CN110724200A - 嵌合细胞因子受体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供嵌合细胞因子受体(CCR)，其包含：(i)外域，其结合选自肿瘤分泌因子，趋化因子和细胞表面抗原的配体；和(ii)细胞因子受体胞内域。

Description

嵌合细胞因子受体
本申请是基于申请日为2016年8月19日，优先权日为2015年8月20日，申请号为201680046834.3，发明名称为：“嵌合细胞因子受体”的专利申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及嵌合细胞因子受体(CCR)，在细胞表面表达此类嵌合细胞因子受体和任选地嵌合抗原受体的细胞。
发明背景
嵌合抗原受体(CAR)
已经描述了一些免疫治疗剂用于癌症的治疗，包括治疗性单克隆抗体(mAbs)，双特异性T细胞接合子和嵌合抗原受体(CAR)。
嵌合抗原受体是将单克隆抗体(mAb)的特异性移植到T细胞的效应子功能的蛋白。它们的通常形式是I型跨膜结构域蛋白，具有抗原识别氨基末端，间隔区，跨膜结构域，其全部连接至传输T细胞存活和活化信号的复合胞内域。
这些分子最常见的形式是来源于识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)，经由间隔区和跨膜结构域融合至信号传导胞内域的融合物。响应scFv对其靶标的识别，此类分子导致T细胞的活化。当T细胞表达此类CAR时，它们识别并杀死表达该靶抗原的靶细胞。已经开发了几种针对肿瘤相关抗原的CAR，且使用此类表达CAR的T细胞的过继转移方法目前已经在临床研究中用于多种癌症的治疗。
基于CAR的方法以治疗前列腺癌
前列腺癌是全球男性中第二常见的癌症，也是癌症相关死亡的第六大原因。从全球来看，每年约有1,100,000新病例和300,000死亡，包含所有癌症死亡的4％。据估计，每6名男子中就有1人在其一生中将被诊断为患有该疾病。
前列腺癌的初始治疗可以包括手术，放疗或激素疗法，或每一种的任何组合。激素治疗包括降低睾丸酮的水平，其是激发失控的细胞生长的男性激素。化疗通常保留用于晚期癌症。
尽管睾丸酮水平通过激素疗法降低，但当前列腺癌生长时，治疗选择是有限的。典型地，癌症疫苗sipuleucel-T
Figure BDA0002244046900000021
设计用于诱导靶向前列腺酸性磷酸酶((PAP)抗原)的免疫应答的基于树突细胞的治疗性癌症疫苗，放射性药剂(例如氯化镭-223)，次级激素疗法(如阿比特龙或恩佐鲁胺(enzalutamide))和/或化疗(多西他赛和卡巴他赛)依次添加到激素疗法。虽然这些治疗中的每一种都可以延迟癌症的生长达数月并减轻疾病产生的症状，但是疾病最终会对它们产生抗性。
在临床前，已经用基于CAR T细胞的疗法靶向两种与前列腺癌相关的抗原：前列腺特异性膜抗原(PSMA)和前列腺干细胞抗原(PSCA)。
用PSCA CAR工程化的T细胞处理的小鼠显示延迟的肿瘤生长(Hillerdal et al(2014)BMC Cancer 14:30；和Abate-Daga et al(2014)25:1003-1012)。尽管细胞显示出高的体外细胞毒性，但在体内肿瘤生长被延迟，但是荷瘤小鼠未被治愈。
这可能是因为在体内，CAR T细胞努力克服肿瘤的敌对微环境。特别是CAR T细胞可能无法在前列腺癌肿瘤床中植入并扩增。
可以通过施用细胞因子，或通过组成型产生细胞因子的CAR T细胞，来增强CAR T细胞的持久性和活性。然而，这些方法具有局限性：系统性施用细胞因子可以是有毒的；细胞因子的组成型产生可以导致不受控制的增殖和转化(Nagarkatti et al(1994)PNAS 91:7638-7642；Hassuneh et al(1997)Blood89:610-620)。
因此需要替代CAR T细胞方法，其促进T细胞植入和扩增以抵消敌对肿瘤微环境的作用
中靶脱瘤毒性
存在单一抗原有效地描述癌症是相对罕见的，其可以导致缺乏特异性。
大多数癌症不能以单一抗原为基础从正常组织区分。因此，发生相当大的“中靶脱瘤”毒性，由此正常组织被治疗损伤。例如，尽管使用利妥昔单抗靶向CD20以治疗B细胞淋巴瘤，但整个正常B细胞部分被耗尽，而靶向CD52以治疗慢性淋巴细胞白血病，整个淋巴样部分被耗尽，而靶向CD33以治疗急性髓样白血病，整个髓样部分被损伤等。
临床试验已经证实了预测的“中靶脱瘤”毒性的问题。例如，靶向ERBB2的方法导致结肠癌转移至肺和肝的患者死亡。在一些患者中，ERBB2在结肠癌中过表达，但其在正常组织(包括心脏和正常血管)中也有表达。
因此，需要改善的方法来进行癌症治疗，其中此类“中靶脱瘤”毒性降低或消除。
附图简述
图1：总结各种细胞因子受体的结构，产生细胞因子的细胞类型和表达细胞因子受体的细胞类型的示意图。
图2：显示提出的嵌合细胞因子受体的示意图
(a)细胞因子IL2和IL7细胞因子受体通过共同γ链和细胞因子特异性α/β链发出信号。
(b)嵌合细胞因子受体的一种实施方式是用识别PSA的不同表位的不同scFv(或任何其他合适的结合子)替换细胞因子α/β和γ链的胞外域(ectodomain)。
(c)替代方法是用PSA特异性抗体的VH/VL替换α/β和γ的胞外域，其中VH和VL都参与结合，使得结合让它们在一起。
图3：基于聚集的细胞因子信号传导增强剂
显示嵌合细胞因子受体和CAR组合系统的示意图。该细胞包含两种嵌合细胞因子受体，其结合相同可溶性配体上的不同表位。在不存在可溶性配体(例如PSA)但存在细胞膜抗原(例如PSMA)的情况下，信号传导通过CAR发生。在存在可溶性配体的情况下，发生两种嵌合细胞因子受体的聚集，导致基于细胞因子的信号增强。
图4：图3所示的嵌合细胞因子受体/CAR组合系统的理论构建体图。
图5：显示本发明的嵌合跨膜蛋白的结构实例的示意图。嵌合跨膜蛋白包含二聚化结构域和细胞因子受体胞内域。所示的实施方案具有“Fab”型结构，因为二聚化结构域包含抗体型重链和轻链恒定区。这些结构域之间的恒定二聚化使得IL2受体共同γ链与IL-2受体β链或IL-7受体α链在一起，导致组成型细胞因子信号传导。
图6：通过嵌合跨膜蛋白的IL-2信号传导。
对具有图5所示的一般结构的两种嵌合跨膜蛋白质测试了其诱导IL-2信号传导的能力。一种嵌合跨膜蛋白包含IL2受体胞内域，而另一种包含IL-7受体胞内域。使用依赖于IL-2信号传导进行生长的鼠细胞系CTLL2来测试IL-2信号传导。作为阳性对照，用100u/mL鼠IL2培养CTLL2细胞。表达包含IL2受体胞内域(Fab_IL2endo)的嵌合跨膜蛋白的细胞支持CTLL2细胞存活和生长，而表达包含IL-7受体(Fab_IL7endo)的嵌合跨膜蛋白的细胞则不支持。
图7：显示一组PSA嵌合细胞因子受体的示意图
使用来源于结合不同PSA表位的两种抗体5D5A5和5D3D11的scFv开发了一组靶向PSA的嵌合细胞因子受体(CCR)。
左上图：具有在具有IL2Rβ链的链上具有A5且在具有共同γ链的链上具有D11的IL-2R胞内域的CCR；
右上图：具有在具有IL7Rα链的链上具有A5且在具有共同γ链的链上具有D11的IL7R胞内域的CCR；
左下图：具有在具有IL2Rβ链的链上具有D11且在具有共同γ链的链上具有A5的IL-2R胞内域的CCR；和
右下图：具有在具有IL7Rα链的链上具有D11且在具有共同γ链的链上具有A5的IL-7R胞内域的CCR。
还为每个CCR创建了阴性对照，其中IL2Rγ链被刚性接头替换。
图8：在PSA的存在下从表达PSA嵌合细胞因子受体的细胞的IL2信号传导-CTLL2增殖
用表达图7中所示的一些PSA嵌合细胞因子受体的构建体转导CTLL2细胞。在存在或不存在IL2(阳性对照)和存在或不存在5ng/mL或5μg/mL PSA的情况下培养细胞。3天和7天后评估CTLL2增殖。
在不存在IL2和存在PSA的情况下，具有IL2R胞内域的抗PSA嵌合细胞因子受体支持CTLL2细胞增殖，但具有IL7R胞内域的受体或包含刚性接头替换共同γ链的任何CCR不支持。
图9：在存在PSA的情况下从表达PSA嵌合细胞因子受体的细胞的IL-2信号传导-CTLL2 STAT5磷酸化
CTLL2细胞不转导(WT)；或用表达针对PSA的CCR的载体(D11-CD8STK-IL2Rg_A5-Hinge-IL2Rb)或具有刚性接头替换共同γ链的等同构建体(D11-CD8STK-RL_A5-Hinge-IL2Rb)转导。将细胞用500μMPervanadate或500ng/mL PSA孵育1或4小时。然后使用phosphoflow来研究STAT5的Y694的磷酸化。
发明概述
本发明人开发了“嵌合细胞因子受体”(CCR)，其将非细胞因子结合分子的结合特异性移植细胞因子受体的胞内域。此类CCR与嵌合抗原受体(CAR)的共表达帮助CAR T细胞在敌对肿瘤微环境中植入和扩增。对CCR的配体以及CAR配体的要求增加了另一层选择性并有助于防止中靶脱瘤的毒性。
例如，他们开发了共表达CAR和嵌合细胞因子受体的细胞，所述嵌合细胞因子受体检测PSA并向CAR T细胞传输IL2/15或IL7信号。以这种方式，仅在前列腺癌微环境中选择性刺激CAR T细胞增殖，而在PSA不存在的情况下(即在患者缓解后)，细胞因子刺激丢失。
在第一方面，本发明提供嵌合细胞因子受体(CCR)，其包含：
外域(exodomain)，其结合选自肿瘤分泌因子，趋化因子和细胞表面抗原的配体；和
细胞因子受体胞内域。
在本发明的第一方面的第一实施方案中，嵌合细胞因子受体包含两个多肽：
(i)第一多肽，其包含
(a)第一抗原结合结构域，其结合配体的第一表位
(b)细胞因子受体胞内域的第一链；和
(ii)第二多肽，其包含
(a)第二抗原结合结构域，其结合配体的第二表位
(b)细胞因子受体胞内域的第二链。图2b说明了此类排列。
第一和第二抗原结合结构域的每一个可以是单链可变片段(scFv)或单域结合子。
在本发明的第一方面的第二实施方案中，嵌合细胞因子受体其包含两个多肽：
(i)第一多肽，其包含
(a)重链可变结构域(VH)
(b)细胞因子受体胞内域的第一链；和
(ii)第二多肽，其包含
(a)轻链可变结构域(VL)
(b)细胞因子受体胞内域的第二链。
图2c说明了此列排列。
细胞因子受体胞内域的第一链和第二链既可以是不同的且可以选自I型细胞因子受体胞内域α-，β-，和γ-链。
或者细胞因子受体胞内域的第一链和第二链可以是相同的且可以选自I型细胞因子受体胞内域α-，β-，和γ-链
例如，细胞因子受体胞内域可以包含：
(i)IL-2受体β-链胞内域
(ii)IL-7受体α-链胞内域；
(iii)IL-15受体α-链胞内域；或
(iv)共同γ-链受体胞内域
细胞因子受体胞内域可以包含(i)，(ii)或(iii)，和(iv)。
配体可以是肿瘤分泌因子，例如选自以下的肿瘤分泌因子：前列腺特异性抗原(PSA)，癌胚抗原(CEA)和血管内皮生长因子(VEGF)和CA125。
配体可以是趋化因子，例如，选自以下的趋化因子：CXCL12，CCL2，CCL4，CCL5和CCL22。
配体可以是细胞表面分子，例如跨膜蛋白。配体可以是例如CD22。
在第二方面，本发明提供细胞，其包含根据本发明第一方面的嵌合细胞因子受体。
细胞可以包含第一嵌合细胞因子受体和第二嵌合细胞因子受体，其结合相同配体上的不同表位。
细胞可以包含第一嵌合细胞因子受体，其包含I型细胞因子受体胞内域α-或β-链，和第二嵌合细胞因子受体，其包含I型细胞因子受体胞内域γ-链，使得当第一嵌合细胞因子受体和第二细胞因子受体结合所述配体时，发生通过所述α-/β-链和γ-链的组合信号传导。
细胞可以包含嵌合抗原受体，例如结合肿瘤相关细胞表面抗原的嵌合抗原受体。
嵌合抗原可以结合与前列腺癌相关的细胞表面抗原，例如前列腺干细胞抗原(PSCA)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
在CCR识别细胞表面抗原的情况下，CCR和CAR可以识别在相同靶(例如肿瘤)细胞上共表达的细胞表面抗原。例如，对于B细胞恶性肿瘤，CAR可以识别细胞表面抗原例如CD19，而CCR可以识别在相同靶细胞表面上共表达的分子例如CD22，从而提高移植。
在第三方面，本发明提供编码根据本发明第一方面的嵌合细胞因子受体(CCR)的核酸序列。
在第四方面，本发明提供了核酸构建体，其包含编码第一CCR的第一核酸序列和编码第二CCR的第二核酸序列，该核酸构建体具有以下结构：
AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-AbB2-spacer2-TM2-endo2
其中
AgB1是编码第一CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
spacer 1是编码第一CCR的间隔区的核酸序列；
TM1是编码第一CCR的跨膜结构域的核酸序列；
endo1是编码第一CCR的胞内域的核酸序列；
coexpr是使得两个CCR能够共表达的核酸序列；
AgB2是编码第二CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
spacer 2是编码第二CCR的间隔区的核酸序列；
TM2是编码第二CCR的跨膜结构域的核酸序列；
endo2是编码第二CCR的胞内域的核酸序列。
核酸构建体还可以编码嵌合抗原受体(CAR)。在该实施方案中，核酸构建体可以具有以下结构：
(i)CCRAgB1-CCRspacer1-CCRTM1-CCRendo1-coexpr1-CCRAgB2-CCRspacer2-CCRTM2-CCRendo2-coexpr2-CARAgB-CARspacer-CARTM-CARendo；
(ii)CCRAgB1-CCRspacer1-CCRTM1-CCRendo1-coexpr1-CARAgB-CARspacer-CARTM-CARendo-coexpr2-CCRAgB2-CCRspacer2-CCRTM2-CCRendo2；或者
(iii)CARAgB-CARspacer-CARTM-CARendo-coexpr1-CCRAgB1-CCRspacer1-CCRTM1-CCRendo1-coexpr2-CCRAgB2-CCRspacer2-CCRTM2-CCRendo2；
其中
CCRAgB1是编码第一CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
CCRspacer1是编码第一CCR的间隔区的核酸序列；
CCRTM1是编码第一CCR的跨膜结构域的核酸序列；
CCRendo1是编码第一CCR的胞内域的核酸序列；
CCRAgB2是编码第二CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
CCRspacer2是编码第二CCR的间隔区的核酸序列；
CCRTM2是编码第二CCR的跨膜结构域的核酸序列；
CCRendo2是编码第二CCR的胞内域的核酸序列；
Coexpr1和coexpr2是使得两个侧翼序列能够共表达的核酸序列；
CARAgB是编码CAR的抗原结合结构域的核酸序列；
CARspacer是编码CAR的间隔区的核酸序列；
CCRTM是编码CAR的跨膜结构域的核酸序列；和
CARendo是编码CAR的胞内域的核酸序列。
序列coexpr，coexpr1，coexpr2的任一项或所有可以编码包含自切割肽的序列。
为了避免同源重组，可以在编码相同或相似氨基酸序列的序列的区域中使用替换密码子。
在第五方面，本发明提供载体，其包含根据本发明第四方面的核酸构建体。
载体可以是例如逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。
在第六方面，本发明提供试剂盒，其包含：
i)载体，其包含编码根据本发明第一方面的第一CCR的核酸序列；和
ii)载体，其包含编码根据本发明第二方面的第二CCR的核酸序列。
试剂盒可以还包括包含编码嵌合抗原受体的核酸序列的载体。
试剂盒可以包含：
i)载体，其包含编码根据本发明第一方面的CCR的核酸序列；和
ii)载体，其包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。
在第七方面，本发明提供制备根据本发明的第二方面的细胞的方法，其包括将以下项导入细胞的步骤：根据本发明第三方面的核酸序列；根据本发明第四方面的核酸构建体；根据本发明第五方面的载体；或根据本发明第六方面的载体的试剂盒。
细胞可以来自从受试者分离的样品。
在第八方面，提供药物组合物，其包含多个根据本发明第二方面的细胞。
在第九方面，提供用于治疗和/或预防疾病的方法，其包含对受试者施用根据本发明第八方面的药物组合物的步骤。
方法可以包括以下步骤：
(i)从受试者分离含细胞的样品；
(ii)用以下项转导或转染所述细胞：根据本发明第三方面的核酸序列；根据本发明第四方面的核酸构建体；根据本发明第五方面的载体；或根据本发明第六方面的载体。
(iii)将来自(ii)的细胞施用至受试者。
样品可以是含有T细胞的样品。
疾病可以是癌症。
还提供了根据本发明第八方面的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
还提供了根据本发明第二方面的细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
在以下编号段落中总结本发明的其它方面：
1.嵌合跨膜蛋白，其包含：
二聚化结构域；和
细胞因子受体胞内域。
2.根据段落1的嵌合跨膜蛋白，其中所述二聚化结构域包含重链恒定域(CH)和轻链恒定域(CL)的二聚化部分。
3.根据任意前述段落的嵌合跨膜蛋白，其包含两个多肽：
(i)第一多肽，其包含
(a)第一二聚化结构域；和
(b)细胞因子受体胞内域的第一链；和
(ii)第二多肽，其包含：
(a)第二二聚化结构域，其与所述第一二聚化结构域二聚化；和
(b)细胞因子受体胞内域的第二链。
4.根据段落3的嵌合跨膜蛋白，其中所述第一和第二二聚化结构域自发地二聚化，或在二聚化化学诱导剂(CID)的存在下二聚化。
5.根据段落2，3或4的嵌合跨膜蛋白，其包含两个多肽：
(i)第一多肽，其包含：
(a)重链恒定域(CH)
(b)细胞因子受体胞内域的第一链；和
(ii)第二多肽，其包含：
(a)轻链恒定域(CL)
(b)细胞因子受体胞内域的第二链。
6.根据段落5的嵌合跨膜蛋白，其中所述细胞因子受体胞内域的第一和第二链不同且选自I型细胞因子受体胞内域α-，β-，和γ-链。
7.根据段落5的嵌合跨膜蛋白，其中所述细胞因子受体胞内域的第一和第二链相同且选自I型细胞因子受体胞内域α-，β-，和γ-链。
8.根据任意前述段落的嵌合跨膜蛋白，其中所述细胞因子受体胞内域包含：
(i)IL-2受体β-链胞内域
(ii)IL-7受体α-链胞内域；
(iii)IL-15受体α-链胞内域；或
(iv)共同γ-链受体胞内域
9.根据段落5的嵌合跨膜蛋白，其中所述第一多肽包含重链可变域(VH)和重链恒定域(CH)；且所述第二多肽包含轻链可变域(VL)和轻链恒定域(CL)。
10.根据段落9的嵌合跨膜蛋白，其包含Fab外域。
11.细胞，其包含根据任意前述段落的嵌合跨膜蛋白。
12.根据段落11的细胞，其包含嵌合抗原受体。
13.根据段落12的细胞，其中所述嵌合抗原受体结合肿瘤相关细胞表面抗原。
14.编码根据段落1至10中任一项的嵌合跨膜蛋白的核酸序列。
15.核酸构建体，其包含编码如段落3中定义的第一多肽的第一核酸序列和编码如段落3中定义的第二多肽的第二核酸序列，所述核酸构建体具有以下结构：
Dim1-TM1-endo1-coexpr-Dim2-TM2-endo2
其中
Dim1是编码第一二聚化结构域的核酸序列；
TM1是编码第一多肽的跨膜结构域的核酸序列；
endo1是编码第一多肽的胞内域的核酸序列；
coexpr是使得两个CCR能够共表达的核酸序列
Dim2是编码第二二聚化结构域的核酸序列；
TM2是编码第二多肽的跨膜结构域的核酸序列；
endo2是编码第二多肽的胞内域的核酸序列。
16.根据段落15的核酸构建体，其还编码嵌合抗原受体(CAR)。
17.根据段落15或16的核酸构建体，其中coexpr编码包含自切割肽的序列。
18.根据段落15至17中任一项的核酸构建体，其中为了避免同源重组，在编码相同或相似氨基酸序列的序列区域中使用替换密码子。
19.载体，其包含根据段落15至18中任一项的核酸构建体。
20.根据段落19的逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。
21.试剂盒，其包含：
i)载体，其包含编码如段落3中定义的第一多肽的核酸序列；和
ii)载体，其包含编码如段落3中定义的第二多肽的核酸序列。
22.根据段落21的试剂盒，其还包含包括编码嵌合抗原受体的核酸序列的载体。
23.试剂盒，其包含：
i)载体，其包含编码如段落1至10中任一项定义的嵌合跨膜蛋白的核酸序列；和
ii)载体，其包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。
24.制备根据段落11至13中任一项的细胞的方法，其包括将以下项引入细胞的步骤：根据段落14的核酸序列；根据段落15至18中任一项的核酸构建体；根据段落19或20的载体；或根据段落21至23中任一项的载体的试剂盒。
25.根据段落24的方法，其中所述细胞来自从受试者分离的样品。
26.药物组合物，其包含多个根据段落11至13中任一项的细胞。
27.治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据段落26的药物组合物施用至受试者的步骤。
28.根据权利要求27的方法，其包括以下步骤：
(i)从受试者分离含细胞的样品；
(ii)用以下项转导或转染所述细胞：根据段落14的核酸序列；根据段落15至18中任一项的核酸构建体；根据段落19或20的载体；或根据段落21至23中任一项的载体的试剂盒。
(iii)将来自(ii)的细胞施用至受试者。
29.根据段落28的方法，其中所述样品是含有T细胞的样品。
30.根据段落28或29的方法，其中所述疾病是癌症。
31.根据段落26的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
32.根据段落11至13中任一项的细胞在制造用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
发明详述
嵌合细胞因子受体(CCR)
嵌合细胞因子受体(CCR)是包含细胞因子受体胞内域和异源配体结合外域(exodomain)的分子。异源配体结合外域结合除衍生胞内域的细胞因子受体选择性针对的细胞因子以外的配体。以这种方式，可以通过移植异源结合特异性改变细胞因子受体的配体特异性。
嵌合细胞因子受体包含：
(i)配体结合外域；
(ii)任选地间隔区；
(iii)跨膜结构域；和
(iv)细胞因子受体胞内域。
细胞因子受体和信号传导
细胞因子受体超家族的成员调节许多细胞功能。这些受体的信号传导依赖于它们与Janus激酶(JAK)的结合，其将配体结合与募集到受体复合物的信号传导蛋白的酪氨酸磷酸化偶联。在这些之中是信号传导子和转录活化子(STAT)，这是促成细胞因子应答多样性的转录因子家族。
当本发明的嵌合细胞因子受体结合其配体时，可以启动一个或多个以下细胞内信号传导途径：
(i)JAK-STAT途径
(ii)MAP激酶途径；和
(iii)磷酸肌醇3-激酶(PI3K)途径。
JAK-STAT系统由三个主要组分组成：(1)受体(2)Janus激酶(JAK)和(3)信号转导子和转录激活子(STAT)。
具有酪氨酸激酶活性的JAK与细胞表面细胞因子受体结合。配体与受体的结合触发JAK的活化。随着激酶活性的增加，它们磷酸化受体上的酪氨酸残基并创建与含有结合磷酸酪氨酸的SH2结构域的蛋白相互作用的位点。具有能够结合这些磷酸酪氨酸残基的SH2结构域的STAT募集到受体，并且它们本身被JAK酪氨酸磷酸化。然后这些磷酸酪氨酸作为其他STAT的SH2结构域的结合位点，介导它们的二聚化。不同的STAT形成异或同二聚体。活化的STAT二聚体在细胞核中积累并激活其靶基因的转录。
细胞因子受体胞内域
本发明的嵌合细胞因子受体包含当外域结合其配体时引起“细胞因子型”细胞信号传导(单独或当存在另一种嵌合细胞因子受体时)的胞内域。
胞内域可以是细胞因子受体胞内域。
胞内域可以来源于I型细胞因子受体。I型细胞因子受体共享在邻近细胞膜的细胞外部分中共同的氨基酸基序(WSXWS)。
胞内域可以来源于II型细胞因子受体。II型细胞因子受体包括结合I型和II型干扰素的那些，以及结合白细胞介素-10家族成员(白细胞介素-10，白细胞介素-20和白细胞介素-22)的那些。
I型细胞因子受体包括：
(i)白细胞介素受体，例如IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-9，IL-11，IL-12，IL13，IL-15，IL-21，IL-23和IL-27的受体；
(ii)集落刺激因子受体，例如促红细胞生成素，GM-CSF和G-CSF的受体；和
(iii)激素受体/神经肽受体，例如激素受体和催乳素受体
I型细胞因子受体家族的成员包含不同的链，其中一些参与配体/细胞因子相互作用而其它参与信号传导。例如，IL-2受体包含α-链，β-链和γ-链。
在IL-2受体，IL-4受体，IL-7受体，IL-9受体，IL-13受体和IL-15受体之间共享IL-2受体共同γ链(也称为CD132)。
IL-2
IL-2结合IL-2受体，其具有三种形式，由三种不同蛋白(通常称为“链”)的不同组合生成：α，β和γ，这些亚基也是其他细胞因子受体的一部分。IL-2R的β和γ链是I型细胞因子受体家族的成员。
三种受体链在不同细胞类型上独立和不同地表达，并且可以以不同的组合和顺序组装以生成低，中，高亲和力IL-2受体。
α链以低亲和力结合IL-2，β和γ一起的组合形成以中等亲和力结合IL-2的复合物，主要在记忆T细胞和NK细胞上；并且所有三种受体链形成复合物，其在活化的T细胞和调节性T细胞上以高亲和力(Kd约10-11M)结合IL2。
三种IL-2受体链跨越细胞膜并延伸到细胞中，从而将生化信号传递到细胞内部。α链不参与信号传导，但β链与酪氨酸磷酸酶JAK1复合。相似地，γ链与称为JAK3的另一种酪氨酸激酶复合。这些酶被IL-2与IL-2R的外部结构域的结合所激活。
当初始T细胞也被抗原刺激时，IL-2信号传导促进T细胞分化为效应T细胞和记忆T细胞。通过它们在T细胞免疫记忆的形成(其依赖于抗原选择的T细胞克隆的数量的扩增和功能)中的作用，它们在长期的细胞介导的免疫中也具有关键作用。
本发明的嵌合细胞因子受体可以包含IL-2受体β链和/或IL-2受体(即共同)γ链
IL-2β链和共同γ链的胞内域的氨基酸序列如SEQ ID No.1和2所示
SEQ ID No.1：来源于人共同γ链的胞内域：
ERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIPPKGGALGEGPGASPCNQHSPYWAPPCYTLKPET
SEQ ID No.2：来源于人IL-2Rβ的胞内域：
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
术语“来源于”表示本发明的嵌合细胞因子受体的胞内域具有与内源性分子的野生型序列，或其保留与JAK-1或JAK-3形成复合物并激活上述信号传导途径之一的能力的变体的相同的序列。
与野生型序列(例如SEQ ID No.1或2)具有至少80，85，90，95，98或99％序列同一性的“变体”序列，条件是变体序列保留野生型序列的功能，即与JAK-1或JAK-3形成复合物并激活例如JAK-STAT信号传导途径的能力。
两个多肽序列之间的同一性百分比可以容易地通过诸如在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov上免费获得的BLAST程序来确定。
IL-7
白细胞介素-7受体由两条链组成：白细胞介素-7受体-α链(CD127)和共同-γ链受体(CD132)。共同-γ链受体是多种细胞因子共享，包括白细胞介素-2，-4，-9和-15。白细胞介素-7受体在多种细胞类型上表达，包括幼稚和记忆T细胞。
白细胞介素7受体在淋巴细胞的发育中起关键作用，特别是在V(D)J重组中。IL-7R还控制STAT5和组蛋白乙酰化对含有T细胞受体γ基因的基因组的区域的可接近性。小鼠中的敲除研究表明，在T淋巴细胞的分化和激活过程中阻断细胞凋亡是这种蛋白质的基本功能。
本发明的嵌合细胞因子受体可以包含IL-7受体α链和/或IL-7受体(即共同)γ链，或其变体。
IL-7α链的胞内域的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
SEQ ID No.3-来源于人IL-7Rα的胞内域
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
IL-15
白细胞介素15(IL-15)是与IL-2具有结构相似性的细胞因子。像IL-2一样，IL-15与IL-2/IL-15受体β链(CD122)和共同γ链(γ-C，CD132)组成的复合物结合并进行信号传导。IL-15由病毒感染后的单核吞噬细胞(和一些其它细胞)分泌。IL-15诱导天然杀伤细胞的细胞增殖。
白细胞介素-15受体由白细胞介素15受体α亚基组成并与IL-2受体共享共同的β和γ亚基。
间隔区
本发明的嵌合细胞因子受体可以包含间隔区，以将抗原结合结构域与跨膜结构域连接，并将抗原结合结构域与胞内域在空间上分开。柔性间隔区允许抗原结合结构域在不同的方向上定向以实现抗原结合。
在本发明的细胞包含两个或更多个嵌合细胞因子受体的情况下，间隔区可以相同或不同。在本发明的细胞包含嵌合细胞因子受体(CCR)和嵌合抗原受体(CAR)的情况下，CCR和CAR的间隔区可以不同，例如具有不同的长度。CAR的间隔区可以比CCR或每个CCR的间隔区长。
间隔区序列可以例如包含IgG1 Fc区，IgG1铰链或CD8茎部。接头可以备选地包含备选接头序列，其具有与IgG1 Fc区域，IgG1铰链或CD8茎部相似的长度和/或结构域间隔特性。
可以改变人IgG1间隔区以去除Fc结合基序。
这些间隔区的氨基酸序列的实例如下给出：
SEQ ID No.4(人IgG1的铰链-CH2CH3)
AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD
SEQ ID No.5(人CD8茎部):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI
SEQ ID No.6(人IgG1铰链):
AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK
跨膜结构域
跨膜结构域是CCR中跨越膜的序列。其可以包含疏水性α螺旋。跨膜结构域可以来源于CD28，其产生良好的受体稳定性。
或者，跨膜结构域可以来源于细胞因子受体，例如衍生胞内域的相同细胞因子。
跨膜结构域可以例如来源于IL-2R，IL-7R或IL-15R。
SEQ ID No.7-来源于人共同γ链的跨膜:
VVISVGSMGLIISLLCVYFWL
SEQ ID No.8-来源于人IL-2Rβ的跨膜:
IPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLI
SEQ ID No.9-来源于人IL-7Rα的跨膜:
PILLTISILSFFSVALLVILACVLW
SEQ ID No.10-来源于人IL-15Rα的跨膜:
AISTSTVLLCGLSAVSLLACYL
配体结合外域
配体结合结构域包含抗原结合结构域。抗原结合结构域结合CCR的靶抗原，例如肿瘤分泌因子或细胞因子或细胞表面抗原。
本领域已知许多抗原结合结构域，包括基于抗体，抗体模拟物和T细胞受体的抗原结合位点的那些。例如，抗原结合结构域可以包含：源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)；来自靶抗原的天然受体的结合结构域；对靶配体具有足够亲和力的肽；单域结合子如骆驼的(camelid)；单一人工结合子例如Darpin；或来源于T细胞受体的单链。
术语“配体”与“抗原”同义使用，意指被CCR的抗原结合结构域特异性识别和结合的实体。
在配体是肿瘤分泌因子的情况下，抗原结合结构域可以包含基于免疫球蛋白的抗原结合位点，例如scFv或单域结合子。
当配体是趋化因子的情况下，抗原结合结构域可以包含趋化因子的天然受体的趋化因子结合部分。
配体
本发明的CCR结合配体。
配体可以是可溶性配体例如肿瘤分泌因子或趋化因子。
或者，配体可以是膜结合配体，例如细胞表面抗原。
术语“可溶性配体”用于表示不是细胞的一部分或不附着于细胞，但其在细胞外空间中自由移动(例如在感兴趣的组织的体液中)的配体或抗原。这些可溶性配体可以在个体的血清，血浆或其他体液中以无细胞状态存在。
可溶性配体可以与特定疾病例如癌症的存在或病理学相关。
可溶性配体可以是癌症分泌物组，即肿瘤分泌的因子的集合的一部分，由癌症干细胞，非干细胞或周围基质分泌。可溶性配体可以由肿瘤细胞分泌或脱落(参见以下小节)。
可溶性配体可以是疾病或患病组织特征性的。在患有疾病的受试者相对于健康受试者中，或在患病组织相对于健康组织中，其可以是排他性存在，或以较高的水平存在。在患有疾病的受试者相对于健康受试者，或在患病组织相对于健康组织中，可溶性配体可以以高至少2倍，5倍，10倍，100倍，1000倍，10,000倍或100,000倍的水平表达。
术语“细胞表面抗原”和“细胞表面配体”与“膜结合抗原”和“膜结合配体”同义使用，以表示附着于细胞表面上或在细胞表面上表达的配体。细胞表面配体可以是例如跨膜蛋白。
上面存在细胞表面配体的细胞可以是靶细胞，如癌细胞。
细胞表面配体可以与特定疾病如癌症的存在或病理有关。或者，细胞表面配体可以是靶细胞(例如B细胞)的细胞类型特征性的，而不一定与疾病状态相关联。
在细胞表面配体是疾病或患病组织特征性的情况下，其可以排他性存在，或在患有疾病的受试者相对于健康受试者的相关细胞；或患病组织相对于健康组织上以较高水平存在。在患有疾病的受试者相对于健康受试者，或在患病组织相对于健康组织中，细胞表面配体可以以高至少2倍，5倍，10倍，100倍，1000倍，10,000倍或100,000倍的水平表达。
肿瘤分泌因子
由CCR识别的配体可以是由肿瘤分泌或脱落的可溶性配体。
该“肿瘤分泌因子”可以是例如前列腺特异性抗原(PSA)，癌胚抗原(CEA)，血管内皮生长因子(VEGF)或癌抗原-125(CA-125)。
肿瘤分泌因子可以是非细胞因子的可溶性配体。因此，本发明的CCR将非细胞因子配体的结合特异性移植到细胞因子受体的胞内域上。
前列腺特异性抗原(PSA)
可溶性配体可以是前列腺特异性抗原(PSA)。
前列腺特异性抗原(PSA)，也称为γ-精浆蛋白或激肽释放酶-3(KLK3)，是由KLK3基因在人体内编码的糖蛋白酶。PSA是激肽释放酶相关肽酶家族的成员，并由前列腺的上皮细胞分泌。
PSA在具有健康前列腺的男性的血清中以少量存在，但是在患有前列腺癌和其他前列腺疾病的个体中升高。
PSA是237个残基的糖蛋白，并被KLK2激活。它的生理作用是精液凝固成分的液化，其导致精子的释放。在癌症中，PSA可以参与肿瘤生长和转移的过程。
PSA是胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，具有典型的His-Asp-Ser三联体和与其他激肽释放酶相关肽酶的催化结构域类似的催化结构域。已经获得了PSA晶体结构：i)与单克隆抗体(mAb)8G8F5的复合物；和ii)与两种mAbs5D5A5和5D3D11的三明治式复合物中(Sturaet al(J.Mol.Biol.(2011)414:530-544)。
各种单克隆抗体是已知的，包括在Bavat et al AvicennaJ.Med.Biotechnol.2015,7:2-7；和Leinonen(2004)289:157-67中描述的克隆2G2-B2，2D8-E8，IgG1/K。
本发明的CCR可以例如包含来自PSA结合mAb如8G8F5，5D5A5或5D3D11的6个CDR或VH和/或VL结构域。
在CCR包含两种抗原结合特异性，结合PSA上的不同表位的情况下，一个可以基于例如5D3D11，且一个可以基于例如5D5A5。
以下给出5D3D11和5D5A5 VH和VL的氨基酸序列。互补决定区(CDR)以粗体突出显示。
5D3D11 VH(SEQ ID No.11)
Figure BDA0002244046900000191
5D3D11 VL(SEQ ID No.12)
5D5A5 VH(SEQ ID No.13)
Figure BDA0002244046900000193
5D5A5 VL(SEQ ID No.14)
Figure BDA0002244046900000194
基于5D5A5的ScFv(SEQ ID No.15)
QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKTSGYSFSSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTENNQKFKDKVTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARSGRLYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPPSLAVSLGQRATISCRASESIDLYGFTFMHWYQQKPGQPPKILIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQTHEDPYTFGGGTKLEIK
基于5D3D11的ScFv(SEQ ID No.16)
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKVSGYAISSSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTKYNGKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSVDSAVYFCARDGYRYYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTAPSVFVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPVTFGAGTKVEIK
在细胞包含两个CCR的情况下，第一CCR的抗原结合结构域可以包含来自5D5A5的6个CDR，并且第二CCR的抗原结合结构域可以包含来自5D3D11的6个CDR，
第一CAR的抗原结合结构域可以包含来自5D5A5的VH和/或VL结构域或其变体；并且第二CAR的抗原结合结构域可以包含来自5D3D11的VH和/或VL结构域或其变体。变体VH和VL结构域可以与以上给出的序列具有至少80，90，95或99％的同一性，条件是它们保留PSA结合活性。
表达结合PSA的CCR的细胞可以在前列腺癌的治疗中有用。
癌胚抗原(CEA)
可溶性配体可以是CEA。
癌胚抗原(CEA)描述了参与细胞粘附的一组高度相关的糖蛋白。CEA通常在胎儿发育期间在胃肠组织中产生，但在出生前停止产生。因此，CEA通常仅在健康成年人的血液中呈现非常低的水平。然而，在某些类型的癌症中血清水平升高，这意味着它可以在临床测试中用作肿瘤标志物。
CEA是糖基磷脂酰肌醇(GPI)细胞表面锚定的糖蛋白，其特化的唾液酸糖基化糖型作为功能性结肠癌L-选择素和E-选择素配体，其对于结肠癌细胞的转移性播散可以是关键的。在免疫学上它们被鉴定为CD66分化簇的成员。
CEA和相关基因组成属于免疫球蛋白超家族的CEA家族。在人类中，癌胚抗原家族由29个基因组成，其中18个正常表达。以下是编码癌胚抗原相关细胞粘附蛋白的一批人类基因：CEACAM1,CEACAM3,CEACAM4,CEACAM5,CEACAM6,CEACAM7,CEACAM8,CEACAM16,CEACAM18,CEACAM19，CEACAM20，CEACAM21。
靶向CEA的各种抗体描述于WO 2011/034660中。
表达针对CEA的CCR的细胞可以在例如结直肠癌的治疗中有用。
血管内皮生长因子(VEGF)
可溶性配体可以是VEGF。
血管内皮生长因子(VEGF)是由细胞产生的信号蛋白，其刺激血管发生和血管生成。当血液循环不足时，其是恢复组织氧气供应的系统的一部分。在支气管哮喘和糖尿病中VEGF的血清浓度高。VEGF的正常功能是产生在胚胎发育过程中新的血管，损伤后的新血管，运动后的肌肉，以及绕过阻塞的血管的新血管(侧支循环)。
当VEGF过度表达时，其可以有助于疾病。如果没有足够的血液供应，实体癌症不能生长超过有限的大小；能够表达VEGF的癌症能够生长和转移。
VEGF是胱氨酸结生长因子的血小板衍生生长因子家族的亚家族。它们是参与血管发生(胚胎循环系统的从头形成)和血管生成(从预先存在的血管系统的血管生长)的重要信号传导蛋白。
在哺乳动物中VEGF家族包含五个成员：VEGF-A，胎盘生长因子(PGF)，VEGF-B，VEGF-C和VEGF-D。
已知各种针对VEGF的抗体，例如贝伐单抗(Avastin)和Ranibizumab(Lucentis)。
癌症抗原125(CA-125)
CA-125与卵巢癌相关，且是卵巢癌检测最常用的生物标志物。尽管CA-125是最有名的卵巢癌标志物，其也可以在其它癌症(包括子宫内膜癌，输卵管癌，肺癌，乳腺癌和胃肠癌)中升高。
人CA-125(也称为粘蛋白-16)的序列可从NCBI，登录号078966获得。
许多结合CA125的单克隆抗体是已知的，包括OC125和M11(Nustad et al1996,Tumour Biol.17:196-329)。在这项研究中，研究了针对CA 125抗原的26种单克隆抗体的特异性。发现CA 125抗原仅携带两个主要抗原结构域，其将抗体分类为OC125样(组A)或M11样(组B)。
本发明的嵌合细胞因子受体可以包含来自此类抗体的抗原结合结构域。包含此类CCR的细胞可以在例如卵巢癌的治疗中有用。
肿瘤分泌因子(或者，如果以膜结合形式，则是跨膜蛋白)可以选自以下非详尽列表：
ALK基因重排和过表达产生突变形式的ALK蛋白
甲胎蛋白(AFP)
β-2-微球蛋白(B2M)
β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)
产生突变的B-REF蛋白的BRAF V600突变
c-kit/CD117
CA15-3/CA27.29
CA19-9
降钙素
CD20
嗜铬粒蛋白A(CgA)
细胞角蛋白片段21-1
EGFR基因突变分析
雌激素受体(ER)/孕酮受体(PR)
纤维蛋白/纤维蛋白原
HE4
HER2/neu基因扩增或蛋白过表达
免疫球蛋白
KRAS基因突变分析
乳酸脱氢酶
神经元特异性烯醇酶(NSE)
核基质蛋白22
程序性死亡配体1(PD-L1)
甲状腺球蛋白
尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)和纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)
趋化因子
趋化因子是趋化性细胞因子。细胞迁移受嵌入并固定化在细胞外基质中的趋化因子梯度的引导。带正电的趋化因子如CXCL12与带负电荷的ECM分子结合。这些梯度为癌细胞和免疫细胞归巢提供了轨道。对T细胞的作用似乎抑制细胞毒性T细胞的归巢，而似乎吸引调节性T细胞。
趋化因子的质量约为8-10千道尔顿，在保守位置有四个半胱氨酸残基，其是形成其三维形状的关键。
一些趋化因子被认为是促炎性的并且可以在免疫反应过程中被诱导以将免疫系统的细胞募集到感染部位，而另一些则被认为是稳态的并参与控制在组织维持或发育的正常过程中的细胞迁移。
趋化因子已被分为四个主要亚家族：CXC，CC，CX3C和XC。所有这些蛋白质都通过与选择性存在于其靶细胞表面上的称为趋化因子受体的G蛋白连接的跨膜受体相互作用来发挥其生物学作用。
趋化因子的主要作用是作为化学引诱物来引导细胞迁移。被趋化因子吸引的细胞遵循朝向趋化因子源增加的趋化因子浓度的信号。一些趋化因子在免疫监视过程中控制免疫系统的细胞，例如将淋巴细胞引导到淋巴结，因此它们能够通过与存在于这些组织中的抗原呈递细胞相互作用来筛选病原体的侵袭。其他趋化因子是炎性的并且响应于细菌感染，病毒和其它媒介物而从极其多种细胞中释放。它们的释放通常由促炎细胞因子例如白细胞介素1刺激。炎性趋化因子主要作为白细胞的化学引诱物，从血液募集单核细胞，嗜中性粒细胞和其他效应细胞到感染部位或组织损伤部位。某些炎性趋化因子激活细胞以启动免疫应答或促进伤口愈合。它们由许多不同的细胞类型释放，并作用于引导先天免疫系统和适应性免疫系统两者的细胞。
CC趋化因子
CC趋化因子(或β-趋化因子)蛋白在其氨基末端附近具有两个相邻的半胱氨酸(氨基酸)。对于哺乳动物已经报道了该亚组至少27个不同的成员，称为CC趋化因子配体(CCL)-1至-28；CCL10与CCL9相同。该亚家族的趋化因子通常含有四个半胱氨酸(C4-CC趋化因子)，但少数CC趋化因子具有六个半胱氨酸(C6-CC趋化因子)。C6-CC趋化因子包括CCL1，CCL15，CCL21，CCL23和CCL28。CC趋化因子诱导单核细胞和其他细胞类型如NK细胞和树突细胞的迁移。
CC趋化因子的实例包括单核细胞化学引诱物蛋白-1(MCP-1或CCL2)，其诱导单核细胞离开血流并进入周围组织以成为组织巨噬细胞。
CCL5(或RANTES)吸引表达受体CCR5的细胞如T细胞，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
CXC趋化因子
CXC趋化因子(或α-趋化因子)的两个N-末端半胱氨酸被一个氨基酸隔开，在该名称中用“X”表示。已经在哺乳动物中描述了17种不同的CXC趋化因子，其被细分为两类，在CXC基序的第一个半胱氨酸之前立即具有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(或简写为ELR)的特定氨基酸序列(或基序)(ELR阳性)的那些和没有ELR基序(ELR阴性)的那些。ELR阳性CXC趋化因子特异性地诱导嗜中性粒细胞的迁移，并与趋化因子受体CXCR1和CXCR2相互作用。
C趋化因子
第三组趋化因子称为C趋化因子(或γ趋化因子)，并且不同于所有其它趋化因子，因为它只有两个半胱氨酸；一个N-末端半胱氨酸和一个下游半胱氨酸。已经描述了这个亚组的两种趋化因子，称为XCL1(淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)-α)和XCL2(淋巴细胞趋化因子-β)。
CX3C趋化因子
CX3C趋化因子在两个半胱氨酸之间具有三个氨基酸。迄今为止发现的唯一CX3C趋化因子称为fractalkine(或CX3CL1)。它既被分泌，也被栓系在表达它的细胞表面，从而起到化学引诱物和粘附分子两者的作用。
趋化因子受体是包含在白细胞表面上发现的7个跨膜结构域的G蛋白偶联受体。迄今为止已经表征了大约19种不同的趋化因子受体，根据它们所结合的趋化因子的类型将其分为四个家族；结合CXC趋化因子的CXCR，结合CC趋化因子的CCR，结合唯一CX3C趋化因子(CX3CL1)的CX3CR1和结合两种XC趋化因子(XCL1和XCL2)的XCR1。它们共享许多结构特征；它们在大小上相似(具有约350个氨基酸)，具有短的酸性N-末端，具有三个细胞内和三个细胞外亲水环的七螺旋跨膜结构域，以及含有对受体调节重要的丝氨酸和苏氨酸残基的细胞内C末端。趋化因子受体的前两个细胞外环各自具有保守的半胱氨酸残基，其允许在这些环之间形成二硫桥。G蛋白与趋化因子受体的C末端偶联以允许受体活化后的细胞内信号传导，而趋化因子受体的N末端结构域决定配体结合特异性。
CXCL12
CXCL12对淋巴细胞具有强趋化性。CXCL12通过CXCR4依赖性机制通从骨髓募集内皮祖细胞(EPC)在血管生成中起重要作用。正是CXCL12的该功能使其成为肿瘤发生和与肿瘤发展相关的新血管形成的非常重要的因素。CXCL12在肿瘤转移中也有作用，其中表达受体CXCR4的癌细胞吸引到释放配体CXCL12的转移靶组织。
CXCL12的受体是CXCR4。本发明的CCR可以包含与来源于细胞因子受体(例如IL-2受体)的胞内域连接的来自CXCR4的CXCL12结合结构域。
CXCR4偶联的IL2表达将支持治疗性T细胞的植入用于癌症疗法。在多发性骨髓瘤中，表达此类CCR的细胞可以动员细胞并改变骨髓环境。此类细胞还通过修饰实体肿瘤微环境在实体癌症的治疗中具有用途。
CXCR4的氨基酸序列在以下显示为SEQ ID No.17
SEQ ID No.17
Figure BDA0002244046900000251
CXCR7也结合CXCL12。
CCL2
趋化因子(C-C基序)配体2(CCL2)也被称为单核细胞趋化蛋白1(MCP1)和小的可诱导细胞因子A2。CCL2募集单核细胞，记忆T细胞和树突状细胞到由组织损伤或感染产生的炎症的部位。
CCR2和CCR4是结合CCL2的两种细胞表面受体。
CCR2具有如SEQ ID No.18所示的氨基酸序列
SEQ ID No.18
Figure BDA0002244046900000252
Figure BDA0002244046900000261
CCR4具有如SEQ ID No.19所示的氨基酸序列。
SEQ ID No.19
Figure BDA0002244046900000262
本发明的CCR在其配体结合结构域中可以包含CCR2或CCR4的CCL2结合位点。
细胞表面抗原
配体可以是细胞表面抗原，例如跨膜蛋白。
细胞表面抗原可以是CD22。
CD22或分化簇22是属于SIGLEC凝集素家族的分子。它存在于成熟的B细胞表面，和在一些未成熟的B细胞上以较少程度存在。一般来说，CD22是防止免疫系统过度激活和自身免疫性疾病发展的调控分子。
CD22是糖结合跨膜蛋白，其通过定位在其N末端的免疫球蛋白(Ig)结构域特异性结合唾液酸。Ig结构域的存在使得CD22成为免疫球蛋白超家族的成员。CD22作为B细胞受体(BCR)信号传导的抑制性受体起作用。
在非霍奇金和其他淋巴瘤中可见增加的CD22表达。靶向CD22的各种单克隆抗体是已知的，包括依帕珠单抗(epratuzumab)，伊珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)，m971和m972。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明的细胞可以包含一个或多个嵌合抗原受体。CAR可以对于肿瘤相关抗原特异性。
经典CAR是嵌合I型跨膜蛋白，其将细胞外抗原识别结构域(结合子)连接至细胞内信号传导结构域(胞内域)。所述结合子通常是衍生自单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)，但其可以基于包含抗体样或基于配体的抗原结合位点的其它形式。跨膜结构域将蛋白锚定于细胞膜中并将间隔区连接至胞内域。
早期CAR设计具有衍生于FcεR1的γ链或CD3ζ的细胞内部分的胞内域。因此，这些第一代受体传输免疫信号1，其足以触发T细胞杀伤关联(cognate)靶细胞，但不能完全活化T细胞以增殖和存活。为了克服这一限制，已经构建了复合胞内域：T细胞共刺激分子的细胞内部分与CD3ζ的细胞内部分融合，产生第二代受体，其可以在抗原识别之后同时传递激活且共刺激的信号。最常用的共刺激结构域是CD28的共刺激结构域。这提供了最强力的共刺激信号-即免疫信号2，其触发T细胞增殖。还描述了一些受体，其包括TNF受体家族胞内域，例如密切相关的OX40和41BB，其传输存活信号。现在已经描述了甚至更强力的第三代CAR，其具有能够传输活化，增殖和存活信号的胞内域。
可以使用例如逆转录病毒载体将CAR编码核酸转移到T细胞。以这种方式，可以产生大量抗原特异性T细胞用于过继细胞转移。当CAR结合靶抗原时，这导致激活信号传输到上面有其表达的T细胞上。因此，CAR将T细胞的特异性和细胞毒性引导至表达靶向抗原的细胞。
本发明的细胞可以包含一个或多个CAR。
CAR可以包含抗原结合结构域，间隔区结构域，跨膜结构域和胞内域。胞内域可以包含传输T细胞活化信号的结构域或与其缔合。
CAR抗原结合结构域
抗原结合结构域是CAR中识别抗原的部分。
许多抗原结合结构域是本领域已知的，包括基于抗体，抗体模拟物和T细胞受体的抗原结合位点的抗原结合结构域。例如，抗原结合结构域可以包含：衍生于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)；靶抗原的天然配体；具有对靶标足够亲和力的肽；单结构域结合子例如骆驼的；人工结合子单一作为Darpin；或来源于T细胞受体的单链。
术语“配体”与“抗原”同义使用以表示由CAR的抗原结合结构域特异性识别并结合的实体。
细胞表面抗原
CAR可以识别细胞表面抗原，即实体，例如在靶细胞例如肿瘤细胞的表面上表达的跨膜蛋白。
CAR可以特异性结合肿瘤相关细胞表面抗原。
各种肿瘤相关抗原(TAA)是已知的，其中一些示于以下表1中。本发明中使用的抗原结合结构域可以是能够结合TAA的结构域，如其中指出。
表1
癌症类型 TAA
弥散性大B细胞淋巴瘤 CD19,CD20,CD22
乳腺癌 ErbB2,MUC1
AML CD13,CD33
成神经细胞瘤 GD2,NCAM,ALK,GD2
B-CLL CD19,CD52,CD160
结直肠癌 叶酸结合蛋白,CA-125
慢性淋巴细胞性白血病 CD5,CD19
胶质瘤 EGFR,波形蛋白
多发性骨髓瘤 BCMA,CD138
肾细胞癌 碳酸酐酶IX,G250
前列腺癌 PSMA
肠癌 A33
在CAR识别B细胞淋巴瘤或白血病抗原(例如CD19，CD20，CD52，CD160或CD5)的情况下，CCR可以识别另一B细胞抗原，例如CD22。
前列腺癌相关抗原
CAR可以特异性结合与前列腺癌相关的细胞表面抗原，例如前列腺干细胞抗原(PSCA)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
PSCA是糖基磷脂酰肌醇锚定的细胞膜糖蛋白。其在大部分前列腺癌中上调，并在膀胱癌和胰腺癌中也检测到。
已知多种抗PSCA抗体，例如7F5(Morgenroth et al(Prostate(2007)67:1121-1131)；1G8(Hillerdal et al(2014)BMC Cancer 14:30)；和Ha1-4.117(Abate-Daga et al(2014)25:1003-1012)。
本发明的表达CCR的细胞还可以表达抗PSCA CAR，其可以包含基于这些抗体之一的抗原结合结构域。
PSMA是驻留在膜中的锌金属酶。PSMA在人类前列腺中强烈表达，比大多数其他组织中的表达高百倍。在癌症中，其表达上调，并被称为前列腺癌中第二上调的基因，与非癌性前列腺相比增加8至12倍。除了在人类前列腺癌和前列腺癌中的表达之外，还发现PSMA在所有类型的实体瘤例如肾，乳腺，结肠等的肿瘤新血管系统中高度表达，但不在正常血管系统中表达。
已知多种抗PSMA抗体，例如7E11，J591，J415和Hybritech PEQ226.5和PM2J004.5，其各自结合PSMA的不同表位(Chang et al(1999)Cancer Res15:3192-8)。
本发明的表达CCR的细胞还可以表达抗PSMA CAR，其可以包含基于这些抗体之一的抗原结合结构域
例如，CCR可以包含基于J591的scFv，其具有如SEQ ID No.20所示的序列。
SEQ ID No.20(J591scFv)
EVQLQQSGPELKKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKR
CAR跨膜结构域
跨膜结构域是CAR中跨越膜的序列。其可以包含疏水性α螺旋。CAR跨膜结构域可以来自CD28，其产生良好的受体稳定性。
CAR信号肽
本文所述的CAR和CCR可以包含信号肽，使得当其在细胞例如T细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面，其在那里表达。
信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。信号肽可以以氨基酸的短正电荷区段开始，这有助于在移位期间强制多肽的适当拓扑学。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。
信号肽可以在分子的氨基末端。
信号肽可以包含如SEQ ID No.21,22或23所示的序列或具有5、4、3、2或1个氨基酸突变(插入，取代或添加)的其变体，条件是信号肽仍然发挥功能以引起CAR的细胞表面表达。
SEQ ID No.21：MGTSLLCWMALCLLGADHADG
SEQ ID No.21的信号肽是紧凑且高效的，并且衍生于TCRβ链。预期在末端甘氨酸后可产生约95％的切割，产生由信号肽酶的有效去除。
SEQ ID No.22：MSLPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID No.22的信号肽衍生于IgG1。
SEQ ID No.23：MAVPTQVLGLLLLWLTDARC
SEQ ID No.23的信号肽衍生于CD8a。
CAR胞内域
胞内域是经典CAR的部分，其位于膜的细胞内侧。
胞内域是经典CAR的信号传输部分。在抗原结合结构域的抗原识别后，个体CAR分子簇集，天然CD45和CD148从突触中排除且信号传输至细胞。
CAR胞内域可以是或包含细胞内信号传导结构域。在替代实施方案中，本CAR的胞内域可以能够与存在于细胞质中的细胞内信号传导分子相互作用，导致信号传导。
细胞内信号传导结构域或单独的细胞内信号传导分子可以是或包含T细胞信号传导结构域。
最普遍使用的信号传导结构域是含有3个ITAM的CD3-zeta胞内域的。这在抗原结合后将活化信号传输至T细胞。CD3-zeta可以不提供完全有能力的活化信号，并且可以需要另外的共刺激信号。例如，嵌合CD28和OX40可以与CD3-Zeta一起使用以传输增殖/存活信号，或者所有三种可以一起使用。
CAR可以包含仅CD3-Zeta胞内域，CD3-Zeta胞内域与CD28或OX40的胞内域，或者CD28胞内域和OX40和CD3-Zeta胞内域。
CAR胞内域可以包含一种或多种以下项：ICOS胞内域，CD27胞内域，BTLA胞内域，CD30胞内域，GITR胞内域和HVEM胞内域。
胞内域可以包含如SEQ ID No.24至32所示的序列或具有至少80％序列同一性的其变体。
SEQ ID No.24-CD3 Z胞内域
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.25-CD28和CD3 Zeta胞内域
SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.26-CD28,OX40和CD3 Zeta胞内域
SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.27–ICOS胞内域
CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
SEQ ID No.28-CD27胞内域
QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPSEQ ID No.29-BTLA胞内域
RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS
SEQ ID No.30-CD30胞内域
HRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK
SEQ ID No.31-GITR胞内域
QLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV
SEQ ID No.32-HVEM胞内域
CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH
变体序列可以与SEQ ID No.24至32具有至少80％，85％，90％，95％，98％或99％的序列同一性，条件是该序列提供有效的细胞内信号传导结构域。
核酸
本发明还提供编码本发明的CCR的核酸。
核酸可以具有以下结构：
AgB-spacer-TM-endo
其中
AgB1是编码CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
spacer 1是编码CCR的间隔区的核酸序列；
TM1是编码CCR的跨膜结构域的核酸序列；
endo 1是编码CCR的胞内域的核酸序列。
核酸构建体
本发明进一步提供核酸构建体，其包含编码本发明第一方面相关定义的第一CCR的第一核酸序列，和编码本发明第一方面相关定义的第二CCR的第二核酸序列。
核酸构建体可以具有以下结构：
AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-AbB2-spacer2-TM2-endo2
其中
AgB1是编码第一CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
spacer 1是编码第一CCR的间隔区的核酸序列；
TM1是编码第一CCR的跨膜结构域的核酸序列；
endo1是编码第一CCR的胞内域的核酸序列；
coexpr是使得两个CCR能够共表达的核酸序列；
AgB2是编码第二CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
spacer 2是编码第二CCR的间隔区的核酸序列；
TM2是编码第二CCR的跨膜结构域的核酸序列；
endo2是编码第二CCR的胞内域的核酸序列。
当核酸构建体在细胞例如T细胞中表达时，其编码在切割位点切割的多肽，使得第一和第二CCR在细胞表面处共表达。
第一和第二CCR可以结合相同抗原上的不同表位。
第一和第二CCR可以具有互补胞内域，例如一个来源于细胞因子受体的α或β链，且一个来源于相同细胞因子受体的γ链。
本发明还提供编码本发明的CCR和CAR的核酸构建体。此类构建体可以具有以下结构：
CCRAgB-CCRspacer-CCRTM-CCRendo-coexpr-CARAgB-CARspacer-CARTM-CARendo
或者
CARAgB-CARspacer-CARTM-CARendo-coexpr-CCRAgB-CCRspacer-CCRTM-CCRendo
其中
CCRAgB是编码CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
CCRspacer是编码CCR间隔区的核酸序列；
CCRTM是编码CCR的跨膜结构域的核酸序列；
CCRendo是编码CCR的胞内域的核酸序列；
coexpr是使得CCR和CAR能够共表达的核酸序列
CARAgB是编码CAR的抗原结合结构域的核酸序列；
CARspacer是编码CAR的间隔区的核酸序列；
CARTM是编码CAR的跨膜结构域的核酸序列；和
CARendo是编码CAR的胞内域的核酸序列。
本发明还提供编码本发明的第一和第二CCR和CAR的核酸构建体。第一和第二CCR可以结合相同抗原上的不同表位。此类构建体可以具有以下结构：
(i)CCRAgB1-CCRspacer1-CCRTM1-CCRendo1-coexpr1-CCRAgB2-CCRspacer2-CCRTM2-CCRendo2-coexpr2-CARAgB-CARspacer-CARTM-CARendo；
(ii)CCRAgB1-CCRspacer1-CCRTM1-CCRendo1-coexpr1-CARAgB-CARspacer-CARTM-CARendo-coexpr2-CCRAgB2-CCRspacer2-CCRTM2-CCRendo2；或者
(iii)CARAgB-CARspacer-CARTM-CARendo-coexpr1-CCRAgB1-CCRspacer1-CCRTM1-CCRendo1-coexpr2-CCRAgB2-CCRspacer2-CCRTM2-CCRendo2；
其中
CCRAgB1是编码第一CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
CCRspacer1是编码第一CCR的间隔区的核酸序列；
CCRTM1是编码第一CCR的跨膜结构域的核酸序列；
CCRendo1是编码第一CCR的胞内域的核酸序列；
CCRAgB2是编码第二CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
CCRspacer2是编码第二CCR的间隔区的核酸序列；
CCRTM2是编码第二CCR的跨膜结构域的核酸序列；
CCRendo2是编码第二CCR的胞内域的核酸序列；
Coexpr1和coexpr2是使得两个侧翼序列能够共表达的核酸序列；
CARAgB是编码CAR的抗原结合结构域的核酸序列；
CARspacer是编码CAR的间隔区的核酸序列；
CCRTM是编码CAR的跨膜结构域的核酸序列；和
CARendo是编码CAR的胞内域的核酸序列。
如本文所用，术语“多核苷酸”，“核苷酸”和“核酸”旨在彼此同义。
技术人员将会理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。另外，应当理解的是，技术人员可以使用常规技术进行核苷酸替换，其不影响此处描述的多核苷酸编码的多肽序列，以反映多肽在其中表达的任何特定宿主生物体的密码子选择。
根据本发明的核酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链或双链的。它们也可以是其中包含合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯骨架，在分子的3'和/或5'末端添加吖啶或多聚赖氨酸链。为了如本文所述的用途的目的，应当理解可以通过本领域可用的任何方法来修饰多核苷酸。可以进行这样的修饰以增强感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命。
与核苷酸序列相关的术语“变体”，“同源物”或“衍生物”包括对序列的一种(或多种)核酸的任何取代，修饰，置换，缺失或添加。
在上述结构中，“coexpr”是使得能够共同表达第一和第二CAR两者的核酸序列。其可以是编码切割位点的序列，使得核酸构建体产生包含通过切割位点连接的两个或更多个CCR，或CCR和CAR。切割位点可以是自切割的，从而当产生多肽时，其立即切割成单独的肽而不需要任何外部切割活性。
切割位点可以是能够使得第一和第二CCR，或CCR和CAR变得分开的任何序列。
术语“切割”在本文中为了方便而使用，但是切割位点可以通过除经典切割外的机制将肽分离成单独的实体。例如，对于口蹄疫病毒(FMDV)2A自身切割肽(参见下文)，已经提出了各种模型来解释“切割”活性：由宿主-细胞蛋白酶蛋白水解，自体蛋白水解或翻译效应(Donnelly等(2001)J.Gen.Virol.82：1027-1041)。只要当位于编码蛋白质的核酸序列之间的切割位点导致蛋白质作为单独的实体表达时，这种“切割”的确切机制对于本发明的目的并不重要。
切割位点可以是弗林蛋白酶切割位点。
弗林蛋白酶是属于枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶家族的酶。该家族的成员是将潜伏的前体蛋白加工成其生物学活性产物的前蛋白转化酶。弗林蛋白酶是钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶，其可以在它们配对的基本氨基酸加工位点有效切割前体蛋白。弗林蛋白酶底物的实例包括甲状旁腺激素原，转化生长因子β1前体，白蛋白原，β-分泌酶原，膜1型基质金属蛋白酶，神经生长因子原的β亚基和Willebrand因子。弗林蛋白酶正好在碱性氨基酸靶序列(典型地为Arg-X-(Arg/Lys)-Arg')的下游切割蛋白，并且在高尔基体中富集。
切割位点可以是烟草蚀刻病毒(TEV)切割位点。
TEV蛋白酶是高度序列特异性的半胱氨酸蛋白酶，其是糜蛋白酶样蛋白酶。它非常特异于其靶切割位点，因此经常用于体外和体内融合蛋白的受控切割。共有TEV切割位点为ENLYFQ\S(其中“\”表示被切割的肽键)。哺乳动物细胞，如人类细胞，不表达TEV蛋白酶。因此，在本核酸构建体包含TEV切割位点并且在哺乳动物细胞中表达的实施方案中，必须在哺乳动物细胞中也表达外源TEV蛋白酶。
切割位点可以编码自切割肽。
“自切割肽”是指下述肽，该肽发挥功能使得当包含蛋白质和自切割肽的多肽产生时，其立即被“切割”或分离成独特的且离散的第一和第二多肽，而不需要任何外部切割活性。
自切割肽可以是来自口蹄病毒或心脏病毒的2A自切割肽。口蹄病毒和心脏病毒的主要2A/2B切割由在其自身C末端“切割”的2A介导。在口蹄病毒例如口蹄疫病毒(FMDV)和马鼻炎A型病毒中，2A区域是约18个氨基酸的短区段，其与蛋白2B的N末端残基(保守的脯氨酸残基)一起代表了能够在介导其自身C末端“切割”的自主元件(Donelly et al(2001)，如上文)。
已经在除口蹄病毒或心脏病毒外的小核糖核酸病毒，“小RNA病毒样”昆虫病毒，C型轮状病毒，锥虫属物种中的重复序列和细菌序列中发现了“2A样”序列(Donelly et al(2001)，如上文)。切割位点可以包含这些2A样序列之一，例如：
YHADYYKQRLIHDVEMNPGP(SEQ ID No.33)
HYAGYFADLLIHDIETNPGP(SEQ ID No.34)
QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID No.35)
ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID No.36)
AARQMLLLLSGDVETNPGP(SEQ ID No.37)
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID No.38)
TRAEIEDELIRAGIESNPGP(SEQ ID No.39)
TRAEIEDELIRADIESNPGP(SEQ ID No.40)
AKFQIDKILISGDVELNPGP(SEQ ID No.41)
SSIIRTKMLVSGDVEENPGP(SEQ ID No.42)
CDAQRQKLLLSGDIEQNPGP(SEQ ID No.43)
YPIDFGGFLVKADSEFNPGP(SEQ ID No.44)
切割位点可以包含如SEQ ID No.38所示的2A样序列(RAEGRGSLLTCGDVEENPGP)。
本发明还提供了试剂盒，其包含一种或多种编码根据本发明的第一方面的第一和第二CCR，或根据本发明的一种或多种CCR和一种或多种CAR的核酸序列。
SEQ ID NO 45和46给出抗PSMA CAR和抗PSA CCR之间的融合物的完整氨基酸序列。给出小标题以标记序列的每个部分，但实际上各个元件连接成一个连续的序列。
本发明的核酸构建体编码如SEQ ID No.45或46所示的融合蛋白。
SEQ ID NO.45-具有IL-2Rβ链的示例性构建体
来源于人CD8a的信号序列：
MSLPVTALLLPLALLLHAA
scFv aPSMA(J591 H/L)
EVQLQQSGPELKKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKR
接头
SDPA
人IgG1 Fc间隔区(HCH2CH3pvaa)：
EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
来源于人CD28的跨膜：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
来源于TCRz的胞内域：
RRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
来自Thesea asigna病毒衣壳蛋白的2A肽：
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP
来源于小鼠κVIII的信号序列：
METDTLILWVLLLLVPGSTG
scFv aPSA(5D5A5H/L)：
QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKTSGYSFSSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTENNQKFKDKVTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARSGRLYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPPSLAVSLGQRATISCRASESIDLYGFTFMHWYQQKPGQPPKILIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQTHEDPYTFGGGTKLEIK
接头：
SDPA
人CD8aSTK间隔区：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI
来源于人类共同γ链的跨膜：
VVISVGSMGLIISLLCVYFWL
来源于人共同γ链的胞内域：
ERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIPPKGGALGEGPGASPCNQHSPYWAPPCYTLKPET
来自马鼻炎A病毒多蛋白的2A肽：
QCTNYALLKLAGDVESNPGP
来源于小鼠κVIII的信号序列：
METDTLILWVLLLLVPGSTG
scFv aPSA(5D3D11 H/L)：
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKVSGYAISSSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTKYNGKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSVDSAVYFCARDGYRYYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTAPSVFVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPVTFGAGTKVEIK
接头：
SDPA
人CD28STK间隔区：
KIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
来源于人IL-2Rβ的跨膜：
IPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLI
来源于人IL-2Rβ的胞内域：
NCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDALEIEACQVYFTYDPYSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPSLLGGPSPPSTAPGGSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELVLREAGEEVPDAGPREGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
SEQ ID NO.46-具有IL-7Rα链的示例性构建体
来源于人CD8a的信号序列：
MSLPVTALLLPLALLLHAA
scFv aPSMA(J591 H/L)
EVQLQQSGPELKKPGTSVRISCKTSGYTFTEYTIHWVKQSHGKSLEWIGNINPNNGGTTYNQKFEDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAAGWNFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSIICKASQDVGTAVDWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCQQYNSYPLTFGAGTMLDLKR
接头
SDPA
人IgG1Fc间隔区(HCH2CH3pvaa)：
EPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
来源于人CD28的跨膜：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
来源于TCRz的胞内域：
RRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
来自Thesea asigna病毒衣壳蛋白的2A肽：
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP
来源于小鼠κVIII的信号序列：
METDTLILWVLLLLVPGSTG
scFv aPSA(5D5A5 H/L)：
QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKTSGYSFSSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTENNQKFKDKVTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARSGRLYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPPSLAVSLGQRATISCRASESIDLYGFTFMHWYQQKPGQPPKILIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQTHEDPYTFGGGTKLEIK
接头：
SDPA
人CD8aSTK间隔区：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI
来源于人共同γ链的跨膜：
VVISVGSMGLIISLLCVYFWL
来源于人共同γ链的胞内域：
ERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSAWSGVSKGLAESLQPDYSERLCLVSEIPPKGGALGEGPGASPCNQHSPYWAPPCYTLKPET
来自马鼻炎肽A病毒多蛋白的2A肽：
QCTNYALLKLAGDVESNPGP
来源于小鼠κ VIII的信号序列：
METDTLILWVLLLLVPGSTG
scFv aPSA(5D3D11 H/L)：
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKVSGYAISSSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGDTKYNGKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSVDSAVYFCARDGYRYYFDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTAPSVFVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPVTFGAGTKVEIK
接头：
SDPA
人CD28STK间隔区：
KIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
来源于人IL-7Rα的跨膜：
PILLTISILSFFSVALLVILACVLW
来源于人IL-7Rα的胞内域：
KKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
载体
本发明还提供载体，或载体的试剂盒，其包含编码一种或多种根据本发明的第一方面的CCR和任选地一种或多种CAR的一种或多种核酸。此类载体可以用于将核酸序列引入宿主细胞中，使得其表达根据本发明的第一方面的CCR。
载体可以是例如质粒或病毒载体，例如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成mRNA。
载体可以能够转染或转导T细胞或NK细胞。
细胞
本发明提供细胞，其包含一种或多种本发明的CCR和任选地一种或多种CAR。
该细胞可以包含本发明的核酸或载体。
该细胞可以是细胞裂解性免疫细胞例如T细胞或NK细胞。
T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中发挥中心作用的淋巴细胞类型。通过细胞表面上T细胞受体(TCR)的存在，它们可以与其它淋巴细胞例如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)区分。存在多种类型的T细胞，如下文总结的。
辅助性T辅助细胞(TH细胞)在免疫学过程中辅助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞。TH细胞在其表面表达CD4。当它们通过抗原呈递细胞(APC)表面上的MHC II类分子呈递肽抗原时，TH细胞被激活。这些细胞可以分化成几种亚型之一，包括TH1，TH2，TH3，TH17，Th9或TFH，其分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。
细胞毒性T细胞(TC细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也涉及移植排斥。CTL在其表面表达CD8。这些细胞通过与存在于所有有核细胞表面上的MHC I类相关的抗原结合而识别其靶标。通过调节性T细胞分泌的IL-10，腺苷和其他分子，可以将CD8+细胞失活至无能力状态，其防止自身免疫疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎。
记忆T细胞是抗原特异性T细胞的子集，其在感染已经解决之后长期持续。它们在再次暴露于其关联抗原后迅速扩增为大量效应T细胞，从而为免疫系统提供了针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包括三种亚型：中央记忆T细胞(TCM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(TEM细胞和TEMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4+或CD8+。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。
以前称为抑制性T细胞的调节性T细胞(Treg细胞)对于维持免疫耐受性至关重要。它们的主要作用是关闭T细胞介导的免疫以朝向免疫反应的结束，和抑制逃避胸腺阴性选择过程的自身反应性T细胞。
已经描述了两种主要类型的CD4+Treg细胞，即自然发生的Treg细胞和适应性Treg细胞。
自然发生的Treg细胞(也称为CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞)出现在胸腺中，并与已经与发育中的T细胞和已经用TSLP激活的骨髓(CD11c+)和浆细胞样(CD123+)树突状细胞之间的相互作用相关。天然存在的Treg细胞可以通过称为FoxP3的细胞内分子的存在与其它T细胞区分开来。FOXP3基因的突变可以阻止调节性T细胞发育，导致致命的自身免疫性疾病IPEX。
适应性Treg细胞(也称为Tr1细胞或Th3细胞)可以在正常免疫应答期间产生。
细胞可以是自然杀伤细胞(或NK细胞)。NK细胞形成先天免疫系统一部分。NK细胞以不依赖于MHC的方式对来自病毒感染细胞的先天信号提供快速应答。
NK细胞(属于先天性淋巴细胞群)被定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并构成从产生B和T淋巴细胞的共同淋巴祖细胞分化的第三种细胞。已知NK细胞在骨髓，淋巴结，脾，扁桃体和胸腺中分化和成熟，在那里它们进入循环。
本发明的表达CCR的细胞可以是上述任何细胞类型。
根据本发明第一方面的T或NK细胞可以从患者自己的外周血(第一方)离体产生，或在来自供体外周血的造血干细胞移植(第二方)的设置中产生，或来自不相关供体的外周血(第三方)。
或者，根据本发明第一方面的T或NK细胞可以衍生自诱导型祖细胞或胚胎祖细胞离外分化为T或NK细胞。或者，可以使用保留其溶解功能并且可以用作治疗剂的永生化T细胞系。
在所有这些实施方案中，通过包括使用病毒载体转导，使用DNA或RNA转染的许多方式之一引入编码CCR或每个CCR的DNA或RNA来生成表达CCR的细胞。
本发明的细胞可以是来自受试者的离体T或NK细胞。T或NK细胞可以来自外周血单个核细胞(PBMC)样品。T或NK细胞可以在用核酸转导之前活化和/或扩增，所述核酸编码提供根据本发明的第二方面的CCR的分子，例如通过用抗CD3单克隆抗体处理。
本发明的T或NK细胞可以通过以下制备：
(i)从受试者或上文列出的其它来源分离含T或NK细胞的样品；和
(ii)用编码CCR的一种或多种核酸序列转导或转染T或NK细胞。
然后可以纯化T或NK细胞，例如通过基于抗原结合多肽的抗原结合结构域的表达进行选择。
药物组合物
本发明还涉及药物组合物，其含有多个根据本发明的细胞。
药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的药学活性多肽和/或化合物。此类剂型可以是例如以适合用于静脉内输注的形式。
治疗方法
本发明提供了治疗和/或预防疾病的方法，其包括将本发明的细胞(例如在上述药物组合物中)施用至受试者的步骤。
治疗疾病的方法涉及本发明的细胞的治疗用途。在本文中，细胞可以施用于患有现有疾病或状况的受试者，以减轻，降低或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓，降低或阻断疾病的进展。
预防疾病的方法涉及本发明的细胞的预防用途。在本文中，此类细胞可以施用于尚未感染疾病的受试者和/或没有显示任何疾病症状的受试者以预防或削弱疾病的起因或降低或预防与疾病相关的至少一种症状的形成。该受试者可以具有形成疾病的倾向，或认为有风险形成疾病。
该方法可以包括以下步骤：
(i)分离含T细胞或NK细胞的样品；
(ii)用本发明提供的核酸序列或载体转导或转染此类细胞；
(iii)将来自(ii)的细胞施用至受试者。
含T细胞或NK细胞的样品可以从受试者或其他来源(例如如上所述)分离。可以从受试者自己的外周血(第一方)，或在来自供体外周血的造血干细胞移植(第二方)的背景中，或从不相关供体的外周血(第三方)分离T细胞或NK细胞。
本发明提供本发明的表达CCR的细胞，其用于治疗和/或预防疾病。
本发明还涉及本发明的表达CCR的细胞在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
通过本发明的方法治疗和/或预防的疾病可以是癌性疾病，例如膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，肾癌(肾细胞)，白血病，肺癌，黑色素瘤，非霍奇金淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌和甲状腺癌。
在由CCR识别的配体是PSA的情况下，癌症可以是前列腺癌。
本发明的细胞可以能够杀死靶细胞，例如癌细胞。靶细胞可以通过在靶细胞附近肿瘤分泌配体或细胞因子配体的存在来表征。靶细胞可以通过可溶性配体的存在以及靶细胞表面处肿瘤相关抗原(TAA)的表达来表征。
本发明的细胞和药物组合物可以用于上述疾病的治疗和/或预防。
本发明的细胞和药物组合物可以用于上述任何方法中。
嵌合跨膜蛋白
本发明还提供了包含二聚化结构域；和细胞因子受体胞内域的嵌合跨膜蛋白。
二聚化可以自发发生，在这种情况下，嵌合跨膜蛋白将是组成型活性的。或者，二聚化只有在二聚化化学诱导物(CID)存在的情况下才可以发生，在这种情况下，跨膜蛋白仅在CID存在下引起细胞因子型信号传导。
WO2015/150771中描述了适合的二聚化结构域和CID，其内容在此通过引用并入本文。
例如，一个二聚化结构域可以包含FK结合蛋白12(FKBP12)的雷帕霉素结合结构域，另一个可以包含mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合(FRB)结构域；CID可以是雷帕霉素或其衍生物。
一个二聚化结构域可以包含FK结合蛋白12(FKBP12)的FK506(他克莫司)结合结构域，而另一个二聚化结构域可以包含环孢素A的环孢菌素结合结构域；并且CID可以是FK506/环孢菌素融合物或其衍生物。
一个二聚化结构域可以包含雌激素结合结构域(EBD)，而另一个二聚化结构域可以包含链霉亲合素结合结构域；且CID可以是雌激素酮/生物素融合蛋白或其衍生物。
一个二聚化结构域可以包含糖皮质激素结合结构域(GBD)而另一个二聚化结构域可以包含二氢叶酸还原酶(DHFR)结合结构域；且CID可以是地塞米松/甲氨蝶呤融合蛋白或其衍生物。
一个二聚化结构域可以包含O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)结合结构域，且另一个二聚化结构域可以包含二氢叶酸还原酶(DHFR)结合结构域；且CID可以是O6-苄基鸟嘌呤衍生物/甲氨蝶呤融合蛋白或其衍生物。
一个二聚化结构域可以包含视黄酸受体结构域，而另一个二聚化结构域可以包含蜕皮激素(ecodysone)受体结构域；而CID可以是RSL1或其衍生物。
在二聚化结构域自发异二聚化的情况下，其可以基于抗体的二聚化结构域。具体地，其可以包含重链恒定结构域(CH)和轻链恒定结构域(CL)的二聚化部分。恒定结构域的“二聚化部分”是形成链间二硫键的序列的部分。
嵌合细胞因子受体可以包含抗体的Fab部分作为外域，例如如图5中示意性说明的。
嵌合跨膜蛋白可以包含两个多肽：
(i)第一多肽，其包含：
(a)第一二聚化结构域；和
(b)细胞因子受体胞内域的第一链；和
(ii)第二多肽，其包含：
(a)第二二聚化结构域，其与第一二聚化结构域二聚化；和
(b)细胞因子受体胞内域的第二链。
以上定义嵌合细胞因子受体的细胞因子受体胞内域的小节也适用于本发明的嵌合跨膜蛋白。
以上关于核酸，载体，试剂盒，细胞，药物组合物和方法的小节也适用于本发明的嵌合跨膜蛋白。
现在将通过实施例的方式来进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明，而不意图以任何方式限制本发明的范围。
本发明包括以下实施方案：
实施方案1.嵌合细胞因子受体(CCR)，其包含：
外域(exodomain)，其结合选自肿瘤分泌因子，趋化因子和细胞表面抗原的配体；和
细胞因子受体胞内域。
实施方案2.根据实施方案1的嵌合细胞因子受体，其包含两个多肽：
(i)第一多肽，其包含
(a)第一抗原结合结构域，其结合所述配体的第一表位，
(b)所述细胞因子受体胞内域的第一链；和
(ii)第二多肽，其包含
(a)第二抗原结合结构域，其结合所述配体的第二表位，
(b)所述细胞因子受体胞内域的第二链。
实施方案3.根据实施方案2的嵌合细胞因子受体，其中所述第一和第二抗原结合结构域的每一个是单链可变片段(scFv)。
实施方案4.根据实施方案2的嵌合细胞因子受体，其中所述第一和第二抗原结合结构域的每一个是单域结合子(dAb)。
实施方案5.根据实施方案1的嵌合细胞因子受体，其包含两个多肽：
(i)第一多肽，其包含
(a)重链可变结构域(VH)，
(b)所述细胞因子受体胞内域的第一链；和
(ii)第二多肽，其包含
(a)轻链可变结构域(VL)，
(b)所述细胞因子受体胞内域的第二链。
实施方案6.根据实施方案5的嵌合细胞因子受体，其中所述细胞因子受体胞内域的所述第一和第二链是不同的且选自I型细胞因子受体胞内域α-，β-，和γ-链。
实施方案7.根据实施方案5的嵌合细胞因子受体，其中所述细胞因子受体胞内域的所述第一和第二链是相同的且选自I型细胞因子受体胞内域α-，β-，和γ-链。
实施方案8.根据前述实施方案中任一项的嵌合细胞因子受体，其中所述细胞因子受体胞内域包含：
(i)IL-2受体β-链胞内域
(ii)IL-7受体α-链胞内域；或
(iii)IL-15受体α-链胞内域；和/或
(iv)共同γ-链受体胞内域。
实施方案9.根据前述实施方案中任一项的嵌合细胞因子受体，其中所述配体是选自以下的肿瘤分泌因子：前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)和血管内皮生长因子(VEGF)和CA125。
实施方案10.根据实施方案1至7中任一项的嵌合细胞因子受体，其中所述配体是选自以下的趋化因子：CXCL12、CCL2、CCL4、CCL5和CCL22。
实施方案11.细胞，其包含根据前述实施方案中任一项的嵌合细胞因子受体。
实施方案12.根据实施方案11的细胞，其包含第一嵌合细胞因子受体和第二嵌合细胞因子受体，其结合相同配体上的不同表位。
实施方案13.根据实施方案12的细胞，其中所述第一嵌合细胞因子受体包含I型细胞因子受体胞内域α-或β-链，且所述第二嵌合细胞因子受体包含I型细胞因子受体胞内域γ-链，使得当所述第一嵌合细胞因子受体和所述第二嵌合细胞因子受体结合所述配体时，发生通过所述α-/β-链和γ-链的组合信号传导。
实施方案14.根据实施方案11至13中任一项所述的细胞，其还包含嵌合抗原受体。
实施方案15.根据实施方案14的细胞，其中所述嵌合抗原受体结合肿瘤相关细胞表面抗原。
实施方案16.根据实施方案15的细胞，其中所述嵌合抗原受体结合与前列腺癌相关的细胞表面抗原。
实施方案17.根据实施方案16的细胞，其中所述细胞表面抗原是前列腺干细胞抗原(PSCA)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
实施方案18.核酸序列，其编码根据实施方案1至10中任一项的嵌合细胞因子受体(CCR)。
实施方案19.核酸构建体，其包含编码第一CCR的第一核酸序列和编码第二CCR的第二核酸序列，所述核酸构建体具有以下结构：
AgB1-spacer1-TM1-endo1-coexpr-AbB2-spacer2-TM2-endo2
其中
AgB1是编码所述第一CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
spacer 1是编码所述第一CCR的间隔区的核酸序列；
TM1是编码所述第一CCR的跨膜结构域的核酸序列；
endo1是编码所述第一CCR的胞内域的核酸序列；
coexpr是使得两个CCR能够共表达的核酸序列；
AgB2是编码所述第二CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
spacer 2是编码所述第二CCR的间隔区的核酸序列；
TM2是编码所述第二CCR的跨膜结构域的核酸序列；
endo2是编码所述第二CCR的胞内域的核酸序列。
实施方案20.根据实施方案19的核酸构建体，其还编码嵌合抗原受体(CAR)，所述核酸构建体具有以下结构：
(i)CCRAgB1-CCRspacer1-CCRTM1-CCRendo1-coexpr1-CCRAgB2-CCRspacer2-CCRTM2-CCRendo2-coexpr2-CARAgB-CARspacer-CARTM-CARendo；
(ii)CCRAgB1-CCRspacer1-CCRTM1-CCRendo1-coexpr1-CARAgB-CARspacer-CARTM-CARendo-coexpr2-CCRAgB2-CCRspacer2-CCRTM2-CCRendo2；或者
(iii)CARAgB-CARspacer-CARTM-CARendo-coexpr1-CCRAgB1-CCRspacer1-CCRTM1-CCRendo1-coexpr2-CCRAgB2-CCRspacer2-CCRTM2-CCRendo2；
其中
CCRAgB1是编码所述第一CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
CCRspacer1是编码所述第一CCR的间隔区的核酸序列；
CCRTM1是编码所述第一CCR的跨膜结构域的核酸序列；
CCRendo1是编码所述第一CCR的胞内域的核酸序列；
CCRAgB2是编码所述第二CCR的抗原结合结构域的核酸序列；
CCRspacer2是编码所述第二CCR的间隔区的核酸序列；
CCRTM2是编码所述第二CCR的跨膜结构域的核酸序列；
CCRendo2是编码所述第二CCR的胞内域的核酸序列；
Coexpr1和coexpr2是使得两个侧翼序列能够共表达的核酸序列；
CARAgB是编码所述CAR的抗原结合结构域的核酸序列；
CARspacer是编码所述CAR的间隔区的核酸序列；
CCRTM是编码所述CAR的跨膜结构域的核酸序列；和
CARendo是编码所述CAR的胞内域的核酸序列。
实施方案21.根据实施方案19或20的核酸构建体，其中coexpr编码包含自切割肽的序列。
实施方案22.根据实施方案19至21中任一项的核酸构建体，其中为了避免同源重组，在编码相同或相似氨基酸序列的序列区域中使用替换密码子。
实施方案23.载体，其包含根据实施方案19至22中任一项的核酸构建体。
实施方案24.根据实施方案23的逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。
实施方案25.试剂盒，其包含:
i)载体，其包含编码如实施方案1至10中任一项中定义的第一CCR的核酸序列；和
ii)载体，其包含编码如实施方案1至10中任一项中定义的第二CCR的核酸序列。
实施方案26.根据实施方案25的试剂盒，其还包含载体，所述载体包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。
实施方案27.试剂盒，其包含：
i)载体，其包含编码如实施方案1至10中任一项定义的CCR的核酸序列；和
ii)载体，其包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。
实施方案28.制备根据实施方案11至17中任一项的细胞的方法，其包括将以下项引入细胞的步骤：根据实施方案18的核酸序列；根据实施方案19至22中任一项的核酸构建体；根据实施方案23或24的载体；或根据实施方案25至27中任一项的载体的试剂盒。
实施方案29.根据实施方案28的方法，其中所述细胞来自从受试者分离的样品。
实施方案30.药物组合物，其包含多个根据实施方案11至17中任一项的细胞。
实施方案31.治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据实施方案30的药物组合物施用至受试者的步骤。
实施方案32.根据实施方案31的方法，其包括以下步骤：
(i)从受试者分离含细胞的样品；
(ii)用以下项转导或转染所述细胞：根据实施方案18的核酸序列；根据实施方案19至22中任一项的核酸构建体；根据实施方案23或24的载体；或根据实施方案25至27中任一项的载体；和
(iii)将来自(ii)的所述细胞施用至所述受试者。
实施方案33.根据实施方案32的方法，其中所述样品是含T细胞的样品。
实施方案34.根据实施方案32或33的方法，其中所述疾病是癌症。
实施方案35.根据权利要30的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
实施方案36.根据实施方案11至17中任一项的细胞在制造用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
实施例
实施例1-体外测试
T细胞用PSMA特异性CAR转导，或用共表达PSMA特异性CAR与PSA特异性CCR的构建体转导。T细胞与表达PSMA的靶细胞共培养，所述表达PSMA的靶细胞分泌或不分泌PSA。在外源IL2存在或不存在的情况下进行共培养。以不同的效应物对靶标比率进行共培养。使用用重复靶细胞攻击(challenge)的T细胞连续重复共培养。确定T细胞的增殖和对靶细胞的杀伤。以这种方式，可以测量CCR做出的对T细胞增殖和存活的贡献。此外，测量对重复再攻击的贡献能力和连续的能力(the ability contribution to repeated re-challenge theability of serial)。
实施例2-体内测试
NSG小鼠植入表达PSMA并分泌PSA并表达萤火虫萤光素酶的人前列腺癌细胞系。T细胞用PSMA特异性CAR转导，或用共表达PSMA特异性CAR与PSA特异性CCR的构建体转导。将T细胞施用至小鼠。可以使用生物发光成像连续测量肿瘤负荷，并评估对CAR T细胞的应答。每个组内的小鼠可以在不同的时间点处死，并通过肉眼测量和免疫组织化学直接测量肿瘤负荷。此外，通过所述组织的流式细胞术测量，在肿瘤床或在淋巴样组织例如淋巴结，脾脏和骨髓中的T细胞植入/扩增。
实施例3-创建并测试组成型活性的细胞因子信号传导分子
通过将细胞因子受体胞内域与“Fab”型外域连接来产生组成性活性的细胞因子信号传导嵌合跨膜蛋白(图5)。该结构使用抗体的天然二聚化组分，即来自重链和轻链恒定区的二聚化结构域。嵌合跨膜蛋白具有两条链；包含抗体轻κ链和IL2受体共同γ链作为胞内域的第一多肽；和第二多肽，其包含抗体重链CH1和包含以下之任一的胞内域：IL2受体β链(产生组成型活性的IL2信号传导分子)；或IL7受体(产生组成型活性的IL7信号传导分子)。本研究中测试的组成型活性细胞因子信号传导嵌合跨膜蛋白包括scFv重链和轻链可变区。二聚化的发生不需要这些结构域。信号不依赖于抗原结合，且该结构可以同样是“无头(headless)”(如图5所示)或包含另一个实体如蛋白标签。
编码这些两种多肽的核酸序列以符合读码框的方式克隆，被2A-肽编码序列分开。
CTLL-2(
Figure BDA0002244046900000511
TIB-214TM)是依赖于IL-2以进行生长的鼠细胞毒性T淋巴细胞。在IL-2不存在的情况下，该细胞发生凋亡。用表达包含IL2受体胞内域(Fab_IL2endo)的嵌合蛋白的载体，或表达包含IL7受体胞内域(Fab_IL7endo)的嵌合蛋白的载体转导CTLL-2细胞，或使其未传导(WT)。作为阳性对照，所有三种类型的细胞与100U/ml鼠IL2共培养。培养3天和7天后评估细胞增殖，且结果示于图6中。
在100U/mL鼠IL2存在下未转导的CTLL2细胞以及用构建体(Fab_IL2endo或Fab_IL7endo)转导的CTLL2细胞增殖(图6，左侧图)。然而，在不存在外源添加的IL2的情况下，只有用具有IL2R胞内域(Fab_IL2endo)的构建体转导的细胞存活并增殖。这表明嵌合跨膜受体为CTLL2细胞提供必需的IL2信号。
实施例4-生成和测试针对PSA的嵌合细胞因子受体
使用来源于结合不同PSA表位的两种抗体5D5A5和5D3D11的scFv开发了一组靶向PSA的嵌合细胞因子受体。已经在这两种抗体的三明治式复合物中获得了PSA的晶体结构(Stura et al(2011)如上文)。
图7中显示了说明该CCR组的一些的示意图。
该组包括以下构建体：
A5-CD8stk-IL2Rg_D11-Hinge-IL2Rb：具有IL2-2R胞内域的CCR，所述IL-2R胞内域具有在具有共同γ链的链上具有A5且在具有IL2Rβ链的链上具有D11；
D11-CD8stk-IL2Rg_A5-Hinge-IL2Rb：具有IL-2R胞内域的CCR，所述IL-2R胞内域具有在具有共同γ链的链上具有D11且在具有IL2Rβ链的链上具有A5；
D11-CD8stk-RL_A5-Hinge-IL2Rb：阴性对照构建体，其等同于D11-CD8stk-IL2Rg_A5-Hinge-IL2Rb，但其中IL2Rγ链被刚性接头替换；
D11-CD8stk-IL2Rg_A5-Hinge-IL7Ra：具有IL-7R胞内域的CCR，所述IL-7R胞内域具有在具有共同γ链的链上具有D11且在具有IL7Rα链的链上具有A5；和
D11-CD8stk-RL_A5-Hinge-IL7Ra：阴性对照构建体，其等同于D11-CD8stk-IL2Rg_A5-Hinge-IL7Ra，但其中IL2Rγ链被刚性接头替换；
用表达这些构建体的载体转导CTLL2细胞。细胞在存在或不存在IL2(IL2的存在作为阳性对照)和存在或不存在5ng/mL或5μg/mL PSA的情况下培养。3天和7天后评估CTLL2细胞增殖，且结果示于图8中。
表达具有IL7胞内域的CCR的CTLL2细胞不支持CTLL2细胞存活和增殖(图8，最后两个图)。在这些细胞中鼠IL-2的存在在第3天支持CTLL2细胞生长和增殖，但是到第7天，大部分细胞已经经历细胞凋亡。
在不存在IL2且存在5ng/ml和5μg/ml的PSA的情况下，具有IL2R胞内域的抗PSA嵌合细胞因子受体支持CTLL2细胞增殖(图8，第一图)，其中5μg/ml产生更大的存活和增殖，特别是在第7天。
这两种具有IL2R胞内域的抗PSA嵌合细胞因子受体，即A5-CD8stk-IL2Rg_D11-Hinge-IL2Rb和D11-CD8stk-IL2Rg_A5-Hinge-IL2Rb，表明两个PSA结合结构域，即5D5A5和5D3D11的相对位置对于功能并不重要。
用刚性接头替换共同γ链消除了CCR支持CTLL2细胞存活和增殖的能力(图8，第三图)。
作为IL2信号传导的另一种读出，使用phosphoflow来研究STAT5的Y694的磷酸化。
CTLL2细胞未转导(WT)；用具有IL2R胞内域的PSA CCR构建体(D11-CD8STK-IL2Rg_A5-Hinge-IL2Rb)转导；或用其中IL2Rγ链被刚性接头替换的等同阴性对照构建体(D11-CD8STK-RL_A5-铰链-IL2Rb)转导。细胞在不存在外源添加IL-2的情况下孵育过夜。第二天，将细胞与500μM的Pervanadate(抑制磷酸酶并将导致STAT5磷酸化的阳性对照)或500ng/mL的PSA孵育1或4小时。孵育后将细胞固定，通透并通过流式细胞仪分析。
结果如图9中所示。在表达PSA CCR的细胞中，PSA的存在导致随时间增加STAT5磷酸化(图9，中图)。用未转导的CTLL2细胞或者用其中IL2Rγ链被刚性接头替换的等同构建体转导的CTLL2细胞没有看到此类磷酸化的增加(图9，右侧图)。
这些结果与图8中所示的CTLL2存活/增殖数据一致，并证明针对可溶性配体(在此为PSA)的嵌合细胞因子受体可用于触发T细胞中的细胞因子信号传导。
在上述说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应该过度限于这些具体实施方案。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修饰旨在在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 奥托路斯有限公司
<120> 受体
<130> P0029CN
<150> GB1514875.2
<151> 2015-08-20
<160> 55
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 86
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于IL-2受体共同γ链的胞内域
<400> 1
Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu
1 5 10 15
Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys
20 25 30
Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu
35 40 45
Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly
50 55 60
Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr
65 70 75 80
Thr Leu Lys Pro Glu Thr
85
<210> 2
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于IL-2受体共同β链的胞内域
<400> 2
Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn
1 5 10 15
Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly
20 25 30
Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe
35 40 45
Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu
50 55 60
Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu
65 70 75 80
Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn
85 90 95
Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala
100 105 110
Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp
115 120 125
Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln
130 135 140
Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp
145 150 155 160
Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro
165 170 175
Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro
180 185 190
Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly
195 200 205
Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro
210 215 220
Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro
225 230 235 240
Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu
245 250 255
Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu
260 265 270
Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
275 280 285
<210> 3
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于IL-7受体α链的胞内域
<400> 3
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Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe
50 55 60
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Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser
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130 135 140
Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly
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Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser
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Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr
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195
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1的铰链-CH2CH3
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Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp
225 230
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人CD8茎部
<400> 5
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
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Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
35 40 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1铰链
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1 5 10 15
Lys Asp Pro Lys
20
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<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于人共同γ链的跨膜
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 8
Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly
1 5 10 15
Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile
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<210> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于IL-7Rα的跨膜
<400> 9
Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu
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Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于人IL-15Rα的跨膜
<400> 10
Ala Ile Ser Thr Ser Thr Val Leu Leu Cys Gly Leu Ser Ala Val Ser
1 5 10 15
Leu Leu Ala Cys Tyr Leu
20
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5D3D11 VH的序列
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ala Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5D3D11 VL的序列
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Ala Pro Ser Val Phe Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 13
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5D5A5 VH的序列
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5D5A5 VL的序列
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asp Leu Tyr
20 25 30
Gly Phe Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Ile Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于5D5A5的ScFv
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asp Leu Tyr Gly Phe Thr Phe Met His Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Ile Leu Ile Tyr Arg Ala
180 185 190
Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 16
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于5D3D11的ScFv
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ala Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
130 135 140
Thr Ala Pro Ser Val Phe Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser
145 150 155 160
Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
165 170 175
Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
210 215 220
Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Val Thr
225 230 235 240
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 17
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CXCR4的序列
<400> 17
Met Ser Ile Pro Leu Pro Leu Leu Gln Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr
1 5 10 15
Thr Glu Glu Met Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys
20 25 30
Phe Arg Glu Glu Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile
35 40 45
Tyr Ser Ile Ile Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile
50 55 60
Leu Val Met Gly Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr
65 70 75 80
Arg Leu His Leu Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro
85 90 95
Phe Trp Ala Val Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu
100 105 110
Cys Lys Ala Val His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val
115 120 125
Leu Ile Leu Ala Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His
130 135 140
Ala Thr Asn Ser Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val
145 150 155 160
Tyr Val Gly Val Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe
165 170 175
Ile Phe Ala Asn Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg
180 185 190
Phe Tyr Pro Asn Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile
195 200 205
Met Val Gly Leu Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys
210 215 220
Ile Ile Ile Ser Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys
225 230 235 240
Ala Leu Lys Thr Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp
245 250 255
Leu Pro Tyr Tyr Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu
260 265 270
Ile Ile Lys Gln Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile
275 280 285
Ser Ile Thr Glu Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile
290 295 300
Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala
305 310 315 320
Leu Thr Ser Val Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly
325 330 335
Lys Arg Gly Gly His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser
340 345 350
Phe His Ser Ser
355
<210> 18
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞表面受体CCR2的序列
<400> 18
Met Leu Ser Thr Ser Arg Ser Arg Phe Ile Arg Asn Thr Asn Glu Ser
1 5 10 15
Gly Glu Glu Val Thr Thr Phe Phe Asp Tyr Asp Tyr Gly Ala Pro Cys
20 25 30
His Lys Phe Asp Val Lys Gln Ile Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu
35 40 45
Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Val
50 55 60
Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Lys Leu Lys Cys Leu Thr Asp Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Ile Thr Leu Pro
85 90 95
Leu Trp Ala His Ser Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ala Met
100 105 110
Cys Lys Leu Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile
115 120 125
Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His
130 135 140
Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Val Thr
145 150 155 160
Ser Val Ile Thr Trp Leu Val Ala Val Phe Ala Ser Val Pro Gly Ile
165 170 175
Ile Phe Thr Lys Cys Gln Lys Glu Asp Ser Val Tyr Val Cys Gly Pro
180 185 190
Tyr Phe Pro Arg Gly Trp Asn Asn Phe His Thr Ile Met Arg Asn Ile
195 200 205
Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Ile Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly
210 215 220
Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg
225 230 235 240
Ala Val Arg Val Ile Phe Thr Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp
245 250 255
Thr Pro Tyr Asn Ile Val Ile Leu Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe
260 265 270
Gly Leu Ser Asn Cys Glu Ser Thr Ser Gln Leu Asp Gln Ala Thr Gln
275 280 285
Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile
290 295 300
Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg Ser Leu Phe His Ile Ala Leu
305 310 315 320
Gly Cys Arg Ile Ala Pro Leu Gln Lys Pro Val Cys Gly Gly Pro Gly
325 330 335
Val Arg Pro Gly Lys Asn Val Lys Val Thr Thr Gln Gly Leu Leu Asp
340 345 350
Gly Arg Gly Lys Gly Lys Ser Ile Gly Arg Ala Pro Glu Ala Ser Leu
355 360 365
Gln Asp Lys Glu Gly Ala
370
<210> 19
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞表面受体CCR4的序列
<400> 19
Met Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr
1 5 10 15
Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys Thr Lys Glu
20 25 30
Gly Ile Lys Ala Phe Gly Glu Leu Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu
35 40 45
Val Phe Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn Ser Val Val Val Leu Val Leu
50 55 60
Phe Lys Tyr Lys Arg Leu Arg Ser Met Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn
65 70 75 80
Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Leu Pro Phe Trp Gly
85 90 95
Tyr Tyr Ala Ala Asp Gln Trp Val Phe Gly Leu Gly Leu Cys Lys Met
100 105 110
Ile Ser Trp Met Tyr Leu Val Gly Phe Tyr Ser Gly Ile Phe Phe Val
115 120 125
Met Leu Met Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe
130 135 140
Ser Leu Arg Ala Arg Thr Leu Thr Tyr Gly Val Ile Thr Ser Leu Ala
145 150 155 160
Thr Trp Ser Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Phe Leu Phe Ser
165 170 175
Thr Cys Tyr Thr Glu Arg Asn His Thr Tyr Cys Lys Thr Lys Tyr Ser
180 185 190
Leu Asn Ser Thr Thr Trp Lys Val Leu Ser Ser Leu Glu Ile Asn Ile
195 200 205
Leu Gly Leu Val Ile Pro Leu Gly Ile Met Leu Phe Cys Tyr Ser Met
210 215 220
Ile Ile Arg Thr Leu Gln His Cys Lys Asn Glu Lys Lys Asn Lys Ala
225 230 235 240
Val Lys Met Ile Phe Ala Val Val Val Leu Phe Leu Gly Phe Trp Thr
245 250 255
Pro Tyr Asn Ile Val Leu Phe Leu Glu Thr Leu Val Glu Leu Glu Val
260 265 270
Leu Gln Asp Cys Thr Phe Glu Arg Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Gln Ala
275 280 285
Thr Glu Thr Leu Ala Phe Val His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Ile Tyr
290 295 300
Phe Phe Leu Gly Glu Lys Phe Arg Lys Tyr Ile Leu Gln Leu Phe Lys
305 310 315 320
Thr Cys Arg Gly Leu Phe Val Leu Cys Gln Tyr Cys Gly Leu Leu Gln
325 330 335
Ile Tyr Ser Ala Asp Thr Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Met
340 345 350
Asp His Asp Leu His Asp Ala Leu
355 360
<210> 20
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于J591的scFv
<400> 20
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Glu Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser
130 135 140
Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly
145 150 155 160
Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu
165 170 175
Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe
180 185 190
Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val
195 200 205
Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr
210 215 220
Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Asp Leu Lys Arg
225 230 235
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于TCR β链的信号肽
<400> 21
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asp His Ala Asp Gly
20
<210> 22
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于IgG1的信号肽
<400> 22
Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于CD8a的信号肽
<400> 23
Met Ala Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys
20
<210> 24
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3 Z 胞内域
<400> 24
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 25
<211> 152
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28和CD3 Zeta 胞内域
<400> 25
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
1 5 10 15
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
20 25 30
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
35 40 45
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
50 55 60
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
65 70 75 80
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
85 90 95
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
100 105 110
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
115 120 125
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
130 135 140
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145 150
<210> 26
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28, OX40和CD3 Zeta 胞内域
<400> 26
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
1 5 10 15
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
20 25 30
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp
35 40 45
Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu
50 55 60
Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe
65 70 75 80
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
85 90 95
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
100 105 110
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
115 120 125
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
130 135 140
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
145 150 155 160
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
165 170 175
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
180 185
<210> 27
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS 胞内域
<400> 27
Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Ser Ser Val His Asp Pro Asn
1 5 10 15
Gly Glu Tyr Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys Lys Ser Arg
20 25 30
Leu Thr Asp Val Thr Leu
35
<210> 28
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD27 胞内域
<400> 28
Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro
1 5 10 15
Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr
20 25 30
Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro
35 40 45
<210> 29
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTLA 胞内域
<400> 29
Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg
1 5 10 15
Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr Glu Ala
20 25 30
Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile Tyr
35 40 45
Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser Glu Val
50 55 60
Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val Tyr Ala
65 70 75 80
Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala Arg Asn
85 90 95
Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg Ser
100 105 110
<210> 30
<211> 188
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD30 胞内域
<400> 30
His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile Arg Gln Lys Leu His Leu Cys
1 5 10 15
Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg
20 25 30
Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu
35 40 45
Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr
50 55 60
Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp
65 70 75 80
Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro
85 90 95
Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile
100 105 110
Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro
115 120 125
Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu
130 135 140
Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro
145 150 155 160
Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly
165 170 175
Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala Ser Gly Lys
180 185
<210> 31
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GITR 胞内域
<400> 31
Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro
1 5 10 15
Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala
20 25 30
Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu
35 40 45
Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp Val
50 55
<210> 32
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVEM 胞内域
<400> 32
Cys Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val
1 5 10 15
Ser Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile
20 25 30
Glu Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu
35 40 45
Thr Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
50 55 60
<210> 33
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点, 2A样序列
<400> 33
Tyr His Ala Asp Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Ile His Asp Val Glu Met
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 34
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点, 2A样序列
<400> 34
His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile His Asp Ile Glu Thr
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 35
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点, 2A样序列
<400> 35
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 36
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点, 2A样序列
<400> 36
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 37
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点, 2A样序列
<400> 37
Ala Ala Arg Gln Met Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Thr Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点, 2A样序列
<400> 38
Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 39
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点, 2A样序列
<400> 39
Thr Arg Ala Glu Ile Glu Asp Glu Leu Ile Arg Ala Gly Ile Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 40
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点, 2A样序列
<400> 40
Thr Arg Ala Glu Ile Glu Asp Glu Leu Ile Arg Ala Asp Ile Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 41
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点, 2A样序列
<400> 41
Ala Lys Phe Gln Ile Asp Lys Ile Leu Ile Ser Gly Asp Val Glu Leu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点, 2A样序列
<400> 42
Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Met Leu Val Ser Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 43
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点, 2A样序列
<400> 43
Cys Asp Ala Gln Arg Gln Lys Leu Leu Leu Ser Gly Asp Ile Glu Gln
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 切割位点, 2A样序列
<400> 44
Tyr Pro Ile Asp Phe Gly Gly Phe Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Phe
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 45
<211> 1722
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有IL-2 β链的融合构建体
<400> 45
Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Glu Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met
145 150 155 160
Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln
165 170 175
Asp Val Gly Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
180 185 190
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro
195 200 205
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
210 215 220
Thr Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr
225 230 235 240
Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Asp Leu Lys
245 250 255
Arg Ser Asp Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val
290 295 300
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
325 330 335
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
340 345 350
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
355 360 365
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
370 375 380
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
385 390 395 400
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
405 410 415
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
435 440 445
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
450 455 460
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
465 470 475 480
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Phe Trp Val Leu
485 490 495
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
500 505 510
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
515 520 525
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
530 535 540
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
545 550 555 560
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
565 570 575
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
580 585 590
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
595 600 605
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
610 615 620
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu
625 630 635 640
Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp
645 650 655
Thr Leu Ile Leu Trp Val Leu Leu Leu Leu Val Pro Gly Ser Thr Gly
660 665 670
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
675 680 685
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Tyr
690 695 700
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
705 710 715 720
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Gln Lys Phe
725 730 735
Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
740 745 750
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
755 760 765
Ala Arg Ser Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
770 775 780
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
785 790 795 800
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
805 810 815
Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys
820 825 830
Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asp Leu Tyr Gly Phe Thr Phe Met His Trp
835 840 845
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Ile Leu Ile Tyr Arg Ala
850 855 860
Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
865 870 875 880
Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val
885 890 895
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly
900 905 910
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Asp Pro Ala Thr Thr Thr Pro
915 920 925
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
930 935 940
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
945 950 955 960
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Val Val Ile Ser Val Gly
965 970 975
Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu
980 985 990
Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val
995 1000 1005
Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys
1010 1015 1020
Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys
1025 1030 1035
Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly
1040 1045 1050
Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro
1055 1060 1065
Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr Gln Cys Thr Asn Tyr Ala
1070 1075 1080
Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met
1085 1090 1095
Glu Thr Asp Thr Leu Ile Leu Trp Val Leu Leu Leu Leu Val Pro
1100 1105 1110
Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu
1115 1120 1125
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly
1130 1135 1140
Tyr Ala Ile Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro
1145 1150 1155
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly
1160 1165 1170
Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr
1175 1180 1185
Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu
1190 1195 1200
Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Gly Tyr
1205 1210 1215
Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
1220 1225 1230
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1235 1240 1245
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Ala
1250 1255 1260
Pro Ser Val Phe Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys
1265 1270 1275
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
1280 1285 1290
Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
1295 1300 1305
Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
1310 1315 1320
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val
1325 1330 1335
Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu
1340 1345 1350
Tyr Pro Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
1355 1360 1365
Asp Pro Ala Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp
1370 1375 1380
Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His
1385 1390 1395
Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Ile Pro
1400 1405 1410
Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly Phe
1415 1420 1425
Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro
1430 1435 1440
Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys
1445 1450 1455
Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys
1460 1465 1470
Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly
1475 1480 1485
Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys
1490 1495 1500
Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala
1505 1510 1515
Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn Gln
1520 1525 1530
Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala
1535 1540 1545
Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro
1550 1555 1560
Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro
1565 1570 1575
Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro
1580 1585 1590
Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly
1595 1600 1605
Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu
1610 1615 1620
Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp
1625 1630 1635
Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu
1640 1645 1650
Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly
1655 1660 1665
Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro
1670 1675 1680
Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu Phe Arg Ala Leu Asn Ala
1685 1690 1695
Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln Glu Leu
1700 1705 1710
Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val
1715 1720
<210> 46
<211> 1631
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有IL-7R α链的融合构建体
<400> 46
Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Thr Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Glu Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Gly Trp Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met
145 150 155 160
Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Ile Cys Lys Ala Ser Gln
165 170 175
Asp Val Gly Thr Ala Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
180 185 190
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro
195 200 205
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
210 215 220
Thr Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr
225 230 235 240
Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Met Leu Asp Leu Lys
245 250 255
Arg Ser Asp Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
275 280 285
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val
290 295 300
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
305 310 315 320
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
325 330 335
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
340 345 350
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
355 360 365
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
370 375 380
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
385 390 395 400
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
405 410 415
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
420 425 430
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
435 440 445
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
450 455 460
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
465 470 475 480
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Phe Trp Val Leu
485 490 495
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
500 505 510
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
515 520 525
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
530 535 540
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
545 550 555 560
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
565 570 575
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
580 585 590
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
595 600 605
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
610 615 620
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu
625 630 635 640
Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr Asp
645 650 655
Thr Leu Ile Leu Trp Val Leu Leu Leu Leu Val Pro Gly Ser Thr Gly
660 665 670
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
675 680 685
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Tyr
690 695 700
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
705 710 715 720
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Asn Asn Gln Lys Phe
725 730 735
Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
740 745 750
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
755 760 765
Ala Arg Ser Gly Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
770 775 780
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
785 790 795 800
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
805 810 815
Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys
820 825 830
Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asp Leu Tyr Gly Phe Thr Phe Met His Trp
835 840 845
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Ile Leu Ile Tyr Arg Ala
850 855 860
Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
865 870 875 880
Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val
885 890 895
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr His Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly
900 905 910
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Asp Pro Ala Thr Thr Thr Pro
915 920 925
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
930 935 940
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
945 950 955 960
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Val Val Ile Ser Val Gly
965 970 975
Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu
980 985 990
Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val
995 1000 1005
Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys
1010 1015 1020
Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys
1025 1030 1035
Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly
1040 1045 1050
Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro
1055 1060 1065
Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr Gln Cys Thr Asn Tyr Ala
1070 1075 1080
Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met
1085 1090 1095
Glu Thr Asp Thr Leu Ile Leu Trp Val Leu Leu Leu Leu Val Pro
1100 1105 1110
Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu
1115 1120 1125
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly
1130 1135 1140
Tyr Ala Ile Ser Ser Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro
1145 1150 1155
Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly
1160 1165 1170
Asp Thr Lys Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr
1175 1180 1185
Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu
1190 1195 1200
Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Gly Tyr
1205 1210 1215
Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
1220 1225 1230
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1235 1240 1245
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Ala
1250 1255 1260
Pro Ser Val Phe Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys
1265 1270 1275
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
1280 1285 1290
Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
1295 1300 1305
Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
1310 1315 1320
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val
1325 1330 1335
Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu
1340 1345 1350
Tyr Pro Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser
1355 1360 1365
Asp Pro Ala Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp
1370 1375 1380
Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His
1385 1390 1395
Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Pro Ile
1400 1405 1410
Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu Leu
1415 1420 1425
Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile
1430 1435 1440
Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu
1445 1450 1455
Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu
1460 1465 1470
Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala
1475 1480 1485
Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe Pro Gln Gln
1490 1495 1500
Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val Gln Ser
1505 1510 1515
Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser Phe
1520 1525 1530
Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala
1535 1540 1545
Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg
1550 1555 1560
Glu Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu
1565 1570 1575
Ser Leu Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu
1580 1585 1590
Gln Ser Gly Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro
1595 1600 1605
Ile Leu Thr Ser Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr
1610 1615 1620
Met Ser Ser Phe Tyr Gln Asn Gln
1625 1630
<210> 47
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于人CD8a的信号序列
<400> 47
Met Ser Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala
<210> 48
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 48
Ser Asp Pro Ala
1
<210> 49
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IgG1 Fc间隔区(HCH2CH3pvaa)
<400> 49
Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 50
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于人CD28的跨膜
<400> 50
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 51
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于TCRz的胞内域
<400> 51
Arg Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
1 5 10 15
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
20 25 30
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
35 40 45
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 52
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来源于小鼠kappa VIII的信号序列
<400> 52
Met Glu Thr Asp Thr Leu Ile Leu Trp Val Leu Leu Leu Leu Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 53
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD28STK间隔区
<400> 53
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
1 5 10 15
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
20 25 30
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35 40
<210> 54
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa 可以是任意天然发生的氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa 可以是Arg或Lys
<400> 54
Arg Xaa Xaa Arg
1
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共有烟草蚀刻病毒(TEV) 切割位点
<400> 55
Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser
1 5

Claims (32)

1.嵌合跨膜蛋白，其包含：
二聚化结构域；和
细胞因子受体胞内域。
2.根据权利要求1的嵌合跨膜蛋白，其中所述二聚化结构域包含重链恒定域(CH)和轻链恒定域(CL)的二聚化部分。
3.根据前述权利要求中任一项的嵌合跨膜蛋白，其包含两个多肽：
(i)第一多肽，其包含
(a)第一二聚化结构域；和
(b)所述细胞因子受体胞内域的第一链；和
(ii)第二多肽，其包含：
(a)第二二聚化结构域，其与所述第一二聚化结构域二聚化；和
(b)所述细胞因子受体胞内域的第二链。
4.根据权利要求3的嵌合跨膜蛋白，其中所述第一和第二二聚化结构域自发地二聚化，或在二聚化化学诱导剂(CID)的存在下二聚化。
5.根据权利要求2，3或4的嵌合跨膜蛋白，其包含两个多肽：
(i)第一多肽，其包含：
(a)重链恒定域(CH)
(b)所述细胞因子受体胞内域的第一链；和
(ii)第二多肽，其包含：
(a)轻链恒定域(CL)
(b)所述细胞因子受体胞内域的第二链。
6.根据权利要求5的嵌合跨膜蛋白，其中所述细胞因子受体胞内域的第一和第二链不同且选自I型细胞因子受体胞内域α-，β-，和γ-链。
7.根据权利要求5的嵌合跨膜蛋白，其中所述细胞因子受体胞内域的第一和第二链相同且选自I型细胞因子受体胞内域α-，β-，和γ-链。
8.根据前述权利要求中任一项的嵌合跨膜蛋白，其中所述细胞因子受体胞内域包含：
(i)IL-2受体β-链胞内域
(ii)IL-7受体α-链胞内域；或
(iii)IL-15受体α-链胞内域；和/或
(iv)共同γ-链受体胞内域。
9.根据权利要求5的嵌合跨膜蛋白，其中所述第一多肽包含重链可变域(VH)和重链恒定域(CH)；且所述第二多肽包含轻链可变域(VL)和轻链恒定域(CL)。
10.根据权利要求9的嵌合跨膜蛋白，其包含Fab外域。
11.细胞，其包含根据前述权利要求中任一项的嵌合跨膜蛋白。
12.根据权利要求11的细胞，其还包含嵌合抗原受体。
13.根据权利要求12的细胞，其中所述嵌合抗原受体结合肿瘤相关细胞表面抗原。
14.核酸序列，其编码根据权利要求1至10中任一项的嵌合跨膜蛋白。
15.核酸构建体，其包含编码如权利要求3中定义的第一多肽的第一核酸序列和编码如权利要求3中定义的第二多肽的第二核酸序列，所述核酸构建体具有以下结构：
Dim1-TM1-endo1-coexpr-Dim2-TM2-endo2
其中
Dim1是编码所述第一二聚化结构域的核酸序列；
TM1是编码所述第一多肽的跨膜结构域的核酸序列；
endo1是编码所述第一多肽的胞内域的核酸序列；
coexpr是使得两个CCR能够共表达的核酸序列
Dim2是编码所述第二二聚化结构域的核酸序列；
TM2是编码所述第二多肽的跨膜结构域的核酸序列；
endo2是编码所述第二多肽的胞内域的核酸序列。
16.根据权利要求15的核酸构建体，其还编码嵌合抗原受体(CAR)。
17.根据权利要求15或16的核酸构建体，其中coexpr编码包含自切割肽的序列。
18.根据权利要求15至17中任一项的核酸构建体，其中为了避免同源重组，在编码相同或相似氨基酸序列的序列区域中使用替换密码子。
19.载体，其包含根据权利要求15至18中任一项的核酸构建体。
20.根据权利要求19的逆转录病毒载体或慢病毒载体或转座子。
21.试剂盒，其包含：
i)载体，其包含编码如权利要求3中定义的第一多肽的核酸序列；和
ii)载体，其包含编码如权利要求3中定义的第二多肽的核酸序列。
22.根据权利要求21的试剂盒，其还包含包括编码嵌合抗原受体的核酸序列的载体。
23.试剂盒，其包含：
i)载体，其包含编码如权利要求1至10中任一项定义的嵌合跨膜蛋白的核酸序列；和
ii)载体，其包含编码嵌合抗原受体的核酸序列。
24.制备根据权利要求11至13中任一项的细胞的方法，其包括将以下项引入细胞的步骤：根据权利要求14的核酸序列；根据权利要求15至18中任一项的核酸构建体；根据权利要求19或20的载体；或根据权利要求21至23中任一项的载体的试剂盒。
25.根据权利要求24的方法，其中所述细胞来自从受试者分离的样品。
26.药物组合物，其包含多个根据权利要求11至13中任一项的细胞。
27.治疗和/或预防疾病的方法，其包括将根据权利要求26的药物组合物施用至受试者的步骤。
28.根据权利要求27的方法，其包括以下步骤：
(i)从受试者分离含细胞的样品；
(ii)用以下项转导或转染所述细胞：根据权利要求14的核酸序列；根据权利要求15至18中任一项的核酸构建体；根据权利要求19或20的载体；或根据权利要求21至23中任一项的载体的试剂盒；和
(iii)将来自(ii)的细胞施用至所述受试者。
29.根据权利要求28的方法，其中所述样品是含有T细胞的样品。
30.根据权利要求28或29的方法，其中所述疾病是癌症。
31.根据权利要求26的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。
32.根据权利要求11至13中任一项的细胞在制造用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。
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