CN110903241A - 水溶性儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的分离纯化方法 - Google Patents

水溶性儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的分离纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用大孔树脂分离纯化水溶性儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的方法，所述水溶性儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱具有式(I)所示结构：
Figure DDA0001803473460000011
其中，R选自C1‑C5直链或支链的烷基、含有至少一个杂原子的脂肪环烷基、被至少一个取代基团取代的脂肪环烷基、苯基、苄基、被至少一个取代基团取代的苯基和被至少一个取代基团取代的苄基；所述杂原子选自N、O和S；所述取代基团选自取代或未被取代的C1‑C5直链或支链的烷基、C1‑C5支链或支链的烷氧基、硝基、卤素和羟基。该方法简便、经济、高效、环保。

Description

水溶性儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的分离纯化方法
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及水溶性儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的分离纯化方法。
背景技术
生物碱是广泛存在于自然界天然动植物中的含氮有机化合物，绝大多数生物碱具有显著的生理活性，是药物研发的热点化合物。四氢异喹啉类生物碱在自然界分布广泛，是木兰科、樟科、马兜铃科、毛茛科、小檗科、防己科、罂粟科等许多药用植物中的活性成分。近年来,随着对四氢异喹啉类生物碱研究的深入，越来越多新的生物活性、新的作用机制和靶点被发现和揭示，此类生物碱生物活性的多样性受到人们的广泛关注，其药理活性包括抗菌、抗炎、抗肿瘤、镇痛、抗心律失常、抗血小板聚集、降压、调节免疫、松弛平滑肌、抗哮喘等功能，代表性药物如去甲乌药碱、盐酸小檗碱、延胡索乙素和可待因等。申请人从中药马齿苋(Portulaca oleracea L.)中分离得到一系列结构新颖的水溶性儿茶酚型异喹啉类生物碱，包括四氢异喹啉类生物碱，并发现它们具有不同程度的激动β2-AR和抗炎双功能(Catecholic isoquinolines from Portulaca oleracea L.and their anti-inflammatory andβ2-adrenergic receptor agonist activity.Journal of NaturalProducts,2018,81(4):768-777)；利用Gold柔性分子对接模拟，发现部分结构新颖的儿茶酚型四氢异喹啉衍生物与β2-AR的结合作用更强。鉴于此类水溶性儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱在药理活性方面具有潜在应用价值，而其在天然产物中的含量通常很低，化学合成及其分离纯化成为制备此类四氢异喹啉类生物碱的关键手段。
采用磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应合成儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱(Phosphate mediated biomimetic synthesis of tetrahydroisoquinolinealkaloids.Chemical Communication,2011,47:3242-3244；Facile one-pot synthesisof tetrahydroisoquinolines from amino acids via hypochlorite-mediateddecarboxylation and Pictet-Spengler condensation.Tetrahedron Letters,2014,55:5047-5051)已有文献报道。但目前文献报道的方法是采用硅胶柱色谱或半制备反相硅胶柱色谱(Phosphate mediated biomimetic synthesis of tetrahydroisoquinolinealkaloids.Chemical Communication,2011,47:3242-3244；Facile one-pot synthesisof tetrahydroisoquinolines from amino acids via hypochlorite-mediateddecarboxylation and Pictet-Spengler condensation.Tetrahedron Letters,2014,55:5047-5051；One-pot N-deprotection and catalytic intramolecular asymmetricreductive amination for the synthesis of tetrahydroisoquinolines.AngewandteChemie International Edition,2017,56(10):2725-2729)分离纯化儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的合成产物，但申请人在实验研究中发现，此类生物碱由于水溶性极强，具有在硅胶柱色谱上死吸附严重，而在反相硅胶柱色谱中保留时间极短、不易与反应底物盐酸多巴胺分离等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用大孔树脂分离纯化由磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应产物(水溶性儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱)的方法，该方法能够除去反应体系中的磷酸盐、维生素C和反应底物盐酸多巴胺，从而得到纯化的水溶性儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱化合物。该方法简便、经济、高效、环保。
本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
首先，本发明提供了一种利用大孔树脂分离纯化水溶性儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的方法，所述水溶性儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱具有式(I)所示结构：
Figure BDA0001803473440000031
其中，R选自C1-C5直链或支链的烷基、含有至少一个杂原子的脂肪环烷基、被至少一个取代基团取代的脂肪环烷基、苯基、苄基、被至少一个取代基团取代的苯基和被至少一个取代基团取代的苄基；
所述杂原子选自N、O和S；
所述取代基团选自取代或未被取代的C1-C5直链或支链的烷基、C1-C5直链或支链的烷氧基、硝基、卤素和羟基。
优选地，R选自甲基、异丁基、四氢呋喃基、苯基、被至少一个取代基团取代的四氢呋喃基和被至少一个取代基团取代的苯基；
所述取代基团选自羟基甲基、甲氧基和羟基；
所述取代基在四氢呋喃环上的取代位置选自C-3、C-4和C-5位；
所述取代基在苯环上的取代位置选自C-2、C-3和C4位；
优选地，R选自甲基、异丁基、C-5位被羟甲基取代的四氢呋喃基和被选自甲氧基和羟基中的一个或多个取代的苯基；
所述取代基在苯环上的取代位置选自C-3和C4位；
优选地，所述R选自甲基、异丁基、C-5位被羟基甲基取代的四氢呋喃基、3-羟基苯基、4-甲氧基苯基、3,4-二羟基苯基和3-甲氧基-4-羟基苯基中的一个或多个。
优选地，所述式(I)化合物选自以下化合物：
6,7-二羟基-1-(4-甲氧基苯基)-1,2,3,4-四氢异喹啉(I-1)；
6,7-二羟基-1-(4-羟基苯基)-1,2,3,4-四氢异喹啉(I-2)；
6,7-二羟基-1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉(I-3)；
6,7-二羟基-1-异丁基-1,2,3,4-四氢异喹啉(I-4)；
6,7-二羟基-1-(5-(羟甲基)呋喃-2-基)-1,2,3,4-四氢异喹啉(I-5)；
6,7-二羟基-1-(3-羟基苯基)-1,2,3,4-四氢异喹啉(I-6)；
6,7-二羟基-1-(3,4-二羟基苯基)-1,2,3,4-四氢异喹啉(I-7)；
6,7-二羟基-1-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-1,2,3,4-四氢异喹啉(I-8)。
优选地，所述式(I)化合物通过磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应合成；
优选地，所述方法包括进行Pictet-Spengler反应合成式(I)化合物，反应结束后将含有式(I)化合物的反应体系用乙酸乙酯萃取，再使用大孔吸附树脂分离纯化水相，以获得纯化的式(I)化合物。
优选地，所述Pictet-Spengler反应以盐酸多巴胺和
Figure BDA0001803473440000041
为反应物；R的定义同上所述；
优选地，所述Pictet-Spengler反应以磷酸盐介导，以水为反应溶剂，并在抗氧化剂维生素C的存在下进行，以防止盐酸多巴胺和反应产物发生氧化变性。
优选地，所述反应过程包括：将盐酸多巴胺、
Figure BDA0001803473440000042
维生素C依次加入反应体系中，然后加入磷酸盐缓冲液和纯化水，在氮气保护条件下于水浴中搅拌反应。
优选地，所述盐酸多巴胺、
Figure BDA0001803473440000043
和维生素C的摩尔比为2-2.5：1.9-2：1，优选为2.5：2：1；
优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.0-6.9，优选为6.0；
优选地，所述磷酸盐缓冲液为1M的磷酸钾缓冲液；
优选地，所述磷酸钾缓冲液通过如下方法配制：
(1)1M的K2HPO4溶液的配制：精密称取三水合磷酸氢二钾22.8g，加水溶解并定容至100mL量瓶中，摇匀；
(2)1M的KH2PO4溶液的配制：精密称取磷酸二氢钾13.6g，加水溶解并定容至100mL量瓶中，摇匀；
(3)1M的磷酸钾缓冲液的配制：量取配制好的86.8mL的1M KH2PO4溶液与13.2mL的1M K2HPO4的溶液混匀，调pH至6.0-6.9。
优选地，磷酸盐缓冲溶液与反应溶剂的体积比为1：2。
优选地，所述水浴温度为40℃，反应时间为6h。
优选地，所述方法包括进行磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应合成式(I)化合物，反应结束后将含有式(I)化合物的反应体系用乙酸乙酯萃取，得酯相和主要含有式(I)化合物的水相；将水相缓慢加于大孔吸附树脂柱上，待吸附完全后，用纯化水和/或无水乙醇进行洗脱；优选使用纯化水和无水乙醇依次洗脱。
优选地，所述洗脱分两步进行，首先使用5-15BV(BV即bed volume，为床容积)，优选为10-15BV，更优选为10BV的纯化水快速洗脱大孔吸附树脂，以除去维生素C与磷酸盐，再用1-3BV，优选为2BV的无水乙醇慢速洗脱大孔吸附树脂，浓缩干燥乙醇洗脱液以获得纯化的式(I)化合物。
优选地，洗脱过程中使用TLC监测流分中成分的变化。
优选地，所述快速洗脱的流速控制在1000-3000mL/h，优选为1500mL/h。
优选地，所述慢速洗脱的流速控制在10-30mL/h，优选为15mL/h。
本发明的洗脱速度以及洗脱方式影响本发明的纯化效果，根据本发明的洗脱方式，在本发明的优选参数内总能实现更优的纯化效果，比如，以纯化水进行洗脱，用量在5-15BV，流速在1000-3000mL/h，以无水乙醇进行洗脱，用量在1-3BV，流速在10-30mL/h可较好的实现本发明，获得95-100％纯度的纯化产物，当进一步选用更优的参数，比如纯化水洗脱时采用10BV、1500mL/h的流速，同时无水乙醇洗脱时采用2BV、15mL/h的流速，两者的搭配组合会最好的实现本发明的分离纯化效果；而调换纯化水与无水乙醇的洗脱顺序无法实现本发明，以及改变纯化水和无水乙醇的用量及流速，使其超过本发明的范围，则无法实现满意的分离纯化效果或者难以获得符合纯度要求的纯化产物。还需说明的是，用量与流速以及洗脱的先后顺序在本发明中是特定组合的，以突破本发明的组合方式进行也无法实现预期效果。
优选地，所述大孔树脂选自AB-8、D-101、Diaion HP等，优选采用弱极性大孔树脂AB-8。
如本发明所述的磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应产物中，儿茶酚型四氢异喹啉水溶性强，其在正相硅胶柱色谱上死吸附严重，部分产物在HPLC反相硅胶色谱柱上保留时间极短，难以和底物多巴胺分离，且由于有磷酸盐和维生素C等水溶性成分干扰，造成产物的分离纯化极其困难。大孔树脂在天然产物活性部位(如总生物碱、总黄酮、总皂苷等)或发酵产物的分离纯化中应用普遍，但极少用于单体化合物的分离纯化。本发明采用大孔吸附树脂柱色谱(比如弱极性AB-8树脂)，利用水洗脱首先除去磷酸盐和维生素C水溶性成分，采用乙醇洗脱即可实现目标产物与未反应的多巴胺底物的一步分离，从而得到纯化的目标产物。本发明的分离纯化方法简便高效、溶剂种类及使用量少，尤其适用于磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应的水溶性反应产物儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的分离与纯化，相较于文献报道的HPLC法(Pesnot T,Gershater M C,Ward J M,et al.Phosphate mediatedbiomimetic synthesis of tetrahydroisoquinoline alkaloids.ChemicalCommunications,2011,47(11):3242-3244)和Amberlite CG-50弱酸型阳离子交换树脂柱色谱-乙酸盐缓冲液洗脱法(Morita S,Ito T,Tono T.Syntheses of isoquinolines bycondensation of dopamine with carbonyl compounds.Journal of the AgriculturalChemical Society of Japan,1975,39(2):547-549)，本发明的方法更为简单，成本更低，并且使用的大孔树脂经稀碱处理后可回收使用。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1：实施例1合成的化合物的结构。
图2：实施例1的硅胶薄层色谱图(DA代表盐酸多巴胺，2、4、6、8、10、12、14、16、Fr.16-25分别代表盐酸多巴胺与4-甲氧基苯甲醛反应体系的水相过大孔树脂柱色谱的乙醇洗脱流分Fr.2-16以及合并后的流分Fr.16-25；A-C：展开剂为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1，依次为UV365nm、碘熏、茚三酮显色；D-E：展开剂分别为乙酸乙酯：甲醇：水：甲酸＝40：10：10：1和正丁醇：醋酸：水＝4：1：1，碘熏显色)。
图3：实施例1合成的化合物的1H NMR谱(600MHz,DMSO-d6)(1.12,3.51为残留的乙醇溶剂峰)。
图4：实施例1合成的化合物的13C NMR谱(150MHz,DMSO-d6)(19.02,55.47为残留的乙醇溶剂峰)。
图5：实施例2合成的化合物的结构。
图6：实施例2的硅胶薄层色谱图(DA代表盐酸多巴胺，3、5、7、9、11、13、14、15、16、17、18和Fr.13-19分别代表盐酸多巴胺与4-羟基苯甲醛反应体系的水相过大孔树脂柱色谱的乙醇洗脱流分Fr.3-18以及合并后的流分Fr.13-19；A-F：展开剂为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1，依次为UV365nm、碘熏、茚三酮、三氯化铁、碘熏和茚三酮显色；G-H：展开剂分别为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1和乙酸乙酯：甲醇：水：甲酸＝40：10：10：1，碘熏显色)。
图7：实施例2合成的化合物的1H NMR谱(600MHz,DMSO-d6)。
图8：实施例2合成的化合物的13C NMR谱(150MHz,DMSO-d6)。
图9：实施例3合成的化合物的结构。
图10：实施例3的硅胶薄层色谱图(DA代表盐酸多巴胺，2、4、6、8、10和Fr.10-18分别代表盐酸多巴胺与乙醛反应体系的水相过大孔树脂柱色谱的乙醇洗脱流分Fr.2-10以及合并后的流分Fr.10-18；A-B：展开剂为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1，依次为碘熏、茚三酮显色；C-D：展开剂分别为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1和乙酸乙酯：甲醇：水：甲酸＝40：10：10：1，茚三酮显色)。
图11：实施例3合成的化合物的1H NMR谱(600MHz,DMSO-d6)。
图12：实施例3合成的化合物的13C NMR谱(150MHz,DMSO-d6)
图13：实施例4合成的化合物的结构。
图14：实施例4的硅胶薄层色谱图(DA代表盐酸多巴胺，3、5、7、9、11、13、15、17和Fr.14-25分别代表盐酸多巴胺与异戊醛反应体系的水相过大孔树脂柱色谱的乙醇洗脱流分Fr.3-17以及合并后的流分Fr.14-25；A：展开剂为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1，碘熏显色；B-C：展开剂分别为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1和乙酸乙酯：甲醇：水：甲酸＝40：10：10：1，茚三酮显色)。
图15：实施例4合成的化合物的1H NMR谱(600MHz,DMSO-d6)(1.12,3.51为残留的乙醇溶剂峰)。
图16：实施例4合成的化合物的13C NMR谱(150MHz,DMSO-d6)
(δ56.49、19.02为残留的乙醇溶剂峰)。
图17：实施例5合成的化合物的结构。
图18：实施例5的硅胶薄层色谱图(DA代表盐酸多巴胺，3、5、7、9、11、13、15和Fr.12-20分别代表盐酸多巴胺与5-羟甲基糠醛反应体系的水相过大孔树脂柱色谱的乙醇洗脱流分Fr.3-15以及合并后的流分Fr.12-20；A-C：展开剂为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1，依次为碘熏、茚三酮、三氯化铁显色；D：展开剂分别为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1，碘熏显色)。
图19：实施例5合成的化合物的1H NMR谱(600MHz,DMSO-d6)。
图20：实施例5合成的化合物的13C NMR谱(150MHz,DMSO-d6)。
图21：实施例6合成的化合物的结构。
图22：实施例6的硅胶薄层色谱图(DA代表盐酸多巴胺，2、4、6、8、10、12、14、16和Fr.12-23分别代表盐酸多巴胺与3-羟基苯甲醛反应体系的水相过大孔树脂柱色谱的乙醇洗脱流分Fr.2-16以及合并后的流分Fr.12-23；A-B：展开剂为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1，依次为碘熏和茚三酮显色；C-D：展开剂分别为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1和乙酸乙酯：甲醇：水：甲酸＝40：10：10：1，茚三酮显色)。
图23：实施例6合成的化合物的1H NMR谱(600MHz,DMSO-d6)(δ3.52、1.11为乙醇溶剂峰)。
图24：实施例6合成的化合物的13C NMR谱(150MHz,DMSO-d6)图12化合物1f的13CNMR谱(150MHz,DMSO-d6)(δ56.49、19.03为乙醇溶剂峰)。
图25：实施例7合成的化合物的结构。
图26：实施例7的硅胶薄层色谱图(DA代表盐酸多巴胺，2、4、6、8、10、12、14、16和Fr.13-21分别代表盐酸多巴胺与3,4-二羟基苯甲醛反应体系的水相过大孔树脂柱色谱的乙醇洗脱流分Fr.2-16以及合并后的流分Fr.13-21；A-B：展开剂为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1，依次为UV365nm和碘熏显色；C-D：展开剂分别为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1和乙酸乙酯：甲醇：水：甲酸＝40：10：10：1，三氯化铁显色)。
图27：实施例7合成的化合物的1H NMR谱(600MHz,DMSO-d6)(δ3.52、1.12为乙醇溶剂峰)。
图28：实施例7合成的化合物的13C NMR谱(150MHz,DMSO-d6)(δ56.49、19.03为乙醇溶剂峰)。
图29：实施例8合成的化合物的结构。
图30：实施例8的硅胶薄层色谱图(DA代表盐酸多巴胺，2、4、6、8、10、12、14、16和Fr.12-23分别代表盐酸多巴胺与3-甲氧基-4-羟甲苯甲醛反应体系的水相过大孔树脂柱色谱的乙醇洗脱流分Fr.2-16以及合并后的流分Fr.12-23；A-C：展开剂为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1，依次为UV365nm、碘熏、茚三酮显色；D-E：展开剂分别为正丁醇：醋酸：水＝4：1：1和乙酸乙酯：甲醇：水：甲酸＝40：10：10：1，茚三酮显色)。
图31：实施例8合成的化合物的1H NMR谱(600MHz,DMSO-d6)(δ3.45、1.05为乙醇溶剂峰)。
图32：实施例8合成的化合物的13C NMR谱(150MHz,DMSO-d6)(δ56.49、19.02为乙醇溶剂峰)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实验材料：盐酸多巴胺(C8H11NO2·HCl，M＝189，分析纯)购自山东广鑫药业有限公司；4-甲氧基苯甲醛(纯度为99％)购自北京伊诺凯科技有限公司；抗坏血酸(分析纯)购自天津市大茂化学试剂厂；三水合磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O，M＝228)与磷酸二氢钾(KH2PO4，M＝136)购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯；纯化水购自山东普利思饮用水股份有限公司。
柱层析填料：AB-8弱极性大孔吸附树脂(河北省沧州宝恩化工有限公司)；薄层层析：聚酰胺薄膜(浙江省台州市路桥四青生化材料厂)、硅胶薄层板及薄层层析硅胶(GF254)为青岛海洋化工有限公司制造；常规分析纯试剂无水乙醇、甲醇购自济南市诚言化学试剂有限公司。
实验仪器：RE52-98型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、SHB-IV双A循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、KQ5200型超声波清洗器(昆山市仪器厂)、AL104分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、WFH-203型三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司)、85-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)、Sartorius PB-10pH计(德国赛多利斯集团)。
实施例1-8式(I)化合物的分离纯化
在50mL圆底烧瓶中依次加入盐酸多巴胺(0.1g,0.529mmol)、
Figure BDA0001803473440000101
(0.44mmol)、维生素C(0.04g,0.227mmol)，再加入5mL 1M磷酸钾缓冲液(pH 6.0)、10mL纯化水，将圆底烧瓶置于40℃的水浴中，在氮气保护条件下搅拌反应6小时。之后将上述反应体系用乙酸乙酯萃取6次，每次15mL，得水相和酯相。
(其中，实施例1-8中
Figure BDA0001803473440000111
结构分别为4-甲氧基苯甲醛(实施例1)、4-羟基苯甲醛(实施例2)、乙醛(实施例3)、异戊醛(实施例4)、5-羟甲基糠醛(实施例5)、3-羟基苯甲醛(实施例6)、3,4-二羟基苯甲醛(实施例7)和3-甲氧基-4-羟甲苯甲醛(实施例8))。
将上述乙酸乙酯萃取后的水相(15mL)加于大孔吸附树脂柱(2×35cm)上，首先用10BV的纯化水快速洗脱，洗脱速度为1500mL/h，除去水相中的维生素C和磷酸盐，再用2BV的无水乙醇慢速洗脱，洗脱速度为15mL/h。TLC点板检查乙醇洗脱流分，将流分合并，浓缩干燥，得到纯化的式(I)化合物，其产率在13-52％之间，化合物的结构及氢谱和碳谱见附图，氢谱显示其纯度在95-100％之间，实施例1-8硅胶薄层色谱图分别如图2、6、10、14、20、24、28和32所示，展开剂及显色情况详见附图说明。实验结果显示，本发明的方法能够很好地实现式(I)化合物与反应底物盐酸多巴胺以及磷酸盐和维生素C的分离。
其他方法
文献报道的其他两种分离纯化方法，如下：
方法A：参见Pesnot T,Gershater M C,Ward J M,et al.Phosphate mediatedbiomimetic synthesis of tetrahydroisoquinoline alkaloids.ChemicalCommunications,2011,47(11):3242-3244.
将盐酸多巴胺(0.527mmol)和4-甲氧基苯甲醛、或4-羟基苯甲醛、或乙醛(0.64mmol)加入10mL乙腈/磷酸钾缓冲液(pH＝6的0.1M溶液，V/V＝1：1)的混合物中。将所得溶液在50℃下搅拌12小时。将粗产物用二氯甲烷(3×20mL)萃取，将其真空蒸发，然后将二氯甲烷萃取相通过制备型HPLC(Discovery BIO大孔容反相硅胶柱C18-10Supelco，梯度洗脱：5％至40％乙腈/水(0.1％TFA)，保留时间：10.5min)纯化，将含有所需产物的组分合并，浓缩，得到浅黄色固体(即分别得到本发明实施例1-3合成的化合物)。
儿茶酚型四氢异喹啉产物水溶性强，其在正相硅胶柱色谱上死吸附严重，该方法采用的是HPLC反相硅胶柱，申请人在实验中发现部分产物在HPLC反相硅胶色谱柱上保留时间极短，难以和底物多巴胺分离，并且还存在有磷酸盐和维生素C等水溶性成分的干扰，分离纯化比较困难，且该方法的成本高。
方法B：参见Morita S,Ito T,Tono T.Syntheses of isoquinolines bycondensation of dopamine with carbonyl compounds.Journal of the AgriculturalChemical Society of Japan,1975,39(2):547-549.
该文献中不仅涉及Pictet-Spengler反应，也涉及Pschorr反应，由于本发明方法尤其适用于磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应得到的儿茶酚型四氢异喹啉产物的分离纯化，所以仅对多巴胺和丙酮的Pictet-Spengler反应生成1,1-二甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉进行了实验，不再涉及多巴胺和3-或4-羟基苯甲醛的Pschorr反应。
将盐酸多巴胺(19.0mg)溶于4.73ml 0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)中，并加入0.63ml丙酮。将混合物在50℃±0.1℃下加热3小时。移取1ml反应混合物，在40℃下真空浓缩，将残余物溶于3ml 0.1M乙酸盐缓冲液(pH4.43)中，用Amberlite CG-50弱酸型阳离子交换树脂(15×250mm)处理该溶液，并用相同的缓冲液洗脱，依次得到多巴胺和产物。
该方法多巴胺和丙酮反应后的溶液需要进行真空浓缩，然后溶于3ml 0.1M乙酸盐缓冲液(pH4.43)中，用Amberlite CG-50弱酸型阳离子交换树脂分离，并用相同的乙酸盐缓冲液洗脱，该方法只能实现多巴胺和产物的分离，但是产物中必然还含有部分残留的乙酸盐缓冲溶液，这意味着要得到纯化的产物至少还需要进一步除盐的操作，显然，该方法并未认识到该问题，也并未提出解决该问题的方法。此外，本发明所采用的大孔树脂相较于阳离子树脂，其前处理和后处理都更容易。
本发明的实施例1-8中所述的方法与上述方法A和B相比，本发明的反应体系经乙酸乙酯萃取后，儿茶酚四氢异喹啉生物碱绝多部分保留在水相中，水相可直接用大孔吸附树脂洗脱，反应液中的磷酸盐和维生素C可用水直接洗去，进一步使用无水乙醇洗脱即可实现反应物与产物的完全分离，减压快速干燥后即可得到纯化的产物，本发明的分离纯化方法简单、高效快速、纯化效果好，加入的溶剂种类及用量均大大减少、成本大大降低。

Claims (10)

1.一种利用大孔树脂分离纯化水溶性儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱的方法，所述水溶性儿茶酚型四氢异喹啉类生物碱具有式(I)所示结构：
Figure FDA0001803473430000011
其中，R选自C1-C5直链或支链的烷基、含有至少一个杂原子的脂肪环烷基、被至少一个取代基团取代的脂肪环烷基、苯基、苄基、被至少一个取代基团取代的苯基和被至少一个取代基团取代的苄基；
所述杂原子选自N、O和S；
所述取代基团选自取代或未被取代的C1-C5直链或支链的烷基、C1-C5直链或支链的烷氧基、硝基、卤素和羟基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，R选自甲基、异丁基、呋喃基、苯基、被至少一个取代基团取代的呋喃基和被至少一个取代基团取代的苯基；
所述取代基团选自羟基甲基、甲氧基和羟基；
所述取代基在呋喃环上的取代位置选自C-3、C-4和C-5位；
所述取代基在苯环上的取代位置选自C-2、C-3和C4位；
优选地，R选自甲基、异丁基、C-5位被羟甲基取代的呋喃基和被选自甲氧基和羟基中的一个或多个取代的苯基；
所述取代基在苯环上的取代位置选自C-3和C4位；
优选地，所述R选自甲基、异丁基、C-5位被羟基甲基取代的呋喃基、3-羟基苯基、4-甲氧基苯基、3,4-二羟基苯基和3-甲氧基-4-羟基苯基中的一个或多个。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述式(I)化合物通过Pictet-Spengler反应合成；
优选地，所述方法包括进行Pictet-Spengler反应合成式(I)化合物，反应结束后将反应体系用乙酸乙酯萃取，再使用大孔吸附树脂分离纯化水相以获得纯化的式(I)化合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Pictet-Spengler反应以盐酸多巴胺和
Figure FDA0001803473430000021
为反应物；R的定义与权利要求1或2中相同；
优选地，所述Pictet-Spengler反应以磷酸盐介导，以水为反应溶剂，并在抗氧化剂维生素C的存在下进行；
优选地，所述反应过程包括：将盐酸多巴胺、
Figure FDA0001803473430000022
维生素C依次加入反应体系中，然后加入磷酸盐缓冲液和纯化水，在氮气保护条件下于水浴中搅拌反应。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述盐酸多巴胺、
Figure FDA0001803473430000023
和维生素C的摩尔比为2-2.5：1.9-2：1，优选为2.5：2：1；
优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为60-6.9，优选为6.0；
优选地，所述磷酸盐缓冲液为1M的磷酸钾缓冲液；
优选地，所述磷酸钾缓冲液通过如下方法配制：
(1)1M的K2HPO4溶液的配制：精密称取三水合磷酸氢二钾22.8g，加水溶解并定容至100mL量瓶中，摇匀；
(2)1M的KH2PO4溶液的配制：精密称取磷酸二氢钾13.6g，加水溶解并定容至100mL量瓶中，摇匀；
(3)1M的磷酸钾缓冲液的配制：量取配制好的86.8mL的1M KH2PO4溶液与13.2mL的1MK2HPO4的溶液混匀，调pH至6.0-6.9。
6.根据权利要求4述的方法，其特征在于，磷酸盐缓冲溶液与反应溶剂的体积比为1：2；
优选地，所述水浴温度为40℃，反应时间为6h。
7.据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进行磷酸盐介导的Pictet-Spengler反应合成式(I)化合物，反应结束后将含有式(I)化合物的反应体系用乙酸乙酯萃取，得酯相和含有式(I)化合物的水相；将水相缓慢加于大孔吸附树脂柱上，待吸附完全后，用纯化水和/或无水乙醇进行洗脱；优选使用纯化水和无水乙醇依次洗脱。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述洗脱分两步进行，首先使用5-15BV，优选10-15BV，更优选为10BV的纯化水快速洗脱大孔吸附树脂，以除去维生素C与磷酸盐，再用1-3BV，优选为2BV的无水乙醇慢速洗脱大孔吸附树脂，浓缩干燥乙醇洗脱液以得到纯化的式(I)化合物；
优选地，洗脱过程中使用TLC监测流分中成分的变化。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述快速洗脱的流速控制在1000-3000mL/h，优选为1500mL/h。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述慢速洗脱的流速控制在10-30mL/h，优选为15mL/h；
优选地，所述大孔树脂选自AB-8、D-101和Diaion HP，优选为大孔树脂AB-8。
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