CN111088390A - 与陆地棉叶片绒毛相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
与陆地棉叶片绒毛相关的snp分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供与陆地棉叶片绒毛相关的SNP分子标记及其应用，属于分子生物学领域。本发明与陆地棉植株绒毛相关的SNP标记共31个，这些标记具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.31所示的DNA序列，这些SNP分子标记单独或任两个或多个组合应用均可用于陆地棉植株绒毛的早期预测，还可用于棉花遗传背景分析和筛选，以及植株绒毛位点分子标记辅助选择育种，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，涉及与陆地棉叶片绒毛关联的SNP标记及其应用。
背景技术
陆地棉作为主要的天然纤维作物，最新统计全世界陆地棉种植面积约3 420万公顷，截止2017年中国陆地棉栽培种种植面积约319.4万公顷，约占世界陆地棉种植面积的9.3％。在中国陆地棉是种植面积最广泛的棉种，近年来随着陆地棉棉区向西北内陆(新疆)棉区转移。截止2017年新疆种植面积已占中国陆地棉种植面积的70％。由于棉花生育期受有效积温偏低、无霜期短、降雨量、辐射量、纬度和地表温度等气候条件的影响，由于长江流域和黄河流域气候条件与新疆降雨量差异较大导致这两个棉区多数棉花品种难以在新疆地区正常成熟吐絮，因此快速筛选出适应新疆地区的棉花品种尤为重要。植物毛状体起源于表皮细胞，在长度、密度和分布上差异很大。高密度的毛状体有利于抵抗昆虫的攻击及适应西北内陆地区干旱。研究不同组织表皮毛状体的形成，有助于阐明毛状体的形成机制，改善毛状体性状，而与绒毛性状又是紧密相关的。因此筛选出与陆地棉叶绒毛相关的位点是有助于快速鉴定和筛选出适应西北内陆棉区的耐旱性较强的品种。寻找与目标性状紧密连锁/关联的分子标记，对目标性状跟踪选择，可以减少育种过程中选择的盲目性，利于打破连锁累赘。
全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)是一种对全基因组范围内的常见遗传变异基因总体关联分析的方法，该方法以自然群体为研究对象，以长期重组后保留下来的基因(位点)间连锁不平衡(linkagedisequilibrium，LD)为基础，将目标性状表型的多样性与基因(或标记位点)的多态性结合起来分析，可直接鉴定出与表型变异密切相关且具有特定功能的基因位点或标记位点。在全基因组范围内进行整体研究，能够一次性对优良性状进行轮廓性概览，适用于挖掘优良性状等的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：提供与陆地棉叶片绒毛相关的SNP分子标记及其应用，解决现有的利用传统育种方法多年多点种植来评估品种绒毛多少的方法，存在选择效率低和周期长等问题。
本发明的技术方案为：与陆地棉叶片绒毛关联的SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.31任一个所示。
SNP位点位于SEQ ID No.1～SEQ ID No.31任一个核苷酸序列的第50位碱基，SNP位点的碱基如下表所示：
上述SNP分子标记可以用于棉花植株绒毛的早期预测或棉花分子标记辅助育种中。
与陆地棉植株绒毛关联的SNP分子标记组合，由SEQ ID No.1～SEQ ID No.31所示的核酸中的任两个或多个构成。
上述SNP分子标记组合可以用于棉花植株绒毛的早期预测或棉花分子标记辅助育种中。
含有上述所述的SNP分子标记或SNP分子标记组合的基因芯片或试剂盒。这些基因芯片或试剂盒可用于棉花植株绒毛的早期预测或棉花分子标记辅助育种中。
用于检测上述SNP分子标记的特异性引物对。
本发明具有以下优点和增益效果：
本发明提供的与棉花叶绒毛关联的SNP分子标记，直接以DNA的形式表现，在棉花的各个组织和发育阶段均可检测，不受环境和季节限制，不存在表达与否等问题影响，不用分析片段的长度，适于快速、规模化、自动化筛查。本发明中的SNPs分子标记单独或任两个或多个组合应用均可用于陆地棉植株绒毛的早期预测，还可用于棉花遗传背景分析和筛选，以及植株绒毛位点分子标记辅助选择育种，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或者条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1与陆地棉植株绒毛相关的SNP分子标记的筛选
实施例1
1、从中国农业科学院棉花研究所中期库中保存的7362份陆地棉种质中筛选出419份核心种质，这些种质资源来自中国、美国等17个国家，国内材料来自23个省市。田间试验于2015年分别在河南安阳中国农业科学院棉花研究所试验基地、湖北荆州长江大学试验基地、甘肃敦煌甘肃省农业科学院经济作物研究所试验基地进行，试验采取完全随机区组设计，三次重复。
2、陆地棉叶片绒毛调查
根据陆地棉材料的特点，由于试验材料多，小区多，为了控制田间试验系统误差，一方面选择肥力相差不大的试验田，另一方面种植方式和调查方法均需要统一规范，最后要增加调查株数。叶片绒毛(leaf pubescence amount，LPA，个/cm2)调查具体方法如下：
第一，在花期每个小区选取10株(不包括两端植株)，每株取倒数第四叶片，每片叶随机取3个观察区域在80X体视显微镜下观察叶绒毛个数。第二，根据观测数据计算单位面积的叶绒毛数量：WF20X/10高眼点大视场广角目镜，放大倍率20倍，接口30mm或30.5mm，视场10mm实际视场(d)＝视场数/视场数物镜的倍率(中间倍率)＝10/4＝2.5mm，实际视场数的面积S＝∏(d/2)2＝3.14×(2.5/2)2＝4.90625mm2，单位面积个数＝20个/4.90625＝4.076个/mm2)。
3、SNPs检测：取棉株嫩叶用于基因组重测序。测序获得高质量的clean data数据量为6454Gb，平均每个样品15.4G，测序深度6.55倍以上。利用Base Calling分析及低质量碱基过滤，获得有效原始DNA序列数据。有效的高质量测序数据通过BWA软件比对到棉花参考基因组，比对结果用SAMTOOLS去除重复，获得有效高质量序列。采用GATK软件进行群体SNPs检测。利用贝叶斯模型检测群体中的多态性位点，对GATK结果SNPs进行过滤，以获得高质量的SNPs。利用ANNOVAR软件对SNPs检测结果进行注释。
4、陆地棉叶绒毛性状全基因组关联分析
本发明对419份棉花材料进行了1年、3个地点、3个自然环境：安阳(AY，E 114.07°、N 35.85°、年降雨量551.8mm、海拔75mm)；荆州(JZ，E 112.18°、N 30.35°、年降雨量1077.6mm、海拔20mm)；敦煌(DH；E 94.44°、N40.08°、年降雨量40.2mm、海拔1139mm)种植。并检测分析了这些品种的叶绒毛，采用最新的高质量陆地棉基因组作为参考基因组(Yang etal.,2019)，通过Illumina Hiseq测序平台对这419份棉花品种进行基因组重测序，获得高质量的clean data数据量为6454Gb，平均每个样品为15.4G，测序深度达6.55倍以上，共有1,944,369个高质量的SNPs(最小等位基因频率>0.05；缺失率<10％)。采用Efficientmixed-model associationexpedited(EMMA)统计分析软件的混合线性模型进行统计分析(Yanget al.,2014)。所有被测性状的全基因组显著性阈值用公式P＝0.05/n(其中n是有效SNP的数量)进行评估(Li，et al.,2012)。419陆地棉核心种质的P值阈值约为2.57×10-8。通过GWAS分析获得至少在一个及以上环境中稳定出现的与陆地棉叶绒毛关联的SNP分子标记31个(表1)。
SNP分子标记及其发生突变的等位基因位点如表1所示，参考基因组为陆地棉品种TM-1(Yang,et al.2019)，NCBI版本号网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝ASM698074v1。
表1与陆地棉叶绒毛关联的SNP标记
5、结论：本发明的与陆地棉叶绒毛关联的SNP分子标记可以用于棉花绒毛性状的早期预测和筛选，还可以用于棉花叶绒毛的分子标记辅助选择育种。其直接以DNA的形式表现，在棉花的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制、不存在表达与否等问题；表现为中性，不影响目标形状的表达；SNP适于快速、规模化筛查。不用分析片段的长度，利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 与陆地棉叶片绒毛关联的SNP分子标记及其应用
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 100
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400> 1
actcacacat ataaagaaaa ggtaagagta agatggagct catatattat gcgtcgaatt 60
atattttact ccttctacta aaataaataa gattagtctt 100
<210> 2
<211> 100
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400> 2
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gtgtaatacg ccttatgtgg attttgtcta gtgtttcgtc 100
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<211> 100
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
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cccattgctt tgaaccatcc agcgatgagt ttcttattat 100
<210> 4
<211> 100
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
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<210> 5
<211> 100
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
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<210> 6
<211> 100
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400> 6
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ttgaacatta aaatcgaaat aacgtatcaa atagtatatt 100
<210> 7
<211> 100
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
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ctattgtttt gatgttgaat cagctaaatt tggcagaagg 100
<210> 8
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<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
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aatgaccaaa tttgtttttc atatttgtta atcacaagtg 100
<210> 10
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<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
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<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
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cattgtaaca ctcatttagt gcatcaaatt tccaaatcca 100
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<212> DNA
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<212> DNA
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<210> 20
<211> 100
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
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ctctcaatca tctattggat tgctatcctt ttggagagat 100
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<212> DNA
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<400> 21
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gaacccttat ttcctcaggt gaggttcctt tggattattg 100
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<212> DNA
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gtctttgtac attagattaa agagtaaact ggttcttttg ttaaaaattc catctatttt 60
tattgttaaa atttgattcc tatgcattag atacatgtgg 100
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<212> DNA
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aaaaagatag agaagagaaa caaatgcctt aagaattgag cttttgttgt ggtaatccta 60
ccttttactt ggtttgacag gtcttgcttg tactggtcct 100
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<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400> 24
ccatgctcta cgcacagcct aagtggacca gaacattgtt gaaaatggaa catattaaag 60
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<211> 100
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attgtttaaa actgatccct gtacaacagc atgaggtaca 100
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<211> 100
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tggactcatc ttctaaaggt cacctctcat ctggagcttt 100
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tagggacaat tttatcaccg tcctctctag tttggtagat 100
<210> 28
<211> 100
<212> DNA
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<400> 28
ctttaaaagt agtgaacacc catcattttc cattgttgaa cccttatttc ctcaggtgag 60
gttcctttgg attattgtct catttttggg tcatcattat 100
<210> 29
<211> 100
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400> 29
ccattgcttt ctcaagaacg actttgatga tgaatcttcc attttttttt ccctcacctc 60
ttaaaaaaat cgaattaatt gaactctcgc tttctctcag 100
<210> 30
<211> 100
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400> 30
atttctaatt catccttgct ccgtattaaa cttcaaagtc catcatcttg gatcttcaac 60
ttttcttctc gaaatttctt cgtgatatag ttttgaacga 100
<210> 31
<211> 100
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400> 31
tcagccaagt gatcgacgaa tacccattta tttcaatgga tactgagttt ccgggtataa 60
tttccggcca aaagtggacc ccacaaggcc gtacaacggt 100
Claims (8)
1.与陆地棉叶片绒毛关联的SNP分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.31任一个所示。
2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，SNP位点位于SEQ ID No.1～SEQID No.31任一个核苷酸序列的第50位碱基，SNP位点的碱基如下表所示：
3.与陆地棉植株绒毛关联的SNP分子标记组合，由SEQ ID No.1～SEQ ID No.31所示的核酸中的任两个或多个构成。
4.含有权利要求1所述的SNP分子标记或权利要求3所述的SNP分子标记组合的基因芯片或试剂盒。
5.权利要求1或2所述的SNP分子标记在棉花植株绒毛的早期预测或棉花分子标记辅助育种中的应用。
6.权利要求3所述的SNP分子标记组合在棉花植株绒毛的早期预测或棉花分子标记辅助育种中的应用。
7.权利要求4所述的基因芯片或试剂盒在棉花植株绒毛的早期预测或棉花分子标记辅助育种中的应用。
8.用于检测权利要求1或2所述的SNP分子标记的特异性引物对。
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|---|---|---|---|---|
| CN116790807A (zh) * | 2023-08-17 | 2023-09-22 | 中国农业科学院棉花研究所 | 陆地棉d12号染色体与耐盐关联的snp分子标记及其应用 |
| CN117089645A (zh) * | 2023-08-17 | 2023-11-21 | 三亚中国农业科学院国家南繁研究院 | 陆地棉a01号染色体与耐盐关联的snp分子标记及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109762923A (zh) * | 2019-03-07 | 2019-05-17 | 中国农业科学院棉花研究所 | 与陆地棉生育期和植株绒毛紧密连锁的ssr分子标记 |
-
2020
- 2020-02-18 CN CN202010100225.XA patent/CN111088390B/zh active Active
Patent Citations (1)
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| CN109762923A (zh) * | 2019-03-07 | 2019-05-17 | 中国农业科学院棉花研究所 | 与陆地棉生育期和植株绒毛紧密连锁的ssr分子标记 |
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| CN116790807B (zh) * | 2023-08-17 | 2024-05-28 | 中国农业科学院棉花研究所 | 陆地棉d12号染色体与耐盐关联的snp分子标记及其应用 |
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