CN115820892A - 陆地棉a07号染色体与棉铃重关联的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与陆地棉棉铃重关联的SNP分子标记及其应用，属于分子生物学、生物信息学领域。所述SNP分子标记为如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中至少一个。本发明提供的与陆地棉棉铃重关联的SNP分子标记可以用于棉花棉铃重性状的早期预测和筛选。其直接以DNA的形式表现，在棉花的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制、不存在表达与否等问题；表现为中性，不影响目标性状的表达；SNP适于快速、规模化筛查。基因组筛选中SNPs往往只需+/‑的分析，而不用分析片段的长度，利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。

Description

陆地棉A07号染色体与棉铃重关联的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及与陆地棉棉铃重关联的SNP分子标记及其应用，属于分子生物学、生物信息学领域。

背景技术

陆地棉是一种纤维作物，其产量占世界棉花总产量的90％以上，在世界经济中有着重要地位。棉铃重是决定棉花产量的主要因素之一。棉铃重由多种因素综合影响，其中自身的遗传因素是最重要的决定因子。目前通过人工采棉的成本还是比较高，给棉花种植户的收益带来了一定的影响。比如采摘同等重量的棉花，铃重高的棉田人工采收费用更低，一定程度上提高了棉花的种植经济效益。因此，对于棉农来说，高铃重的棉花品种深受欢迎，也是棉花育种工作者改良的重要目标性状之一。

传统的棉花育种手段主要是通过表型直接选择，育种效率低，难以满足高铃重棉花育种的需要。随着科技的发展，SNP分子标记凭借着在基因组中数量多、分布广的特点，成为目前最具发展潜力的分子标记，适合于大规模自动化检测。SNP分子标记技术能够达到直接选择数量性状的基因型的效果，为标记辅助育种奠定基础，目前已在医学和生物等领域得到广泛应用，但在棉花育种研究中相对还较少。全基因组关联分析(Genome-wideassociation study，GWAS)是一种对全基因组范围内的常见遗传变异(单核苷酸多态性和拷贝数)基因总体关联分析的方法，该方法以自然群体为研究对象，以长期重组后保留下来的基因(位点)间连锁不平衡(linkagedisequilibrium，LD)为基础，将目标性状表型的多样性与基因(或标记位点)的多态性结合起来分析，可直接鉴定出与表型变异密切相关且具有特定功能的基因位点或标记位点。在全基因组范围内进行整体研究，能够一次性对优良性状进行轮廓性概览，适用于挖掘优良性状等的研究。

近年来，随着陆地棉全基因组测序的完成和高通量DNA测序技术的突飞猛进，发明人成功完成了1812份棉花核心种质资源的重测序。通过测序数据比对，获得大量高质量的SNPs，这些SNPs可用于单体型图谱、遗传图谱、关联性图谱、指纹图谱的构建，为分子育种、系统进化、种质资源鉴定提供重要保障。本发明利用全基因组关联分析发掘了一批与陆地棉棉铃重关联的SNP分子标记，为以后的标记辅助选择及聚合育种改良棉花产量奠定了基础。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一批与陆地棉棉铃重关联的SNP分子标记及其应用。将这些SNP分子标记应用于棉铃重的辅助选择，可以尽快提高我国棉花品种的产量水平。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

陆地棉A07号染色体与棉铃重关联的SNP分子标记，所述SNP分子标记为如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中至少一个。

所述SNP分子位点于序列第51bp处发生突变，所述SNP分子标记的突变形式如下所示：

一种所述SNP分子标记在陆地棉棉铃重早期预测和筛选中的应用。

一种所述SNP分子标记在高产棉花分子标记辅助选择和聚合育种改良中的应用。

一种检测所述SNP分子标记的引物或试剂。

一种检测所述SNP分子标记的试剂盒。

一种含有所述SNP分子标记的基因芯片。

一种利用所述SNP分子标记分析陆地棉棉铃重的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)以提取的DNA为模板，根据SNP分子标记设计引物，分别进行PCR扩增；

(3)根据PCR扩增产物，分析陆地棉棉铃重。

本发明的有益效果：

本发明通过对1812份棉花材料进行了2年、5个地点、一共10个自然环境的种植，并对每个自然环境下的每个棉花品种进行棉铃重(g)称重。通过IlluminaHiseq测序平台对这1812份棉花品种进行基因组重测序，获得高质量的clean data，数据量为20.47Tb，亲本平均测序深度35X，子代平均测序深度4X以上。通过GWAS分析累计21个计算值(2年5个试验点共计10个环境，所有10个环境的BLUP值记为1个，5个试验点每年的育种值共计10个，2年共20个；上述总计为21个计算值)，获得至少在一个及以上环境中稳定出现的与陆地棉棉铃重关联的SNP分子标记3个。

本发明提供的与陆地棉棉铃重关联的SNP分子标记可以用于棉花棉铃重性状的早期预测和筛选。其直接以DNA的形式表现，在棉花的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制、不存在表达与否等问题；表现为中性，不影响目标性状的表达；SNP适于快速、规模化筛查。基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1：SNP分子标记的获得

(1)棉铃重测定：

通过对1812份棉花材料进行了2年、5个地点、一共10个自然环境的种植，对每个自然环境下的每个棉花材料随机采摘发育条件均匀的吐絮棉铃30个，晾晒干后称重量，计算平均棉铃重(g)。

(2)SNP的检测：

共采集陆地棉样本1812份进行基因组重测序，其中亲本13份，重组自交系RIL(recombinant inbred lines)1799份。采集样品时，将各品系的种子播种在培养箱中，采集棉株幼叶。用CTAB法提取所有样本高质量的棉花基因组DNA各5μg。上述提取的基因组DNA送到深圳华大基因科技有限公司，用于基因组重测序。测序获得高质量的clean data数据量为20.47Tb，亲本平均测序深度35X，子代平均测序深度4X以上。以优质四倍体棉TM-1(G.hirsutum’Texas Marker 1’)基因组为参考基因组进行序列定位。在映射之前，将所有未组装的contigs连接到一个伪染色体(命名为“ChrUN”)。使用BWA(v.0.7.12)软件分别将1812份样本的短序列映射到参考基因组，剔除所有未对齐的读段和低质量(映射质量小于20)的读段。然后，采用GATK UnifiedGenotyper(v.3.8.0)分别对每个样本进行变异鉴定，并将所有样本(n＝1812)的变异文件合并为一个总的VCF文件。最后，分别鉴定出11,856,129个和4,543,742个高品质SNP和Indel。基于次等位基因频率大于0.05和缺失率小于0.2，使用VCFtools进一步过滤变异位点筛选出高质量的SNP和Indel分别1,855,955个和l,309,084个，用作后续的全基因组关联分析。所有变异的影响由ANNOVAR进行注解。

(3)陆地棉棉铃重性状全基因组关联分析：

陆地棉棉铃重性状全基因组扫描(GWAS)定位，对步骤(1)所得的陆地棉棉铃重性状结果和步骤(2)所得的基因型数据，采用(efficient mixed-model associationexpedited)(EMMAX)统计分析软件的混合线性模型进行统计分析，具体可参考：http://csg.sph.umich.edu/kang/emmax/download/index.html。统计模型为：

y＝Xα+Zβ+Wμ+e

y为表型性状，X为固定效应的指示矩阵，α为固定效应的估计参数；Z为SNP的指示矩阵，β为SNP的效应；W为随机效应的指示矩阵，μ为预测的随机个体，e是随机残差，服从e～(0，δ_e ²)。该模型中，通过在μ中加入亲缘关系矩阵来校正群体分析。分析发现共计有3个SNPs与陆地棉棉铃重性状显著相关，所述SNP标记的等位基因位点信息如表1所示。参考序列为陆地棉栽培品种TM-1，参考基因组版本号G.hirsutum_TM-1_ICR(http://grand.cricaas.com.cn/page/download/download)。这些SNP位点上下游50bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示。

表1与陆地棉棉铃重关联的SNP分子标记

(4)验证：利用1812份棉花多亲本群体2年5点共计10个环境下的棉铃重BLUP值(最佳线性无偏预测值)对上述SNP的效应进行了验证，结果显示100％的SNP表现出对棉铃重性状变异具有显著的影响。

Claims (8)

1.陆地棉A07号染色体与棉铃重关联的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记为如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中至少一个。

2.根据权利要求1所述SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子位点于序列第51bp处发生突变，所述SNP分子标记的突变形式如下所示：

3.一种权利要求1所述SNP分子标记在陆地棉棉铃重早期预测和筛选中的应用。

4.一种权利要求1所述SNP分子标记在高产棉花分子标记辅助选择和聚合育种改良中的应用。

5.一种检测权利要求1所述SNP分子标记的引物或试剂。

6.一种检测权利要求1所述SNP分子标记的试剂盒。

7.一种含有权利要求1所述SNP分子标记的基因芯片。

8.一种利用权利要求1所述SNP分子标记分析陆地棉棉铃重的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)以提取的DNA为模板，根据SNP分子标记设计引物，分别进行PCR扩增；

(3)根据PCR扩增产物，分析陆地棉棉铃重。