CN111012744A - 一种可用于改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束，在细胞水平上可以使细胞膜形成微型孔洞，增加细胞膜的通透性，改善细胞对药物的摄取，提高药物的疗效。同时在动物水平上，提前注射桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束，可以有效提高药物在肺组织的递送效率和载药量，增强药物的治疗效果。所述自组装纳米胶束是以桔梗次生皂苷682为原料，溶解于双极性有机溶剂中，在超声条件下缓慢滴加入水中而制成，具体阐述了对桔梗次生皂苷种类的选择、自组装纳米胶束制备条件的优化，以及胶束表征考察等。

Description

一种可用于改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷682自组装纳 米胶束

技术领域

本发明属于生物医药制剂技术领域，涉及一种桔梗次生皂苷682纳米自组装胶束及其生物学应用。

背景技术

桔梗又名白桔梗、苦桔梗、秋桔梗，始载于《神农本草经》，李时珍在《本草纲目》中曰：“此草之根结实而梗直，故名桔梗”。桔梗其味苦、辛、平，归肺经，主治以咳嗽、咽痛、肺痈等病症为主，具有宣肺祛痰、排脓消痈之功。桔梗能“宣开肺气”，有“引药上浮”入肺的作用，又有“升提肺气”之功效，但对其作用机制的研究与解析较少。

近年来从桔梗中已经分离得到了皂苷、黄酮、酚酸、多烯和固醇等百余种化合物，其中桔梗皂苷被认为是主要的药效成分，目前报道有近70种[Lee JW等.Int J MolSci.2015；16(11):26786-96]。桔梗皂苷的结构类型如式(I)所示，以三萜皂苷为主，其结构上的共同特点是C12位为烯键和C28位为羧基。其苷元结构变化主要发生在C24位(R₁)，有-CH₃、-CH₂OH以及-COOH等3种主要类型，而化学结构的复杂性和多样性则主要表现在C3位(R₂)和C28位(R₃)糖酯化所连接的糖及其衍生物的不同，其中桔梗酸和桔梗二酸为主要的结构母核类型。

现代药理研究表明，桔梗皂苷具有改善心血管、神经保护、抗肿瘤和抗病毒等作用[Nyakudya E等.Prev Nutr Food Sci.2014；19(2):59-68；Chun J等.Planta Med.2013；79(8):639-45；Wu J等.Biol Pharm Bull.2012；35(8):1216-21；Xie Y等.ChemBiodivers.2010；7(1):178-85]。桔梗皂苷D(platycodin D)作为代表性的化合物，已被报道具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种活性[Khan M等.J Cell Mol Med.2016；20(3):389-402；Zhao R,等.J Cancer.2015；6(7):623-31；Jang KJ等.Int J Mol Med.2013；31(6):1357-66；Wang B等.Biomed Pharmacother.2016；84:1108-12]。尽管桔梗总皂苷体外有较强的溶血作用[Sun H等.Int Immunopharmacol.2011；11(12):2047-56]，但口服桔梗提取物小鼠的半数致死量为24g/kg，桔梗总皂苷为420mg/kg，而桔梗皂苷D的安全剂量超过2g/kg[Lee WH,等.Toxicological Research.2011；27:217-24]。目前桔梗被广泛地用于治疗呼吸系统感染[Ishimaru N,等.J Complement Integr Med.2013；11(1):51-4；Tao W,等.Int Immunopharmacol.2015；27(1):138-47；Meng Y,等.Front Cell InfectMicrobiol.2015；4:192]，桔梗能显著增加呼吸道黏液分泌量，有明显的祛痰、镇咳作用[RyuJ,等.Phytomedicine.2014；21(4):529-33；Choi JH,等.Food Chem Toxicol.2009；47:1272-9]。此外，桔梗皂苷具有抗脂质过氧化和肝纤维化作用，能促进肝损伤的恢复，还能抑制脂肪合成减轻脂肪肝[Kim TW,等.Food Chem Toxicol.2013；51:364-9；Hwang YP,等.Food Chem.2013；140(1-2):115-23；Choi JH,等.Biomed Pharmacother.2016；86:205-12]，对调节血清指标，提高糖尿病模型大鼠的胰岛素敏感性，降低糖尿病血管并发症，改善肥胖均具有一定功效[Zheng J,等.Plant Food Hum Nutr.2007；62:7-11；Lee H,等.LifeSci.2011；89(11-12):388-94]。体内代谢研究表明，桔梗总皂苷在胃肠道内可以被水解，其中桔梗次生皂苷，桔梗酸628和桔梗二酸696是其主要的代谢产物[Tang ZY,等.RSCAdvances,2017,7(59):37459-37466]。

部分皂苷结构由亲水结构的糖链和疏水皂苷母核结构两个部分组成，在水溶液中会自发的组成聚合物胶束。聚合物胶束具有独特的性质，亲水性结构有利于胶束形成亲水性外壳，使胶束在水溶液中均匀稳定的分布。胶束的形成取决于其结构类型以及其临界胶束浓度(CMC)，研究发现桔梗皂苷D在水溶液中可自组装形成纳米胶束[J Mol GraphModel.2015；57:20-6]。

随着纳米药物和纳米载体药物研究的不断深入，其在制药和医疗保健领域的应用不断拓展，特别在心血管疾病、肌肉骨骼、神经变性、精神性疾病、癌症、糖尿病以及感染等领域已经广泛应用。然而，传统的胶束载药途径仍存在诸多问题，载药胶束制备时对药物的消耗较大，且难以达到较高的包封率，载药后的胶束由于其体积增大，往往伴随着载药胶束毒性的增加及稳定性下降等缺点。两亲性的天然化合物桔梗次生皂苷在水溶液中具有自组装的性质，可以构成一个新的纳米材料和纳米颗粒，从而通过新的策略改善药物的药代动力学和药效学特性，提高联用药物在靶细胞或组织中的药物浓度，继而提高效力。

发明内容

本发明的目的是利用纳米自组装技术解决单独用药时药物利用率低等问题，提供一种可改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束。探究桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束的生物学应用，确证本胶束可显著改善细胞膜通透性，增加细胞及肺组织对药物的摄取，提高联用药物的递送效率。通过考察不同的桔梗次生皂苷改善细胞膜通透性的能力，选择最优的化合物桔梗次生皂苷682，公开了以其为原料制备纳米自组装纳米胶束的工艺条件。

本发明的技术方案

一种可用于改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束，以桔梗次生皂苷682为原料，溶解于双极性有机溶剂中，然后在超声条件下缓慢滴入水溶液中，形成稳定的自组装纳米胶束；该自组装纳米胶束具有显著改善细胞膜的通透性作用，通过提前在细胞中给药30分钟，再向细胞内加入联用药物，可以增加联用药物在细胞内的摄取量；通过提前向小鼠体内注射该胶束30分钟后再注射联用药物，可以提高联用药物在肺组织的递送效率，增加药物的肺组织分布浓度。

所述桔梗次生皂苷682，结构式如下所示：

所述自组装纳米胶束的具体制备包括：

第1、将桔梗次生皂苷单体原料，用双极性有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇或甲醇溶解，其中优选DMF，配置成0.125mg/mL至10mg/mL的有机相溶液。

第2、在200W超声条件下，将上述桔梗次生皂苷溶液按每10秒1滴的速度滴入水中，并继续保持超声5分钟，使其自组装形成胶束。其中桔梗次生皂苷682在水中的终浓度控制在0.05mg/mL至0.25mg/mL。

第3、将上述胶束溶液转移至预先处理的透析袋中(MWCO＝3500)，置于纯水溶液中常温下透析，去除残留的有机溶剂后获得自组装纳米胶束溶液。

第4、将所得胶束溶液经0.45μM过滤膜过滤后，冷冻干燥，得到桔梗次生皂苷自组装纳米胶束粉末。

所述的自组装纳米胶束的形状为均匀的球型，平均粒径为60nm至120nm，最佳Zeta电位为-20mV至-23mV。

所述桔梗次生皂苷自组装纳米胶束能够作用于细胞并使细胞膜穿孔，增加细胞膜通透性，有助于细胞对药物的摄取，作用时间限定在10分钟至60分钟，其优选30分钟。

所述桔梗次生皂苷纳米胶束预先注射给药后，可以提高其他药物在肺组织的递送效率，增加药物的肺组织分布浓度。注射给予该胶束后，与其他联用药物的给药时间间隔优选为30分钟。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束，该自组装纳米胶束具有良好的生物相容性，可以改变细胞膜结构完整性并增加细胞膜的通透性，提高药物在细胞内的递送效率，起到“宣开肺气”的作用；同时可与其他药物联合给药，增加联用药物在肺组织中的分布，从而达到“载药上行”，靶向肺部的效果。同时由于胶束制备原料桔梗次生皂苷682的两亲性结构，有利于其在水中进行胶束的自组装，使得胶束的制备方法简便易行，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是四种桔梗次生皂苷改变细胞膜通透性的效果考察；

图2是不同浓度的桔梗次生皂苷682所制备的自组装纳米胶束的性质表征。其中A为胶束Zeta电位的考察；B为胶束透射电镜的形态学表征；C为测量的胶束粒径；

图3是梗次生皂苷682自组装纳米胶束不同作用时间改变细胞膜通透性的效果考察；

图4是桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束改善细胞膜通透性的成像考察；

图5是桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束与桔梗次生皂苷682载药胶束对细胞药物摄取的影响。其中A为682自组装纳米胶束及682载药胶束丁达尔现象的图片；B为不同胶束给药形式下，细胞对尼罗红摄取情况的考察情况；

图6是桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束改善细胞对阿霉素摄取情况的考察；

图7是桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束联合阿霉素提高抗肿瘤效果的考察；

图8是预注射桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束对改善左氧氟沙星在小鼠肺组织分布的影响；

图9是预注射桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束对提升左氧氟沙星抗菌效果的考察。

具体实施方式

实施例1：不同桔梗次生皂苷改善细胞膜通透性的效果考察

取人肺上皮细胞(BEAS-2B)置于共聚焦细胞培养皿中培养，采用含有10％胎牛血清和含有1％双抗体(100U/mL)的RPMI-1640培养基，37℃，5％CO₂条件下培养。待细胞生长至70％至80％时，分别将不同的桔梗次生皂苷(5×10^-4mol/L)以及含异硫氰酸荧光素(FITC,1×10^-6mol/L)的细胞培养液加入上述细胞中，通过共聚焦显微镜(Leica TCS SP8)动态考察FITC染料进入细胞的情况，激发波长为488nm，发射检测波长为600nm。实验设有0.1％DMSO溶剂对照组、桔梗次生皂苷682组(5×10^-4mol/L)、桔梗次生皂苷696组(5×10^{- 4}mol/L)、桔梗皂苷K组(5×10^-4mol/L)和桔梗皂苷D组(5×10^-4mol/L)。上述四种桔梗皂苷均为口服桔梗总皂苷后体内代谢可产生的次生皂苷(RSC Advances,2017,7(59):37459)，其化学结构式见图1。其中桔梗次生皂苷682、696依据CN201910450176.X号专利申请自行分离制备，桔梗皂苷D及桔梗皂苷K购置于大连美仑生物技术有限公司。

结果如图1所示，在给药240秒内，DMSO溶剂对照组、桔梗皂苷D组及桔梗次生皂苷696组均未观察到细胞内FITC有明显的摄入情况。相比桔梗皂苷K组轻微的改变，桔梗次生皂苷682组在相同观察条件下对FITC进入细胞有明显的促进作用。因此确定桔梗次生皂苷682为最适化合物，并用于后述胶束的制备及考察。

实施例2：桔梗次生皂苷682纳米自组装胶束的制备条件考察

依据CN201910450176.X号专利申请自行分离制备桔梗次生皂苷682，并分别称取0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00mg桔梗次生皂苷682，溶于400μL甲醇溶剂中，分别配置成0.125mg/mL至10mg/mL的溶液。在超声条件下(200W，SB-25-12DT超声波震荡仪，宁波新芝生物科技股份有限公司)，将上述溶液分别以每10秒1滴的速度，缓慢滴入2mL的纯水中，并持续保持超声5分钟，使其自组装形成两亲性胶束。将上述胶束混悬液分别转移至预先处理的透析袋中(MWCO＝3500)，常温下采用250ml纯水透析24小时(前12小时内，每2小时更换一次，后12小时，每6小时更换一次纯水)。分别将所制得的上述胶束溶液用0.45μM微孔滤膜(MCE Syringe Filter)过滤，即得桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束溶液。其中桔梗次生皂苷682在水相胶束中的浓度为0.025mg/mL至2mg/mL。

采用NanoZS电位粒度仪(MalvernZetasizerNano-ZS90)测定上述各条件下所制备胶束的Zeta电位。结果如图2A显示，在低浓度0.025mg/mL时，胶束的电位绝对值偏高，体系相对不稳定，其他条件0.05mg/mL至2.0mg/mL的电位值在-20左右，胶束较为稳定。因此选取0.05mg/mL至2.0mg/mL的浓度范围的胶束进行冷冻电镜的形态观察(Talos F200C TEM)。结果如图2B示，在上述浓度范围内随着浓度的增加，胶束从球状向管状逐渐演变，其中0.05、0.10、0.25mg/mL条件下，自组装纳米胶束的形状较为规整，呈球形，0.5、1、2mg/mL条件下的自组装纳米胶束的形状不规整。使用NanoZS电位粒度仪检测上述胶束的粒径，结果如图2C显示，其粒径范围在60nm至120nm之间。综合考虑上述各项指标，最终确定桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束的最佳制备浓度为0.05mg/mL至0.25mg/mL，简称682胶束。

实施例3：682胶束改善细胞通透性的时间考察

参照实施例2中的胶束制备方式及最佳胶束制备条件，取5mg桔梗次生皂苷682，溶解在0.5mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，并在超声条件下逐渐滴入20mL的水溶液中，制备0.25mg/mL的682胶束溶液20mL。经透析(MWCO＝3500)去除DMF，再经0.45μM微孔滤膜(MCE Syringe Filter)过滤后，将上述682胶束溶液置于-80℃冷冻干燥，即得到682胶束粉末4.5mg，备用。

取人肺上皮细胞(BEAS-2B)置于共聚焦细胞培养皿中培养，采用含有10％胎牛血清和含有1％双抗体(100U/mL)的RPMI-1640培养基，37℃，5％CO₂条件下培养。待细胞生长至70％至80％时，将含有100μg/mL682胶束粉末的细胞培养液加入细胞中，同时再向细胞内加入1×10^-6mol/L异硫氰酸荧光素(FITC)，通过共聚焦显微镜(Leica TCS SP8)动态考察FITC染料进入细胞的情况，激发波长为488nm，发射波长为600nm。结果如图3所示，在682胶束作用于细胞后胞内荧光强度迅速上升并维持平衡15分钟，30分钟后细胞内荧光强度再次达到平衡，因此682胶束在细胞膜作用的时间优选为30分钟。

实施例4：682胶束改善细胞通透性的成像考察

将BEAS-2B细胞培养于10cm细胞培养皿中，参照实施例1的培养条件，待细胞生长至80％时，向细胞内加入终浓度为100μg/mL的682胶束，置于37℃培养箱中继续培养30分钟。收集上述细胞，经胰酶消化(03-050-1A，bioind，天津市中奥天元科技发展有限公司)，1000转/分钟离心10分钟，弃上清，用预冷的生理盐水洗涤后，1000转/分钟再次离心，弃上清，将细胞重悬于1mL2.5％预冷的戊二醛固定液中固定24小时。取上述处理后的细胞样品置于铜网(TWZCM04，天津艾利安电子科技有限公司)上，采用投射电镜(Talos F200C)观察细胞膜的形态。结果如图4所示，当细胞孵育桔梗次生皂苷682的自组装纳米胶束(100μg/mL)后，其细胞膜上可以观察到明显的孔洞形成，孔洞的大小与682胶束的粒径大小基本符合。实验结果表明，桔梗次生皂苷682胶束可以破坏细胞膜的结构，改变细胞膜的通透性。

实施例5：682胶束与682纳米载药胶束对细胞内药物递送效率的影响

取5mg桔梗次生皂苷682与0.5mg尼罗红染料按照10：1的比例共同溶解在0.5mL乙醇有机溶剂中，桔梗次生皂苷682包裹尼罗红胶束的具体制备方式参照实施例2。在超声条件下(200W，SB-25-12DT超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司)，将上述溶液分别以每10秒1滴的速度，逐渐滴入20mL纯水中，并持续超声10分钟，使其自组装形成两亲性胶束。经透析、过滤后得到桔梗次生皂苷682包裹尼罗红纳米载药胶束，简称682载药胶束，如图5A所示。将得到的682载药胶束冷冻干燥，得到682载药胶束粉末4.6mg，用于后续生物实验的考察。

将BEAS-2B细胞培养于共聚焦培养小皿中，细胞培养条件具体参见实施例1。实验采用尼罗红为指示剂，利用其进入细胞与脂质结合后产生红色荧光的性质，分别考察682胶束与682载药胶束向细胞内药物递送的效率。实验设尼罗红染料单独给药对照组、682载药胶束组、682胶束预给药组(682胶束预孵育30分钟后再加入尼罗红染料)，三组中尼罗红染料的最终给药浓度统一为10μg/mL。以共聚焦显微镜(Leica TCS SP8)分别检测细胞对尼罗红的摄取情况，考察不同给药形式细胞对药物的摄取效率。

结果如图5B所示，在单独给药尼罗红染料的组别中，由于尼罗红的溶解性差，导致其进入细胞的效率相对缓慢；在相同观察时间20分钟内，682包裹尼罗红胶束组可以明显增加细胞对尼罗红染料的摄取；而在682胶束预孵育组，15分钟内细胞对尼罗红染料的摄取速度最快，表明682胶束通过预先改变细胞膜的结构，可以改善细胞膜的通透性，从而更有利于细胞对药物的摄取。

实施例6：682胶束通过改善细胞膜通透性促进阿霉素的摄入

为了验证实施例5提出的“682胶束通过预先改变细胞膜的结构，可以改善细胞膜的通透性”的结论，选择抗肿瘤药物阿霉素，在细胞水平考察了682胶束辅助阿霉素细胞递送的效果。实验分别设置空白组，单独孵育阿霉素药物组，以及预孵育682胶束30分钟后再联合阿霉素给药组。

具体细胞培养条件参见实施例1，将BEAS-2B细胞培养于共聚焦小皿中，待细胞生长至70％左右时，向细胞内加入实施例2制备的682胶束(100μg/mL)，孵育30分钟后，再向细胞内加入终浓度为1×10^-5mol/L的阿霉素，采用共聚焦显微镜观察2分钟、10分钟、60分钟不同时间细胞对阿霉素的摄入情况。结果如图6所示，较682阿霉素对照组相比，预先孵育682胶束30分钟再加入阿霉素组可以明显增加细胞内阿霉素的摄入量(**,p<0.01，*,p<0.05)，表明细胞通过682胶束预处理后，可以增加细胞膜的通透性，从而在1小时内增加了阿霉素向细胞内的递送效率。

实施例7：682胶束可以有效增强阿霉素的抗肿瘤效果

为了验证实施例6中提及的682胶束辅助阿霉素的细胞递送可提升药物疗效的效果，另取人非小细胞肺癌细胞A549细胞株，置于含有10％胎牛血清和1％双抗体(100U/mL)的DMEM培养基中，37℃，5％CO₂条件下培养。待细胞生长至70％时，加入682胶束(100μg/mL)，孵育30分钟后，加入终浓度为1×10^-5mol/L阿霉素，继续培养24小时后，通过CCK-8检测试剂盒(HY-K0301,上海皓元生物医药科技有限公司)，采用酶标仪在450nm处检测各组对A549细胞的细胞毒性作用。

结果如图7所示，与空白对照组相比，682胶束自身对A549细胞的增殖无显著抑制作用，而阿霉素单独给药组和预先孵育682胶束再给药阿霉素组均可以显著杀伤肿瘤细胞(***,p<0.001)。与阿霉素单独给药组相比，682胶束预孵育后可以明显增加阿霉素对细胞的杀伤作用(△△,p<0.01)，提高阿霉素的抗肿瘤效果。

实施例8：682胶束有效提升左氧氟沙星在小鼠肺组织的分布

为了考察682胶束在动物水平上的作用效果，取50只SPF级雄性昆明小鼠(20-25g/只)，常规饲养一周后，实验前禁食12小时。实验随机分为两组，分别为左氧氟沙星给药组(80mg/kg,B26415，上海源叶生物科技有限公司)，及682胶束(5mg/kg)预给药30分钟后再给药左氧氟沙星组(80mg/kg)。给药方式均采用腹腔注射。分别于给药左氧氟沙星后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时的5个时间点取材，每组各25只，每个时间点分别设置5只。用生理盐水心脏灌流冲洗后，取小鼠的肺组织，滤纸吸干水分后称重。分别取1克的肺组织置于匀浆器中，加入3倍量生理盐水3mL匀浆，3000转/分钟离心10分钟，取上清液。精密量取上述上清液样品100μL，加入100μL内标溶液(50μg/mL盐酸特拉唑嗪甲醇溶液)和200μL甲醇，涡旋震荡充分混匀后，10000转/分钟离心15分钟，准确量取上清液320μL，氮气吹干，残渣加入100μL甲醇复溶，10000转/分钟离心15分钟，取上清液，采用HPLC法进行左氧氟沙星的含量测定。

岛津HPLC高效液相色谱仪(LC-20A)，色谱条件，色谱柱：phenomenex luna C₁₈(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：10mmol/L磷酸盐缓冲液(含0.01％三乙胺，pH＝3)-乙腈(82:18)；流速1mL/分钟；激发波长295nm，发射波长490nm；柱温35℃；进样量20μL。采用Graphpadprism 8进行数据处理分析。

结果如图8所示，在联合给药组中，左氧氟沙星的肺部药物分布的药时曲线明显高于单独给药组，在给药1小时后左氧氟沙星含量相对最高。实验表明，提前给药682胶束可以增加肺部的药物递送能力，提高肺组织的药物浓度。

实施例9：682胶束联合左氧氟沙星改善铜绿假单胞菌诱导的急性肺损伤

为了证明实施例8中提出的682胶束联合左氧氟沙星可减少抗生素的用量，提高抗生素疗效的效果。在本实施例中选取昆明小鼠进行682胶束联合左氧氟沙星，改善小鼠急性肺损伤的实验。

取160只SPF级小鼠雄性昆明小鼠(20-25g/只，北京维通利华实验动物技术有限公司)，实验前常规饲养一周，实验前禁食12小时。实验分别设置空白组，铜绿假单胞菌PA14(Pseudomonas aeruginosa PA14)感染模型组，682胶束单独给药组(5mg/kg)，左氧氟沙星高(80mg/kg)、中(40mg/kg)、低(20mg/kg)剂量单独给药组，682胶束(5mg/kg)联合左氧氟沙星(20mg/kg)低剂量组，682胶束(5mg/kg)联合左氧氟沙星(40mg/kg)中剂量组，每组设20只小鼠。

取Luria-Bertani(LB)平板活化的铜绿假单胞菌PA14，置于37℃培养24h，挑取单菌落，置于LB液体培养基中(5mL/管)，37℃，180转/分钟，摇床培养过夜。吸取100μL菌液至新鲜的LB液体培基中进行再次活化复壮，37℃，继续摇床培养6-8小时，至菌液的吸光度值在600nm波长下约为1。收集菌液，10000转/分钟，离心3分钟，弃上清，用10mL PBS洗涤菌体一次，10000转/分钟，离心3分钟，再次弃上清，并用PBS稀释菌体至菌体个数为5×10⁷/mL。除空白组外，其余各组小鼠均经4％水合氯醛麻醉后，向小鼠左右鼻腔各呛入10μL上述菌悬液，并仰卧放置10分钟，诱导铜绿假单胞菌急性肺感染。造模完毕后，立即腹腔注射上述682胶束(5mg/kg)，注射30分钟后，再向各给药组小鼠体内注射对应剂量的左氧氟沙星，观察记录24小时内小鼠的死亡情况。

结果如图9所示，与模型组相比，单独给与682胶束并没有改善小鼠的死亡率，左氧氟沙星各组间呈计量依赖地缓解小鼠的死亡。与此同时，682胶束联合左氧氟沙星组较相同计量的左氧氟沙星单独给药组小鼠的生存率有显著提高。其中，682胶束联合给药的低剂量组的药效与左氧氟沙星单独给药的中剂量组相当；而682胶束联合给药的中剂量组的药效接近左氧氟沙星单独给药的高剂量组的药效，抗菌效果得到明显提升。

整合上述实施例8和9的实验结果，682胶束的使用可以增加左氧氟沙星肺部的组织分布，提高抗生素的利用效率，为临床上减少抗生素用量提供依据。

Claims (10)

1.一种可用于改善细胞膜通透性的桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束，其特征在于，所述自组装纳米胶束是以桔梗次生皂苷682为原料，溶解于双极性有机溶剂中，然后在超声条件下缓慢滴加入水溶液中而自组装形成；该自组装纳米胶束具有改善细胞膜通透性的作用，能够增加细胞对药物的摄取，并提高药物在肺组织的递送效率。

2.根据权利要求1所述的桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束，其特征在于，所述的桔梗次生皂苷682，结构式如下所示：

3.根据权利要求1所述桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束，其特征在于，所述自组装纳米胶束的制备过程是：称取桔梗次生皂苷682单体，用双极性有机溶剂溶解，配置成0.125mg/mL至10mg/mL的溶液，在200W超声条件下，将配制的溶液按每10秒1滴的速度缓慢滴入纯水中，并继续保持超声5分钟，使桔梗次生皂苷682自组装为纳米胶束；经透析除去有机溶剂获得自组装纳米胶束溶液。

4.根据权利要求3所述的桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束，其特征在于，所述胶束溶液中的桔梗次生皂苷682的浓度范围为0.05mg/mL至0.25mg/mL。

5.根据权利要求3所述的桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束，其特征在于，所述的双极性有机溶剂限定为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇或甲醇。

6.根据权利要求5所述的桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束，其特征在于，所述的双极性有机溶剂优选为DMF。

7.根据权利要求3所述桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束，其特征在于，将所得自组装纳米胶束溶液经0.45μM过滤膜过滤后，冷冻干燥，得到桔梗次生皂苷自组装纳米胶束粉末。

8.根据权利要求7所述桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束的胶束制备方法，其特征在于所述的自组装纳米胶束的形状为均匀的球型，平均粒径为60nm至120nm，最佳Zeta电位为-20mV至-23mV。

9.权利要求1至8任一项所述的桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束的应用，其特征在于所述桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束能够使细胞膜穿孔，增加细胞膜通透性，有助于联用药物进入细胞，胶束的作用时间限定在10分钟至60分钟，优选30分钟。

10.权利要求1至8任一项所述的桔梗次生皂苷682自组装纳米胶束的应用，其特征在于桔梗次生皂苷682胶束预先注射给与小鼠体内后，可以提高联用药物，包括抗生素左氧氟沙星及其他药物在肺组织的递送效率，增加药物的肺组织分布浓度；注射给予该胶束后，与其他联用药物的给药时间间隔优选为30分钟。

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