CN110669087A - 两性霉素b肽衍生物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及两性霉素B肽衍生物及其制备方法。本发明两性霉素B肽衍生物以R₂‑AEEAc‑OH为原料，采用固相合成的方式，合成R₂‑(AEEAc)_n‑OH系列化合物，然后通过酰胺键与两性霉素B进行偶联，最后脱除氨基保护基，再经过纯化获得。相比两性霉素B，本发明化合物具有溶解性高，毒性低的特点，抗菌效果良好。

Description

两性霉素B肽衍生物及其制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，涉及到两性霉素B肽衍生物及其制备方法与应用，具体而言涉及到一系列具有较高溶解性，低毒性，较好抗菌活性的两性霉素B肽衍生物及其合成制备与应用。

背景技术

两性霉素B(Amphotericin B,AMB)是一种多烯类广谱抗真菌药，适用于下列真菌感染的治疗：隐球菌病、北美芽生菌病、播散性念珠菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病，由毛霉菌、酒曲菌属和犁头霉菌属等所致的毛霉菌病，由申克孢子丝菌引肝功能检查项目起的孢子丝菌病，由烟曲菌所致的曲菌病等。

自1955年从链霉菌属代谢物中分离得到两性霉素B以来，该化合物就备受瞩目。一方面，两性霉素B是临床上治疗深部真菌感染及全身系统性感染的金标准，并且对于某些致命性全身真菌感染，它是唯一有效的治疗药物；另一方面，在治疗剂量时，两性霉素B有比较严重的毒副作用，例如溶血毒性，肾毒性，神经系统毒性等，而且两性霉素B水溶解性极差，口服该品后自胃肠道吸收少且不稳定，因此临床上两性霉素B的应用受到了极大的限制。

虽然研究表明，作为药物载体的脂质体可以显著降低两性霉素B的毒副作用，两性霉素B脂质体是利用磷脂双分子层膜形成的囊泡包裹药物分子而制成的具有靶向给药功能的新型药物，较普通制剂具有更好的耐受性，一方面它可以较多地分布在肝、脾、肺，而在其它脏器尤其在肾组织内的浓度较低，另一方面，脂质体中的胆固醇成分可降低药物与人体细胞中胆固醇的结合而增强对真菌细胞麦角固醇的结合，对肾脏等的副作用相对较小。但是两性霉素B脂质体类制剂，也存在如下的缺点：一、脂质体类制剂的抗菌活性差于两性霉素B，需要加大治疗剂量，二、脂质体类制剂成本较高，价格比较昂贵，三，脂质体本身的不稳定性，四、脂质体类制剂并没有从根本上消除两性霉素B的肾毒性等毒副作用。

鉴于两性霉素B所述的特点，及两性霉素B化学结构改造的历史，结合发明人掌握的固相合成多肽技术：以两性霉素B为先导化合物，采用固相和液相联合的实验方法，对两性霉素B进行接肽反应，合成一系列两性霉素B肽衍生物，包括NH₂-(AEEAc)n-OH(n为整数，范围为1-20)系列的两性霉素B肽衍生物，在保留其抗菌活性的同时，提高其水溶性，降低其溶血毒性，肾毒性等毒副作用。

发明内容

一方面，本发明涉及具体两性霉素B肽衍生物及其合成制备方法与应用，具体而言涉及到改善两性霉素B溶解性，降低两性霉素B毒性，但同时保留两性霉素B抗菌活性的两性霉素B肽衍生物及其合成制备方法与应用。该两性霉素B肽衍生物通常是指：以R₂-AEEAc-OH为原料，采用固相合成的方式，合成R₂-(AEEAc)n-OH系列化合物，然后通过酰胺键与两性霉素B进行偶联，最后脱除氨基保护基，再经过纯化即可得到目标化合物。

一方面，本发明涉及通式为[Ⅰ]的化合物：

其中，R₁为亲水性多聚物；R₂为Fmoc-，Boc-等氨基保护基或H；R₃为-H或C_1-4的烃基或苯基；R₄为-OH或-H；可供选择地，亲水性多聚物可以为含NH₂-AEEAc-OH单体的NH₂-(AEEAc)n-OH多聚物，在这里n取1-40的整数，较优地，n取2-15的整数，最优地，n为5或6。

在一些方案中，本发明涉及到两性霉素B肽衍生物的合成制备方法。

在一些方案中，本发明涉及到该衍生物在保留抗真菌活性的同时，改善了溶解性及降低了毒性。

在一些方案中，本发明涉及到水溶性多肽化合物，包括但不限于NH₂-(AEEAc)n-OH或多个8-氨基-3,6-二氧杂辛酸通过肽键构成的多肽。

在一些方案中，本发明所指的两性霉素B衍生物是通过酰胺键连接的。

在一些方案中，本发明所提到的两性霉素B衍生物包含：水溶性的多肽，该多肽通过一个稳定的酰胺键与两性霉素B上的糖胺结构相连，因此该类化合物在本文中可以简称为两性霉素B多肽衍生物(DTY-AMB)，在本发明中水溶性多肽指代NH₂-(AEEAc)n-OH。

DTY-AMB也包含C₁₆上羧基被酯化的一类衍生物，比如烃基类酯。NH₂-(AEEAc)n-OH是NH₂-AEEAc-OH及NH₂-AEEAc-OH衍生物的多聚物，一个NH₂-AEEAc-OH及其NH₂-AEEAc-OH的衍生物在本发明专利中被称为“NH₂-(AEEA_C)n-OH的单体”。

在本篇专利中DTY-AMB的可能结构为[Ⅱ]所示的化合物：

R₂为Fmoc-，Boc-等氨基保护基或者H；R₃为-H或C_1-4的烃基或苯基；可供选择地，亲水性多肽可以为NH₂-(AEEAc)n-OH，在这里n为1-20，较优地，n为3-7，最优地，n为5。

在一些方案中，DTY-AMB中亲水性多肽有不同的长度，可能含有1-40个单体，较优地，含有2-15个单体，最优地，含有6个单体，在专利中，DTY-AMB可以含有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39或40个单体。该单体可以为NH₂-AEEAc-OH。

在一些方案中，DTY-AMB中亲水性多肽是NH₂-(AEEA_C)n-OH，NH₂-(AEEA_C)n-OH有不同的长度，可能含有1-20个单体，较优地，含有3-7个单体，最优地，含有5个单体，在专利中，DTY-AMB可以含有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个单体。该单体可能为NH₂-AEEAc-OH

在一些方案中，DTY-AMB的C₁₆位上含有一个游离羧基，或者是羧基的烃基酯，包括甲酯，乙酯，丙酯，苯酯等。

本发明中，含有亲水性多肽NH₂-(AEEA_C)n-OH的DTY-AMB具有较好的抑菌活性，同时由于是通过酰胺键连接的而不易被酶水解。

目前深部真菌感染的主要病原菌仍然是白色念珠菌,耐药现象也最为突出,因此白色念珠菌深部感染的防治也是抗真菌感染研究领域的重点，本发明专利中，含有水溶性多聚物NH₂-(AEEA_C)n-OH的DTY-AMB对白色念珠菌具有良好的抗菌效果。

DTY-AMB可以是药学上可接受的盐的形式。

DTY-AMB可以作为口服制剂的有效药物成分；也可以充当注射用药的有效药物成分，如静脉注射，皮下注射，肌肉注射等；也可以作为局部用药的有效药物成分。

DTY-AMB可以通过现有的医药学技术制成药物有效剂量单位，该有效剂量单位的形式可以为口服，药片，胶囊或液体等剂型。

药物成分可制成含水的制剂，其中水分不低于50％。

口服制剂可以为液体，悬浮液，粉末，药片及胶囊等形式；其中包含各种不同赋形剂(比如：碳酸钙，磷酸钙等)的药片也可以做成崩解制剂。

药物成分可以通过可控的方式进行释放，包括缓释或快速释放，相关药物成分的可控释放剂量可以通过已知的医药学技术进行实现。

药物成分可以包含有0.1％-95％的DTY-AMB(A按重量计算)，较优含量为1％-70％。

图4为DTY-AMB化学合成的总路线图，DTY-AMB的化学合成包括第一步，第二步及第三步。

第一步包括固相合成多肽R₂-NH-(AEEA_C)n-OH及该系列多肽的活化，本发明提供了一种该系列多肽的合成方法。在一些方案中，所述方法包括：合成该系列多肽。在一些方案中，可采用固相合成技术制备该系列多肽，包括：

(1)在树脂上固相合成多肽；

(2)将步骤(1)的产物用弱酸进行裂解，过滤，旋蒸，然后加入适量的有机溶剂溶解多肽，再次旋蒸，重复2-3次，最后用有机溶剂沉淀，干燥，得到目标多肽。

任选地，所述步骤(1)包括如下步骤：

(a)溶胀树脂—投料(首个氨基酸及高位阻碱)—测定树脂取代值—脱除氨基保护基—洗涤—监测—偶联氨基酸—监测—洗涤—脱除氨基保护基—顺序偶联剩余氨基酸—直到最后一个氨基酸，而后只进行洗涤不进行脱除氨基保护基；其中，氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。所述的氨基保护基包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)或9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)，优选9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)。

所述保护基包括但不限于此，可根据具体情况进行合理选择。

所述步骤(a)的投料，即称取适量的R₂-AEEAc-OH及吸取适量的高位阻碱，加入10mLDCM溶解后，投入到反应器中。

所述高位阻碱试剂包括但不限于N,N-二异丙基乙胺(DIEA)。

所述步骤(a)的测定树脂取代值，即分别取适量的偶联上首个氨基酸的树脂(W)于两个EP管中，干燥，脱除氨基保护基，取适量反应液加入过量有机溶剂中(设定稀释倍数为S)，测定301nm的吸光值A，取代值(SD)公式为：SD＝A₃₀₁*S/(7800*W_mg)。

所述步骤(a)的液相环境所用溶剂选自：二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)，优选DCM及DMF。

所述步骤(a)中脱除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂，氨基保护基的脱除剂选用哌啶(PIP)溶液，浓度10-40％(PIP/DMF)，脱除时间为20-50min；优选浓度为20-25％(PIP/DMF)，脱除时间25-35min。

所述步骤(a)中氨基酸的偶联需要加入偶联试剂，偶联试剂由：碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂和1-羟基苯并三唑(HOBt)组成。

所述碳二亚胺型试剂包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。

所述苯并三氮唑鎓盐型试剂包括但不限于2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)。

所述偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，或2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBt)，进一步优选DIC(二异丙基碳二亚胺)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。

所述步骤(a)中的“监测”采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。

所述步骤(a)中的顺序连接氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从C端向N端逐个连接氨基酸。

步骤(2)所述的弱酸切割包括但不限于三氟乙醇，并与二氯甲烷按1:4(V/V)进行配制得到。

第一步反应中的另一部分为含有氨基保护基的多肽的活化，其中多肽中的n为整数，n可为1-20，较优地，n为3-7，最优地，n为5。多肽羧基的活化包括：活化酯法，对称酸酐法，叠氮化法等，优选较为温和的活化酯法；所用的活化试剂：碳二亚胺型试剂或者苯并三氮唑鎓盐型试剂和1-羟基苯并三唑(HOBt)或琥珀酰亚胺(HOSU)组成。所述碳二亚胺型试剂包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)或N-二氨基丙基-N-乙基碳二亚胺(EDC)。所述苯并三氮唑鎓盐型试剂包括但不限于2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-苯并三唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(BOP)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)，优选二异丙基碳二亚胺(DIC)和羟基琥珀酰亚胺(HOSU)；活化时所用的液相体系，溶剂优选有机溶剂，包括DMF，DMSO，DCM，THF等，优选THF四氢呋喃。所述的氨基保护基包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)或9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)，优选9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)；酯的活化在30℃下，1-2小时，加入催化剂量的高位阻碱，有利于活化完全，所述高位阻碱试剂包括但不限于N,N-二异丙基乙胺(DIEA)；经过旋蒸，除去有机溶剂即可得到化合物2。

第二步，化合物2在无水溶剂中，如DMF，DMSO，室温下与两性霉素B进行1-2小时的反应。反应要求避光，较优地，加入催化剂量的高位阻碱，有利于反应完全，所述高位阻碱试剂包括但不限于N,N-二异丙基乙胺(DIEA)；即可得到化合物4，化合物4可以通过半制备型RP-HPLC进行制备纯化。

第三步，对含有氨基保护基的多肽进行脱氨基保护剂，所述的氨基保护基包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Z)或9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)，优选9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)；脱除氨基保护基需要加入氨基保护基的脱除剂，氨基保护基的脱除剂选用哌啶(PIP)溶液，浓度10-40％(PIP/DMF)，脱除时间为20-50min；优选浓度为20-25％(PIP/DMF)，脱除时间25-35min。即可得到化合物5。

另外，5-脱氧两性霉素B也可以代替两性霉素B来充当起始原料，5-脱氧两性霉素B即两性霉素B的R₅部位上有-OH变为-H；相关的5-脱氧两性霉素B可以通过合成得到。

特别有益的是为满足医药用途的质量要求，本发明所提供的两性霉素B肽衍生物的制备方法还可以进一步包括纯化步骤。所采用的纯化方法包括但不限于反相色谱法或离子交换色谱法，优选反相色谱法。

本发明所涉及两性霉素B肽衍生物的体外抗菌活性可以通过测定其最低抑菌浓度(MIC)来鉴定。美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐采用微量肉汤稀释法来测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，培养基采用改良型RPMI-1640培养基。以两性霉素B作为阳性对照。体外活性测定表明，本发明提供的两性霉素B肽衍生物具有较好的抗白色念珠菌活性。

定义

除非另有说明，本申请中所用的下列术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。

本文中的数字范围，是指给定范围中的各个整数。例如“C_1-4”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子。

术语“被取代”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为氧代(即＝O)时，意味着两个氢原子被取代，氧代不会发生在芳香基上。

术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，乙基“任选”被卤素取代，指乙基可以是未被取代的(CH₂CH₃)、单取代的(如CH₂CH₂F)、多取代的(如CHFCH₂F、CH₂CHF₂等)或完全被取代的(CF₂CF₃)。本领域技术人员可理解，对于包含一个或多个取代基的任何基团，不会引入任何在空间上不可能存在和/或不能合成的取代或取代模式。

本文中的C_m-n，是该部分具有给定范围中的整数个碳原子。例如“C_1-6”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。

当任何变量(例如R)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被2个R所取代，则每个R都有独立的选项。

当一个连接基团的数量为0时，比如-(CH₂)₀-，表示该连接基团为共价键。

当其中一个变量选自共价键时，表示其连接的两个基团直接相连，比如A-L-Z中L代表共价键时表示该结构实际上是A-Z。

术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

术语“羟基”指-OH基团。

术语“巯基”指-SH基团。

术语“氨基”指-NH₂基团。

术语“烷基”是指通式为C_nH_2n+1的烃基。该烷基可以是直链或支链的。例如，术语“C_1-6烷基”指含有1至6个碳原子的烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、新戊基、己基、2-甲基戊基等)。类似地，烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基磺酰基和烷硫基的烷基部分(即烷基)具有上述相同定义。

术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。

作为药学上可接受的盐，例如，可以提及金属盐、铵盐、与有机碱形成的盐、与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与碱性或者酸性氨基酸形成的盐等。金属盐的非限制性实例包括但不限于碱金属的盐，例如钠盐、钾盐等；碱土金属的盐，例如钙盐、镁盐、钡盐等；铝盐等。与有机碱形成的盐的非限制性实例包括但不限于与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己基胺等形成的盐。与无机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等形成的盐。与有机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、苹果酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲基苯磺酸等形成的盐。与碱性氨基酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等形成的盐。与酸性氨基酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与天冬氨酸、谷氨酸等形成的盐。

术语“药物成分”是指一种或多种本申请的化合物或其盐与在本领域中通常接受的用于将生物活性化合物输送至有机体(例如人)的赋形剂、稀释剂、或载体的制剂。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本申请的化合物。

术语“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、或载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些赋形剂、稀释剂、或载体。合适的载体、稀释剂及赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且包括诸如碳水化合物、蜡、水溶性和/或水可膨胀的聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等原料。

本申请还包括与本文中记载的那些相同的，但一或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数不同的原子置换的同位素标记的本申请化合物。可结合到本申请化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、¹²³I、¹²⁵I和³⁶Cl等。

某些同位素标记的本申请化合物(例如用³H及¹⁴C标记的那些)可用于化合物和/或底物组织分布分析中。氚化(即3H)和碳-14(即14C)同位素对于由于它们易于制备和可检测性是尤其优选的。此外，用较重同位素(诸如氘(即2H))取代可以提供某些由更高的代谢稳定性产生的治疗优点(例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求)，并且因此在某些情形下可能是优选的。正电子发射同位素，诸如15O、13N、11C和18F可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以测定底物占有率。通常可以通过与公开于下文的方案和/或实施例中的那些类似的下列程序，通过同位素标记试剂取代未经同位素标记的试剂来制备同位素标记的本申请化合物。

本申请的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本申请的实施例。

本申请具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本申请的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本申请的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。

以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面，不是本发明主题的局限。

附图说明

本发明专利中，图1为两性霉素B的化学结构，此结构中包含了一个糖胺结构，糖胺中有一个氨基，亲水性多肽NH₂-(AEEA_C)n-OH可以通过稳定的酰胺键与两性霉素B偶联，一方面改善了两性霉素B的溶解性，另一方面降低了两性霉素B的毒性。

本发明专利中，图2为包含NH₂-(AEEA_C)n-OH的DTY-AMB整体化学结构，NH₂-(AEEA_C)n-OH通过酰胺键与两性霉素B糖胺结构上的氨基进行偶联，该键不容易被酶水解，在体内较稳定。

本发明专利中，图3描述了DTY-AMB化学合成总路线图。

本发明专利中，图4为目标产物DMR005的化学结构图。

本发明专利中，图5为DMR005及AMB的吸收光谱图。图5A.DMR005及AMB(12.7μg/mL)甲醇；B.DMR005及AMB(12.7μg/mL)PBS缓冲盐；C.DMR005(62.4μg/mL)PBS缓冲盐。

具体实施方案

实施例一：DMR005的制备与纯化

亲水多肽结构：Fmoc-AEEAc-AEEAc-AEEAc-AEEAc–AEEAc-OH

DMR005结构：

(1)材料及试剂

2-CTC树脂，取代值0.945mmol/g。

氨基酸为：Fmoc-AEEAc-OH

合成试剂：HATU,DMF,DCM,DIEA,哌啶。

(2)仪器

CS-BIO型多肽合成仪、Waters600半制备型高效液相色谱仪、Beckman离心机、Buchi旋蒸仪。

(3)操作步骤(以1g树脂为例)

a.固相化学合成多肽

称取2-CTC树脂1.00g，置于多肽合成仪反应器中，加入10mLDCM，浸泡1h，称取2-3倍量的Fmoc-AEEAc-OH及吸取4-6倍量的DIEA加入10mLDCM溶解后，投入反应器中，进行反应，反应温度为室温(25℃及其以上，否则延长反应时间)，反应2小时，即第一个氨基酸偶联到了树脂上，然后DCM洗涤树脂6次，测定此时树脂的取代值(SD)；随后加入20％PIP/DMF溶液10ml，混合30min脱除氨基保护基，DMF洗涤树脂6次，偶联第二个氨基酸，称取三倍量的Fmoc-AEEAc-OH，HATU及吸取六倍量的DIEA，加入10mlDMF溶解后，进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，用DMF洗涤树脂6次。而后，即可按照上述偶联第二个氨基酸的方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成。

b.裂解及沉淀

合成结束后，称重树脂肽。按照5mL裂解试剂/1g树脂的比例加入裂解试剂，试剂配比为TFE:DCM＝1:4(V:V)，室温搅拌反应1小时，过滤，旋蒸将滤液蒸干(40℃)，然后加入10mLDCM，再次将液体旋蒸至干，反复进行2-3次；最后加入3mLDCM溶解多肽，加入40mL乙醚，-20℃放置20min，离心弃上清，真空干燥得粗肽。

c.液相反应制备两性霉素B肽衍生物

称取干燥后的粗肽0.1mmol、HOSU0.095mmol、DIC15μL，并加入5mLTHF(25℃，反应2小时)，旋蒸除去THF；加入5mLDMSO溶解反应产物，加入0.095mmol两性霉素B以及7μLDIEA室温下反应1～2小时，加入20％PIP/DMF溶液4ml，反应10～20min，即得到粗产物。

用半制备型RP-HPLC，对粗产物进行纯化。

1纯化

色谱柱：Nano Micro C18制备柱(10mm×250mm,10μm)

流速：5ml/min

检测波长：409nm

流动相：A相：1％HAC/水

B相：1％HAC/乙腈

梯度洗脱程序如表1:

表1梯度洗脱表

用HPLC，对收集产物进行分析

色谱柱：YMC-pack ODS-AQ C18分析柱(4.6mm×250mm,5μm)

流速：1ml/min

检测波长：215,383及405nm

流动相：A相：0.05％TFA/水

B相：0.05％TFA/乙腈

梯度洗脱程序如表2:

表2梯度洗脱表

收集纯度大于90％的目标组分，旋蒸，冷冻干燥。经ESI-MS进行分子量确证，M/Z＝1671(M+Na)⁺与理论分子量相符。

实施例二：含有n个NH₂-AEEAc-OH的两性霉素B肽衍生物的制备与纯化

氨基酸序列：Fmoc-(AEEAc)_n-OH；n＝1-20，n为整数，产物结构如下：

合成NH₂-(AEEAc)_n-AMB的两性霉素B肽衍生物，合成方法参照化合物DMR005，即①采用固相合成法合成Fmoc-(AEEAc)_n-OH；②制备Fmoc-(AEEAc)_n-Osu；③Fmoc-(AEEAc)_n-Osu修饰两性霉素B的氨基，哌啶脱除Fmoc，最终得到NH₂-(AEEAc)_n-AMB的两性霉素B肽衍生物粗品。采用RP-HPLC对粗产物进行纯化；根据化合物总结构式[Ⅱ]，表3列举了化合物的简称及相对分子质量：

表3化合物简称及相对分子质量

名称	n	R	相对分子质量
				NH<sub>2</sub>-AEEAc-AMB	1	H	1069
NH<sub>2</sub>-(AEEAc)<sub>20</sub>-AMB	20	H	3827

实施例三：两性霉素B肽衍生物溶解性的测定

两性霉素B及两性霉素B肽衍生物溶解性的测定，本发明专利中，测定了其在水中的溶解性，结果如表4：

表4溶解性测定结果

化合物	溶解性(mg/mL)
		AMB	<0.001
NH<sub>2</sub>-AEEAc-AMB	<5
		DMR005	>30
NH<sub>2</sub>-(AEEAc)<sub>20</sub>-AMB	>100

结果显示，AMB几乎不溶于水；NH₂-AEEAc-AMB有较低的溶解度，DMR005明显改善了水溶解性；随着NH₂-(AEEAc)_n-OH中n的增大，两性霉素B肽衍生物的溶解度明显增大。但与此同时，抑菌活性明显下降(抑菌活性结果见表5)，甚至无抑菌活性。n为3-7时，溶解度和抑菌活性处于较好的平衡。

实施例四：两性霉素B肽衍生物的稳定性

AMB母体结构的三个不稳定部位—分别为C₁₃位半缩醛结构，七个共轭双键结构及C₁₉位β-糖苷键结构，故药典中规定两性霉素B采用避光、冷藏的方式进行贮藏。本专利制备的两性霉素B肽衍生物是在两性霉素B结构上进行了修饰，故也存在相似的降解途径。①在甲醇溶液中(室温12h)，两性霉素B肽衍生物C₁₃位半缩醛结构会被甲基化；②在低pH(如TFA)下，容易产生m/z 801的杂质，推测其C₁₉位β-糖苷键结构断裂；③在避光室温条件下，其水溶液共轭七烯键很容易氧化，而低温(-20℃)避光条件下，化合物共轭七烯键只有轻微的氧化，故制备的两性霉素B肽衍生物也采取避光、冷藏的方式进行贮藏；同时试验表明两性霉素B与亲水性多肽之间的酰胺键非常稳定，在4℃，25℃下，以水，PBS为溶剂，样品在放置4h、12h、24h、48h后，采用RP-HPLC(215，383，405nm)未检测到断裂的亲水性多肽。

实施例五：体外抗菌活性测定

根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(MIC)，细菌培养基采用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基，白色念球菌培养基采用Hyclone改良型RPMI-1640培养基。

具体步骤为：

(1)抗菌药物贮存液制备：

精确配制浓度为320μg/ml的DMR005及DMR006和阳性对照品两性霉素B配制好的各贮存液置于－20℃环境中避光保存备用。

(2)培养基的配制：

真菌生长培养基采用改良马丁培养基，具体配制方法如下：1L培养基中含有2％葡萄糖、0.2％酵母浸出粉、0.5％鱼粉蛋白胨、0.05％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾，按上述比例称取相应量的各物质，溶解于一定量纯净水之后，定容至1L，调pH至7.2，加入2％琼脂，121℃高温灭菌30min。

真菌MIC测试采用Hyclone改良型RPMI-1640培养基，具体配制方法如下：称取18.00g葡萄糖溶于一定量纯净水中，定容到500ml，115℃高温灭菌15min。在无菌环境中，向已灭菌的葡萄糖溶液中加入500ml RPMI-1640培养基，混合后4℃贮存备用。

(3)接种物的制备：

挑取在平板上生长48h的真菌单菌落，转接到改良型马丁培养基的斜面培养基上，28℃孵育24h，增菌后处于对数生长期的菌液用Hyclone改良型RPMI-1640液体培养基调整其浊度达到0.5麦氏标准，相当于每毫升含1×10⁶～5×10⁶CFU(colony-forming unit)，取此菌悬液用Hyclone改良型RPMI-1640液体培养基进行1：20稀释后，再进行1：50稀释作为待接种物，菌悬液浓度相当于1×10³～5×10³CFU/ml。

(4)稀释抗菌药物的制备及菌液接种：

取一块96孔板，在第1孔中加入160μL RPMI-1640液体培养基，第2-12孔中各加入100μL RPMI-1640液体培养基，然后向第1孔加入抗菌药物原液(320μg/ml)40μL，混匀，接着吸取100μL至第2孔，混匀后再从第2孔中吸取100μL至第3孔，如此连续倍比稀释至第10孔，并从第10孔中吸取100μL弃去，然后向第1-10孔及第12孔中加入上述制备好的接种物各100μL，使每孔最终菌液浓度约为2.5×10³CFU/ml。第1-10孔药物浓度分别为32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml，第11孔为不含抗菌药物及接种物的空白对照，第12孔为不含抗菌药物的阴性对照。

(5)孵育

接种真菌的96孔板置于28℃空气孵箱中孵育40～50h。

(6)结果

以肉眼观察，无真菌生长的最低药物浓度即为该样品的最低抑菌浓度(MIC)。各抗菌肽的MIC测定结果如表5所示。

表5 MIC测定结果

化合物	MIC(μmol/L)
		AMB	1.08
NH<sub>2</sub>-AEEAc-AMB	1.87
		NH<sub>2</sub>-(AEEAc)<sub>2</sub>-AMB	1.65
NH<sub>2</sub>-(AEEAc)<sub>3</sub>-AMB	1.47-2.94
		NH<sub>2</sub>-(AEEAc)<sub>4</sub>-AMB	1.33-2.66
DMR005	1.21-2.43
		NH<sub>2</sub>-(AEEAc)<sub>6</sub>-AMB	2.23-4.46
NH<sub>2</sub>-(AEEAc)<sub>7</sub>-AMB	2.02-4.12
		NH<sub>2</sub>-(AEEAc)<sub>8</sub>-AMB	3.84
NH<sub>2</sub>-(AEEAc)<sub>9</sub>-AMB	7.18
		NH<sub>2</sub>-(AEEAc)<sub>10</sub>-AMB	6.74

实施例六：体外溶血活性测定

1.材料及试剂

无菌脱纤维羊血，NaH₂PO₄.2H₂O，Na₂HPO₄.12H₂O，NaCl

2.仪器设备

Allegra X-22R型低温高速离心机，电子天平，微量移液器，SHP-150型生化培养箱，96well，酶标仪

3.实验方法

(1)PBS(磷酸缓冲盐生理盐水)缓冲液的配制

0.2mol/L NaH₂PO₄·2H₂O母液配制：准确称取NaH₂PO₄·2H₂O 3.12g，加纯净水搅拌溶解后，定容至100ml。

0.2mol/L Na₂HPO₄·12H₂O母液配制：准确称取Na₂HPO₄·12H₂O14.32g，加纯净水搅拌溶解后，定容至200ml。

0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液：取100ml 0.2mol/L Na₂HPO₄·12H2O母液，用0.2mol/L NaH₂PO₄·2H₂O母液将其pH值调至7.4，量取50ml上述缓冲液用纯净水稀释20倍，再称取9.00g NaCl加入其中。

0.01mol/L pH8.0的PBS缓冲液：取100ml 0.2mol/L Na₂HPO₄·12H₂O母液，用0.2mol/L NaH₂PO₄·2H₂O母液将其pH值调至8.0，量取50ml上述缓冲液用纯净水稀释20倍，再称取9.00g NaCl加入其中。

(2)受试物的制备

准确称量待检测的两性霉素B肽衍生物样品，用pH 7.4的PBS缓冲液配制成浓度为2.56mg/ml的待测液，-20℃冷藏备用。准确称取两性霉素B，首先用DMSO配置成5.12mg/mL，然后用用pH 7.4的PBS缓冲液稀释成12.8μg/ml的待测液。

(3)羊血红细胞的处理

取无菌脱纤维羊血数毫升，加入约10倍量的pH 7.4的PBS缓冲液，摇匀，1500r/min离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用pH 7.4的PBS缓冲液按照上述方法洗涤2-3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用pH 7.4的PBS缓冲液配成2％的混悬液，供试验用。

(4)溶血毒性测定步骤

取一块96孔板，在第1-11孔中加入100μLpH 7.4的PBS缓冲液，在12孔加入100μL双蒸水，然后向第1孔加入抗菌药物原液(51.2μg/ml)100μL，混匀，接着吸取100μL至第2孔，混匀后再从第2孔中吸取100μL至第3孔，如此连续倍比稀释至第10孔，并从第10孔中吸取100μL弃去，然后向第1-10孔及第11孔中加入上述制备好的接种物各100μL2％的红细胞混悬液，使每孔最终红细胞浓度约为1×10⁸CFU/ml。第1-10孔药物浓度分别为12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml、0.1μg/ml、0.05μg/ml、0.0125μg/ml，第11孔为2％的红细胞混悬液的阴性对照，第12孔为含2％的红细胞混悬液的阳性对照。最后置于37℃的恒温箱中温育1h。

(5)孵育

温育1h后，取出96well，600r/min离心15分钟，取上清用酶标仪测定540nm下的OD值。按照下列公式计算溶血率，其中阴性对照为PBS，阳性对照为双蒸水。溶血率＝(试品OD-阴性OD)/(阳性OD-阴性OD)

(6)结果

两性霉素B肽衍生物的体外溶血毒性结果见表6。

表6体外溶血毒性结果

实施例七：AMB及DMR005光谱性质和自聚集特征

1.材料及试剂

NaCl，KCl，Na₂HPO₄·12H₂O，KH₂PO₄，DMSO，CH₃OH。

2.仪器设备

电子天平，恒温水浴槽,UV1800紫外可见分光光度计。

3.实验方法

(1)PBS(磷酸缓冲盐生理盐水)缓冲液的配制

PBS，pH7.4，1L：

磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g

磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)：3.85g

氯化钠(NaCl)：8.00g

氯化钾(KCl)：0.20g

加水约800mL充分搅拌溶解，然后加入盐酸调pH至7.4，定容到1L。

(2)受试物的制备

贮备液1：准确称量待检测的DMR005，用DMSO配制成浓度为1.28mg/ml的溶液；-20℃冷藏备用；

贮备液2：准确称取AMB，用DMSO配置成1.28mg/mL的溶液，-20℃冷藏备用；

贮备液3：准确称量待检测的DMR005，用pH7.4的PBS缓冲液配制成浓度为2.56mg/ml的溶液，-20℃冷藏备用。

(3)测定步骤

取20μl贮备液1和贮备液2分别加入2ml甲醇或2ml PBS缓冲盐(消除DMSO的影响)作为待测溶液；分别取20，30，40及50μl的贮备液3加入到2ml PBS缓冲盐中，作为待测溶液；上述待测溶液30℃温育30分钟，进行UV-Vis光谱测定，记录每个样品300-430nm范围内UV-Vis光谱数据。

(4)结果

AMB及DMR005的光谱图结果见图5。图5A.DMR005及AMB(12.7μg/mL)甲醇；B.DMR005及AMB(12.7μg/mL)PBS缓冲盐；C.DMR005(62.4μg/mL)PBS缓冲盐。

文献报道AMB在PBS缓冲液中存在多个形式，即单体形式、可溶性自聚集以及不可溶的自聚集。而吸光度A348/A409的比率已被用作AMB自聚集(s)的衡量指标；由上图可知，AMB以及DMR005在甲醇溶液中不会产生自聚集(图5A)；在相同的浓度(12.7μg/mL)下，AMB在409nm处的吸收和光谱形状显示：AMB具有明显的自聚集现象，然而，衍生物DMR005单体形式的比例很高不存在自聚集现象(图5B)；在更高的浓度(62.4μg/mL)下，在409nm处的吸收和光谱形状显示：衍生物DMR005单体形式的比例仍很高，略微存在自聚集现象(图5C)。

实施例八：体外HEK293T细胞毒性测定

1.材料及试剂

HEK293T细胞，NaCl，KCl，Na₂HPO₄·12H2O，KH₂PO₄，MTT，DMEM。

2.仪器设备

电子天平，微量移液器，多功能酶标仪，A2型生物安全柜，微孔板恒温振荡器，CO2培养箱，离心机，倒置显微镜，恒温水浴槽。

3.实验方法

(1)PBS(磷酸缓冲盐生理盐水)缓冲液的配制

PBS，pH7.4，1L：

磷酸二氢钾(KH2PO4):0.27g

磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O):3.85g

氯化钠(NaCl):8.00g

氯化钾(KCl):0.20g

加水约800mL充分搅拌溶解，然后加入盐酸调pH至7.4，定容到1L。

(2)受试物的制备

准确称量待检测的DMR005，用无菌pH7.4的PBS缓冲液配制成浓度为3.00mg/ml的待测液(使用无菌注射器及0.22μm滤头，在超净工作台中过滤)，-20℃冷藏备用。准确称取两性霉素B，用DMSO配置成10.24mg/mL，然后用pH 7.4的PBS缓冲液稀释成1.024mg/mL的待测液(用无菌pH7.4的PBS缓冲液在超净工作台中稀释)。

(3)细胞肾毒性测定步骤及孵育

收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul，铺板使待测细胞调密度至0.5×10⁴细胞/孔(边缘孔用无菌PBS填充)，5％CO2，37℃孵育过夜。至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，弃去上清液，再加入梯度浓度的药物，共8个浓度梯度，每孔100ul，设1个复孔，5％CO₂，37℃孵育24-48小时，倒置显微镜下观察。弃去上清液，再每孔加入10ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4-6h。吸去孔内培养液，每孔加入100ul二甲基亚砜，置微孔振荡器上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 580nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，阳性对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养基、MTT、二甲基亚砜)，1％二甲基亚砜对照孔(细胞、培养基、MTT、二甲基亚砜)。

(4)结果

AMB及DMR005的体外肾毒性结果见表7。

表7体外肾毒性结果

化合物	EH(μg/mL)
		AMB	6.4
DMR005	1500

根据本发明所公开的内容，在此所公开并要求保护的所有组合物和/或方法均无需进行过多实验即可进行制备和实施。虽然根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但对本领域技术人员而言，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对在此所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。

本文所引用的所有文献的公开内容通过引用结合于此，引用程度为，他们提供示例性的、程序上和其他的细节补充本文所述内容。

Claims (10)

1.式[Ⅰ]所示的化合物或其药用盐：

其中，R₁选自亲水性多聚物；

R₂选自氨基保护基或H；

R₃选自-H或C_1-4的烃基或苯基；

R₄为-OH或-H；

可选择地，所述亲水性多聚物可以为NH2-(AEEAc)n-OH多聚物，其中n取1-40的整数，较优地，n取2-15的整数，最优地，n为5或6。

2.根据权利要求1所述的化合物或其药用盐，所述氨基保护基为Fmoc-或Boc-。

3.权利要求1所述的化合物或其药用盐，与两性霉素B(AMB)相比，具有改善的溶解性和/或毒性。

4.式[II]所示的化合物或其药用盐：

其中，n取1-40的整数，较优地，n取2-15的整数，最优地，n为5或6，R₂为Fmoc-，Boc-等氨基保护基或-H；R₃为-H或C_1-4的烃基或苯基。

5.根据权利要求4所述的化合物或其药用盐，其中，R3选自-H，甲基，乙基，丙基，1-甲基乙基，丁基，1-甲基丙基，2-甲基丙基，1,1-二甲基乙基或苯基。

6.式[III]所示的化合物或其药用盐：

7.制备权利要求1-6任一项的化合物或其药用盐的方法。

8.根据权利要求7所述的方法，包括以两性霉素B为先导化合物，采用固相和液相联合的方法对两性霉素B进行接肽反应，获得两性霉素B肽衍生物。

9.根据权利要求7所述的方法，包括：

a)固相合成多肽R₂-NH-(AEEA_C)n-OH；

b)活化该多肽；

c)将活化产物与两性霉素B反应；

d)对含有氨基保护基的多肽进行脱氨基保护剂。

10.权利要求1-6任一项的化合物或其药用盐用于制备药物的用途。

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