CN110951722A - 一种提高融合细胞疫苗抗肿瘤效应的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学领域，尤其是涉及一种提高融合细胞疫苗抗肿瘤效应的方法，包括以下步骤：1）DC/B16融合细胞疫苗的制备；2）体外DC/B16融合细胞诱导CD4+T细胞向CD8ααTregs转化；3）体外DAPT阻断DC/肿瘤融合细胞疫苗刺激CD4+T细胞向CD8ααTregs转化；4）DC/肿瘤融合细胞诱导CD4+T细胞转化的CD8ααTregs，促进肿瘤的生长，本发明的DC/肿瘤疫苗联合DAPT为提高DC/肿瘤融合细胞疫苗在体内的抗肿瘤生物活性提供一个新的有效方法，本DC/B16融合细胞疫苗，已经在小鼠上试验成功，下一步可以在人体抗肿瘤临床中试验应用，为人类对抗肿瘤的临床使用提供了一种很好的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，尤其是涉及一种提高融合细胞疫苗抗肿瘤效应的方法。
背景技术
在危害人类健康的多种疾病中，肿瘤成为最主要的杀手。肿瘤（tumour）是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物（neogrowth），因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物（neoplasm）。研究发现，肿瘤细胞会出现不同于正常细胞的代谢变化，同时肿瘤细胞自身可通过糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）之间的转换来适应代谢环境的改变。目前治疗肿瘤的主要手段是手术、放射、化疗等，但由于恶性肿瘤大多发生隐匿，侵袭性强、进展快速、易转移，一旦发生转移，不再具有手术治疗的指征，而传统的放疗、化疗法效果差，导致远期疗效依然不甚理想，有待开发更为有效的治疗策略。近年来，免疫治疗逐渐成为肿瘤治疗领域的新手段，其主要针对肿瘤发生发展的机制，采用生物学技术进行干预和改善机体免疫能力，从而抑制肿瘤生长。肿瘤免疫治疗具有较强的特异性、不良反应少等优点，被认为是肿瘤治疗的希望所在。
目前，以DC为核心的肿瘤免疫治疗是近年来研究热点之一。DC即树突状细胞(dendritic cell,DC)因其表面具有星状多形性或树枝状突起而得名,DC尚无特异性细胞表面分子标志,主要通过形态学、组合性细胞表面标志、在混合淋巴细胞反应中能激活初始T细胞等特征进行鉴定。DC起源自骨髓多能造血干细胞,分化主要有两条途径:①髓样干细胞在 GM-CSF的刺激下分化为DC,称为髓样DC( myeloid dendritic cells,MDC),也称DC1,与单核细胞和粒细胞有共同的前体细胞;②来源于淋巴样干细胞,与T细胞和NK细胞有共同的前体细胞,称为淋巴样DC( Lymphoid dendritic cells,LDC)或浆细胞样DC(plasmacytoid dendritic cells,pDC),即DC2。DC是体内抗原提呈能力最强的抗原提呈细胞，在天然免疫及获得性免疫中扮演者重要角色，能显著刺激初始型 T 淋巴细胞增殖。在肿瘤的发展过程中，DC捕获肿瘤相关抗原（Tumor-associated antigens, TAAs），加工成抗原肽与MHC-I类分子和MHC-II类分子结合形成抗原肽-MHC分子复合物，迁移到次级淋巴器官。在次级淋巴器官，DC提呈抗原肽给天然CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，激活和刺激这些细胞的分化，并启动TAA特异性T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。因此，DC为基础的肿瘤疫苗成为治疗肿瘤研究的重点。许多抗肿瘤疫苗正在进行临床试验中，包括由美国食品和药物管理局批准了第一个DC疫苗治疗转移性前列腺癌。体外抗原负载DC是抗肿瘤免疫的第一步。负载抗原肽的方法包括：合成已知的TAA抗原肽、肿瘤裂解物、凋亡的肿瘤细胞、肿瘤RNA等等。但是，人们可获得的已知抗原很少，大多数的肿瘤抗原是未知的。研究者们发现利用PEG法将DC与肿瘤细胞直接融合，相邻细胞膜相互整合，胞质相互流通，即能表达所有已知的和未知的肿瘤抗原，又能表达DC表面分子，从而更有效的刺激T细胞的增殖和活化。很多研究已证明了DC/肿瘤融合细胞疫苗能够较好的活化CD4+ T细胞和CD8+ T细胞发挥抗肿瘤作用，但是临床试验并不十分理想。这表明DC/肿瘤融合细胞疫苗的制备需要进一步的改进，暗示了可能存在破坏这些疫苗抗肿瘤的免疫机制。因此，如何研究一种能提高融合细胞疫苗抗肿瘤效应的方法，是本领域技术人员亟待解决的难题。
发明内容
本发明的目的在于针对上述存在的科学问题，提供提高融合细胞疫苗抗肿瘤效应的方法。
本发明的技术方案概述如下：
本发明的一种提高融合细胞疫苗抗肿瘤效应的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）DC/B16融合细胞疫苗的制备。
2）体外DC/B16融合细胞诱导CD4+ T细胞向CD8αα Tregs转化。
3）体外DAPT阻断DC/肿瘤融合细胞疫苗刺激CD4+ T细胞向CD8αα Tregs转化。
4）DC/肿瘤融合细胞诱导CD4+ T细胞转化的CD8ααTregs，促进肿瘤的生长。
以上所述步骤1）～4）制备的DC/B16融合细胞疫苗，在抗肿瘤临床中应用。
本发明突出的实质性特点和显著的进步是：
本发明的提高融合细胞疫苗抗肿瘤效应的方法，由于在研究DC/肿瘤疫苗刺激T细胞活过程中发现，CD4+ T细胞频率在减少，而出现了一群新的细胞即CD8αα Tregs，这群新的CD8αα Tregs来源于CD4+T细胞。CD8αα Tregs在体内促进肿瘤细胞的生长。通过使用ｒ-分泌酶抑制剂DAPT(N-［N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl］-S- phenylglycinet-t-ButylEster, DAPT)使Notch的受体与配体结合后，胞内段不能被ｒ-分泌酶切割成有效的活性片段，从而阻断Notch信号通路。发现阻断Notch信号通路后，在体外DC /肿瘤融合细胞疫苗不能诱导CD4+ T细胞分化为CD8αα Tregs，促进DC/肿瘤融合细胞疫苗的抗肿瘤作用，因此，本发明的DC/肿瘤疫苗联合DAPT为提高DC/肿瘤融合细胞疫苗在体内的抗肿瘤生物活性提供一个新的有效方法。
本发明的提高融合细胞疫苗抗肿瘤制备的DC/B16融合细胞疫苗，已经在小鼠上试验成功，下一步可以在人体抗肿瘤临床中试验应用，为人类对抗肿瘤的临床使用提供了一种很好的方法。这样会给许多挣扎在瘤症病痛中的患者带来福音,相信融合细胞疫苗不仅会提高肿瘤癌症的疗效，改善了患者的生存质量，还有效的防止肿瘤的扩散以及愈后的复发，实现“让瘤变小”或“让瘤变无”，让众多的还在肿瘤癌症病痛的患者以新的希望，特别是给那些忍受不了西医手术、放化疗等治疗手段的患者以新的治疗方式。
附图说明
图1是体外DC/B16融合细胞能诱导CD4+ T细胞转化为CD8αα Tregs。
流式结果显示DC/B16融合细胞刺激CD4+ T细胞5天后，CD8αα Tregs的表达，融合细胞组较其余各组明显增高。
图2是B16/DC融合细胞诱导CD4+ T细胞转化为CD8αα Tregs依赖于Notch信号通路FC诱导CD8αα Tregs的同时分别加入不同浓度的DAPT，结果显示随着DAPT浓度的升高，FC诱导CD8αα Tregs产生的频率减少。
图3是CD4+ T细胞转化的CD8αα Tregs促进荷瘤小鼠体内肿瘤的生长。
分选融合细胞诱导的CD4+ T转化的CD8αα Tregs细胞，输入到荷黑色素瘤肿瘤模型小鼠体内，PBS为对照组。（A） CD8αα Tregs组与PBS组比较，肿瘤体积增大明显，**P <0.01。(B)两组生存率比较，CD8αα Tregs组生存率缩短，*P <0.05。
图4是DAPT促进DC/肿瘤融合细胞疫苗抗肿瘤作用。
（A) 与 PBS组和DAPT组比较，DAPT+DC/B16组肿瘤生长明显减慢，****P <0.0001，DAPT+DC/B16组与DC/B16组也具有统计学意义**P <0.01。(B)与其它对照组比较，DAPT+DC/B16 组生存率缩短，***P < 0.001。
具体实施方式
下面对本发明的实施操作做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例
本发明的提高融合细胞疫苗抗肿瘤效应的制备方法，包括以下步骤：
1.DC/B16融合细胞疫苗的制备
1) 收集培养5天骨髓来源的DC，细胞计数。
2) 收集培养至对数生在期间的B16细胞用30Gy X线照射后，细胞计数。
3) 用适量PBS调整细胞数，按DC与B16比为2:1，涡旋混匀细胞，离心1500 rpm，10min。
4) 弃上清，弹匀细胞，置于40 ℃水浴5 min。
5) 取300μL PEG（分子量为1500、质量浓度为50%（m/v），37 ℃，预热5 min。
6) 将PEG在1min内旋转缓慢加入细胞中，于37 ℃水浴锅中水浴5min。
7) 取20 mL PBS，沿管壁缓慢旋转加入，离心1500rpm，10min。
8) 弃PBS，弹匀细胞。
9) 取20mL PBS，沿管壁缓慢旋转加入，离心1500rpm，10min。
10)用含5ng/mL的GM-CSF，10 ng/mL的IL-4，完全1640重悬细胞，置于含5% CO2、37℃培养箱中培养。
2.体外DC/B16融合细胞诱导CD4+ T细胞向CD8αα Tregs转化：
1) 颈椎脱臼法处死C57BL/6小鼠，并浸入75% 酒精中10min。
2) 用眼科剪刀镊子，剪开左侧肋下皮肤，并充分暴露皮下腹膜。
3) 用另一套无菌眼科剪刀镊子切入腹膜，找到脾脏，采用钝性分离，游离脾缘，并取出脾脏组织，浸入装有PBS的培养皿中。
4) 取用两支1mL注射器，弯折注射器针头90°，扎破脾脏组织的一端，注射器轻刮脾脏，将脾脏组织挤压出脾脏包膜，取下的脾脏组织要完全浸入PBS中。
5) 用胶头滴管吹匀脾脏组织悬液，并移入50mL离心管中，1200rpm，6min离心。
6) 弃上清液，弹匀离心管底部细胞组织，加入1mL红细胞裂解液，混匀后，室温放置5 min，2min 30sec时再次混匀。
7) 加入1×PBS缓冲液30mL，吹匀后过滤器，1200rpm、6min离心。
8) 弃去上清，Isolation buffer重悬后计数细胞，1200rpm、6min离心，弃去上清，按照计数细胞的结果，1×PBS重悬细胞，调整浓度为1×108/mL。
9) 将上述细胞悬液转移至8mL试管中。
10)加入50μL/mL抗体，室温孵育10min。
11)加入75μL/mL磁珠，吹匀细胞，室温孵育3min，加入Isolation buffer调整细胞悬液总体积为5mL。
12)将试管放入磁力架中，静置3 min。
13)将试管连同磁力架一起，将细胞悬液倒入新的离心管中，所得细胞悬液即为CD4+ T细胞。
14)计数并离心1200rpm，6min，1mLPBS重悬备用。
15)按照2.3所描述制备DC/B16融合细胞疫苗。
16)CD4+ T细胞与DC/B16融合细胞疫苗按10:1的比例在含20u/mL mIL-2的完全RMPI1640培养基共培养。
17)分别于第一天、第三天、第五天、第七天收集细胞，用单克隆抗体抗小鼠CD4-ECD 0.125μg/管、CD8α-PE-Cy5 0.06μg/管、CD8β-PE 0.06μg/管进行孵育30分钟，4℃。
18)加入PBS 4mL/管，1200rpm，6min离心，洗涤3次，弃上清。
19)加入PBS 500μL/管重悬细胞，充分斡旋后用Epics XL Beckman Coulter流式细胞仪检测和Mfa32软件分析。
3.体外DAPT阻断DC/肿瘤融合细胞疫苗刺激CD4+ T细胞向CD8αα Tregs转化
1) DC/B16融合细胞疫苗与CD4+ T细胞10:1的比例在含20u/mL mIL-2的完全RMPI1640培养基共培养，分别加入0ug/mL、1ug/mL、3ug/mL、5ug/mL、7ug/mL或9ug/mL 的DAPT。
2) 第五天收集细胞，单克隆抗体抗小鼠CD4-PE-Cy5、CD8α-PE-Cy5、CD8β-PE，进行孵育30min，4℃。
3) 分别取100μL加入流式抗体抗小鼠CD4-ECD 0.125μg/管、CD8α-PE-Cy5 0.06μg/管、CD8β-PE 0.06μg/管，斡旋后4℃下避光孵育30min。
4) 加入PBS 4mL/管，1200rpm，6min离心，洗涤3次，弃上清。
5) 加入PBS 500μL/管重悬细胞，充分斡旋后用流式细胞仪检测。
4.DC/肿瘤融合细胞诱导CD4+ T细胞转化的CD8αα Tregs促进荷瘤小鼠肿瘤的生长。
1) 小鼠肿瘤模型建立：收集培养至对数生长期的B16细胞，PBS重悬细胞浓度为5×106细胞/mL。将细胞悬液注射在C57BL/6小鼠左下腹部皮下，100μL/只，按照随机数字法将小鼠分成3组（n =10/组）。
2) 用流式细胞仪分选融合细胞诱导CD4+ T细胞转化的CD8αα Tregs。
3) 每只注射1×106个CD8αα Tregs 细胞，PBS为对照组，共输入3次，间隔7天输入1次。
4) 在种瘤后的第5天开始用游标卡尺测量肿瘤，间隔3天测量1次，肿瘤体积的计算公式如下：L1 ×（L2）2 × 0.5，L1代表肿瘤的最长直径，L2代表与L1垂直的最短直径，绘制肿瘤体积生长曲线。
5) 观察并记录各组小鼠的生存时间，绘制生存曲线。
5.DAPT联合DC/肿瘤融合细胞疫苗抗肿瘤作用
1) 小鼠肿瘤模型建立：收集培养至对数生长期的B16细胞，PBS重悬细胞浓度为5×106细胞/mL，将细胞悬液注射在C57BL/6小鼠左下腹部皮下，100μL/只。按照随机数字法将小鼠分成4组（n = 10/组）即PBS组，DAPT组，DC/B16融合细胞疫苗组，DAPT+DC/B16融合细胞疫苗组。
2) 制备融合细胞疫苗。
3) 输入2x106个DC/肿瘤融合细胞疫苗的同时输入100uM的DAPT，同时设PBS组，单独输入2x106个DC/肿瘤融合细胞疫苗组和100uM DAPT组，100ul/只，间隔4天输入一次，共3次。
4) 在种瘤后的第5天开始用游标卡尺测量肿瘤，间隔3天测量1次，肿瘤体积的计算公式如下：L1 ×（L2）2 × 0.5，L1代表肿瘤的最长直径，L2代表与L1垂直的最短直径，绘制肿瘤体积生长曲线。
5) 观察并记录各组小鼠的生存时间，绘制生存曲线。
本发明并不局限于前述的具体实施方式，本发明扩展到任何本说明书中披露的新特征或新的组合，以及披露的任一新方法或过程的步骤或新的组合。
Claims (2)
1.一种提高融合细胞疫苗抗肿瘤效应的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）DC/B16融合细胞疫苗的制备；
2）体外DC/B16融合细胞诱导CD4+ T细胞向CD8αα Tregs转化；
3）体外DAPT阻断DC/肿瘤融合细胞疫苗刺激CD4+ T细胞向CD8αα Tregs转化；
4）DC/肿瘤融合细胞诱导CD4+ T细胞转化的CD8ααTregs，促进肿瘤的生长。
2.根据权利要求1所述的提高融合细胞疫苗抗肿瘤效应的方法，其特征在于：所述步骤1）～4）制备的DC/B16融合细胞疫苗，在抗肿瘤临床中应用。
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| CN102085372A (zh) * | 2009-12-04 | 2011-06-08 | 中国医学科学院基础医学研究所 | Notch通路抑制剂用于治疗mTOR活化导致的肿瘤的用途 |
| CN102827826A (zh) * | 2012-09-11 | 2012-12-19 | 赵永祥 | 一种诱导树突状细胞与肿瘤细胞融合的方法 |
| CN104353067A (zh) * | 2014-10-10 | 2015-02-18 | 中国人民解放军总医院第一附属医院 | 一种抗恶性黑色素瘤疫苗组合物及其应用 |
-
2019
- 2019-12-27 CN CN201911383451.7A patent/CN110951722A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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