CN114594174A - 吲达帕胺制剂中杂质a的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法，所述杂质A具有如下结构，所述方法包括：将吲达帕胺制剂进行预处理，得到供试品溶液；将所述供试品溶液进行高效液相色谱‑质谱检测；其中，所述高效液相色谱检测所采用的流动相为甲醇水溶液，洗脱方式为等度洗脱。本发明的方法可以有效地检测吲达帕胺制剂中杂质A，具有专属性强、准确性高、分离度好、灵敏度高、耐用性好、操作简便、快捷、效率高等优点，适于广泛应用。

Description

吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法

技术领域

本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法。

背景技术

吲达帕胺为磺胺类利尿药，具有利尿和钙拮抗作用，是一种强效、长效的降压药。临床上还用于充血性心力衰竭时水钠潴留的治疗。

杂质A(2-甲基-1-亚硝基-吲哚啉)是吲达帕胺合成过程中的中间体，往下若未充分反应，即可能引入杂质A，同时吲达帕胺片在制备和长期储存过程中杂质A会增加。杂质A具有亚硝胺类结构，为基因毒性杂质，必须对其含量进行测定。

然而，目前针对吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法，该方法可以有效地检测吲达帕胺制剂中杂质A，具有专属性强、准确性高、分离度好、灵敏度高、耐用性好、操作简便、快捷、效率高等优点，适于广泛应用。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法，所述杂质A具有如下结构：

根据本发明的实施例，所述方法包括：将吲达帕胺制剂进行预处理，得到供试品溶液；将所述供试品溶液进行高效液相色谱-质谱检测；其中，所述高效液相色谱检测所采用的流动相为甲醇水溶液，洗脱方式为等度洗脱。

相比于吲达帕胺原料药，吲达帕胺制剂中含有多种辅料，例如滑石粉、乳糖、包衣粉等，这些辅料的存在会干扰杂质A的检测，尤其是滑石粉。滑石粉中有一未知杂质与杂质A的保留时间接近，色谱峰重叠，从而影响杂质A的测定。为此，发明人经过深入研究发现，采用甲醇水溶液作为流动相，并采用等度洗脱方式，可以有效地分离杂质A。然而，其他流动相，例如乙腈、四氢呋喃和三乙酸溶液等，效果不佳，容易出现分离度低、基线不稳、信噪比低等问题。若采用梯度洗脱方式，容易出现吲达帕胺与杂质A共洗脱导致杂质A的检测信号受到抑制、供试品加标溶液(供试品溶液中加入杂质A标准品)在杂质A出峰处的波动较大等问题。由此，根据本发明实施例的方法可以有效地检测吲达帕胺制剂中杂质A，具有专属性强、准确性高、分离度好、灵敏度高、耐用性好、操作简便、快捷、效率高等优点，适于广泛应用。

根据本发明的实施例，上述吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法还可以具有下列附加技术特征：

根据本发明的实施例，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(70～90)：(10～30)。

根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测所采用的色谱柱为InertsurstainC18，尺寸为250×4.6mm，5μm。

根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测所采用的流速为0.8～1.2L/min。

根据本发明的实施例，所述预处理包括：将所述吲达帕胺制剂与乙腈进行混合，得到提取液；将所述提取液进行过滤，收集滤液，得到所述供试品溶液。

根据本发明的实施例，所述预处理进一步包括：所述收集滤液之后，将所述滤液与水混合，得到所述供试品溶液。

根据本发明的实施例，所述滤液与水的体积比为(0.8～1.5)：1。

根据本发明的实施例，所述混合为振摇1～3分钟。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述杂质A与乙腈进行混合，得到对照储备液；将所述对照储备液与水混合，得到所述对照品溶液；将所述对照品溶液进行所述高效液相色谱检测，检测条件与所述供试品溶液的检测条件相同。

根据本发明的实施例，所述吲达帕胺制剂中含有滑石粉。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种吲达帕胺制剂的质量控制方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：利用前面所述吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法测定吲达帕胺制剂中杂质A的含量；将所得杂质A的含量与阈值进行比较，确定所述吲达帕胺制剂质量是否达标。由此，采用根据本发明实施例的方法可以准确判断出吲达帕胺制剂是否符合要求，从而有效地把控质量。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为实施例1中空白溶剂的色谱图；

图2为实施例1中灵敏度溶液的色谱图；

图3为实施例1中对照品溶液的色谱图；

图4为实施例1中供试品溶液的色谱图；

图5为对比例1中普通高效液相色谱法中对照溶液色谱图；

图6为对比例1中普通高效液相色谱法中杂质A对照品溶液色谱图；

图7为对比例1中普通高效液相色谱法中杂质A的紫外扫描图谱；

图8为对比例1中普通高效液相色谱法中滑石粉溶液色谱图；

图9为对比例1中普通高效液相色谱法中滑石粉中未知杂质(与杂质A保留时间一致)的紫外扫描图谱；

图10为对比例2中液相-质谱联用法中“方法1”下提取溶剂色谱图；

图11为对比例2中液相-质谱联用法中“方法1”下对照品溶液色谱图；

图12为对比例2中液相-质谱联用法中“方法1”下供试品加标溶液色谱图；

图13为对比例2中液相-质谱联用法中“方法2”下提取溶剂色谱图；

图14为对比例2中液相-质谱联用法中“方法2”下空白辅料色谱图；

图15为对比例2中液相-质谱联用法中“方法2”下对照品溶液色谱图；

图16为对比例2中液相-质谱联用法中“方法2”下供试品加标溶液色谱图；

图17为对比例2中液相-质谱联用法中“方法3”下对照品溶液色谱图；

图18为对比例2中液相-质谱联用法中“方法4”下对照品溶液色谱图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提出了吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法和吲达帕胺制剂的质量控制方法，下面将分别对其进行详细描述。

吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法

在本发明的一个方面，本发明提出了一种吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法，杂质A具有如下结构：

根据本发明的实施例，该方法包括：将吲达帕胺制剂进行预处理，得到供试品溶液；将供试品溶液进行高效液相色谱-质谱检测；其中，高效液相色谱检测所采用的流动相为甲醇水溶液，洗脱方式为等度洗脱。

发明人经过深入研究发现，采用甲醇水溶液作为流动相，并采用等度洗脱方式，可以有效地分离杂质A。由此，根据本发明实施例的方法可以有效地检测吲达帕胺制剂中杂质A，具有专属性强、准确性高、分离度好、灵敏度高、耐用性好、操作简便、快捷、效率高等优点，适于广泛应用。

根据本发明的实施例，甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(70～90)：(10～30)。发明人经过深入研究，采用上述配比的甲醇水溶液进行等度洗脱，可以保证杂质A的有效分离，出峰处无干扰、波动小，可实现定量检测，检测限低至0.02ng。

根据本发明的实施例，高效液相色谱检测所采用的色谱柱为Inertsurstain C18，尺寸为250×4.6mm，5μm。发明人对多种色谱柱进行优化，发现采用上述色谱柱可以有效地避免主药或辅料对杂质A造成干扰，杂质A的峰型较好，可以准确地确定其含量，检测限低至0.02ng。

根据本发明的实施例，高效液相色谱检测所采用的流速为0.8～1.2L/min。由此，可以有效地避免主药或辅料对杂质A造成干扰，杂质A的峰型较好，可以准确地确定其含量，检测限低至0.02ng。

根据本发明的实施例，预处理包括：将吲达帕胺制剂与乙腈进行混合，得到提取液；将提取液进行过滤，收集滤液，得到供试品溶液。发明人对多种有机溶剂进行筛选优化时发现，不同有机溶剂对吲达帕胺制剂中的杂质A提取效率有所差异，采用乙腈提取，提取效率较高，检测回收率符合要求。

根据本发明的实施例，混合为振摇1～3分钟。若将吲达帕胺制剂与乙腈采用超声方式混合，虽然也可以实现杂质A的分离，但是，存在回收率低、杂质A容易降解的问题。因此，采用振摇1～3分钟，可以提高杂质A检测的准确性，使得回收率符合要求，避免杂质A降解。

根据本发明的实施例，预处理进一步包括：收集滤液之后，将滤液与水混合，得到供试品溶液。由于纯乙腈提取后的溶液直接进行液相色谱检测的溶剂效应较大，故将滤液与水进行混合后再上样分析。

根据本发明的实施例，滤液与水的体积比为(0.8～1.5)：1。由此，既可以避免产生溶剂效应，也可以保证吲达帕胺不被析出来，便于快速定量分析。若水的添加量过多，吲达帕胺会析出来(吲达帕胺在水中溶解度比较低)，不能直接进样，会增加操作步骤(需过滤后才能进样)。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：将杂质A与乙腈进行混合，得到对照储备液；将对照储备液与水混合，得到对照品溶液；将对照品溶液进行高效液相色谱检测，检测条件与供试品溶液的检测条件相同。

根据本发明的实施例，吲达帕胺制剂中含有滑石粉。滑石粉中有一未知杂质与杂质A的保留时间接近，从而影响杂质A的分离。采用本发明的检测方法可以有效地分离杂质A和该滑石粉未知杂质，实现杂质A的定性和定量检测。

吲达帕胺制剂的质量控制方法

在本发明的另一方面，本发明提出了一种吲达帕胺制剂的质量控制方法。根据本发明的实施例，该方法包括：利用前面所述吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法测定吲达帕胺制剂中杂质A的含量；将所得杂质A的含量与阈值进行比较，确定吲达帕胺制剂质量是否达标。

如前所述，利用前面所述吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法可以实现杂质A的定量检测，检测限低至0.02ng。由此，将检测所得结果与阈值进行比较，从而可以判断出吲达帕胺制剂质量是否达标。

需要说明的是，本发明对于阈值的具体值不做严格限定，可以根据实际需要灵活选择。例如，阈值为10％、5％、1％、0.1％、0.5％、0.01％等。在对吲达帕胺制剂进行质量控制时，也可以包含对主药吲达帕胺含量、其他杂质含量或者其他因素进行质量控制，具体可以根据实际需要灵活选择。

需要说明的是，前面针对吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法所描述的特征和优点，同样适用于该吲达帕胺制剂的质量控制方法，在此不再赘述。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

在该实施例中，采用如下方法检测吲达帕胺片中杂质A：

1、样液制备

空白溶剂：50％乙腈水溶液。

吲达帕胺杂质A对照品储备液(25μg/mL)：取吲达帕胺杂质A对照品适量，精密称定，加入甲醇溶解并定量稀释成每1mL中约含25μg的溶液，作为对照品储备液。

吲达帕胺杂质A对照品溶液(2.5ng/mL)：精密量取对照品储备液适量用乙腈稀释成每1mL中约含5ng的溶液，再取适量与水1:1混合，作为对照品溶液。

灵敏度溶液(0.75ng/mL)：精密量取对照品储备液适量用乙腈稀释成每1mL中约含1.5ng的溶液，再取适量与水1:1混合，作为灵敏度溶液。

供试品溶液：精密称取本品细粉适量(约相当于吲达帕胺5mg)置20mL容量瓶中，加入乙腈5mL，摇匀，过滤，取续滤液与水1:1混合，作为供试品溶液。

2、分别将空白溶剂、对照品溶液、灵敏度溶液和供试品溶液进行高效液相色谱-质谱检测，检测条件如下：

结果如图1-图4所示，可以看出，空白溶剂无干扰、灵敏度溶液信噪比大于10、对照品溶液和供试品溶液峰型良好，检测限可低至0.024ng，稳定性强，重复性好。

对比例1

在该对比例中，以乙腈：四氢呋喃：1.5g/L三乙胺溶液(7:20:73)(磷酸调pH2.8)作为流动相，采用普通高效液相色谱进行检测，实验方法如下：

杂质A对照品溶液：取1ml的0.125mg/l杂质A对照品的乙腈溶液，至10ml容量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液配制：取吲达帕胺片25mg，置10ml容量瓶中，加入1ml乙腈溶解，用水稀释至刻度，振摇15min，在4℃条件下放置1h，过滤，作为供试品溶液。

对照溶液配制：取吲达帕胺片25mg，置10ml容量瓶中，加入1ml的0.125mg/l杂质A对照品的乙腈溶液溶解样品，用水稀释至刻度，振摇15min，在4℃条件下放置1h，过滤，作为对照溶液。

色谱柱：Agela Venusil Plus C18，4.6*150mm，5um

柱温：30℃

流动相：乙腈：四氢呋喃：1.5g/L三乙胺溶液(7:20:73)(磷酸调pH2.8)

流速：1.4ml/min

波长：305nm

进样量：100μl。

结果参见图5，以乙腈：四氢呋喃：1.5g/L三乙胺溶液(7:20:73)(磷酸调pH2.8)作为流动相，检测所得到的对照溶液中的杂质A信噪比为4.6，未达到定量限要求(大于10)。所以，采用上述色谱条件难以实现对杂质A的准确定量检测。

在上步实验条件的基础上，将滑石粉溶液(将滑石粉溶解于乙腈中，用水稀释，浓度为21mg/ml)单独进行液相色谱检测以及紫外扫描。该方法专属性不好，由于片剂中含有滑石粉，滑石粉中有一未知杂质与杂质A保留时间一致，但是最大吸收波长不一致，所以滑石粉中的杂质不是杂质A，滑石粉中的杂质干扰了吲达帕胺片中杂质A的测定(相关色谱图见图6～图9)。

由此，表明以乙腈：四氢呋喃：1.5g/L三乙胺溶液(7:20:73)(磷酸调pH2.8)作为流动相，无法实现定量检测目的，且专属性和灵敏度均不符合要求。

对比例2

如对比例1采用乙腈：四氢呋喃：1.5g/L三乙胺溶液(7:20:73)(磷酸调pH2.8)作为流动相，采用普通高效液相色谱法检测，无法实现定量检测的目的，且专属性不强，灵敏度不高。为此，发明人尝试以甲醇水溶液作为流动相进行梯度洗脱，并采用液相-质谱联用法进行检测分析，具体方法如下：

方法1：

其他条件和检测步骤同实施例1。

检测所得色谱图如图10-12所示，供试品加标溶液在杂质A出峰处未出峰，可能的原因是吲达帕胺与杂质A共洗脱导致杂质A的检测信号受到抑制。

方法2：

检测所得色谱图如图13-16所示，在方法1的基础上降低流动相中甲醇的比例，提取溶剂和空白辅料均在杂质A出峰处无干扰，但供试品加标溶液在杂质A出峰处的波动较大。

方法3：

检测所得色谱图如图17所示，在方法2的基础上调整水相，水相中加入0.2％甲酸，杂质A的响应明显低于优化方法2，此方法不适用。

方法4：

检测所得色谱图如图18所示。在方法2基础上调整水相组成，水相中加入0.1％甲酸和10mM甲酸铵，杂质A的响应显著低于优化方法2，故此方法不适用。

综上所述，采用梯度洗脱方式，通过多次调整流动相的组成，均无法实现较好的检测目的。因此，选择进行等度洗脱。

实施例2

在该实施例中，考察不同提取溶剂及不同提取方式对吲达帕胺片中杂质A测定结果的影响。

1、超声对提取效果的影响

按照实施例2的步骤1.3的方法配制杂质A对照品溶液(2.5ng/mL)。

取吲达帕胺片适量，精密称定后研细，取细粉适量(相当于吲达帕胺5mg)，加入杂质A对照品溶液(2.5ng/mL)10mL，分别考察超声5min、10min、15min对杂质A测定结果的影响，每个条件平行制备两份。同时取吲达帕胺原料药约5mg，精密称定，置10ml容量瓶，用50％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，分别超声5min、10min、15min后测定杂质A的含量。具体结果如下表所示。

表1不同超声时间对杂质A提取效果的影响

由上表结果可以看出，超声5min，检测的回收率较低。若延长至10min，样品间的平行性较差。若继续延长至15min，并不能明显改善样品中杂质A的提取效果。另外API同步超声的结果表明超声15min容易降解产生杂质A。因此，综合考虑，在制备供试品溶液、对照品溶液和灵敏度溶液过程中，均不进行超声处理，搅拌或摇动即可。

2、不同提取溶剂及提取方式对杂质A提取效果的影响

取吲达帕胺片适量，精密称定后研细，取细粉适量(相当于吲达帕胺5mg)，按下表2加入提取溶剂后按下表的提取方式操作后过滤，取续滤液与水1:1混合后进样分析。结果见表2。

表2不同提取溶剂及提取方式对杂质A提取效果的影响

上表结果表明甲醇和50％乙腈作为提取溶剂在搅拌条件下的提取结果均很低，乙腈作为提取溶剂振摇3min后直接过滤的样品测定结果比搅拌30min和60min的高。

本实验最终确定以乙腈作为提取溶剂，摇匀的方式进行提取。由于纯乙腈提取后的溶液直接进样溶剂效应较大，故提取方法以乙腈提取后过滤，取续滤液与水1:1混合后进样分析。

综上所述，采用不同的提取溶剂和不同的提取方式，可以实现杂质A的检测。其中，提取过程中不进行超声处理、采用摇动至混匀方式、提取溶剂选择乙腈效果较佳，其可以有效地提高检测结果的准确性，使得回收率符合要求，减少杂质A的降解。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法，所述杂质A具有如下结构：

其特征在于，所述方法包括：

将吲达帕胺制剂进行预处理，得到供试品溶液；

将所述供试品溶液进行高效液相色谱-质谱检测；

其中，所述高效液相色谱检测所采用的流动相为甲醇水溶液，洗脱方式为等度洗脱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(70～90)：(10～30)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测所采用的色谱柱为Inertsurstain C18，尺寸为250×4.6mm，5μm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测所采用的流速为0.8～1.2L/min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理包括：

将所述吲达帕胺制剂与乙腈进行混合，得到提取液；

将所述提取液进行过滤，收集滤液，得到所述供试品溶液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述混合为振摇1～3分钟；

任选地，所述预处理进一步包括：所述收集滤液之后，将所述滤液与水混合，得到所述供试品溶液；

任选地，所述滤液与水的体积比为(0.8～1.5)：1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括：

将所述杂质A与乙腈进行混合，得到对照储备液；

将所述对照储备液与水混合，得到所述对照品溶液；

将所述对照品溶液进行所述高效液相色谱检测，检测条件与所述供试品溶液的检测条件相同。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吲达帕胺制剂中含有滑石粉。

9.一种吲达帕胺制剂的质量控制方法，其特征在于，包括：

利用权利要求1～8任一项所述吲达帕胺制剂中杂质A的检测方法测定吲达帕胺制剂中杂质A的含量；

将所得杂质A的含量与阈值进行比较，确定所述吲达帕胺制剂质量是否达标。

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