-7。

化合物2

HR-ESI-MS谱给出分子量为521.3844[M+HCOO]^－(计算值为521.3842，C₃₁H₅₃O₆)的准分子离子峰，结合¹H NMR、¹³C NMR谱确定分子式为C₃₀H₅₂O₄。

¹H NMR(600MHz,pyridine-d₅)给2个末端烯氢的质子信号：δ4.84(1H,s)和4.80(1H,s)，中场未给出糖质子信号；高场给出7个甲基信号：δ0.83(3H,s),1.05(3H,s),1.20(3H,s),1.32(3H,s),1.39(3H,s),1.71(3H,s),1.91(3H,s)；且Libermann-Burchard呈阳性，提示为人参皂苷元类化合物；H-6位质子信号出现在δ4.38(1H,m)，表明6位有-OH取代，提示可能为三醇型人参皂苷；与化合物1类似，该化合物A环上H-1、2、3、5的质子化学位移偏向低场：δ1.88和1.49(2H,m,H-1)，2.05和1.80(2H,m,H-2)，3.63(1H,d,J＝10Hz,H-3)，1.93(1H,m,H-5)，提示该化合物为化合物1的同分异构体，差异部位在于烯氢位置不同，可能位移至C-25、26末端；¹H NMR谱中还给出其他质子信号。

¹³C NMR(150MHz,pyridine-d₅)中共给出30个碳信号；C-7和C-8化学位移分别为δ47.7和41.4验证了该化合物为三醇型人参皂苷元的推断；将该化合物与化合物1的¹³C NMR数据相比较，结果表明除侧链上C₂₃～C₂₇的化学位移存在差异外，二者的ABCD环上碳的化学位移基本一致，提示该化合物母核构象与化合物1一致，包括C-3位的α构型，仅侧链存在差异；δ110.4和146.8为两个末端烯碳的信号，表明C-25、26末端双键的存在；根据HSQC、HMBC和¹H-¹H COSY谱图，对该化合物的碳氢信号进行全归属，数据见表1。

综合分析，鉴定化合物2为达玛-25-烯-3α，6α，12β，20S-四醇。经SciFinder检索未发现有关该化合物的文献报道，为一新化合物。

该化合物的¹H NMR谱、¹³C NMR谱、HSQC谱、HMBC谱、¹H-¹H COSY谱图、NOESY谱图、MS谱图分别见附图8-14。

表1化合物1和2的NMR数据和HMBC相关

实施例2

取林下山参，收集须根上的疣状季节性不定根5kg并粉碎，加4倍量的80％乙醇加热回流提取，每次3小时，共提取3次，合并提取液，回收溶剂至干，得430g提取物，以水使之混悬，加于AB-8大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加37％乙醇洗脱，再加77％乙醇洗脱，收集77％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，得319g提取物，再进行2次300目硅胶柱层析，洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝80:10，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C₁₈反相硅胶开放柱分离，洗脱液为乙腈：水＝20:80，减压回收至干，采用甲醇重结晶得达玛-24-烯-3α，6α，12β，20S-四醇0.7g，采用乙腈重结晶得达玛-25-烯-3α，6α，12β，20S-四醇0.5g。

实施例3

取林下山参，收集须根上的疣状季节性不定根3kg，并粉碎，加3倍量的88％乙醇加热回流提取，每次2小时，共提取4次，合并提取液，回收溶剂至干，得313g提取物，以水使之混悬，加于AB-8大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加30％乙醇洗脱，再加70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，得251g提取物再进行3次200目硅胶柱层析，洗脱剂：三氯甲烷：乙醇＝120:35，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C₁₈反相硅胶开放柱分离，洗脱液为甲醇：水＝80:20，减压回收至干，采用乙醇重结晶得到达玛-24-烯-3α，6α，12β，20S-四醇0.5g，采用三氯甲烷重结晶得达玛-25-烯-3α，6α，12β，20S-四醇0.36g。

实施例4

取林下山参，收集须根上的疣状季节性不定根10kg并粉碎，加4倍量的85％乙醇加热回流提取，每次4小时，共提取3次，合并提取液，回收溶剂至干，得806g提取物，以水使之混悬，加于D-101大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加40％乙醇洗脱，再加85％乙醇洗脱，收集85％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，得695g提取物，再进行3次400目硅胶柱层析，洗脱剂：二氯甲烷：乙醇＝120:35，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C₁₈反相硅胶中压制备柱分离，洗脱液为甲醇：水＝40:80，减压回收至干，采用乙酸乙酯重结晶得达玛-24-烯-3α，6α，12β，20S-四醇1.5g，采用甲醇重结晶得达玛-25-烯-3α，6α，12β，20S-四醇0.9g。

下边通过药效学试验例进一步说明本发明的效果。

试验例1：达玛烷型皂苷元S对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型小鼠肺功能的影响。

采用被动吸烟法对雌性BALB/c小鼠进行全身暴露建立COPD模型。将小鼠置于自制密封烟雾暴露箱(长：45cm；宽：31cm；高：16cm)内，采用打气泵将烟雾通入熏烟箱中，每次点燃2只香烟(雄狮牌，每支含尼古丁0.7mg，焦油8mg，一氧化碳10mg)，香烟完全燃烧开启通气口，计时10min后打开熏烟箱，10分钟后重复上述步骤3次。采用采用被动吸烟法12周(每周6天，每天两次)造模成功，60只小鼠随机分为正常对照组、模型组、化合物1(达玛-24-烯-3α，6α，12β，20S-四醇)低、高剂量组(10mg/kg；20mg/kg)和化合物2(达玛-25-烯-3α，6α，12β，20S-四醇)低、高剂量组(10mg/kg；20mg/kg)。正常对照组、模型组分别灌胃给以生理盐水，化合物1和2各剂量组分别灌胃给药，连续给药4周。

小鼠称重后，根据体重腹腔注射1％戊巴比妥钠注射液，麻醉小鼠。深度麻醉后，将小鼠仰卧位固定于鼠板上，分离气管后，在气管软骨环上端剪一横切口，插入气管插管并用手术线固定，插管另一端与Buxco小动物肺功能仪的气流传感器、压力传感器和内置小动物呼吸机相连。将肺功能仪PFT检测系统连接并设置好标准值，先描记一段平静呼吸，待其呼吸稳定后再检测第0.1秒用力呼气容积(FEV0.1)、肺功能残气量(FRC)和气道阻力(RI)。

结果：与正常对照组比较，模型组小鼠肺功能参数均显著降低，差异均有统计学意义(^###P<0.001或^##P<0.01)，说明造模成功。与模型组比较，化合物1高剂量组、化合物2低和高剂量组肺功能参数均显著升高，差异均有统计学意义(^*P<0.05或^**P<0.01)，结果见图15(a)～(c)、表2。

表2两种达玛烷型皂苷元化合物1和2对模型小鼠肺功能的影响(n＝10，mean±SD)

组别	呼气容积/mL	肺功能残气量/mL	气道阻力/cmH<sub>2</sub>O/(L·s)
				正常组	1.27±0.07	0.56±0.04	1.16±0.05
模型组	0.81±0.15<sup>###</sup>	0.87±0.13<sup>##</sup>	1.43±0.13<sup>##</sup>
				化合物1低剂量组	0.85±0.08	0.79±0.07	1.35±0.11<sup>*</sup>
化合物1高剂量组	1.02±0.11<sup>**</sup>	0.73±0.10<sup>*</sup>	1.24±0.08<sup>**</sup>
				化合物2低剂量组	0.94±0.14<sup>*</sup>	0.76±0.11<sup>*</sup>	1.33±0.12<sup>*</sup>
化合物2高剂量组	1.06±0.09<sup>**</sup>	0.70±0.06<sup>**</sup>	1.21±0.07<sup>**</sup>

结论：达玛烷型皂苷元S化合物1和2能改善COPD模型小鼠的肺功能。

试验例2：观察达玛烷型皂苷元S对COPD模型小鼠血清中促炎因子IL-6和抑炎因子IL-10表达的影响。

造模方法及给药方法同试验例1。

肺功能测试结束后，小鼠眼球取血，血液置于冰上，待所有实验动物血液标本收集完毕后室温凝集30min，4℃放置过夜，以彻底释放细胞因子，第2天以3000rpm，室温离心10min，收集上层血清-20℃冻存，采用酶联免疫吸附法检测促炎因子IL-6和抑炎因子IL-10。IL-6检测试剂盒(美国R&D公司，批号2017110507)，IL-10检测试剂盒(美国R&D公司，批号2017111203)。

结果：模型组IL-6含量较正常组明显升高(^###P<0.001)，两种达玛烷型皂苷元低、高剂量组IL-6含量较模型组显著降低(^*P<0.05或^**P<0.01)；模型组IL-10含量较正常组明显降低(^##P<0.01)，两种达玛烷型皂苷元低、高剂量组IL-10含量较模型组显著升高(^*P<0.05或^**P<0.01)，见图16(a)～(b)、表3。

表3两种达玛烷型皂苷元化合物1和2对模型小鼠血清中IL-6和IL-10含量的影响(n＝10，mean±SD)

结论：达玛烷型皂苷元S化合物1和2对香烟诱导COPD模型的小鼠血清中促炎因子IL-6的表达有抑制作用，而对抑炎因子IL-10的表达有促进作用，从而减轻气道炎症。

试验例3：达玛烷型皂苷元S对COPD模型小鼠肺部病理变化的逆转作用。

造模方法及给药方法同试验例1。

对各实验小鼠采用甲醛溶液进行灌流固定，苏木素-伊红染色观测肺组织病理学改变。

结果：模型组小鼠肺组织可见明显的慢性阻塞性肺疾病病理损伤，各级支气管上皮细胞出现明显缺失、脱落现象，肺泡隔明显增厚，肺泡腔扩张，有的融合形成大泡，肺泡腔内可见大量棕黄色丝状物，肺泡数目明显减少，支气管管腔大量炎性细胞浸润。两种达玛烷型皂苷元给药组小鼠肺组织可见微弱的慢性阻塞性肺疾病病理损伤，各级支气管上皮细胞出现部分缺失、脱落现象，肺泡隔有增厚，肺泡腔可见扩张，肺泡腔内可见少量棕黄色丝状物，肺泡数目减少，支气管管腔中度炎性细胞浸润。

结论：达玛烷型皂苷元S化合物1和2对香烟诱导COPD模型的小鼠肺病理学变化有逆转作用，能减轻COPD的疾病症状。

Claims (2)

1.一种达玛烷型皂苷元S的提取方法，其特征在于，包括下列步骤：

取林下山参，收集须根上的疣状季节性不定根并粉碎，加3~5倍量的80~95%乙醇加热回流提取，每次2~4小时，共提取3~5次，合并提取液，回收溶剂至干，得提取物，以水使之混悬，加于D-101或者AB-8大孔吸附树脂柱中，先以水冲洗，再加30~45%乙醇洗脱，再加70~85%乙醇洗脱，收集70~85%乙醇洗脱液，回收溶剂至干，再进行2~3次200-400目硅胶柱层析，洗脱剂为（三氯甲烷或二氯甲烷）：（乙醇或甲醇）=（80~120）：（10~35），洗脱液减压浓缩回收至干，进行C₁₈反相硅胶开放柱或者中压制备柱分离，洗脱液为（甲醇或乙腈）：水=（20~80）：（20~80），减压回收至干，采用甲醇、乙醇、或者乙酸乙酯重结晶得达玛-24-烯-3α，6α，12β，20S-四醇，采用甲醇、乙腈或者三氯甲烷重结晶得达玛-25-烯-3α，6α，12β，20S-四醇。

2.根据权利要求1所述的一种达玛烷型皂苷元S的提取方法，其特征在于，包括下列步骤：

取林下山参，收集须根上的疣状季节性不定根并粉碎，加4倍量的85%乙醇加热回流提取，每次4小时，共提取3次，合并提取液，回收溶剂至干，得提取物，以水使之混悬，加于D-101大孔吸附树脂，先以水冲洗，再加40%乙醇洗脱，再加85%乙醇洗脱，收集85%乙醇洗脱液，回收溶剂至干，得提取物，再进行3次200-400目硅胶柱层析，洗脱剂：二氯甲烷：乙醇=120:35，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C₁₈反相硅胶中压制备柱分离，洗脱液为甲醇：水=40:80，减压回收至干，采用乙酸乙酯重结晶得达玛-24-烯-3α，6α，12β，20S-四醇，采用甲醇重结晶得达玛-25-烯-3α，6α，12β，20S-四醇。

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