CN117089645B - 陆地棉a01号染色体与耐盐关联的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了陆地棉A01号染色体与耐盐关联的SNP分子标记及其应用，涉及植物分子生物学领域。该SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑7中任一项所示。本发明提供的与棉花植株耐盐关联的SNP分子标记，直接以DNA的形式表现，在棉花的各个组织和发育阶段均可检测，不受环境和季节限制，不存在表达与否等问题影响，不用分析片段的长度，适于快速、规模化、自动化筛查。该SNP分子标记可用于鉴别陆地棉耐盐性状，实现对陆地棉植株耐盐能力的早期预测，还可用于棉花耐盐相关遗传背景分析和筛选，以及植株耐盐位点分子标记辅助选择育种，具有广阔的应用前景。

Description

陆地棉A01号染色体与耐盐关联的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，特别是涉及陆地棉A01号染色体与耐盐关联的SNP分子标记及其应用。

背景技术

土地盐碱化对人类活动造成的危害很大，会造成农作物的减产甚至绝收，会影响植被生长并间接造成生态环境恶化，会造成巨大的经济损失。

棉花能够提供重要的纺织原材料，是世界上重要的经济作物之一。棉花是耐盐性较强的作物，对盐胁迫具有一定的适应性和调节能力。土壤盐分浓度低于0.2％时有利于棉花的出苗和生长。当土壤盐分浓度超过0.2％时，随着盐浓度的升高，将明显抑制棉花幼苗的正常生长，从而导致生理性减产。盐胁迫条件下植物体内的无机离子含量发生变化，棉花植株体内的Na离子、Cl离子和Ca离子的含量随土壤盐分浓度的增大而递增。许多研究也表明耐盐品种根系具有一定的储蓄Na离子的作用，体内的Na/K离子比显著低于耐盐性较弱的品种。

全基因组关联分析是基于基因组中大量的SNP标记，在基因组范围内，进行对照分析或相关分析，进而定位基因组中目标性状相关位点的一种新的正向遗传学方案。它主要是基于标记间随机组合的原理，进行关联作图。同一染色体上，不同的两对等位基因，当两个等位基因--同时遗传给后代的频率大于随机出现的频率时，那么这两对等位基因位点就存在着连锁不平衡。

利用全基因组关联分析，开发与陆地棉耐盐相关的SNP分子标记，将有利于为棉花耐盐相关遗传背景分析和筛选，以及植株耐盐位点分子标记辅助选择育种提供有力的技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供陆地棉A01号染色体与耐盐关联的SNP分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的SNP分子标记与陆地棉耐盐性状相关联，可用于鉴别陆地棉耐盐性状，实现对陆地棉植株耐盐能力的早期预测。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供陆地棉A01号染色体与耐盐关联的SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQID NO.1-7中任一项所示，

SEQ ID NO.1-7所示序列的第50位碱基处均存在SNP位点，各SNP位点的信息如下：

本发明还提供一种陆地棉A01号染色体与耐盐关联的SNP分子标记组合，由SEQ IDNO.1-7所示的SNP分子标记中的两个或多个组成；

SEQ ID NO.1-7所示序列的第50位碱基处均存在SNP位点，各SNP位点的信息如下：

本发明还提供扩增上述的SNP分子标记或SNP分子标记组合的引物在制备鉴别陆地棉耐盐性状的产品中的应用。

进一步地，所述产品包括试剂、试剂盒或芯片。

本发明还提供一种鉴别陆地棉耐盐性状的产品，包括扩增上述的SNP分子标记或SNP分子标记组合的引物。

进一步地，所述产品包括试剂、试剂盒或芯片。

本发明还提供上述的SNP分子标记在鉴别陆地棉耐盐性状中的应用。

本发明还提供上述的SNP分子标记组合在鉴别陆地棉耐盐性状中的应用。

本发明还提供上述的别陆地棉耐盐性状的产品在鉴别陆地棉耐盐性状中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供的与棉花植株耐盐关联的SNP分子标记，直接以DNA的形式表现，在棉花的各个组织和发育阶段均可检测，不受环境和季节限制，不存在表达与否等问题影响，不用分析片段的长度，适于快速、规模化、自动化筛查。本发明提供的SNP分子标记可用于鉴别陆地棉耐盐性状，实现对陆地棉植株耐盐能力的早期预测，还可用于棉花耐盐相关遗传背景分析和筛选，以及植株耐盐位点分子标记辅助选择育种，具有广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为K元素含量检测构建的标准曲线；

图2为Na元素含量检测构建的标准曲线；

图3为全基因组关联分析得到的曼哈顿图；

图4为针对茎(S)中钠离子相对含量进行全基因组关联分析得到的连锁不平衡结构域和群体单倍型分类结果；

图5为针对叶(L)中钠离子相对含量进行全基因组关联分析得到的连锁不平衡结构域和群体单倍型分类结果；

图6为全基因组关联分析得到的不同单倍型的表型差异对比图；^****P<0.0001，^***P<0.001，^**P<0.01。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1、从中国农业科学院棉花研究所中期库中保存的7362份陆地棉种质中筛选出430份核心种质(表1)，包括385份陆地棉和45份陆地棉半野生种蓬蓬棉。

表1 430份陆地棉核心种质

2、播种：在人工气候室种植430份陆地棉自然群体的种子。每2个品种种在一个大花盆里，各种6杯(每2杯为1个重复)，每杯沙子保证重量为900g(800g沙+100mL水)。每个杯子种3棵苗，即每个品种大约18棵。长至三片真叶一心期时选取生长状态良好且形态相近的幼苗进行处理。一组为对照组，一组为实验组。实验组进行中性盐胁迫处理(NaCl浓度为0.4％(盐沙比))，为防止盐冲击效应，采用逐步加盐方式，开始0.8g，每过12h添加第二、第三次：第一天上午9点加入0.8gNaCl/40mL溶液；第一天下午9点加入1.2g NaCl/30mL；第二天上午9点加入1.6g NaCl/30mL。对照组同时间加入等量蒸馏水。第四天上午9点观察、取样。

3、采取茎(包括叶柄)、真叶(长第三片真叶，保留子叶)，装在写好编号的纸袋后放入烘箱105℃杀青20min，然后在80℃干燥48h，精确测量其干重。使用X SERIES2型电感耦合等离子体质谱仪测试样品。

(1)样本溶液的制备

每批样本进行制备前，先进行烘干精确称重，对烘干后的样品进行粉碎，至40目以下。取已知精确重量的根茎叶，置于烧杯中，将烧杯置于平板加热仪上缓缓加热，使充分干燥，直至完全碳化；再滴加入浓硫酸12mL，均匀浸润，将烧杯置于平板加热仪上缓缓加热，使充分干燥，直至硫酸蒸汽除尽；再将烧杯置于马弗炉550℃下完全灰化；置于室温放冷后，精密加入硝酸2.00mL使充分溶解，完全转移至50mL离心管，精密加入超纯水48.00mL超纯水充分冲洗烧杯，稀释样品溶液，摇匀即可。如果K、Na吸收值超出线性范围，会对该批次进行稀释：精密量取样品溶液1.00mL，置于100mL离心管中，精密加入99.00mL的1.5％硝酸溶液来稀释样品溶液，摇匀即得二步稀释样品溶液。

(2)测定法

样本溶液的测定法：将样品进样管置于测试溶液中进行测定，测定结束后用1.5％硝酸溶液冲洗样品进样管后，继续测定样品。测定过程中高浓度溶液过度低浓度溶液时，用1.5％硝酸溶液冲洗样品进样管5分钟。

二步稀释样品溶液的测定法：将样品进样管置于二步稀释样品溶液中进行测定，测定结束后用1.5％硝酸溶液冲洗样品进样管后，继续测定二步稀释样品溶液。测定过程中高浓度溶液过渡到低浓度溶液时，用1.5％硝酸溶液冲洗样品进样管5分钟。

(3)标准曲线

取试剂空白溶液、6个浓度标准溶液分别进样，得到K、Na元素的读数即一系列响应值，并对进样浓度(ppm)进行线性回归，绘制出标准曲线(见图1和图2)。采用标准曲线法计算K、Na元素含量。

(4)样本溶液测定的计算公式

样品含量(g/kg)＝样品液浓度(ppm)×50/称样量/1000

二步稀释样品含量(g/kg)＝样品液浓度(ppm)×50×100/称样量/1000

纸袋编号命名规则：品种名缩写+处理名称缩写(CK：对照；ST(盐胁迫处理))+组织名称缩写(S：茎；L：叶)+重复(R1、R2、R3)。

4、SNP的检测

取430份陆地棉植株的嫩叶，采用CTAB法分别提取430份基因组DNA，送生物公司测序，获得高质量的clean data数据，测序深度在6.55倍及以上。利用Base Calling软件分析过滤，使用BWA软件对有效的高质量序列数据进行陆地棉参考基因组比对，并利用SAMTOOLS软件去除重复，以获得有效的高质量序列。采用GATK软件对每个样本进行SNPs检测，并利用贝叶斯模型对群体中的多态性位点进行检测，然后经过过滤，获得4,159,775个高质量SNPs(MAF>0.05，缺失<0.2，杂合率<0.3)。所有SNPs检测结果均由ANNOVAR软件进行注解。

5、全基因组关联分析及相关的SNP分子标记发掘

根据430份陆地棉的Na离子相对耐盐系数表型数据与4,159,775个高质量SNPs(MAF>0.05，缺失<0.2，杂合率<0.3)基因型数据进行全基因组关联分析，取-log10(P)>6.5的位点为显著性位点，在染色体A01上筛选显著关联位点。全基因组关联分析得到的曼哈顿图如图3所示。结果在A01染色体上筛选到Na离子相对耐盐系数显著关联耐盐优异区间两个，分别为A01:112926477-113414011和A01:112973915-113404327；筛选到显著关联位点共7个(表2)。

Na离子相对耐盐系数(ST1-L-Na或ST1-S-Na)＝盐胁迫处理下性状值/对照性状值×100％；

其中，性状值为叶片(L)或茎(S)中钠离子相对含量；对照为正常处理(同时间加入等量蒸馏水)的植株。

表2

注：观测值是指在430份种质资源中具有该SNP位点突变的种质资源数目；效应值(S)代表茎的效应值，效应值(L)代表叶的效应值，其中，效应值定义为：SNP位点突变后，Na离子相对耐盐系数较突变前增大为负效应(-)，反之为正效应(+)，持平为0；Na离子相对耐盐系数与耐盐能力成反比，即Na离子相对耐盐系数越高，耐盐能力越弱，反之耐盐能力则越强。

SEQ ID NO.1：

ataatcctataattatttttatccaattttttatgattttccaaagtcaraacaggagaacccgaattcattctgaccttgcttcacaaaattcattata；r为a或g。

SEQ ID NO.2：

aaataaaagtttccaggaaatgaattaaaacatgatacacatgtgggaayatccttgtgactttgctgtccaaatgtcaagttttcattggctttcaact；y为c或t。

SEQ ID NO.3：

gcgatatctactttatggccaaattaaaaaaataaagaaaagtgaattgyggagtaattaaaggaggagggaccaactgggtaaatagcccctcaaacag；y为c或t。

SEQ ID NO.4：

gaagcaaaaacggcgccatttaaaccctcttcaatggtttaaaacaacgycgcctggagccagcccgacctgatctggcccgtcgcccctgggaccagcg；y为c或t。

SEQ ID NO.5：

cccaattattaagtccaacgagaaagtcgaaacccagcacagtagggcaygactgtaacacccccacgcccgaaaccgtcaccggaatcaagcttgaggt；y为t或c。

SEQ ID NO.6：

ttgatctcattttaggaatggactggcttgttaagcataaggcgaccctrgattgtgctgctaaatgaatggtgttaaagaccacaaaggatgaggaggt；r为a或g。

SEQ ID NO.7：

cctaatcctgcttgtggatagggttgtaaatgaaccgagcttgaacgaayaatcttctattcatgtttgtttatttatttttaagcttgctcatgttcag；y为t或c。

6、连锁不平衡(Linkage disequilibrium)分析

用Tassel 5.0对上述SNP位点所在候选区间进行连锁不平衡(Linkagedisequilibrium)分析，均发现一个连锁不平衡区域(LD block)，且LD block相关性(R²)较高；根据Na离子相对耐盐系数表型数据对ST1-L-Na和ST1-S-Na基因座进行单倍型分型并聚类，根据聚类结果(图4和图5)将供试群体分为Hap1和Hap2两种单倍型。通过双尾student-t检验比较不同单倍型之间的叶片和茎的Na离子相对耐盐系数值，发现Hap1与Hap2的ST1-L-Na和ST1-S-Na值均存在极显著差异(图6)。

综上所述，本发明提供的与陆地棉耐盐性状关联的SNP分子标记可以用于陆地棉耐盐性状的早期预测和筛选，还可以用于棉花植株耐盐能力的分子标记辅助选择育种。该分子标记直接以DNA的形式表现，在棉花的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；SNP适于快速、规模化筛查，不用分析片段的长度，利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.扩增SNP分子标记组合的引物在制备鉴别陆地棉耐盐性状的产品中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记组合由SEQ ID NO.1-7所示的SNP分子标记组成；

SEQ ID NO.1-7所示序列的第50位碱基处均存在SNP位点，各SNP位点的信息如下：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒或芯片。

3.一种鉴别陆地棉耐盐性状的产品，其特征在于，包括扩增SNP分子标记组合的引物；

所述SNP分子标记组合由SEQ ID NO.1-7所示的SNP分子标记组成；

SEQ ID NO.1-7所示序列的第50位碱基处均存在SNP位点，各SNP位点的信息如下：

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂、试剂盒或芯片。

5.一种SNP分子标记组合在鉴别陆地棉耐盐性状中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记组合由SEQ ID NO.1-7所示的SNP分子标记组成；

SEQ ID NO.1-7所示序列的第50位碱基处均存在SNP位点，各SNP位点的信息如下：

6.一种如权利要求3或4所述的产品在鉴别陆地棉耐盐性状中的应用。