CN110687218A - 液相色谱测定苯并噁嗪利福霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用液相色谱对利福平合成中间体苯并噁嗪利福霉素定量分析的方法，属于化学分析领域。所述方法包括：一、用缓冲液配制苯并噁嗪利福霉素标准物质的标准溶液；二、对苯并噁嗪利福霉素粗产物进行处理：将粗产物加入到醋酸溶液中，抽滤，获得固体产物苯并噁嗪利福霉素，再加入乙腈溶解，用缓冲液定容，然后用微孔滤膜过滤除杂，得到液相色谱检测样品；三、对所述标准溶液进行液相色谱分析，绘制标准曲线；四、将样品用液相色谱分析，对比标准曲线测定利福平合成中间体苯并噁嗪利福霉素。所述方法可准确测定利福平合成中间体苯并噁嗪利福霉素的含量，填补了现有技术的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用液相色谱对利福平合成过程中产生的中间体定量分析的方法，具体涉及一种采用液相色谱测定利福平合成过程中环合反应后的中间体苯并噁嗪利福霉素的方法，属于化学分析领域。
背景技术
利福平(Rifampin)是一种所属于利福霉素类的半合成广谱抗生素，对结核菌有强大抑制和杀灭作用，对革兰氏阴性细菌、麻风杆菌、沙眼衣原体及某些革兰氏阳性细菌亦有效。
在公开的专利中利福平的合成通常包括两步反应，即环合和缩合反应。中国发明专利申请公开说明书101486716A中公开优质利福平的制备方法，利福霉素S钠盐经醋酸酸化得到游离的利福霉素S，随后同二羟甲基叔丁胺反应生成苯并噁嗪利福霉素，然后再更换溶剂，同1-甲基-4-氨基哌嗪反应，生成利福平。以利福霉素S为原料，与二羟甲基叔丁胺反应生成苯并噁嗪利福霉素的反应方程式如下：
目前，第一步反应主要由薄层色谱进行监控，虽然可以快速检测反应物是否反应完全，但其在定量方面的精密度偏差，不能得到确切的反应数据，因此不能很好地服务于生产工艺的改进。针对利福平合成中间体苯并噁嗪利福霉素建立一种切实可行的分析方案，分析中间体含量、反应收率变化，可为更好地优化利福平合成工艺提供指导。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种液相色谱测定利福平合成中间体的方法，所述利福平是以利福霉素S为原料，经环合和缩合反应生成的，所述环合反应中会生成中间体苯并噁嗪利福霉素。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
提供一种利用液相色谱对利福平合成过程中产生的中间体定量分析的方法，其中，所述利福平是以利福霉素S为原料，经环合和缩合反应生成的，所述合成中间体为环合反应后生成的苯并噁嗪利福霉素；所述方法步骤如下：
步骤一、配制标准溶液
称取苯并噁嗪利福霉素标准物质，用乙腈溶解，然后用体积比为1:1的乙腈和0.075mol/L磷酸二氢钾溶液的混合溶液定容，用孔径为0.45μm微孔滤膜进行过滤，收集滤液得到标准溶液；
步骤二、对环合反应液进行处理，所述的环合反应液为环合反应后反应器出口的溶液；
将环合反应后含苯并噁嗪利福霉素的反应器出口物料滴加到质量分数为0.45％～0.9％的醋酸溶液中，同时不断搅拌以分散固体粗产品，然后在-0.04MPa～-0.1MPa下减压抽滤，得到固体苯并噁嗪利福霉素，经烘干后，取适量固体，用乙腈溶解，再用体积比为1:1的乙腈和0.075mol/L磷酸二氢钾溶液的混合溶液定容，用孔径为0.45μm的滤膜进行微孔滤膜过滤，收集滤液用作液相色谱检测样品；
步骤三、绘制标准曲线
采用外标法对步骤一制得的标准溶液进行液相色谱分析，色谱分析条件如下所示：
色谱柱：Kromasil 100C8,5μm,150mm×4.6mm
柱温：25℃
柱压：97.60bar
泵模式：等度
流动相优选为：甲醇:乙腈:磷酸二氢钾溶液或醋酸钠溶液:柠檬酸溶液按体积比为30:30:6:4配制的混合溶液
流速：1.0mL/min
进样量：20μL
检测器：UV紫外检测器
检测波长：275nm
运行时间：35min
测得标准物质的物质峰的峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线的线性方程和线性相关系数；
步骤四、测定利福平合成中间体苯并噁嗪利福霉素
按照步骤三中的液相色谱分析条件，将步骤二处理得到的样品用液相色谱进行测定，测得苯并噁嗪利福霉素的峰面积，根据峰面积可直接从步骤三绘制得到的标准曲线上算得其浓度，计算出其含量。
本发明所述标准物质(reference material,RM)是一种已经确定了具有一个或多个足够均匀的特性值的物质或材料，作为分析测量行业的“量具”，在校准测量仪器和装置、评价测量分析方法、测量物质或材料特性值和考核分析人员的操作技术水平，以及在生产过程中产品的质量控制等领域起着不可或缺的作用。
本发明所述外标法是仪器分析常用的方法之一，是比较法的一种。与内标法相比，外标法不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。
有益效果：本发明提供了一种液相色谱测定利福平合成中间体的方法，可准确对利福平合成中间体苯并噁嗪利福霉素定量分析，填补了现有技术的缺陷。
附图说明
图1为苯并噁嗪利福霉素的标准曲线图。
图2为苯并噁嗪利福霉素标准物质的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
以利福霉素S为原料，经环合反应得到苯并噁嗪利福霉素的反应方程式及相关物质结构式如下：
将利福霉素S 41.8g与DMF 100mL，以及二羟甲基叔丁胺23mL放入反应器中进行环合反应，得到含环合反应后含中间体苯并噁嗪利福霉素的产物。
一种利用液相色谱对利福平合成中间体苯并噁嗪利福霉素定量分析的方法，所述方法步骤如下：
步骤一、配制标准溶液
准确称取苯并噁嗪利福霉素标准物质25mg，精确至±0.0001g，先用2mL乙腈溶解，再用体积比为1:1的乙腈和0.075mol/L磷酸二氢钾溶液的混合溶液定容至25mL，得到标准溶液，随后用该混合溶液将其稀释2倍、4倍、6倍、8倍、10倍，得到不同浓度梯度的标准溶液，浓度分别为1.26mmol/L、0.63mmol/L、0.32mmol/L、0.21mmol/L、0.16mmol/L和0.13mmol/L，用孔径为0.45μm的滤膜进行微孔滤膜过滤，收集滤液用作液相色谱检测样品；
步骤二、处理环合反应液
将含苯并噁嗪利福霉素的环合反应的反应器出口物料滴加到质量分数为0.9％的醋酸溶液中，同时不断搅拌以分散固体粗产品，然后在-0.1MPa下减压抽滤，得到固体苯并噁嗪利福霉素，经烘干后，取25mg样品，用2mL乙腈溶解，再用体积比为1:1的乙腈和0.075mol/L磷酸二氢钾溶液的混合溶液定容至25mL，用孔径为0.45μm的滤膜进行微孔滤膜过滤，收集滤液用作液相色谱检测样品；
步骤三、绘制标准曲线
采用外标法对步骤一得到的标准溶液进行液相色谱分析，分析条件如发明内容所述，测得标准物质峰的峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线的线性方程和线性相关系数，测定结果见图1-2，图2的最大峰为标准物质的峰，标准曲线及相关系数如下所示：
y＝19595.88x R2＝1.00
步骤四、测定出口物料中中间体苯并噁嗪利福霉素的含量
按照步骤三中的液相色谱分析条件，将步骤二处理得到的样品用液相色谱进行测定，测得苯并噁嗪利福霉素的峰面积，测量两次，取平均值，根据峰面积可直接从步骤三绘制得到的标准曲线上算得其含量，进一步的算得苯并噁嗪利福霉素质量收率为95.2％。
Claims (5)
1.一种利用液相色谱对利福平合成过程中产生的中间体苯并噁嗪利福霉素定量分析的方法，所述合成为以利福霉素S为原料通过环合和缩合反应合成利福平，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
步骤一、标准溶液配制
将苯并噁嗪利福霉素标准物质用乙腈溶解，用缓冲液定容，然后用微孔滤膜过滤除杂，收集滤液，得到苯并噁嗪利福霉素标准溶液；
步骤二、对环合反应液进行处理：
将含苯并噁嗪利福霉素的环合反应后的产物加入到醋酸溶液中搅拌分散，抽滤，获得固体产物苯并噁嗪利福霉素，烘干后，用乙腈溶解，用缓冲液定容，然后用微孔滤膜过滤除杂，得到液相色谱检测样品；
步骤三、标准曲线绘制
对步骤一所得标准溶液进行液相色谱分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；
步骤四、苯并噁嗪利福霉素含量测定
将步骤二所得的液相色谱检测样品用液相色谱分析，测得所述样品中苯并噁嗪利福霉素的峰面积，对比标准曲线，计算出利福平合成中间体苯并噁嗪利福霉素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种利用液相色谱对利福平合成过程中中间体苯并噁嗪利福霉素定量分析的方法，其特征在于所述步骤中的缓冲液为乙腈和磷酸二氢钾混合溶液、甲醇和磷酸二氢钾混合溶液或乙腈和醋酸钠混合溶液。
3.根据权利要求1所述的一种利用液相色谱对利福平合成过程中产生的中间体苯并噁嗪利福霉素定量分析的方法，其特征在于所述步骤二中醋酸的质量分数为0.45％～0.9％，微孔滤膜的孔径为0.45μm。
4.根据权利要求1所述的一种利用液相色谱对利福平合成过程中产生的中间体苯并噁嗪利福霉素定量分析的方法，其特征在于所述步骤中标准溶液的液相色谱分析采用外标法。
5.根据权利要求1所述的一种利用液相色谱对利福平合成过程中产生的中间体苯并噁嗪利福霉素定量分析的方法，其特征在于所述步骤中色谱条件为：
色谱柱：Kromasil 100C8,5μm,150mm×4.6mm
柱温：25℃
柱压：97.60bar
泵模式：等度
流动相：甲醇和乙腈和磷酸二氢钾溶液或醋酸钠溶液和柠檬酸溶液的混合溶液
流速：1.0mL/min
进样量：20μL
检测器：UV紫外检测器
检测波长：275nm
运行时间：35min 。
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| CN101355950A (zh) * | 2005-11-03 | 2009-01-28 | 活跃生物药物学有限公司 | 利福霉素类似物及其用途 |
| CN101486716A (zh) * | 2009-02-20 | 2009-07-22 | 薛荔 | 优质利福平的制备方法 |
| WO2017152083A1 (en) * | 2016-03-04 | 2017-09-08 | Genentech, Inc. | Process for the preparation of an antibody-rifamycin conjugate |
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