CN110582291A - 抗pd1/pd-l1/pd-l2抗体的反应性标志物和功效改善用调节剂 - Google Patents

抗pd1/pd-l1/pd-l2抗体的反应性标志物和功效改善用调节剂 Download PDF

Info

Publication number
CN110582291A
CN110582291A CN201780079668.1A CN201780079668A CN110582291A CN 110582291 A CN110582291 A CN 110582291A CN 201780079668 A CN201780079668 A CN 201780079668A CN 110582291 A CN110582291 A CN 110582291A
Authority
CN
China
Prior art keywords
species
composition
patient
cancer
cag
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780079668.1A
Other languages
English (en)
Inventor
L·齐特沃格尔
B·鲁蒂
E·勒查特勒
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gustavus Institute
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Sud
Original Assignee
Gustavus Institute
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Sud
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gustavus Institute, Institut National de la Recherche Agronomique INRA, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Universite Paris Sud filed Critical Gustavus Institute
Publication of CN110582291A publication Critical patent/CN110582291A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及与ICB治疗的反应或抗性相关的肠道微生物群特征，特别是抗PD1或抗PD‑L1或抗PD‑L2抗体。特别地，本发明涉及用于鉴定良好响应者的治疗诊断方法，可以向其施用抗PD1或抗PD‑L1或抗PD‑L2，同时基于FMT和/或免疫原性益生菌的预处理是建议表现出菌群失调的不良响应者。特别地，本发明涉及作为主要共生物种的Akkermansia muciniphila，其区别对应于进展者及其单独使用或与希氏肠球菌(E.hirae)一起用于治疗抗生素或肠道功能不全相关的菌群失调。

Description

抗PD1/PD-L1/PD-L2抗体的反应性标志物和功效改善用调 节剂
【发明领域】
本发明涉及抗癌治疗领域。特别地，本发明涉及肠道微生物群在癌症治疗功效中的作用，并提供用于确定患者是否可能从癌症治疗中受益的方法，更确切地说，包括单独或与CTLA4一起施用针对免疫关卡阻断剂PD1，PD-L1或PD-L2的抗体的治疗。本发明还提供益生菌以改善这种治疗在有此需要的患者中的功效。
【背景和现有技术】
胃肠道代表免疫系统的最大区域。它暴露于食物，共生抗原，是许多病原体进入的门户。统称为肠道微生物群的一百万亿个生物(主要是细菌，噬菌体，还有古细菌，真菌和寄生虫)在人体肠道中定殖 (Hugon等，2016)。肠道微生物群包括以增加的密度(从顶部到底部)定殖人胃肠道的微生物群体，并且已经显示在人类健康中起关键作用(Blaser，2016；Gensollen等，2016)。事实上，肠道微生物群发挥着无数的基本功能，例如提供能量来源的营养物质的降解，异生素的消除，免疫系统的教育，上皮细胞的生长和终末分化，肠道蠕动，以及生产抗菌肽以根除病原体并确保定植抗性(Goodrich等，2016； Rooks和Garrett，2016)。
对人类肠道微生物组的研究表明，健康个体拥有多样化的微生物种群，肠道微生物群的组成因人而异，可能对健康和疾病产生影响。大多数细菌分类群属于硬壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门 (Bacteroidetes)，属于放线菌门(Actinobacteria)，变形杆菌门 (Proteobacteria)，疣微菌门(Verrucomicrobia)和梭杆菌门 (Fusobacteria)的细菌也有代表。我们对肠道微生物的遗传和功能多样性的了解远未完成。由qPCR或FISH分析组成的旧细菌鉴定方法既不全面，也不具体，也不够敏感。最近的知识爆发来自目标16S rRNA基因分析，远远超出了宏基因组鸟枪法测序，这是一种昂贵的重数据挖掘方法(Nielsen etal，2014)，因为它可以识别所有存在的微生物物种(已知或未知)数据库中存在的参考基因组)及其编码能力。已经报道了人肠道微生物组中参考基因的目录，收集来自MetaHIT，人类微生物组计划HMP和大型中国糖尿病研究的数据，以及被认为可能是人类肠道来源的>3400个测序的原核基因组。这个9,879,896个基因的非冗余参考目录可通过互联网免费访问(人体肠道微生物组的综合参考目录)，数据可在GigaScience数据库上获得(Li等，2014)。我们可能已达到核心基因内容和功能的饱和覆盖。值得注意的是，超过50％的受试者中存在的基因数量仍然低于300,000，指出个体特异性基因的优势。个体特异性基因在细胞壁/膜/包膜生物发生和DNA复制，重组和修复的类别中富集。常见基因富含功能，如信号转导机制，能量产生，碳水化合物转运和代谢，以及氨基酸转运和代谢。
肠道微生物组，肠上皮细胞和宿主免疫系统之间共生的扰动与各种免疫病理学和慢性炎症(包括癌症)相关。因此，肠道微生物群的组成与营养不良，肥胖和慢性炎症性疾病如NASH和IBD有关(Pigneur 和Sokol，2016；Raoult，2016)。显而易见的是，肠道微生物群不仅介导对病原体定植的抗性，还通过促进不同T细胞表型的分化来调节免疫功能，这可能解释自身免疫或特应性疾病，例如类风湿性关节炎和哮喘(Arrieta等，2015年)。来自Zitvogel小组的先前研究已经表明，肠道微生物群可以影响对全身性癌症化疗的免疫应答，并且肠道微生物组的破坏与对癌症治疗的抗性相关(Viaud等人，2013；WO 2015/075688)。Pamer等人还报道了异基因造血干细胞移植过程中移植物抗宿主病和移植物抗白血病的作用与肠道微生物群落的多样化组成有关，两者之间存在致病关系(Shono等，2016；Taur等，2015)。
肺癌(LC)仍然是任何癌症死亡的最常见原因，据估计，全球近160万人死亡，法国每年约有3万人死亡(Fidler等，2016)。这种疾病谴责年轻人，中位年龄为50-55岁，并处于"未满足的医疗需求"之中。在过去十年中，肿瘤生物学，基因组学技术，计算分析和药物发现方面的进展推动了LC中转化和临床癌症研究的进展。LC成为定制靶向治疗的原型，特别是使用免疫关卡阻断剂(ICB)的免疫疗法，例如针对CTLA-4的单克隆抗体(mAb)和靶向T细胞抑制受体或配体的 PD1/PD-L1(Garon，2015)。已经在I期试验中研究了2种mAb阻断 PD1受体(纳武单抗和派姆单抗)和3种mAb中和PD1配体(PD-L1) (Atezolizumab，德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗)。117例鳞状非小细胞液相色谱(NSCLC)的一项II期试验显示，纳武单抗导致15％的客观反应率，中位反应时间为3.3个月(Rizvi等，2015)，而两项开创性III 期随机试验在顺铂耐药鳞状细胞(SQ)和非鳞状(NSQ)NSCLC患者中，与二线多西紫杉醇相比，纳武单抗组的总生存期(OS)也有益 (SQ：中位OS＝9.2个月对6个月，对于NSQ：18个月的OS率＝39％对23％)。2015年3月，纳武单抗终于成为第1个在晚期SQ NSCLC 中批准的关卡抑制剂，在铂类化疗期间或之后进展。这些创新和昂贵的治疗的第1个限制是相对较低且不可预测的功效。只有少数参数如肺癌细胞上PD-L1的阳性表达(约25％病例)以及LC的高突变负荷似乎与对抗PD1mAb的高反应率相关。其次，通常观察到严重的不良事件(疲劳(4％)，肺炎(3％)和腹泻(3％))。尽管CTLA-4和 PD1的共同阻断显著增加了客观反应产量，但这些相关性导致更高的毒性，尤其是暴露于共生微生物群(例如肠道)的位点的免疫相关不良事件(irAE)(Berman等人，2010)。在20％的病例中，IrAE可以是III-IV级，近5％的病例会危及生命，从而导致治疗过早中断 (Champiat等，2016)。重要的是，尽管以低调节性Treg数和特定遗传性状为特征，但迄今为止无法有效预测或预防irAE。然而，患者会产生针对肠道微生物组的抗体，这表明肠道共生体或细菌抗原可能对这些irAE产生影响。
因此，预测ICB的主要耐药性和ICB功效与肠道毒性的解偶联代表了一种未满足的医学需求，其挑战了免疫关卡阻断剂治疗LC(或任何其他癌症，如肾细胞癌，头颈肿瘤，膀胱癌)的未来发展，以及所有适合抗PD1/PD-L1抗体或与化疗联合的肿瘤)。
Zitvogel等探讨了癌症疗法(细胞毒素和ICB)如何改变这种共生共生关系。三年前，Zitvogel的小组和其他人报告了肠道微生物群在有效治疗癌症(如环磷酰胺，铂盐)的背景下引发对宿主有益的先天性和适应性免疫反应的重要作用(Pitt等，2016；Viaud等人，2013；WO 2015/075688；WO 2016/063263)。通过损害肠道完整性，化学治疗剂增强肠道通透性，有利于不同免疫原性细菌(即希氏肠球菌(E.hirae)) 的选择性易位，诱导肿瘤微环境的显著变化(骨髓细胞氧化还原和效应TH1细胞的积累)。此外，ICB和免疫调节剂(抗IL-10R，TLR9L) 也影响肠粘膜的脆弱共生，有利于出现有利于影响肿瘤微环境张力的不同细菌物种。事实上，Zitvogel的小组研究了一流的免疫关卡阻断剂抗-CTLA-4 Ab/伊匹单抗，显示了微生物群(拟杆菌目(Bacteroidales) 和Burkholderiales)在其抗肿瘤免疫和临床效果中的强制作用以及这种作用对小鼠亚临床结肠炎的共生的预防作用(Vetizou等，2015；WO 2016/063263)。同时，Gajewski小组证明了双歧杆菌在成熟的瘤内树突细胞中的作用，允许肿瘤床中抗癌T细胞的扩增和抗PD-L1 Ab的活化(Sivan等，2015)。在所有这些模型系统中，研究人员表明ICB 无法在无菌小鼠中或在无特定病原体条件下饲养的啮齿动物中施用广谱抗生素后介导抗肿瘤作用。因此，更好地了解ICB治疗肺癌期间进入门口的粘膜免疫和免疫，上皮，微生物串扰可能为解释癌症患者对 ICB或化疗的耐药性开辟了新的途径。
在下面公开的实验数据中，发明人显示抗生素摄入损害了被诊断患有晚期癌症的个体对PD1/PD-L1阻断的反应，然后鉴定了癌症(例如肺癌或肾细胞癌)中的称为"菌群失调"(发现与预后不良有关)的肠内容物的典型癌症相关微生物指纹。这种预后可以通过同种异体粪便微生物移植(FMT)来自健康个体的粪便，或通过施用益生菌组合物，例如选自下列的细菌组合物来改善：希氏肠球菌(Enterococcus hirae)，Akkermansia muciniphila，Alistipes以及青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，梭菌目(Clostridialesspp.)物种，罗斯氏菌属(Roseburia)，布劳特氏菌属(Blautia)，粪杆菌属(Faecalibacterium)，瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)，Christensenella minuta，粘液真杆菌(Eubacterium limosum)，和/或选自下列的免疫原性细菌：史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，Barnesiella intestinihominis，脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，Collinsella intestinalis，Dielma fastidiosa，Flavonifractor plautii，Actinotignum schaalii和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)。
本发明人还鉴定了与ICB治疗的反应或抗性相关的肠道微生物群谱，特别是抗PD1或抗PD-L1或抗PD-L2抗体，以及相关的血液谱。因此，他们提出了一种诊断方法，用于鉴定良好的响应者，可以给予抗PD1或抗PD-L1或抗PD-L2抗体，同时基于FMT和/或益生菌的预处理是建议表现出菌群失调的不良响应者。
【发明内容】
本发明涉及益生菌组合物，其设计用于改善对有此需要的患者的基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的反应。根据本发明的益生菌组合物包含选自下组的一种或几种细菌的分离物：希氏肠球菌 (Enterococcus hirae)，Akkermansia muciniphila，Alistipesshahii，其他Alistipes物种如Alistipes indistinctus及其混合物。
根据一个实施方式，所述组合物包含选自下列的至少2种，至少 3种，至少四种或至少5种细菌物种：硬壁菌门(Firmicutes)物种，梭菌目(Clostridiales)物种，Alistipes物种，真杆菌属(Eubacterium) 物种，拟杆菌目(Bacteroidales)物种，史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，Akkermansia muciniphila和希氏肠球菌(Enterococcushirae)。根据本发明，可以用于在接受基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的癌症患者中诱导免疫刺激的特定组合物是包含希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和/或Akkermansiamuciniphila和/或Alistipes的细菌组合物。
根据一个实施方式，所述组合物包含选自下组的至少2种，至少3种，至少四种或至少5种细菌：希氏肠球菌(Enterococcus hirae)， Akkermansia muciniphila，Alistipesindistinctus，真杆菌属(Eubacterium) 物种(如粘液真杆菌(Eubacterium limosum))，硬壁菌门(Firmicutes) 物种(如Christensenella minuta，Dielma fastidiosa)，Bacteroidesia(如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，Bacteroides salyersae，Barnesiella intestinihominis)，放线菌门(Actinobacteria)(如Collinsellaintestinalis， Collinsella tanakaei，Actinotignum schaalii)和古细菌史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)。
根据本发明，可以用于在接受基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的癌症患者中诱导免疫刺激的特定组合物是包含希氏肠球菌 (Enterococcus hirae)和/或Akkermansiamuciniphila和/或Alistipes的细菌组合物。
根据另一方面，本发明涉及一种体外治疗诊断方法，用于确定癌症患者是否可能是对基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的良好响应者，包括：
(i)在来自所述患者的粪便样品中评估选自表1和表2中公开的微生物种类的至少10种微生物物种的相对丰度；
(ii)对于每种微生物，将步骤(i)中测量的相对丰度与预定阈值进行比较，
其中表1(下文)中公开的微生物种类的过表现和表2(下文)中公开的微生物种类的低表现表明患者可能是对基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的良好响应者。
设计用于容易地执行上述方法的工具也是本发明的一部分，例如包含对于在该方法的步骤(i)中待检测的每种微生物物种特异的核酸探针的核酸微阵列，例如一组包含引物对的引物，用于扩增对所述方法的步骤(i)中待检测的每种微生物种类特异的序列。
本发明还涉及免疫原性组合物，其包含选自下组的细菌片段：硬壁菌门(Firmicutes)物种，梭菌目(Clostridiales)物种，Alistipes物种，真杆菌属(Eubacterium)物种，拟杆菌目(Bacteroidales)物种，史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，Akkermansia muciniphila和希氏肠球菌(Enterococcushirae)及其混合物，用作对癌症患者施用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的辅佐物。
根据另一个重要方面，本发明涉及同种异体正常志愿者或响应患者衍生的粪便微生物群组合物用于与基于抗PD1/PD-L1 Ab的疗法组合治疗癌症的用途。具有这种组合物的粪便微生物移植(FMT)特别适用于通过本发明的治疗诊断方法改善对被鉴定为不良响应者的患者的抗PD1/PD-L1/PD-L2抗体的应答率。
用于在接受基于抗PD1/PD-L1 Ab的疗法之前确定个体是否需要具有细菌组合物和/或通过FMT的细菌组合物的治疗方法也是本发明的一部分。
本发明还涉及用于离体确定癌症患者是否可能受益于基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2Ab的疗法的治疗的方法，包括评估来自所述患者的血液样品中针对下列细菌的记忆Th1或Tc1的存在：洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)，Akkermansia muciniphila，希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和/或脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的细胞，其中存在针对洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)， Akkermansia muciniphila和希氏肠球菌(Enterococcus hirae)的记忆 Th1或Tc1细胞表明患者可能是对所述治疗的良好响应者，并且存在针对脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的记忆Th1细胞表明患者可能是不良响应者。
【附图说明】
图1：肾细胞癌患者的Kaplan Meier无进展生存(PFS)曲线。70 例转移性肾细胞癌患者接受纳武单抗(ICB)治疗，根据抗生素(ATB，上图)或质子泵抑制剂(PPI，下图)共同治疗(均在首次注射ICB之前一至两个月内服用)PD1/PD-L1阻断后1个月开始)。
图2：评估膀胱癌患者ATB(+)组与ATB(-)组患者PFS的 Kaplan-Meier方法。42例转移性膀胱尿路上皮细胞癌患者接受抗 PD-L1抗体治疗(ICB)，根据抗生素(ATB)联合治疗(在首次注射ICB前1至2个月内服用，并在PD-开始后1个月内服用)L1封锁)。
图3：癌症队列中对比的147MGS的热图/层次聚类。热图颜色代码：在3个癌症群组上选择的147MGS的p值的log10转换后进行热图。为了将"癌症"物种与"健康"物种区分开来，"健康"的价值观正相反为正值。因此，健康物种出现在顶部，而癌症物种出现在底部。行颜色代码(标记为R的列)：颜色表示根据387个对照个体鉴定的高和低丰度MGS，没有诊断出癌症(Spearman相关|ρ|＞0.3，p值＜2e-05)。 |ρ|使用3色梯度代码＞0.3、0.4和0.5，深色表示更高的相关性。癌症患者被诊断患有早期乳腺癌，或转移性肺癌或转移性肾癌(3种癌症类型)。
图4：癌症队列中对比的43种"健康"物种的热图/层次聚类。从热量图中提取，如图3所示。
图5：癌症队列中对比的104个"癌症"物种的热图/层次聚类。从热量图中提取，如图3所示。
图6：27个对比和相干物种的热图/层次聚类至少在2个不同的癌症队列中(3种癌症类型中)。
图7：在癌症患者队列(C)和健康对照组(H)之间发现的MGS 的条形码和p值(基因计数(GC)*)。
图8：PD1阻断期间MGS进化的动力学。在使用抗PD1/PDL1抗体治疗期间，MGS的条形码在肺癌V1(开始前)和汇集的肺+膀胱 V4(治疗6个月)患者之间形成对比。
图9：MGS的条形码对比汇集的肺+肾R(响应者)/NR(无响应者)样本，无论抗生素和诊断时(用抗PD1抗体治疗前)
图10：在PD1阻断之前FMT转移到ATB处理的肿瘤携带者 (AVATAR小鼠)中的实验设置。将具有肺癌患者粪便的FMT进行到携带已建立的MCA205WT的ATB处理的小鼠中(2个实验)。
图11：接种于5名SPF受体或5名接受来自进展者(A)或来自应答(D)NSCLC患者的FMT的ATB治疗小鼠的MCA205的典型生长曲线和动力学。
图12：在几个独立的小鼠组中接受ATB，然后没有FMT(NaCl) 或来自四个不同进展者(A，B，E，F)和两个不同响应者(C，D) 的FMT的处死时肿瘤大小的联合数据。每个点代表治疗开始后第12 天的一个小鼠肿瘤大小。治疗包括ip给予抗PD1抗体。
图13：接种于GF小鼠的MCA205的生长曲线，所述GF小鼠接受来自进展者(A)NSCLC患者的FMT，然后口服灌胃Akkermansia municiphila(Akk)，希氏肠球菌(Enterococcushirae)13144(EH) 或纤细真杆菌(Eubacterium tenue)(Euba)。在第1次和第2次注射抗PD1抗体时，用109个细菌进行两次强饲。使用3种不同的细菌，在分离的隔离器中每组一只小鼠(每组n＝5只小鼠)。
图14：在PD1阻断之前和期间对ATB处理的肿瘤携带者 (AVATAR小鼠)的细菌补偿的实验设置。对携带已建立的 MCA205WT的ATB处理的小鼠进行细菌管饲。在第1次，第2次，第3次、第4次注射抗PD1 Ab之前和之时，用109个细菌进行五次强饲。单独使用3种不同的细菌(Akkermansia muciniphila，Alistipes物种和希氏肠球菌(Enterococcus hirae)13144)或Akkermansia muciniphila+希氏肠球菌(Enterococcus hirae)13144的组合，每组小鼠(每组n＝5-6只小鼠)保持在分离的隔离器中。
图15：根据图14的方案的MCA205的生长曲线，其接受口服管饲的Akkermansiamuniciphila(Akk)或Akkermansia municiphila+希氏肠球菌(Enterococcus hirae)13144(EH)。根据图14中所示的实验设置，在停止ATB后用小鼠微生物群自发重建的化身小鼠中通过管饲法施用细菌。
图16：接种于GF小鼠的MCA205的生长曲线，所述GF小鼠从进展者(B)NSCLC患者接受FMT，然后口服管饲Akkermansia municiphila(Akk)或Akkermansia municiphila+希氏肠球菌 (Enterococcus hirae)13144(EH)或Alistipes物种(上午)。根据图 14中所示的实验设置，通过强饲法在从进展者(B)NSCLC患者接受 FMT的化身小鼠中施用细菌。
图17：来自两个不同进展者(B和F)NSCLC患者接受FMT的几个独立的ATB治疗小鼠的肿瘤大小的演变，然后口服灌胃 Akkermansia municiphila(Akk)，希氏肠球菌(Enterococcus hirae) 13144(EH)，Alistipes物种(AM)或Akkermansia municiphila+希氏肠球菌(Enterococcus hirae)13144(Akk+E.H)。根据图14中所示的实验设置，通过强饲法在从进展者(B或F)NSCLC患者接受FMT 的化身小鼠中施用细菌。每个点代表在治疗开始后第0、3、6或9天的一个小鼠肿瘤大小。治疗包括ip给予抗PD1抗体。
图18：补偿ATB处理的益生菌小鼠，其对CTLA4+PD1共阻断与 "oncobax"(免疫原性共生物)的组合无反应。在施用14天广谱ATB 后，用MCA205肉瘤接种C57BL/6小鼠。然后，在MCA205植入的第6天，用静脉内注射抗-CTLA4 Ab(每隔3天而注射4次)以及抗 -PD1 Ab(6次注射，每隔3天而注射6次)处理小鼠。在不同笼子中分离的独立组中，小鼠接受具有不同oncobax的口服强饲，例如短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)与长双歧杆菌(Bifidobacterium longum) 或脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)组合单独，或与洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)或肠杆菌(Barnesiella intestinihominis) 组合(用于直肠给药途径的"直肠")。在6只小鼠/组中监测肿瘤生长动力学，每周两次。牺牲时无肿瘤动物的数量用括号表示。
图19：记忆Th1/Tr1应答预测IV期NSCLC中PD1阻断下的进展时间(TTP)。Tc1或TH1记忆T细胞对癌症患者在诊断时或在基于抗PD1 Ab的治疗的第1个月期间所指示的共同体的响应根据整个群组中IFNg产生的平均值进行分离以计算TTP。还显示了暴露于在14 名晚期肺癌患者中与不同共生物孵育的自体单核细胞的记忆CD4+T 细胞或CD8+T细胞中IFNg和IL-10之间的比率。根据队列的中位数， Kaplan Meier曲线将患者的高比率与低比率分开。
图20：非小细胞肺癌患者的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)，这些患者在首次注射抗PD1抗体前2个月接受ATB治疗，第1次接种后1个月接受ATB治疗。在ATB(+)/(-)中用纳武单抗治疗的NSCLC患者的Kaplan Meier存活曲线显示左心室和右图的无进展存活：总体存活。对数排名(Mantel-Cox)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p ＜0.001，ns＝不显著。
图21：用PD1/PDL1抑制剂治疗的所有3种晚期癌症类型中的PFS 和OS n＝175(NSCLC，mRCC，mUC)。通过合并的3组晚期癌症患者的Kaplan-Meier曲线，无进展存活(左图)和存活分析(右图)。 N＝66非小细胞肺癌，n＝67转移性肾细胞癌，n＝42转移性尿路上皮癌，均在ATB(+)与ATB(-)上用PD1/PDL1抑制剂治疗。ATB(+)/ (-)组定义为在ICB之前(2个月期间)或ICB第1个月内接受或未接受ATB治疗的患者。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，ns＝不显著。
图22：宏基因组物种(MGS)中与癌症相关的肠道指纹：18个对比的MGS。细菌MGS的非监督层次聚类的热图在癌症患者的两个独立队列(1、2)中常见(Br：用于乳腺癌，Lu用于肺癌，Ni用于肾癌)，考虑所有患者(全部)或高分集子集(高)或低不同子集(低)。在蓝色中，那些在癌症患者中低表现的健康志愿者中的MGS过多，而在红色中则是那些在癌症患者中过多的MGS。
图23：MG中与癌症相关的肠道指纹：11个对比MGS(无ATB)。与图22中的分析相同，但消除了在粪便采集前两个月服用任何抗生素至少1周的癌症患者。
图24：肾脏或肺癌患者在诊断时粪便中基因计数和宏基因组物种的更高丰度预示在使用抗PD1 Ab持续治疗6个月时无更好的无进展生存期。根据临床结果(PFS在6个月)对所有癌症患者的基因和MGS 计数表示诊断时的粪便样品的喷枪测序。对于经历PFS>或＜6个月的患者，描绘了计数的±SEM。值得注意的是，基因或MGS丰度并未预测3个月的PFS。
图25：在ATB-SPF受体中由Oncobax补偿的2个NSCLC进展者的FMT的实验设置。实验设计：两名无响应者NSCLC患者的粪便微生物移植治疗ATB治疗小鼠的抗PD1抗体。C57/BL6SPF小鼠接受3 天广谱ATB：粘菌素，氨苄青霉素，链霉素。在ATB中断后12小时，用200μL粪便进行FMT，并将100μL施用于每只小鼠的毛皮上(根据 IHMS推荐存储患者粪便)。随后，2周后，在右侧腹侧灌注MCA205 WT肿瘤，当肿瘤大小达到20-25mm2时开始抗PD1 Ab。Oncobax-细菌管饲(108个细菌)在第1次腹膜内注射抗PD1 Ab前一天进行，然后在每次抗-PD1 Ab注射时进行。
图26：图25中描述的实验结果。在ATB-SPF受体中由Oncobax 补偿的2个NSCLC进展者的FMT：Akk+/-希氏肠球菌(E.hirae) (oncobax)的功效。。用2名无响应者NSCLC患者或NaCL对照在 FMT后ATB处理的小鼠中MCA-205WT的肿瘤生长。用Iso对照和抗-PD1 Ab+不同的Oncobax组合处理小鼠。进行T-检验。*p＜0.05， **p＜0.01，***p＜0.001，ns＝不显著。
图27：在肿瘤引流淋巴结中具有有效oncobax的效应和中枢记忆 CD8+T细胞的累积。使用肺癌粪便(患者F)并用抗PD1 Ab+不同的 oncobax组合处理的FMT后ATB处理的引流淋巴结中的CD8+效应子 (CD62-CD44+)和CD8+中枢记忆(CD62L+CD44+)细胞的流式细胞术分析。
图28：ATB-益生菌SPF受体中RET黑素瘤肿瘤模型的实验设置：用各种oncobax补偿。将RET黑素瘤肿瘤注射到用粘菌素，链霉素和氨苄青霉素处理的ATB益生菌SPF C57/BL6小鼠的左侧腹部，持续两周。然后在停止ATB后，根据详细的时间表，每组进行细菌管饲和用Oncobax的108个细菌或2种细菌的组合进行单一定植。每只小鼠接受 4次腹膜内注射IsoControl或抗PD1抗体。
图29：来自图28中描述的实验设置的结果。希氏肠球菌 (Enterococcus hirae)(13144)+Akkermansia muciniphila(Akk)的组合在RET模型中非常有效。在ATB生育障碍SPF小鼠中RET的肿瘤生长，并根据图19中解释的实验设置进行处理。每条线代表一只小鼠。两个左上图代表仅接受水的对照小鼠。右上两个图描绘了接受ATB 的小鼠的肿瘤生长。底部的四个图表示在ATB与Akkermansia muciniphila，希氏肠球菌(Enterococcus hirae)13144+Akkermansia muciniphila，纤细真杆菌(Eubacterium tenue)+Akkermansiamuciniphila，Alistipes indistinctus分别进行oncobax单定殖的小鼠的肿瘤生长。显示了两个中的一个表现实验。
图30：Orthotopic LLC：PD1阻断+放疗联合oncobax的疗效(1)。组合形式的实验设置放射疗法+PD1在SPF小鼠中。之后，将3天的 ATB C57/BL6小鼠与表达荧光素酶的Lewis肺癌(LLC)细胞系或者同时注射荧光素酶，其可以在荧光素注射后使用IVIS光谱体内成像系统进行监测。在第3-4天，他们接受了针对胸部的9Gy放射治疗。每 3天根据详细的时间表腹膜内注射抗PD1抗体或Iso对照抗体。在细菌组中：小鼠在与抗PD1抗体注射的同一天以108口服希氏肠球菌 (Enterococcus hirae)13144+Akkermansia muciniphila。
图31：Orthotopic LLC：PD1阻断+放疗联合oncobax的疗效(2)。左图表示使用IVIS光谱体内成像系统的肿瘤生长测量。对于每组，标准化的总通量在第10天表示。右图：通过Iso-Ctrl或放射疗法+PD1 或放射疗法+抗PD1 Ab+细菌组的所有小鼠的Kaplan-Meier曲线的存活分析。对数排名(Mantel-Cox)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001， ns＝不显著。
图32：肠道微生物组在RENCA肿瘤模型中抗-CTLA4+抗-PD1 Ab 的抗癌作用中的作用(1)。粪便微生物移植在转移性肾细胞癌患者粪便Balb/c ATB治疗小鼠中的实验研究。在氨苄青霉素，粘菌素和链霉素3天后，Balb/c小鼠从纳武单抗的3名患有mRCC的不同患者接受 FMT。两名患者没有临床获益，而另一名患者在10个月后仍然保持部分反应。在FMT后第14天，原位注射RENCA-荧光素酶肿瘤，并且小鼠每4天根据时间表组合接受Iso Control或PD1+CTLA4。底部的表显示了几种细菌的3个供体的宏基因组粪便组成。
图33：肠道微生物组在RENCA肿瘤模型中抗-CTLA4+抗-PD1 Ab 的抗癌作用中的作用(2)。使用光谱体内成像系统装置评估 FMT后Balb/c中RENCA的肿瘤大小。每只小鼠的总通量表示在第9-15 天。进行T检验。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，ns＝不显著。
图34：循环T细胞上的PD-L1上调是与PD1阻断的临床益处相关的有利的粪便MG组成的标志。流式细胞术分析PDL1分子在细胞表面的脾CD4+和CD8+T细胞表达。A.在ATB治疗的小鼠中，响应者或非响应者的FMT后。图B是无响应者的FMT后接着用oncobax 治疗。
图35：在肠系膜淋巴结中用oncobax口服管饲后的表型变化。单独使用希氏肠球菌(Enterococcus hirae)或与Akkermansia muciniphila 组合增强CD4+和CD8+CCR9+CM(并且在某种程度上是幼稚的)。用oncobax管饲后48小时对肠系膜淋巴结进行流式细胞术分析，并用 1次腹膜内抗PD1抗体注射治疗。图A：CD4+天然CCR9+和CD4+中央记忆CCR9+。图B：CD8+CCR9+，CD8+中央记忆CCR9+，CD8+CM CCR9+CXCR3+。希氏肠球菌(Enterococcus hirae)显著增加CD8+TCM CCR9++和CCR9+CXCR3+，而Akkermansia muciniphila主要增加 CD4+CCR9+TCM。
图36：使用患者粪便的宏基因组组成预测FMT后Atb处理的小鼠的肿瘤大小。我们在ATB处理的小鼠中用来自纳武单抗的来自 NSCLC(2个响应者和4个进展者)的粪便进行FMT(图12)。个体小鼠肿瘤大小与患者粪便组成之间的Spearman相关性，用于响应者或非响应者部分中的宏基因组特征中存在的不同细菌。
图37：用Akkermansia muciniphila与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)刺激的CD4。在单核细胞/CD4+T细胞共培养物的各种细菌刺激后，在免疫疗法期间通过ELISA测定每个转移性肾细胞癌患者的 CD4IFN-g释放的预测值。使用CD8-IFNg(Tc1)响应用A.muciniphila 再刺激获得了类似的结果。显示高于/低于细胞因子产生中值的每个亚组(TH1：IFNg，TR1：L-10或比率IFNg/IL-10)患者的PFS的Kaplan Meier曲线表示2种细菌。针对A.muciniphila的记忆TH1和Tc1免疫应答预测在肺癌和肾癌患者中PD1阻断期间的TTP(未显示)。对数秩*p＜0.05，**p＜0.01。
图38：用来自响应的患者来源的粪便的粪便补偿来自肾癌患者 (RCC)的菌群失调，用于恢复对免疫关卡抑制剂的响应。用3天的广谱抗生素处理BALB/c小鼠，然后口服管饲，用无反应的患者来源的粪便。20天后，我们在BALB/c小鼠的肾脏中原位接种了RENCA-荧光素酶肿瘤，我们可以用报告显像系统IVI进行跟踪。8天后，BALB/c 小鼠每3天接受ip施用抗PD1和抗CTLA4 Ab进行5次注射。在用 mAb进行每次ip治疗的前一天，接受荷瘤小鼠的小鼠接受来自一名 RCC患者的粪便(1010cfu)的口服管饲，所述RCC患者对基于抗 PD1mAb的疗法有反应。使用3种不同的RCC响应患者(R4-R5-R6) 粪便。遵循肿瘤生长动力学。该图描绘了处死时的肿瘤大小，显示了个体数据并且还汇集了来自3组R4-R6的数据。Anova统计分析：*p ＜0.05。
图39：用健康志愿者(HV)来源的粪便补偿来自乳腺癌患者(BC) 的菌群失调，以恢复对节拍性环磷酰胺(CTX)的反应。A.实验设置。C57BL/6小鼠用3天广谱抗生素治疗，然后口服强饲(FMT)，两名乳腺癌患者(BC1和BC2)-化疗后收获的粪便，当粪便生物多样性低，多样性低。BC1是三阴性BC，预后不良，而BC2预后良好。 20天后，我们接种了AT3乳腺同系小鼠肿瘤sc。10天后，C57BL/6 小鼠每周接受ip给予节拍CTX进行3次注射。在每次用CTX进行ip治疗前一天，然后在同一天，受体荷瘤小鼠接受来自一个HV的粪便 (1010cfu)的口服管饲。或者，将小鼠(经受HV或BC的FMT)一起携带3周。B.遵循肿瘤生长动力学。该图描绘了随时间和处死时肿瘤大小。Anova统计分析：*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
图40：补偿来自无应答的肾癌患者(RCC)的菌群失调，其具有用于恢复对免疫关卡抑制剂的响应的确定菌株。A.用3天广谱抗生素处理BALB/c小鼠，然后口服管饲，用无反应的患者来源的粪便。二十天后，我们在BALB/c小鼠的肾脏中原位接种了RENCA-荧光素酶肿瘤，我们可以用报告显像系统IVI进行跟踪。8天后，BALB/c小鼠每3天接受ip施用抗PD1和抗CTLA4 Ab进行5次注射。在用mAb 进行每次ip治疗的前一天，接受荷瘤肿瘤的小鼠接受1010cfu各种菌株的口服管饲(在X轴中列出)。B.遵循肿瘤生长动力学。该图描绘了处死时的肿瘤大小。处死时无肿瘤小鼠的百分比如下所示。Anova 统计分析：*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
图41：补偿来自无响应的肾癌患者(RCC)与Bacteroides salyersae 的菌群失调，以恢复对免疫关卡抑制剂的反应。用3天广谱抗生素处理C57BL/6小鼠，然后口服管饲，用无反应的RCC患者来源的粪便。二十天后，我们接种了MCA205肉瘤sc。8天后，C57BL/6小鼠每隔3天腹膜内施用抗-PD1Ab+抗CTLA4 Ab，进行5次注射。在用mAb 进行每次ip治疗的前一天，接受荷瘤肿瘤的小鼠接受1010cfu各种菌株的口服管饲(在X轴中列出)。遵循肿瘤生长动力学。该图描绘了处死时的肿瘤大小。处死时无肿瘤小鼠的百分比如下所示。Anova统计分析：*p＜0.05。
图42：补偿来自肺NSCLC患者的菌群失调，其具有6个细菌菌株的联合体，用于恢复对抗PD1mAb的应答。A.用3天的广谱抗生素处理C57BL/6小鼠，然后口服管饲，用无反应的NSCLC患者来源的粪便。二十天后，我们接种了MCA205肉瘤sc。8天后，C57BL/6 小鼠每隔3天腹膜内施用抗-PD1 Ab，进行5次注射。在用mAb进行每次ip治疗的前一天，接受荷瘤肿瘤的小鼠接受1010cfu各种菌株的口服管饲(列于6A中)。B.遵循肿瘤生长动力学(平均值+/-SEM或每个单独的曲线)。该图描绘了最佳组中的生长动力学随时间的变化(小鼠在上图中的小鼠，在下图中的平均值)。C.在第13天重现所有组的所有肿瘤大小。肿瘤Anova统计分析：*p＜0.05。
图43：不同的细菌聚集体能够改善抗PD1功效。用3天的广谱抗生素治疗C57BL/6小鼠，然后用肺癌患者来源的粪便进行口服强饲 (FMT)。15天后，用MCA205肉瘤小鼠肿瘤sc接种C57BL/6小鼠。 4天后，C57BL/6小鼠每3天腹膜内施用抗-PD1，总共进行4次注射，最后用由109cfu各种菌株组成的细菌聚集体(在X轴中列出)进行口服强饲。遵循肿瘤生长动力学。在管饲后第8天描绘肿瘤生长。每个点代表一个小鼠肿瘤大小。描述了两个产生类似结果的表现实验。
图44：Barnesiella intestinihominis包含在抗PD1抗体治疗的标志性特征中(以及对该疗法的反应)。用MCA205肉瘤小鼠肿瘤sc接种 C57BL/6小鼠。6天后，C57BL/6小鼠每3天腹膜内施用抗PD1或抗 PD1/抗CTLA4 Ab组合，总共进行6次注射。PD1阻断或PD1+CTLA4共阻断后粪便的宏基因组分析，以确定与每种mAb治疗相关的特异性肠指纹。在两次注射基于mAb的免疫疗法(F3)后，Lefse(A)和箱图(B)图表。Kruskal-Wallis分析；P＜0.05。MCA205是肉瘤，而 RET是黑素瘤(未显示)。因此，在PD1阻断后选择Barnesiellaintestinihominis并与临床益处相关联。
图45.免疫组织化学分析苏木精伊红中的肠毒性(隐窝不规则性，丧失绒毛，炎症模式)或用抗裂解的半胱天冬酶3 Ab染色。实验设置如图40-42所示。来自响应者的粪便转移减少了来自无响应者的粪便所获得的毒性。用oncobax补偿的FMT可降低结肠炎评分。
图46.两个独立的肿瘤小鼠模型中的实验设置和样品采集时间。从 2种不同的小鼠肿瘤模型收集粪便样品的时间。将MCA-205-肉瘤或 RET-黑素瘤接种于SPF小鼠中，随后用单一疗法抗-PD-1mAb(n＝6)，组合抗-PD-1mAb+抗-CTLA-4mAb(n＝6)或者Iso Ctrl(n＝6)处理。 F1：肿瘤接种前。F2：肿瘤接种后5-7天和第1次治疗前。F3：第2 次注射后48小时。F4：第5次注射后48小时。F5：第6次注射后48 小时。
图47：肠道微生物群组成受抗PD-1单一疗法或与抗-CTLA-4mAb 组合以及MCA-205小鼠模型中的肿瘤大小的影响。左图：主成分分析 (PCA)图表示源自大便的16S rRNA测序的分类的β多样性(exp设置图46)，基于Bray-Curtis距离在不同时间点F2-F3-F4为每组(IsoCtrl， PD-1和combo：PD-1+抗-CTLA-4)。右图：R统计量(来自ANOSIM) 评估每个治疗组的肿瘤大小的细菌分类学多样性。接近"1.0"的R值表示组之间的差异(对于确定的标准)，而接近"0"的R值表示组内和组之间的高和低等级的均匀分布。低于"0"的R值表明组内的差异大于组之间的差异。
图48：肠道微生物群的变化受ICB组合(抗PD-1+抗CTLA-4抗体)的影响，并与RET小鼠模型中的肿瘤大小相关。左图：主成分分析，代表细菌分类-在大鼠的16S rRNA测序中获得的β多样性(exp 设置图46)，基于每组中不同时间点F2-F3-F4的Bray-Curtis距离(IsoCtrl，PD-1和combo：抗-PD-1+抗-CTLA-4抗体)。右图：R统计量(来自ANOSIM)评估每个治疗组的肿瘤大小的多样性。接近"1.0" 的R值表示组之间的差异(对于确定的标准)，而接近"0"的R值表示组内和组之间的高和低等级的均匀分布。低于"0"的R值表明组内的差异大于组之间的差异。
图49：独特的基线微生物群组成和细菌物种在Exp设定中预测对 ICB的反应或抗性(图46)。用RET或MCA-205接种的小鼠的基线粪便组成(F2)的16S rRNA焦磷酸测序分析。根据它们的肿瘤大小，在两组响应者(R)和非响应者(NR)中杀死动物，无论其治疗如何(Iso Control，PD-1或PD-1+Anti-CTLA-4)。在响应者中，相对于 NR组，仅在该R组中发现了78种细菌。
图50：与用免疫关卡阻断剂(抗PD-1+抗-CTLA-4Abs)组合治疗的小鼠中的有益反应相关的物种。对接种MCA-205或RET的小鼠F2 基线粪便样品中的基因扩增子进行16SrRNA焦磷酸测序分析。在2 种肿瘤模型中用抗PD-1+抗-CTLA-4mAb处理的应答小鼠中共有169 种细菌。
【优选实施方式的详细描述】
在本文中，使用了以下一般定义：
【肠道微生物群】
"肠道微生物群"(以前称为肠道菌群或微生物群)指的是生活在属于动物界(人，动物，昆虫等)的任何生物的肠中的微生物群。虽然每个人都有独特的微生物群组成(超过50％的样本人口共有60到 80种细菌物种，总共有400-500种不同的细菌物种/个体)，但它总能实现类似的主要生理功能并且具有直接的对个人健康的影响：
●它有助于消化胃和小肠无法消化的某些食物(主要是不易消化的纤维)；
●它有助于生产某些维生素(B和K)；
●它可以防止其他微生物的侵害，保持肠粘膜的完整性；
●它在适当的免疫系统的发展中起着重要作用；
●健康，多样和平衡的肠道微生物群是确保肠道功能正常的关键。
考虑到肠道微生物群在身体的正常功能和它所完成的不同功能中所起的主要作用，它现在被认为是"器官"。然而，它是一个"后天"的器官，因为婴儿出生时不育；也就是说，肠道定植在出生后立即开始并随后发展。
肠道微生物群的发育从出生开始。在子宫内无菌，新生儿的消化道很快被母亲的微生物(阴道，皮肤，乳腺等)，分娩的环境，空气等所定殖。从第3天开始，肠道微生物群直接依赖于婴儿的喂养方式：与婴儿配方奶粉喂养的婴儿相比，母乳喂养的婴儿肠道微生物群主要由双歧杆菌控制。
肠道微生物群的组成在从出生到老年的整个生命中发展，并且是不同环境影响的结果。在老化过程中，肠道微生物群的平衡会受到影响，因此，老年人的微生物群与年轻人相比有很大差异。
虽然主要肠道微生物群的一般组成在大多数健康人群中是相似的 (4个主要门，即硬壁菌门(Firmicutes)，拟杆菌门(Bacteroidetes)，放线菌门(Actinobacteria)和变形杆菌门(Proteobacteria))，但物种水平的组成是高度个性化的，并且很大程度上取决于个体的遗传，环境和饮食。肠道微生物群的组成可能暂时或永久地习惯于饮食成分。例如，日本人可以消化海藻(日常饮食的一部分)，这归功于他们的微生物群从海洋细菌中获得的特定酶。
【菌群失调】
虽然它可以适应变化并具有高回弹能力，但在某些特定情况下可能会出现肠道微生物群组成的平衡损失。这被称为"菌群失调"，即肠道中潜在的"有害"和"有益"细菌之间的不平衡，或者就主要细菌群组成和多样性而言被认为是"健康"微生物群的任何偏差。生理障碍可能与健康问题有关，如功能性肠病，炎症性肠病，过敏，肥胖和糖尿病。它也可以是治疗的结果，例如细胞毒性治疗或抗生素治疗。在这里，我们将所谓的"菌群失调"称为癌症患者的肠道成分与健康个体的肠道成分相比的任何偏差，以及"与PD1/PD-L1阻滞反应不足相关的菌群失调"任何不明显或过表现的表1和表2分别描述了这些物种。
【抗肿瘤治疗】
"抗肿瘤治疗"在本文中表示除手术外的任何癌症治疗。它们包括化疗，激素和生物疗法以及放射疗法。
【生物疗法】
抗癌"生物疗法"涉及使用生物体，来自生物体的物质，或这些物质的实验室生产的版本来治疗癌症，通过直接靶向癌细胞，或通过刺激身体的免疫系统来对抗癌症癌细胞("免疫疗法")。生物疗法包括单克隆抗体(Mab)(包括靶向癌细胞表面的那些，例如利妥昔单抗和阿仑单抗；抗-CTLA4Mab，例如伊匹单抗；靶向生长因子，例如：贝伐单抗，西妥昔单抗，帕尼单抗和曲妥珠单抗；抗PD1 Mab，例如如纳武单抗和派姆单抗；抗Tim3 Mabs；抗PD-L1 Mabs，如 Atezolizumab，德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗；抗PD-L2Mabs)，激动性抗体(抗ICOSMabs，抗OX40，抗-41 BB mAbs)，免疫缀合物(例如：90Y-替伊莫单抗，131I-托西莫单抗和曲妥珠单抗-美坦新偶联物)，细胞因子(包括干扰素如IFNα；白细胞介素如IL-2，IL-11，G-CSF，GM-CSF)，治疗性疫苗(例如：Sipuleucel-T)，细菌杆菌Calmette-Guerin，癌症致死病毒(溶瘤病)，基因治疗和过继性 T细胞转移。
【免疫关卡阻滞剂】
在本文中，"阻断免疫关卡的药物"或"免疫关卡阻断剂"或"免疫关卡阻断药物"表示阻断免疫关卡的任何药物，分子或组合物。特别地，它包括抗CTLA-4抗体，抗PD1抗体，抗PD-L1抗体(例如Atezolizumab 或德瓦鲁单抗)和抗PD-L2抗体。更具体地，它可以是抗PD1单克隆抗体，例如纳武单抗或派姆单抗。
"基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法"在本文中表示拮抗PD1或 PD-L1或PD-L2的任何药物。尽管目前使用的拮抗PD1或PD-L1或 PD-L2的药物是单克隆抗体，但是特异性结合PD1，PD-L1或PD-L2 的其他分子可用于开发未来的ICB，例如抗体片段或专门设计的适体。当然，短语"基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法"包括具有拮抗PD1 或PD-L1或PD-L2的活性分子的任何疗法。
【益生菌】
"益生菌"是指在食用时声称具有健康益处的微生物。益生菌通常作为发酵食品的一部分食用，特别添加活跃的活性培养物，例如酸奶，大豆酸奶或膳食补充剂。通常，益生菌帮助肠道微生物群保持(或重新找到)其平衡，完整性和多样性。益生菌的作用可能是菌株依赖性的。在这里，我们将使用短语"抗癌益生菌"或新词"oncobax"和 "oncomicrobiotics"来指定任何共生组合物，其恢复对PD1/PD-L1阻断或抗-CTLA4+抗-PD1或PD-L1 Ab的组合的响应性。因此，在本发明的上下文中，"益生菌组合物"不限于食品或食品补充剂，而是通常表示包含对患者有益的微生物的任何细菌组合物。因此，这种益生菌组合物可以是药物或药物。
【癌症，治疗等】
如本文所用，"癌症"意指所有类型的癌症。特别地，癌症可以是实体或非实体癌症。癌症的非限制性实例是癌或腺癌，例如乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，肺癌，胰腺癌或结肠癌，肉瘤，淋巴瘤，黑素瘤，白血病，生殖细胞癌和胚细胞瘤。
免疫系统对抗癌症具有双重作用：它可以防止肿瘤细胞向外生长，并且还可以显示肿瘤细胞的免疫原性。因此，阻断免疫关卡的药物可用于治疗几乎任何类型的癌症。因此，根据本发明的方法可用于患有选自肾上腺皮质癌，肛门癌，胆管癌(例如，周围癌，远端胆管癌，肝内胆管癌)，膀胱癌，骨癌的癌症的患者(例如成骨细胞瘤，骨软骨瘤，血管瘤，软骨肉瘤纤维瘤，骨肉瘤，软骨肉瘤，纤维肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，骨巨细胞瘤，脊索瘤，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，脑和中枢神经系统癌症(如脑膜瘤，小细胞瘤，少突神经胶质瘤，室管膜瘤)，神经胶质瘤，成神经管细胞瘤，神经胶质瘤，神经鞘瘤，生殖细胞瘤，颅咽管瘤)，乳腺癌(例如导管原位癌，浸润性导管癌，浸润性小叶癌，原位小叶癌，男子女性型乳腺)，Castleman病(例如巨大淋巴结增生，血管滤泡性淋巴瘤)淋巴结增生，宫颈癌，结直肠癌，子宫内膜癌(如子宫内膜腺癌，腺棘皮癌，乳突浆液腺癌，透明细胞)，食道癌，胆囊癌(粘液腺癌，小细胞癌)，胃肠道类癌(如绒毛膜上皮癌，绒毛膜腺瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，卡波西肉瘤，肾癌(如肾细胞癌)，喉癌和下咽癌，肝癌(如血管瘤，肝腺瘤，局灶性结节性增生，肝细胞癌)，肺癌症(如小细胞肺癌，非小细胞肺癌)，间皮瘤，浆细胞瘤，鼻腔和鼻窦癌(如神经母细胞瘤，中线肉芽肿)，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔和口咽癌，卵巢癌，胰腺癌，阴茎癌，垂体癌，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤(如胚胎性横纹肌肉瘤，肺泡横纹肌肉瘤，多形性横纹肌肉瘤)，唾液腺癌，皮肤癌(如黑色素瘤，非黑色素瘤皮肤癌)，胃癌，睾丸癌(如精原细胞瘤，非精原细胞瘤)生殖细胞癌)，胸腺癌，甲状腺癌(如滤泡癌，间变性癌，差分化癌，甲状腺髓样癌，甲状腺淋巴瘤)，阴道癌，外阴癌和子宫癌(例如子宫平滑肌肉瘤)。更具体地，根据本发明的方法可用于预测和优化患者对靶向免疫关卡的药物的反应，其中患者患有选自下列的癌症：转移性黑素瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，小细胞肺癌(SCLC)，间皮瘤，膀胱癌，肾细胞癌，头颈癌，食道癌和胃癌，直肠癌，肝癌，肉瘤，肾母细胞瘤，霍奇金淋巴瘤，ALK-神经母细胞瘤，(激素难治)前列腺癌和GIST。
必要时，下面将详细说明其他定义。
根据第1方面，本发明涉及一种体外治疗诊断方法，用于确定癌症患者是否可能是对抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的治疗的良好响应者，包括：
(i)在来自所述患者的粪便样品中评估选自表1和表2中公开的微生物种类的至少10种微生物物种的相对丰度；
(ii)对于每种微生物，将步骤(i)中测量的相对丰度与预定阈值进行比较，
其中表1中公开的微生物种类的过表现和表2中公开的微生物种类的低表现表明患者可能是基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的良好响应者。
表1：在癌症患者中过表现的细菌物种可能对抗PD1或PD-L1或抗PD-L2抗体有良好反应，并且在可能对抗PD1或PD-L1具有抗性的癌症患者中低表现或抗-PD-L2抗体，以及相应的参考物种(对于已经鉴定的物种)和其中包含的序列。有关相应参考物种的信息可在NCBI网站上找到。
表2：癌症患者中表现较低的细菌物种可能对抗PD1或PD-L1或抗PD-L2抗体有良好反应，并且在可能对抗PD1或PD-L1具有抗性的癌症患者中过表现或抗-PD-L2抗体，以及相应的参考物种(对于已经鉴定的物种)和其中包含的序列。有关相应参考物种的信息可在NCBI网站上找到。
根据上述方法的一个具体实施方式，在步骤(i)中评估选自表1a 和表2a中公开的微生物种类的至少10种微生物物种的相对丰度。
表1a：在癌症患者中过表现的细菌物种亚群可能对抗PD1或 PD-L1或抗PD-L2抗体具有良好反应，并且在可能对抗PD1或PD-L1 或抗PD-L2抗体，以及相应的参考物种(对于已经鉴定的物种)和其中包含的序列具有抗性的癌症患者中低表现。有关相应参考物种的信息可在NCBI网站上找到。
表2a：在癌症患者中低表现的细菌物种的亚组，可能对抗PD1或 PD-L1或抗PD-L2抗体具有良好反应，并且在可能对抗PD1或PD-L1 或抗PD-L2抗体，以及相应的参考物种(对于已经鉴定的物种)和其中包含的序列具有抗性的癌症患者中过表现。有关相应参考物种的信息可在NCBI网站上找到。
根据上述方法的另一个具体实施方式，在步骤(i)中评估选自表 1b和表2b中公开的微生物物种的至少7、8、9或10种微生物物种的相对丰度。
表1b：表1中的物种亚组
表2b：表2中的物种亚组
在之前的情况中，对于每种微生物物种，"过表现"是指该物种以相对丰度高于预定阈值存在于样品中。当然，"低表现"意味着物种存在于样品中，其相对丰度低于预定阈值。
可以在本发明的框架中用作"预定阈值"的阈值的示例在下面的实验部分中公开。当然，技术人员可以根据用于测量微生物相对丰度的技术(例如，定量PCR，微阵列杂交或焦磷酸测序)，特异性抗 PD1/PD-L1/PD-L2抗体，患者的特定病理，患者的饮食习惯和其他可能的因素来调整或改进这些阈值。更一般地，通过在免疫关卡阻断疗法治疗的表现群体中测量所述微生物的相对丰度来预先确定在执行上述方法时要考虑的阈值，并且其对该治疗的反应是已知的。
根据一个实施方式，计算阈值以获得响应的最佳可预测性(灵敏度和特异性)。例如，计算阈值以最大化Youden索引。
根据该方法的特定实施方式，用于每个物种的阈值是灵敏检测方法的检测极限(例如MGS分析)。在这种情况下，评估的不是物种的 "相对丰度"，而仅仅是物种的存在(对应于"过表现")或缺失(对应于 "低表现")。这也适用于根据本发明的其他方法的以下描述，其中"相对丰度"可以被解读为"存在或不存在"，"存在"可以被解读为"过表现" 并且不存在可以被读作"低表现"的问题。
根据本发明，"细菌物种"是来自肠道微生物组的一组细菌基因(即肠道微生物群的基因库)，其丰度水平在不同的个体样品中以相同的比例变化。换句话说，根据本发明的细菌物种是细菌基因序列的簇，来自不同受试者的样品中的丰度水平是统计学上相关的而不是随机分布的。
目前用于分析宏基因组数据的大多数方法依赖于与参考基因组的比较，但人类肠道微生物群多样性超出了参考数据库当前所涵盖的范围。在本文公开的结果中，发明人使用基于跨越一系列宏基因组样品的共富集基因的方法，其能够在不需要参考序列的情况下全面发现新的微生物。在下文中，大多数被确定为可能在患者对基于针对PD1， PD-L1或PD-L2的抗体的治疗的反应中起作用的物种是新鉴定的物种，尚未在公共数据库中引用。对于每种鉴定的物种(新鉴定的物种和非常接近已经参考物种的物种)，本申请公开了一组25个细菌基因，它们是非冗余序列并且可以单独或组合地用作评估相应物种的存在和相对丰度的示踪基因。当然，一旦通过本文公开的一组非冗余基因或稍后通过它们进一步鉴定和/或包含到数据库中鉴定物种，本领域技术人员可以通过任何适当的方法(例如，通过测量与本申请公开的25个序列共同变化的另一个非冗余基因的拷贝数)来评估它们的相对丰度。因此，本发明不限于使用所公开的序列来测量相应物种的相对丰度。
如表1和表2所示，已被确定为对抗PD1/PD-L1/PD-L2封锁反应起重要作用的一些物种非常接近已经参考和可获得的物种，例如，在 NCBI数据库中。对于每个物种，表1和2中所示的"相应的参考物种" 是较近发现的生物体(给定物种的菌株)。对于每个指定的参考文献，本发明人鉴定的CAG基因和参考基因组之间的比对和同一性的平均百分比高于93％(比对)和98％(同一性)。
根据上述方法的一个具体实施方式，表1中公开的微生物种类低表现和表2中公开的微生物种类的过表现表明患者可能对基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法具有抗性。在这种情况下，可以向患者提出替代疗法，或用如下公开的益生菌组合物进行预处理，以改变其微生物群并提高他/她对治疗作出反应的机会。
虽然在执行本发明的方法时测量表1和2中选择的最少10种物种的相对丰度，但是该方法可以通过测量更多数量的物种来进行(例如 11、12、13、14、15，16、17、18、19、20、25、30、35、40种或更多)。在上述方法的一个特定实施例中，选择测量的物质以优化轮廓的相关性。例如，在步骤(i)中测量至少5种硬壁菌门(Firmicutes) 物种，3种梭菌目(Clostridiales)物种，1种Alistipes物种，一种真杆菌属(Eubacterium)物种，1种拟杆菌目(Bacteroidales)物种和史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)的相对丰度。根据该实施方式，可以在步骤(i)中代替史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibactersmithii)的相对丰度或此外测量Akkermansia muciniphila的相对丰度。
根据另一具体实施方式，还在步骤(i)中测量Anaerotruncus colihominis和至少一种Oscillibacter物种的相对丰度。
上述方法可有利地用于患有适于PD1或PD-L1或PD-L2阻断的癌症的任何患者。当然，目前未用这种治疗方法治疗的一些癌症可以成为抗PD1/PD-L1/PD-L2抗体的新应用，患有这些癌症的患者将从本发明中受益。应注意，本发明在旨在确定新适应症和/或新分子中PD1 或PD-L1或PD-L2阻断效率的临床试验框架中也特别有用。根据一个具体实施方式，进行本发明以评估患有选自肺癌(例如鳞状细胞肺癌以及腺癌非小细胞或小细胞肺癌，肾细胞癌，头颈肿瘤，膀胱癌，肝癌，间皮瘤，Merkel细胞癌，食道癌，胃癌，三阴性乳腺癌，黑色素瘤和胸腺瘤)的癌症的患者的响应/抗性状态。
本发明的方法特别适用于评估患有局部晚期或转移性癌症的患者的响应/抗性状态，或者在新辅助治疗中的可操作癌症，即，在本例中，可以在PD1或PD-L1或PD-L2阻断(例如减少注射治疗失败的患者在手术后的周期数或用抗癌益生菌补偿它们以继续治疗)后，通过手术切除的肿瘤。
如下面的实验部分所公开的，本发明的方法对于基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法是第2或第3线疗法的患者是有用的。根据另一个实施方式，进行该方法以在向所述患者施用基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法作为一线疗法之前评估患者的响应者或抗性状态，或用于评估已经接受基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法作为一线治疗的患者的响应者或抗性状态。
当单独施用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法治疗时，以及当施用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法治疗时，可以与抗-CTLA4 Ab 或IDO抑制剂或任何其他免疫调节剂组合而有利地使用上述方法。
如已经提到的，可以在开始用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法之前使用上述方法，以避免对不良响应者施用这种治疗和/或将这种不良响应者转化为通过适当的预处理获得良好的反应，但它也可用于评估已经接受抗PD1/PD-L1/PD-L2抗体的患者的响应者/抵抗状态。在这种情况下，如果患者被确定为具有抗性，则可以停止治疗，或者将其组合到可能增加患者反应的另一种治疗中。这些治疗方法如下所述。
当进行上述方法时，可以通过测量对所述微生物特异性的至少1， 2、5、10、15、20或至少25种核酸序列的拷贝数来评估每种微生物的相对丰度。本领域技术人员已知的任何适当技术可用于测量所述序列的拷贝数，例如基于PCR的技术(Q-PCR，QRT-PCR等)，杂交(例如使用核酸微阵列)，测序(例如通过NGS)和本领域技术人员已知的任何其他适当方法。当然，可以选择对给定微生物特异的任何核酸序列来测量所述微生物的相对丰度。举例来说，可以测量表1和表2中列举的任何序列的拷贝数，应当理解，与给定物种特异性的公开序列共同变化的任何序列也可用作测量所述物种的相对丰度的量度。已经在数据库中引用的非常接近(或相同)细菌的物种的相对丰度可以通过测量对表1和2中鉴定的相应参考物种特异的任何序列的拷贝数来评估。
在第1个具体实施方式中，通过基于PCR的技术评估表1和2中列出的物种特异性序列的拷贝数。使用的PCR技术可以定量测量 DNA，cDNA或RNA的起始量。根据本发明的基于PCR的技术的实例包括例如但不限于下列技术：定量PCR(Q-PCR)，逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)，定量逆转录酶PCR(QRT-PCR)，滚环扩增 (RCA)或数字PCR。这些技术是众所周知的并且容易获得，并且不需要精确的描述。在一个具体实施方式中，通过定量PCR进行本发明的细菌基因的拷贝数的确定。
基于PCR的技术用扩增引物进行，所述扩增引物设计为对测量的序列特异。因此，本发明还涉及适用于实施上述方法的一组引物，即包含引物对的一组引物，用于扩增在所述方法的步骤(i)中待检测的每种微生物物种特异性的序列(即，在表1和2中列出的那些中选择至少10种。这样的一组引物包含最少20个引物，但它可包含更多引物，例如30、40、50、60、70、80、100、200、300、500、1000、2000 或更多个引物。根据一个具体实施方式，该组引物包含至少一个引物对，其特异性扩增选自SEQ ID Nos：1-1125的序列的一部分。当然，根据本发明的引物组可有利地包含2、3、4、5、10、20、30、40、50、 60、70、80、100、200、300、500、1000或更多对引物(每个特异性扩增选自SEQ ID Nos：1-1125的序列的一部分)。
在另一个具体实施方式中，通过使用核微阵列在步骤(i)中评估所选物种的相对丰度。"核微阵列"由附着于固体支持物的不同核酸探针组成，所述固体支持物可以是微芯片，载玻片或微球尺寸的珠子。探针可以是核酸，例如cDNA("cDNA微阵列")或寡核苷酸("寡核苷酸微阵列")，并且寡核苷酸的长度可以是约25至约60个碱基对或更少。为了确定靶核酸样品的拷贝数，将该样品标记并在杂交条件下与微阵列接触，使得在与微阵列表面连接的探针序列和与其互补的靶核酸之间形成复合物。然后检测标记的杂交复合物的存在。微阵列杂交技术的许多变体可供技术人员使用。
因此，设计用于实施根据本发明的方法的核酸微阵列也是本发明的一部分。这种核酸微阵列包含对所述方法的步骤(i)中待检测的每种微生物物种特异的核酸探针(即，在表1和2中列出的那些中选择的至少10种)。在一个具体实施方式中，核酸微阵列是寡核苷酸微阵列，其包含至少一种对选自SEQ ID NO：1-1125的至少一种序列特异的寡核苷酸。例如，所述微阵列包含至少45个寡核苷酸，每个寡核苷酸对表1和2中列举的不同物种的一个序列是特异性的。本发明的微阵列当然可以包含对SEQ ID NO：1-1125的每个序列特异的1125个寡核苷酸。根据本发明的微阵列可以进一步包含至少一种寡核苷酸，用于检测至少一种对照细菌物种的至少一种基因。方便的细菌物种可以是例如细菌物种，其丰度在患有癌症的个体和健康个体之间不变。优选地，寡核苷酸的长度为约50个碱基。可以使用本领域已知的任何微阵列寡核苷酸设计方法，基于每个基因的基因组序列设计对SEQ ID NO：1-1125的任何基因特异的合适的微阵列寡核苷酸。特别地，可以使用为微阵列寡核苷酸的设计开发的任何可用软件，例如，OligoArray 软件，GoArrays软件，Array Designer软件，Primer3软件或Promide 软件，所有这些都是本领域技术人员已知的。
根据另一个实施方式，使用测序确定从受试者获得的样品中至少一种细菌基因的拷贝数。任选地，DNA在测序之前例如通过限制性核酸酶被片段化。使用现有技术中已知的任何技术进行测序，包括通过连接，焦磷酸测序，合成测序，单分子测序或下一代测序进行测序。测序还包括基于PCR的技术，例如定量PCR或乳液PCR。许多平台可用于执行下一代测序(NGS，也称为"大规模并行DNA测序")，例如但不限于Illumina Genome Analyzer平台，Roche 454平台，ABI SOLiD平台，Helicos单分子测序平台，使用单聚合酶分子的实时测序(Eid等人，2009)，Ion Torrent测序(WO2010/008480)和纳米孔测序(Clarke等人，2009)。
当技术人员依赖测序方法测量特定基因的拷贝数时，生物信息学工具是处理收集的信息所必需的。实际上，使用测序，通过与参考序列比较，在全局测序数据中鉴定搜索的核酸序列。因此，进行比对(在测序数据和参考序列之间)，并且技术人员选择同一性百分比的阈值，高于该阈值，序列被认为与参考序列相同。例如，在一个实施方式中，通过与表1和2中所示物种中包含的核酸序列进行比较，在全局测序数据中鉴定相关细菌物种的核酸序列。该比较有利地基于与序列SEQ ID NO：1至1125的序列同一性，或与表1和2中鉴定的物种或"相应的参考物种"中包含的其他核酸序列的序列同一性水平。因此，表现出至少90％的核酸序列，与SEQ ID NO：1至1125中的核酸序列的至少 95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性被鉴定为包含在以下之一中的序列：被鉴定为在对抗PD1/PD-L1/PD-L2 抗体的反应或抗性中起作用的细菌物种。
本文的术语"序列同一性"是指两个核酸序列之间的同一性。为了确定两个氨基酸序列的同一性百分比，对齐序列以进行最佳比较。在该比较中，序列可以是相同的长度或可以是不同的长度。几种比对算法和软件(例如，BLAST软件)是可用的，并且可以用于在比较窗口上评估两个序列之间的同一性百分比，并且技术人员可以自由地使用任何适当的算法和方法来评估测序数据和参考序列之间的同一性百分比。
本发明的另一方面是益生菌组合物。
根据一个实施方式，所述组合物包含选自下组的细菌：希氏肠球菌(Enterococcushirae)，Akkermansia muciniphila，Alistipes shahii，其他Alistipes物种及其混合物。
根据一个实施方式，该组合物与基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法组合用于治疗癌症。该治疗用途的基础是这种组合物在癌症患者中诱导免疫刺激。根据本发明的组合物和基于抗-PD1/PD-L1/PD-L2 Ab 的疗法的组合施用导致协同效应，使得已经或将会是对基于抗 -PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法无响应者或差响应者的患者成为响应者。感兴趣的是，如图45和下面的实施例23所示，根据本发明的组合物还防止了基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的一些副作用。
根据一个实施方式，根据本发明的益生菌组合物包含选自下组的一种或几种细菌的分离物：希氏肠球菌(Enterococcus hirae)， Akkermansia muciniphila，Alistipesindistinctus，其他Alistipes物种及其混合物。另一种组合物包含选自下组的至少5种细菌：希氏肠球菌 (Enterococcus hirae)，Akkermansia muciniphila，Alistipesindistinctus，真杆菌属(Eubacterium)(如粘液真杆菌(Eubacterium limosum))，硬壁菌门(Firmicutes)物种(如Christensenella minuta，Dielma fastidiosa，Flavonifractorplautii)，Bacteroidia(例如脆弱拟杆菌 (Bacteroides fragilis)，Bacteroidessalyersae，Barnesiella intestinihominis)，放线菌门(Actinobacteria)(如Collinsella intestinalis， Collinsella tanakaei，Actinotignum schaalii)和古细菌史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)。根据本发明，可以用于在接受基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的癌症患者中诱导免疫刺激的特定组合物是包含希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和/或Akkermansia muciniphila和/或Alistipes和/或Christensenella minuta的细菌组合物。
在本文中，当上下文明确指出这些组合物包含细菌时，包含可有利地施用于癌症患者的细菌的本发明组合物被无差别地指定为"益生菌组合物"，"细菌组合物"，"oncobax组合物"或仅仅"组合物"。
根据一个具体实施方式，根据本发明的组合物包含选自下列的至少2种细菌物种：硬壁菌门(Firmicutes)物种，梭菌目(Clostridiales) 物种，Alistipes物种，真杆菌属(Eubacterium)物种，拟杆菌目 (Bacteroidales)物种，史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，Akkermansia muciniphila和希氏肠球菌(Enterococcushirae)，例如选自下组的至少2种细菌：希氏肠球菌(Enterococcus hirae)， Akkermansiamuciniphila，Alistipes物种，真杆菌属(Eubacterium)物种，瘤胃球菌科(Ruminococcacae)，梭菌目(Clostridiales)物种，拟杆菌目(Bacteroidales)物种，放线菌门(Actinobacteria)，红蝽杆菌目(Coriobacteriales)物种和史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)。可用于根据本发明的益生菌组合物的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)菌株的非限制性实例是：于2013年11月7日以编号CNCM I-4815保藏在国立微生物保藏中心(CNCM)的菌株 13144，于2017年8月31日以编号CNCM I-5224保藏在CNCM的菌株IGR7，于2017年11月27日以编号CNCM I-5260保藏在CNCM的菌株IGR4，于2017年11月27日以编号CNCM I-5261保藏在CNCM 的菌株IGR11。2种，3种或更多种希氏肠球菌(E.hirae)菌株(在上面列出的那些和其他菌株中)的混合物也可以用于本发明的框架中。
根据一个实施方式，根据本发明的组合物包含下列的至少一种或几种的分离物：希氏肠球菌(Enterococcus hirae)，Akkermansia muciniphila，Alistipesindistinctus，其他Alistipes物种及其混合物。另一种组合物包含选自下组的至少5种细菌：希氏肠球菌(Enterococcus hirae)，Akkermansia muciniphila，Alistipesindistinctus，真杆菌属 (Eubacterium)(如粘液真杆菌(Eubacterium limosum))，硬壁菌门(Firmicutes)物种(如Christensenella minuta，Dielma fastidiosa， Flavonifractorplautii)，Bacteroidia(例如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，Bacteroidessalyersae，Barnesiella intestinihominis)，放线菌门(Actinobacteria)(如Collinsella intestinalis，Collinsella tanakaei，Actinotignum schaalii)和古细菌史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)。根据本发明，可用于在接受基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的癌症患者中诱导免疫刺激的特定组合物是包含下列中的至多2 种的细菌组合物：希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和/或Akkermansia muciniphila和/或Alistipes和/或Christensenella minuta。
根据一个实施方式，所述组合物还包含选自下列的细菌：青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，梭菌目(Clostridiales)物种，罗斯氏菌属(Roseburia)，布劳特氏菌属(Blautia)，粪杆菌属 (Faecalibacterium)，瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)，Flavonifractor plautii和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)。
根据本发明益生菌组合物的优选实施方式，所述组合物包含希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和Akkermansia muciniphila。
根据本发明的益生菌组合物的优选实施方式，所述组合物包含 Alistipesshahii或其他Alistipes物种，有或没有希氏肠球菌 (Enterococcus hirae)和Akkermansia muciniphila。
这样的组合物可以有利地进一步包括洋葱伯克霍尔德氏菌和/或脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)和/或Actinotignum schaalii和/或 Alistipes indistinctus和/或Alistipes onderdonkii。
根据一个具体实施方式，本发明的组合物包含：
●Christensenella minuta的梭菌目(Clostridiales)细菌；和/或
●Erisipelotrichia(Dielma fastidiosa，Erysipelatoclostridium ramosum)；和/或
●Alistipes细菌物种，其选自：Alistipes shahii，Alistipes indistinctus，Alistipes onderdonkii和Alistipes finegoldii；和/或
●粘液真杆菌(Eubacterium limosum)的真杆菌属(Eubacterium)；和/或
●选自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，Bacteroides salyersiae 和Barnesiella intestinihominis的拟杆菌目(Bacteroidales)细菌物种，特别是Bacteroides salyersiae和/或Barnesiella intestinihominis；和/或
●Actinotignum schaalii的放线菌门(Actinobacteria)物种；和/或
●Collinsella intestinalis和/或Collinsella tanakaei的红蝽杆菌目(Coriobacteriales)细菌物种；和/或
●硬壁菌门(Firmicutes)，如Flavonifractor plautii；和/或
●史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)的古细菌物种。
在以下实施例中说明了几种细菌聚生体，其被证明对补偿菌群失调和对抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的治疗的反应特别有效(参见至少图 42和43)。因此，本发明涉及包含特定细菌聚生体的组合物。
根据本发明的一个具体实施方式，该组合物包含：
(i)选自菌株13144(CNCM I-4815)，菌株IGR7(CNCM I-5224)，菌株IGR4(CNCM I-5260)，菌株IGR11(CNCM I-5261)及其混合物的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)；和
(ii)Akkermansia muciniphila，例如菌株p2261和/或p3415的细菌，两者都保藏在立克次氏体联合会保藏机构(CSUR)；和
(iii)粘液真杆菌(Eubacterium limosum)。
根据本发明的另一个具体实施方式，该组合物包含：
(i)选自菌株13144(CNCM I-4815)，菌株IGR7(CNCM I-5224)，菌株IGR4(CNCM I-5260)，菌株IGR11(CNCM I-5261)及其混合物的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)；和
(ii)Barnesiella intestinihominis。
根据本发明的又一个具体实施方式，该组合物包含：
(i)选自菌株13144(CNCM I-4815)，菌株IGR7(CNCM I-5224)，菌株IGR4(CNCM I-5260)，菌株IGR11(CNCM I-5261)及其混合物的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)；和
(ii)Christensenella minuta。
根据本发明的另一具体实施方式，该组合物包含：
(i)选自菌株13144(CNCM I-4815)，菌株IGR7(CNCM I-5224)，菌株IGR4(CNCM I-5260)，菌株IGR11(CNCM I-5261)及其混合物的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)；和
(ii)Actinotignum schaalii。
根据本发明，如上所述的组合物有利地用作补偿癌症患者的菌群失调的药物。特别地，该组合物可以用作对癌症患者施用的基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的辅佐物。
本发明的组合物作为用于降低或预防基于抗-PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法和/或基于抗-CTLA-4 Ab的疗法(例如隐窝，通常与免疫关卡阻滞剂治疗相关的不规则性，丧失的绒毛和炎症模式)的肠毒性的药物也是有效的。
上述益生菌组合物可有利地配制用于口服给药，并作为食品补充剂或作为功能性食品给药。本领域技术人员知道各种配方，其可以包括活的或杀死的微生物，并且可以作为食品补充剂(例如丸剂，片剂等)或作为功能性食品(例如饮料，发酵酸奶等)存在。根据本发明的组合物还可以配制成药物，胶囊，丸剂，液体溶液，例如包封的冻干细菌等。
如已经提到的，根据本发明的上述益生菌组合物可以有利地与基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法组合给予有需要的患者。在这种组合中，益生菌细菌组合物有利地诱导免疫刺激。
如本文所用，术语"组合"是指使用一种以上的药剂(例如，益生菌组合物菌株和抗PD1/PD-L1/PD-L2抗体)。术语"组合"的使用不限制向患者施用治疗的顺序，尽管优选在抗肿瘤治疗之前或同时施用益生菌菌株。例如，益生菌菌株可以在抗PD1/PD-L1/PD-L2抗体之前(例如，6小时，12小时，24小时，48小时，72小时，96小时，1周，2 周，3周，4周，5周，6周，8周或12周前)，在基于抗-PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法之前准时或数次(例如，每天)施用。一种治疗癌症患者的方法，包括给予如上所述的组合物，例如益生菌组合物，其包含选自下列的至少2种细菌物种：硬壁菌门(Firmicutes)物种，梭菌目 (Clostridiales)物种，Alistipes物种，真杆菌属(Eubacterium)物种，拟杆菌目(Bacteroidales)物种，因此，在向所述患者施用阻断PD1， PD-L1或PD-L2的药物之前，史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibactersmithii)，Akkermansia muciniphila和希氏肠球菌(Enterococcus hirae) 也是本发明的一部分。
上述益生菌组合物在单独的抗PD1或与抗-CTLA4共阻断剂组合的情况下特别有用。
根据一个具体方面，本发明涉及益生菌组合物，其包含选自下组的细菌：希氏肠球菌(Enterococcus hirae)，Akkermansia muciniphila， Alistipes物种及其混合物，用于与基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法组合治疗癌症，其中益生菌细菌组合物在癌症患者中诱导免疫刺激。
根据本发明的益生菌组合物特别可用作治疗已被鉴定为可能对基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法具有抗性的癌症患者的辅助疗法。
根据一个具体实施方式，本发明的益生菌组合物在基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法之前和期间给予患者，例如在整个基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法期间每3天，或至少每次静脉内给予抗 PD1/PD-L1/PD-L2抗体的前一天和后一天给予患者(通常在1.5年内每月给予两次)。
根据另一个具体实施方式，患者在施用本发明的益生菌组合物之前接受将杀死或除去其肠中存在的至少部分细菌的治疗。这种治疗旨在有利于益生菌组合物中存在的"有利"细菌的切割。这种预处理的非限制性实例是给予聚乙二醇和/或短期(通常一至三天)广谱抗生素(例如氨苄青霉素或头孢菌素)。因此，一种治疗癌症患者的方法也是本发明的一部分，所述方法包括给予(i)聚乙二醇和/或短时间广谱抗生素，然后(ii)如上所述的益生菌组合物，和(iii)阻断所述患者的 PD1，PD-L1或PD-L2的药物。
根据另一方面，根据本发明的组合物用作免疫刺激疗法以预防癌症复发。一种预防已经治疗癌症的个体的癌症复发的方法，例如用药物阻断PD1，PD-L1或PD-L2，其中将如上所述的组合物作为免疫刺激治疗给予个体，因此也是本发明的一部分。
本发明还涉及用于确定是否需要基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的个体的治疗诊断方法，该个体是否在施用该疗法之前需要细菌补偿。实际上，在可能的副作用和财务成本方面，抗-PD1/PD-L1/PD-L2 Ab都很重，并且应该采取一切措施来确保治疗对患者有益。
因此，本发明涉及用于确定癌症患者在施用基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法之前是否需要细菌补偿的治疗诊断方法，包括在来自所述患者的粪便样品中评估存在或不存在Akkermansia muciniphila，其中如果所述粪便样品中不存在Akkermansiamuciniphila，则患者需要用如上所述的细菌组合物或粪便微生物群组合物进行细菌补偿。
本发明的另一种治疗方法，用于确定癌症患者在施用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法之前是否需要细菌补偿，包括在来自所述患者的粪便样品中评估存在或不存在希氏肠球菌(Enterococcus hirae)，其中如果所述粪便样品中不存在肠球菌，则需要用如上所述的细菌组合物或粪便微生物群组合物进行细菌补偿。
本发明的另一种治疗方法，用于确定癌症患者在施用基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2Ab的疗法之前是否需要细菌补偿，包括在来自所述患者的粪便样品中评估存在或没有瘤胃球菌属(Ruminococcus sp.) CAG:353，瘤胃球菌属(Ruminococcus)细菌LM158，扭链瘤胃球菌 (Ruminococcus torques)2和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)细菌D16，其中如果没有瘤胃球菌属(Ruminococcus sp.)CAG:353，瘤胃球菌属 (Ruminococcus)细菌LM158，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques) 2和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)细菌D16存在于所述粪便样品中，患者需要用如上所述的细菌组合物或粪便微生物群组合物进行细菌补偿。
本发明的另一种治疗方法，用于确定癌症患者在施用基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2Ab的疗法之前是否需要细菌补偿，包括在来自所述患者的粪便样品中评估存在或没有Alistipes sp.CAG:435、Alistipes sp. CAG:514、Alistipes indistinctus CAG328和Alistipes sp.CAG/268，其中如果没有Alistipes sp.CAG:435、Alistipes sp.CAG:514、Alistipes indistinctus CAG328和Alistipes sp.CAG/268存在于所述粪便样品中，患者需要用如上所述的细菌组合物或粪便微生物群组合物进行细菌补偿。
本发明的另一种治疗方法，用于确定癌症患者在施用基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2Ab的疗法之前是否需要细菌补偿，包括在来自所述患者的粪便样品中评估存在或不存在溶木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanosolvens)CAG945，卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)CAG1165，普雷沃氏菌属(Prevotella)CAG:255，CAG163，布氏瘤胃球菌 (Ruminococcusbromii)CAG611，肠罗斯氏菌(Roseburia intestinalis) CAG291和真杆菌属(Eubacterium)CAG:38，CAG:629，其中如果溶木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanosolvens)CAG945，单形拟杆菌 (Bacteroides uniformis)CAG159，卵形拟杆菌(Bacteroidesovatus) CAG1165，普雷沃氏菌属(Prevotella)CAG:255，CAG163，布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)CAG611，肠罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)CAG291或真杆菌属(Eubacterium)CAG:38，CAG629 存在于所述粪便样品中，患者需要细菌补偿，细菌组合物或粪便微生物群组合物如上所述-描述。
本发明的另一种治疗方法，用于确定癌症患者在施用基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2Ab的疗法之前是否需要细菌补偿，包括在来自所述患者的粪便样品中评估存在或不存在选自下列的产生短链脂肪酸的梭菌科(Clostridiaceae)：硬壁菌门(Firmicutes)细菌，真杆菌属 (Eubacterium)，布劳特氏菌属(Blautia)和罗斯氏菌属(Roseburia)，其中所述粪便样品中不存在硬壁菌门(Firmicutes)细菌，真杆菌属 (Eubacterium)，布劳特氏菌属(Blautia)和罗斯氏菌属(Roseburia) 表明患者需要用希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和/或Akkermansia muciniphila或与上述其他细菌组合物一起，或与如上所述的粪便微生物群组合物一起使用进行细菌补偿。
本发明的另一种治疗方法，用于确定癌症患者在施用基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2Ab的疗法之前是否需要细菌补偿，包括在来自所述患者的粪便样品中评估存在或者不存在Dielma fastidiosa，其中来自所述粪便样品的Dielma fastidiosa的缺失表明患者需要用希氏肠球菌 (Enterococcus hirae)和/或Akkermansia muciniphila或如上所述的另一种细菌组合物或如上所述的粪便微生物群组合物进行细菌补偿。
根据以下实验部分中所示的其它方面，本发明涉及用于评估癌症患者是否患有与癌症相关的菌群失调的体外方法，包括在来自所述患者的粪便样品中评估是否存在选自下组的至少10、11、12、13、14、 15、16、17、18或19种微生物物种：粪杆菌属(Faecalibacterium) CAG297，布劳特氏菌属(Blautia)CAG179，罗斯氏菌属(Roseburia)CAG55，副流感嗜血杆菌(Haemophila parainfluenzae)CAG1056，梭菌目(Clostridiales)CAG1132，青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，硬壁菌门(Firmicutes)CAG1308，硬壁菌门(Firmicutes) 细菌CAG713，齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)，粪肠球菌 (Enterococcus faecalis)，罕见小球菌属(Subdoligranulum)CAG140，毛螺菌科(Lachnospiricaeae)细菌CAG14，无害梭菌(Clostridium innocuum)CAG36，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)1，Hungatella hathewayi 1CAG25，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG11，大肠埃希氏菌 (E.coli)CAG371，梭菌目(Clostridiales)CAG533和Tyzzerellanexilis CAG311，其中以下表明患者患有与癌症相关的菌群失调：
●存在选自下组的微生物物种：齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，罕见小球菌属 (Subdoligranulum)CAG140，毛螺菌科(Lachnospiricaeae)细菌 CAG14，无害梭菌(Clostridium innocuum)CAG36，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)1，Hungatella hathewayi 1CAG25，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG11，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG371，梭菌目 (Clostridiales)CAG533和Tyzzerellanexilis CAG311，且
●不存在选自下组的微生物物种：粪杆菌属(Faecalibacterium) CAG297，布劳特氏菌属(Blautia)CAG179，罗斯氏菌属(Roseburia) CAG55，副流感嗜血杆菌(Haemophilaparainfluenzae)CAG1056，梭菌目(Clostridiales)CAG1132，青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，硬壁菌门(Firmicutes)CAG1308和硬壁菌门(Firmicutes) 细菌CAG713。
本发明还涉及用于预测接受治疗或已接受癌症治疗的患者的复发的体外方法，包括评估在不同时间点从所述患者获得的粪便样品中至少存在选自下组的5个，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18或19种微生物种类：粪杆菌属(Faecalibacterium)CAG297，布劳特氏菌属(Blautia)CAG179，罗斯氏菌属(Roseburia)CAG55，副流感嗜血杆菌(Haemophila parainfluenzae)CAG1056，梭菌目 (Clostridiales)CAG1132，青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，硬壁菌门(Firmicutes)细菌CAG1308，硬壁菌门(Firmicutes)细菌CAG713，齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，罕见小球菌属(Subdoligranulum) CAG140，毛螺菌科(Lachnospiricaeae)细菌CAG14，无害梭菌 (Clostridium innocuum)CAG36，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)1，Hungatella hathewayi 1CAG25，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG11，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG371，梭菌目(Clostridiales) CAG533和Tyzzerellanexilis CAG311，其中以下表示患者可能复发：
●选自下组的微生物物种的增加：齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，罕见小球菌属 (Subdoligranulum)CAG140，毛螺菌科(Lachnospiricaeae)细菌 CAG14，无害梭菌(Clostridium innocuum)CAG36，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)1，Hungatella hathewayi 1CAG25，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG11，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG371，梭菌目 (Clostridiales)CAG533和Tyzzerellanexilis CAG311，且
●选自下组的微生物物种的减少：粪杆菌属(Faecalibacterium) CAG297，布劳特氏菌属(Blautia)CAG179，罗斯氏菌属(Roseburia) CAG55，副流感嗜血杆菌(Haemophilaparainfluenzae)CAG1056，梭菌目(Clostridiales)CAG1132，青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，硬壁菌门(Firmicutes)CAG1308和硬壁菌门(Firmicutes) 细菌CAG713。
本发明还涉及基于对所述患者的记忆T细胞的分析来离体确定癌症患者是否可能受益于基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的治疗的方法。根据这些方法之一，评估来自所述患者的血液样品中存在针对洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)，希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和/或脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的记忆 Th1或Tc1细胞，其中存在针对洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)和希氏肠球菌(Enterococcushirae)的记忆Th1或Tc1细胞表明患者可能是对所述治疗的良好响应者，并且针对脆弱拟杆菌 (Bacteroides fragilis)的记忆Th1细胞的存在表明患者可能是不良响应者。
根据本发明的另一种方法用于离体确定癌症患者是否可能受益于基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的治疗，如下面的实验部分所示，包括评估存在记忆Th1或Tr1细胞对来自所述患者的血液样品中的 Akkermansia muciniphila的记忆，其中存在对Akkermansiamuciniphila 的记忆CD4+Th1或CD8+Tc1(产生IFNg)或CD4+Tr1细胞(IL-10 产生)表明患者可能对于所述治疗是良好的响应者，并且仅存在针对 Akkermansia muciniphila的记忆Tr1细胞表明患者可能是不良响应者。
本发明还提供了跟踪用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法治疗的患者的反应的方法。因此，本发明涉及一种用于评估用基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法治疗的癌症患者是否是对所述治疗的良好响应者的方法，包括以下步骤：
(i)评估在治疗开始时从所述患者获得的粪便样品中选自下组的至少3、4、5、6、7、8、9或10种微生物的存在或相对丰度：溶木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanosolvens)CAG945，单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)CAG159，卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)CAG1165，普雷沃氏菌属(Prevotella)CAG:255，CAG163，布氏瘤胃球菌 (Ruminococcusbromii)CAG611，肠罗斯氏菌(Roseburia intestinalis) CAG291，真杆菌属(Eubacterium)CAG:38，CAG:629，瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)CAG1003，Flavonifractor plautiiCAG439和硬壁菌门(Firmicutes)细菌CAG:124，CAG629；
(ii)在抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab施用三次或四次后获得的所述患者的粪便样品中评估与步骤(i)中相同物种的存在或相对丰度，
其中以下表明患者是治疗的良好响应者：
●溶木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanosolvens)CAG945，单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)CAG159，卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus) CAG1165，普雷沃氏菌属(Prevotella)CAG:255，CAG163，布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)CAG611，肠罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)CAG291和真杆菌属(Eubacterium)CAG:38，CAG:629 和/或减少或完全丧失
●瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)CAG1003，Flavonifractor plautii CAG:439和硬壁菌门(Firmicutes)细菌CAG:124，CAG:629的增加或获得。
在根据本发明的益生菌组合物中，益生菌优选存活。然而，包含死细菌的组合物，例如高压灭菌，巴氏灭菌，辐射或片段化的细菌，也是本发明的一部分，以及仅包含某些细菌抗原的组合物。实际上，已经表明，分离的细菌成分可以发挥与活细菌相同的效果，甚至可以发挥增强作用(Plovier等，2016)。在上述组合物中，活细菌因此可以被合适的细菌产物替代，用于引发有利于从生物体中消除肿瘤细胞的先天或获得性免疫应答。
根据另一方面，本发明因此涉及免疫原性组合物，其包含选自下组的细菌片段：硬壁菌门(Firmicutes)物种，梭菌目(Clostridiales) 物种，Alistipes物种，真杆菌属(Eubacterium)物种，拟杆菌目(Bacteroidales)物种，史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，Akkermansia muciniphila和希氏肠球菌(Enterococcushirae) 及其混合物，用作对癌症患者施用的基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的辅佐物。根据一个优选的实施方式，免疫原性组合物包含希氏肠球菌(Enterococcus hirae)的片段(例如其TLR2或NOD2激动剂)，例如菌株CNCM I-4815的片段，以及Akkermansiamuciniphila的片段。如上所述的免疫原性组合物可以进一步包含脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)和/或洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)的片段。
在前面的内容中，术语"片段"可以指细胞组分，代谢物，分泌的分子和由所述细菌的代谢产生的化合物。片段可以例如通过回收一种或几种细菌物种的培养物的上清液或通过从这种培养物中提取细胞组分或细胞组分，代谢物或分泌的化合物来获得。术语"片段"还可以指降解产物。片段可以对应于分离形式的组分或对应于来自所考虑的细菌物种的一种或多种组分的任何混合物。可有利地是如上所述的免疫原性组合物的成分的细菌组分的非限制性实例包括Amuc_1100，一种从Akkermansia muciniphila(Plovier等，同上)的外膜分离的特定蛋白质，荚膜多糖A(PSA)，其中脆弱拟杆菌(B.fragilis)需要占据结肠中的粘膜生态位，来自拟杆菌属物种的两性离子多糖(ZPS)重复基序(例如来自脆弱拟杆菌(B.fragilis))和具有＞15个重复单位的赖氨酸-天冬氨酸(KD)肽。
根据本发明的免疫原性组合物优选配制用于皮内，皮下，静脉内或肌肉内或口服给药。它们可有利地在施用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法之前，同时和/或之后施用，以诱导对治疗具有辅佐物效应的免疫应答。
根据本发明的另一方面，通过粪便微生物群移植(FMT)治疗需要用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法治疗的个体，使用来自该目的的粪便微生物群来自一个或多个个体的健康个体和/或粪便微生物群，用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法并且证明对该疗法有反应，和/或粪便来自一个或多个个体的微生物群展示肠道微生物群特征，该特征识别他/她/他们可能响应预想的治疗或来自响应的患者。当然，本发明的治疗诊断方法可用于选择合适的供体。这可以针对任何患者进行，但是当然这样的FMT对于被鉴定为可能对所述基于抗 PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法治疗的反应差的个体特别有用。
因此，本发明还涉及用于治疗癌症的粪便微生物群组合物，其与基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法组合。如上所述，粪便微生物群组合物优选(直接或间接)从来自(a)健康个体或(a)响应者的粪便样品获得至基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法，或者至少来自表现出肠道微生物群特征的个体，其识别他/她可能对预想的治疗有反应。可以间接从健康个体的粪便样品中获得粪便微生物群组合物的事实意味着可以产生粪便微生物材料库，可能混合粪便样品，并且可能产生"标准健康粪便微生物群组合物"，可能适用于需要FMT的某些条件(用于治疗梭菌感染的粪便微生物群组合物可以与用于癌症背景的粪便微生物群组合物不同)和/或患者的其他特征(年龄，种族，食物方案等)。已经描述了几种调节粪便微生物材料和进行FMT的方法，并且目前正在开发这些方法，并且技术人员可以自由选择适当的技术来制备根据本发明的粪便微生物群组合物，其可以是新鲜制备的液体，冷冻干燥的材料或任何其他条件。
根据一个具体实施方式，本发明的粪便微生物群组合物包含选自下组的至少10种细菌：硬壁菌门(Firmicutes)物种，梭菌目 (Clostridiales)物种，Alistipes物种，真杆菌属(Eubacterium)物种，拟杆菌目(Bacteroidales)物种，史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，Akkermansia muciniphila和希氏肠球菌(Enterococcushirae)，且更优选地，至少5种不同的硬壁菌门(Firmicutes)物种，3种不同的梭菌目(Clostridiales)物种，1种Alistipes物种，1种真杆菌属 (Eubacterium)物种，1种拟杆菌目(Bacteroidales)物种，史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，Akkermansia muciniphila和希氏肠球菌(Enterococcus hirae)。
在一个具体实施方式中，在植入物移植到用作MCA205肉瘤动物模型的无菌动物中时，所述组合物允许为选自下列的至少10种细菌物种的菌群以验证其组成及其抗肿瘤功效：硬壁菌门(Firmicutes)物种，梭菌目(Clostridiales)物种，Alistipes物种，真杆菌属(Eubacterium) 物种，拟杆菌目(Bacteroidales)物种，史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，Akkermansia muciniphila和希氏肠球菌(Enterococcushirae)。
根据另一个实施方式，在用抗PD1/PD-L1/PD-L2抗体处理宿主后，将移植物导入带无菌肿瘤的宿主中时，粪便微生物群组合物允许选自下列的至少10种细菌物种扩增：硬壁菌门(Firmicutes)物种，梭菌目(Clostridiales)物种，Alistipes物种，真杆菌属(Eubacterium)物种，拟杆菌目(Bacteroidales)物种，史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，Akkermansia muciniphila和希氏肠球菌(Enterococcushirae)。在此之前，宿主可以是癌症患者，其已经接受了用于从他/她的肠中消除细菌的预处理，例如上述那些，但它也可以是用作适合筛选粪便微生物物质以选择适当的粪便微生物群组合物的临床前模型的动物。
根据另一个实施方式，粪便微生物群组合物富含如上所述的细菌组合物。
本发明的粪便微生物群组合物有利地用于癌症患者中的同种异体健康粪便微生物移植，所述癌症患者已通过如上所述的治疗诊断方法被鉴定为可能对基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的治疗具有抗性。
具有本发明组合物的FMT优选在治疗开始前，例如几天前进行，但也可以在所述治疗过程中进行。
如下文实验部分(实施例8)中所述，发明人还显示针对某些细菌的Th1或Tc1应答指示用抗PD1抗体治疗的患者是治疗的良好响应者。事实上，在2-4次给予抗PD1抗体后，对希氏肠球菌(Enterococcus hirae)或Akkermansia muciniphila或洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)产生Th1或Tc1免疫应答的患者对PD1阻断记忆具有长期益处，与开发Th1或Tc1对脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的免疫应答相反。因此，本发明还涉及用于离体确定癌症患者是否可能受益于基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的治疗的方法，包括评估来自所述患者的血液样品中针对下列菌的记忆Th1或Tc1细胞的存在：希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和/或洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)和/或脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，其中存在这样的记忆Th1或Tc1细胞表明患者可能是所述治疗的良好响应者，并且记忆 Th1或Tc1细胞对脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的存在表明患者很可能是一个不良响应者。
该方法可以用在使用抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的药物进行的任何治疗开始之前获得的血液样品进行。但是，测试的灵敏度可能不足以提供任何明确的结果。在一次或两次施用所述药物之后，这不再是问题，这是可以进行该方法的另一时刻。
该方法的一个特别有利的方面是它可以使用血液样品进行。可以在治疗期间的不同时间评估患者的Th1或Tc1反应，并导致决定停止治疗或用FMT辅助治疗或如上所述给予益生菌或免疫原性组合物，如果患者是或成为反应迟钝的人。当然，这种方法可以用于患有任何类型癌症的患者，包括肺癌，肾细胞癌，头颈肿瘤，膀胱癌，肝癌，间皮瘤，Merkel细胞癌，食道癌，胃癌，黑素瘤和胸腺瘤。该方法的结果与患有晚期非小细胞肺癌的患者特别相关。
本发明的其他特征在随后的描述过程中也将变得显而易见，所述生物测定在本发明的框架中进行并且为其提供所需的实验支持，而不限制其范围。
【实施例】
【材料和方法】
在没有任何相反的指示的情况下，使用以下材料和方法进行实施例1至8。必要时，在实施例中描述了另外的材料和方法。
【数据集】
对127个样品进行测序，对应于设计用于测试3种不同癌症中的纳武单抗的3个不同群组，具有几个时间点：在(V1)之前或正在进行的处理(V2-V4)。
●来自28名肺癌患者的54份样本
●16个样本/肾癌患者(Nivoren队列)
●4个样本/膀胱癌患者
患有肺癌或肾癌或膀胱癌的患者(第3-5表)均为晚期或不可手术或转移性患者，在接受常规治疗的二线或三线治疗后参加PD1或 PD-L1抗体单药治疗。他们在EMA批准该药物的背景下入选Gustave Roussy，并根据道德准则允许在PD1阻断的不同时间点收获粪便以分析MG组成。该辅助研究的终点是建立粪便组成(物种和基因水平) 与PD1阻滞的临床反应(反应率和无进展生存期(PFS))之间的相关性。
表3：肺癌队列中的患者特征(批次1)
表4：肾细胞癌群组中的患者特征(批次1)
表5：膀胱癌队列中的患者特征(批次1)
在包括至少＞60名未收集粪便的患者的相同试验的其他较大的回顾性分析(特征如下，表6和表8)中，我们分析了抗生素使用对临床结果的影响。
【分析管道和方法】
使用MetaGenoPolis(MGP)开发的定量宏基因组管道进行肠道微生物群分析。该方法允许分析基因和物种水平的微生物群。
从127个粪便样品(SAMBO平台)中提取总DNA，并使用Ion Proton测序仪进行鸟枪测序以达到＞2000万个短DNA序列读数 (MetaQuant平台)。选择并清洁高质量读数以消除人类读数可能的污染物。然后使用MetaHIT hs_9.9M基因目录(Li et ai，2014)使用METEOR Studio内部管道使用两步程序对HQ清洁读数进行映射(共享程序)并计数：首先使用唯一映射读取，然后归因于共享使用独特的读数根据它们的映射比读取(从目录中映射不同的基因)。使用＞ 95％的同一性阈值进行定位以考虑基因变异性和目录的无冗余性质。
在缩小尺寸步骤(以校正不同的测序深度)和标准化(RPKM) 之后，获得基因频率分布矩阵，其用作使用MetaOMineR进行分析的起点，MetaOMineR是在MGP开发的一套R包，专用分析大量定量宏基因组学数据集。
【MGS】
hs_9.9M基因目录已被聚类成1438个MGS(MetaGenomic Species，＞500个基因的组，其在数百个样本中共存，因此属于相同的微生物物种)。使用其基因与先前测序的生物的同源性(使用blastN 对抗nt和wgs数据库)进行MGS的分类学注释。
样品中的MGS信号计算为50个标记基因的平均信号。
使用MGS信号并在归一化之后(样本的MGS频率之和＝1)构建 MGS频率分布矩阵。
MGS条形码：使用"条形码"显示样品中的MGS发生和丰度，50 个标记基因的频率丰度表的热图，列中的样品和行中的基因。使用热色代码(白色为0，浅蓝色＜蓝色＜绿色＜黄色＜橙色＜红色用于增加丰度，每种颜色变化对应于4倍丰度变化)。在这些条形码中，MGS表现为根据基因丰度着色的垂直线(样品中共同丰富的基因)。
【丰度】
可以在基因或MGS水平评估样品的丰度。
GC：基因计数，样本中看到的基因数量。
MGS计数：样本中看到的MGS数量
【相似性】
使用spearman相关性在基因和MGS水平上评估样品之间的相似性。
【微生物群分析】
微生物群分析在MGS水平进行。
首先，我们分析了不同队列的癌症患者与健康"对照"相比的微生物群。
其次，根据几个热门问题进行了探索性微生物群分析。
根据样本类别或临床参数使用Wilcoxon检验或Spearman相关性和MGS平均信号搜索对比或相关的MGS，并根据p值进行选择。
【统计分析】
细菌截止值的测定：从Wilcoxon秩和检验计算双侧p值。生物标志物有效性是根据接受者操作特征曲线(AUC)下的面积确定的，该曲线描述了生物标志物作为鉴别阈值所采用的每个可能值的灵敏度和特异性补体之间的关系。最佳截止值对应于最有效的生物标记物鉴别阈值。它对应于使Youden指数最大化的值，其定义为生物标志物的每个可能值的灵敏度和特异性的总和。通过自举确定AUC的95％置信区间和最佳截止值(B＝1999)。
【实施例1：肾细胞癌和尿路上皮癌患者中口服抗生素显著降低 PD1阻断的功效】
首先，就在NIVOREN募集之前60至30天口服服用抗生素(ATB，至少7天的β-内酰胺)或质子泵抑制剂(PPI)的作用而回顾性分析了一组70名转移性RCC患者参加用抗PD1或抗PD-L1抗体的II期NIVOREN方案的二线或三线治疗。70名患者中有14名和21名患者分别接受了β-内酰胺和PPI。在与加速进展时间(PFS)相关的所有临床参数的单变量分析中，Karnofsky性能状态(KPS)和ATB摄取是模型中保留的两个重要变量，预测较短的PFS。在多变量Cox回归分析中，ATB(以及较小程度的PPI)施用仍然是与PD1阻断受益减少相关的重要因素(分别减少PFS，p＜0.01和p＜0.03)(图1，表6、 7)。
表6：mRCC队列中的患者特征
表7：来自NIVOREN方案的影响70个RCC中无进展存活的临床参数的多变量分析。ATB：抗生素的摄取。KPS：Karnofsky表现状态。IMDC：国际转移性肾细胞癌数据库联盟-预后指数，TBCI：肿瘤负荷分类(低：低，Mi：中，高-高)PPI：质子泵抑制剂的摄取。
其次，对用PD-L1抑制剂(抗PD-L1 Ab)治疗的尿路上皮癌(UC) 患者进行类似的分析。我们对Gustave Roussy治疗的UC患者进行了一项回顾性研究，该患者使用PD-L1抑制剂和ATB的现有数据。ATB (+)/(-)组定义为接受或未接受ATB治疗的患者(首次注射前2 个月，此后长达1个月)。在ATB(+)和ATB(-)之间比较无进展存活(PFS)，反应率(RR)和总体存活(OS)。使用Kaplan-Meier 方法进行统计分析，并针对风险因子调整Cox回归。本研究纳入42 例患者，其中12例(29％)接受ATB(β-内酰胺酶和氟喹诺酮类药物最常见)。与ATB(-)组相比，ATB(+)组PFS降低(1.8对4.3 个月，p＜0.04)。在针对年龄，性别，Karnofsky表现状态，血红蛋白和肝转移的存在进行调整的多变量分析之后，维持该统计关联。在 ATB(+)组与ATB(-)组相比，RR较低(4分(33％)vs 21分(70％)) (p＜0.03)。经过15个月的中位随访后，ATB驱动的操作系统出现了负面趋势，但ATB(-)组的中位数操作系统仍然没有达到。(表8、 8a和图2)。
表8：尿路上皮癌队列中患者的特征
表8a：已知临床危险因素的多变量分析，以确定42例尿路上皮癌患者ATB对PFS的影响。ATB：抗生素的摄取。KPS：Karnofsky 表现状态。Hb：血红蛋白
多变量p-值
ATB 0.026*
KPS 0.046*
Hb 0.565
肝Met 0.765
性别 0.138
总之，这些发现表明ATB阻碍了抗PD1或抗PD-L1抗体所预期的临床益处，这表明纳武单抗或atezolizumab的生物活性可能需要完整的肠道微生物群。这些数据促使我们研究癌症患者(与正常个体相比)肠道微生物组的潜在偏差及其对预后和对化疗或ICB反应的影响。
关于ATB摄取对抗PD1或抗PD-L1抗体的生物活性和临床效果的影响的其他数据公开于下文实施例9中(图20-21)。
【实施例2：癌症影响肠道微生物群的丰度】
读数的质量控制令人满意，并表明所有癌症患者的同质性。感兴趣的是，在纳武单抗后进展的癌症患者中观察到人类读数的污染(未显示)，表明肠道细胞凋亡可能先于或伴随肿瘤细胞的传播。无论群组或结果如何(未显示)，都观察到类似的丰度(GC和MGS计数)。
癌症患者与"健康对照"的比较(从使用Ion Torrent测序的样本中选择>＝13M的hs_9.9M基因目录中的读数：85个样本)显示，与健康对照相比，癌症患者的丰度仅在基因或MGS水平有下降趋势(未显示)。
尽管癌症与健康(H)对照之间缺乏丰富对比的重要性，但是当执行基因(但不是基于MGS)的基于层次聚类时，约一半的癌症患者出现了丰富的深度丧失。实际上，54％(68/127)癌症(C)样本和9％ (8/85)健康(H)样本属于"低"组(χ检验p值＝1.4e-10)，表明与物种分类以外的功能相关的基因将癌症携带者与健康个体分开(未示出)。
【实施例3：与健康微生物群相比癌症相关微生物群的表型特征：与癌症生长相关的19种标志物】
我们的目标是确定不同癌症(C)患者队列和健康(H)队列之间的微生物群对比。对于每位患者，选择第1个样品(在治疗前诊断时) 进行分析。
对于该实施例，添加了另外的群组，其包括53名乳腺癌患者(表 9)。
表9
样品：
癌症患者：101
●乳腺：53名患者
●肾脏：16名患者
●肺：28例患者
●膀胱：4名患者
健康对照：85人。
菌群：
以下策略用于确定癌症患者与健康对照之间的对比MGS：
√基于使用样本根据其基因含量相关得到的2个聚类，整个队列在 "高"和"低"丰富样本中分离
●乳腺：28"高"和25"低"
●肾脏：11"高"和5"低"
●肺：14"高"和14"低"
●健康：77"高"和8"低"
√对于每个癌症队列，使用以下方法搜索MGS与整个健康队列的对比：
●所有人
●"高"丰富样本
●"低"丰富样本
√如果符合以下标准，则选择对比MGS：
●与所有样品和高丰度样品的显著对比(p.val＜0.05)
●2种分析中的状态相同
●至少一项测试的显著性<0.001
使用此策略，发现以下对比MGS：
√乳腺：90对比MGS使用p.val＜0.05和40MGS，使用最佳p.val ＜0.001
√肾：使用最佳p.val＜0.001，使用p.val＜0.05和42MGS对比 MGS对比157
√肺：使用p.val＜0.05和100MGS使用最佳p.val＜0.001的160 对比MGS
在至少一个前面的分析中发现147个MGS显著对比(p＜0.001)，其中一些是常见的，如图3至图5所示的热图/层次聚类所判断的那样。尽管癌症的丰度丧失缺乏显著性，在健康对照和高丰度物种和癌症物种和低丰富物种中富含的细菌物种之间观察到了很大的相关性。
29％的对比MGS似乎是高丰度或低丰度MGS，富含MGS和表型之间具有非常强的关联：高丰度MGS/健康受试者与低丰度MGS/癌症群组。在"健康的MGS"中发现许多潜在的短链脂肪酸(SCFA)产生细菌(如粪杆菌属(Faecalibacterium)，罗斯氏菌属(Roseburia)，布劳特氏菌属(Blautia)物种)(图4)。
发现27个MGS在至少2个癌症队列中形成对比(图6-7)。
总之，肠内容物的典型癌症相关微生物指纹将基于如下定义的19 种标志物：
过量表达齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)，隐杆菌属 (Cryptobacteriumsp.)CAG:338，未分类的Eggerthella，Phascolarctobacterium sp.CAG:266，梭菌属(Clostridium sp.)CAG:169，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，Faecalitaleacylindroides，罕见小球菌属(Subdoligranulum sp.)4_3_54A2FAA，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)，Hungatella hathewayi，梭菌属(Clostridium sp.)CAG:242，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CAG00011；CAG00815 乳酸乳球菌。
表10
青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，未分类的梭菌目(Clostridiales)，罗斯氏菌属(Roseburia sp.)CAG:182，未分类的布劳特氏菌属(Blautia)，布劳特氏菌属(Blautia sp.)CAG:237未分类的粪杆菌属(Faecalibacterium)的低表现。
表11
这种对肠内容物的典型癌症相关微生物指纹的观察结果使发明人提出健康个体粪便的同种异体粪便微生物移植给有需要的癌症患者和 /或施用旨在有利于患者对抗肿瘤治疗的反应的组合物，例如，(i)混合下列的组合物：青春双岐杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)，未分类的梭菌目(Clostridiales)，罗斯氏菌属(Roseburia)CAG:182，未分类的布劳特氏菌属(Blautia)，布劳特氏菌属(Blautia sp.) CAG:237，未分类的粪杆菌属(Faecalibacterium)，或(ii)下列免疫原性细菌的益生菌组合物，例如希氏肠球菌(Enterococcus hirae)或 Akkermansia muciniphila或Alistipes shahii或其他Alistipes物种或 Barnesiella intestinihominis或脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)。
关于肠内容物的癌症相关微生物指纹的额外数据在下面的实施例 10中公开(图22-23)。
【实施例4：肠道指纹预测阻断抗PD1/PD-L1-PD-L2轴的抗体的临床益处】
首先，我们在第1次施用抗PD1抗体(V1)之前检查了微生物组谱，并将其与6个月后观察到的相比较(双月注射6个月，V4)。所有V4都是响应者(因为这些治疗性给药在非响应者中停止3个月)。我们汇总了患有膀胱癌和肺癌的患者进行此分析，因为肺癌的结果非常相似。
样品：
●肺：16个样本；11V1/5V4
●膀胱；3个响应者V4样本
【结果】
在PD1阻断的响应者中，在治疗过程中微生物组组成有显著变化，其倾向于表现出以下特征(图8)：
下列的过表现：布劳特氏菌属(Blautia sp.)KLE 1732，Alistipes shahii，硬壁菌门(Firmicutes)细菌CAG:114，梭菌属(Clostridium sp.) CAG:265，未分类的硬壁菌门(Firmicutes)(CAG00618)，未分类的梭菌目(Clostridiales)，青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)
下列的低表现：未分类的梭菌目(Clostridiales)细菌1_7_47FAA，Doreaformicigenerans，真杆菌属(Eubacterium sp.)CAG:38。
表12
其次，我们旨在通过在时间0(样本V1，治疗前)之间识别响应者/非响应者之间的微生物群对比，通过在PD1阻断开始之前分析样本来预测抗PD1 Ab(纳武单抗)的临床益处。由于在配对的V1和V2 肺样品(未显示)之间未检测到明显差异，因此当V1样品不可用于增加群组大小时，我们使用V2样品。
样品：
●肺：6R(3V1和3V2)/19NR(8V1和11V2)，NB：排除对比3R(1V3和2V4)1R仅跟踪2.4个月
●肾脏：9R V1/6NR V1
【丰度】
没有观察到响应者和非响应者之间的显著丰度差异，但是肺NR 的丰度较低(未显示)。
我们汇集了肺+肾病患者：
由于在肾病患者中约3个月后评估结果，使用R+NR＞3个月进行汇总分析：13名肺+9名肾病患者/NR＜3个月：12名肺+6名肾
我们发现36个MGS在响应者中更丰富，11个MGS在进展者中更丰富(图9)。
总之，基于大约45种标记，富含硬壁菌门(Firmicutes)细菌，梭菌目(Clostridiales)，Alistipes和真杆菌属(Eubacterium)以及感兴趣的物种如史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)和 Akkermansia muciniphila，肠道内容物易于响应PD1阻断的微生物指纹，但是在Oscillibacter中很差，并且确切地定义如下：
过表现
●未分类物种：
■CAG00064
■CAG00245
●硬壁菌门(Firmicutes)物种：
■CAG00604，1714
■CAG01090，1026
■CAG00965，1210
■CAG00621，1695
■CAG01245，780
■CAG01308，606
■CAG00669，1649
■CAG00670，1648
■CAG00872，1359
■CAG00851，1422
■CAG00288，2189
梭菌目(Clostridiales)物种：
■CAG00363，2056
■CAG00391，2019
■CAG00449，1945
■CAG00513，1853
■CAG00559，1776
■CAG00644，1670
■CAG00811
■CAG00907，1299
■CAG01350
瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)物种：
■未分类的瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)，CAG01169，912
■罕见小球菌属(Subdoligranulum sp.)CAG:314，CAG00880，1352 ■未分类的粪杆菌属(Faecalibacterium)，CAG00628，1686
■酸奶瘤胃球菌(Ruminococcus lactaris)CAG00558，1777
真杆菌属(Eubacterium)种类：
■CAG00469，1928
■CAG00393，2011
●细菌物种
■诺氏拟杆菌(Bacteroides nordii)，CAG00116，2783
■拟杆菌属(Bacteroides sp.)CAG:661，CAG00355，2067
■拟杆菌属(Bacteroides sp.)CAG:598，CAG00440，1952
■未分类的Alistipes，CAG00646，1668
■Alistipes sp.CAG:435，CAG00887，1332
●疣微菌门(Verrucomicrobia)物种
Akkermansia muciniphila，CAG00301，3187
Coraliomargarita sp.CAG:312，CAG00313，2139
●古细菌物种
史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)CAG00721，1830
低表现：
Oscillibacter(CAG00931，1257和CAG00270，2225)
青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)(CAG00702，1609)
Anaerotruncus colihominis(CAG00720，1590)
梭菌属(Clostridium sp.)CAG:242，CAG00381，2033
梭菌目(Clostridiales)细菌VE202-14，CAG00168，2534
真杆菌属(Eubacterium)CAG:252，CAG00353，2341
未分类的嗜胆菌属(Bilophila)，CAG01018，1135
表13
【实施例5：来自肺(NSCLC)癌症患者的人粪便的粪便微生物移植赋予无菌荷瘤小鼠对PD1阻断的敏感性或抗性】
我们选择了4名无法应对4个月纳武单抗的IV期NSCLC患者(A， B，E，F)以及对纳武单抗表现出部分反应以将其粪便转移至ATB治疗的受体动物的两名IV期NSCLC患者。平行地，对照特异性无病原体(SPF)小鼠腹膜内施用纳武单抗并且如预期的那样通过减少的肿瘤生长作用来响应(实验设置在图10中描述)。然而，ATB处理的动物转移进展者来源的粪便没有响应，而ATB处理的同窝仔转移响应者来源的粪便(图11-12)。
在进行FMT之前，小鼠接受3天的ATB。然后使用来自用抗PD1 Ab治疗的不同NSCLC患者的粪便进行FMT。随后，接种MCA205WT 肿瘤，并且小鼠接受四次注射抗PD1或同种型对照抗体。
来自任一响应者的FMT的同种型组中的肿瘤大小没有差异。然而，与进展(PRO)相比，在接受来自响应者(RES)的FMT的动物中观察到用抗PD1抗体治疗的小鼠中显著较小的最终肿瘤大小。
该实验在无菌动物中作为受体而不是ATB处理的C57BL/6小鼠重复，产生类似的结果。
【实施例6：补偿性抗癌益生菌也称为"oncomicrobiotics"或 "oncobax"(例如Akkermansia muciniphila或希氏肠球菌(Enterococcus hirae)或Alistipes或其组合)】
为了建立概念证据，即在无响应者患者中口服喂养免疫原性细菌可能是有益的，我们在化身模型中进行FMT(如图10-11-12所示)，然后进行细菌补偿。我们可以获得患者A，B(均经历进展)的宏基因组数据，其粪便分别具有低水平的Akkermansia municiphilaCAG00301：0和0.00344667(截止值0.01598361)。诺氏拟杆菌 (Bacteroides nordii)CAG00116值也低于1.22E-05的截止值(分别为0和0)。
基于图10-12中呈现的经验，我们在GF小鼠中对来自患者A(临床无响应者，宏基因组谱：低Akkermansia)的粪便进行了FMT。然后，在第1次和第2次注射抗PD1抗体时，用109个细菌进行2次强饲。使用3种不同的细菌，在分离的隔离器中每组一只小鼠(每组n＝5 只小鼠)。
Akkermansia municiphila(Akk)或希氏肠球菌(Enterococcus hirae) 13144(EH)的口服强饲法显著降低了从进展的患者A接受FMT的化身小鼠的最终肿瘤大小。另一方面，纤细真杆菌(Eubacterium tenue) 在FMT后没有改变肿瘤大小(图13)。
用来自其他患者(患者B和F)的粪便的FMT重复该实验，其具有相同和其他细菌以及具有更多数量的益生菌施用。
我们可以获得患者B和F(均经历进展)的宏基因组数据，其粪便具有低水平的Akkermansia municiphila CAG00301和Alistipes物种然后，在第1次，第2次，第3次，第4次注射抗PD1 Ab之前和之时，用109个细菌进行5次强饲。单独使用3种不同的细菌(Akkermansia muciniphila，Alistipes物种和希氏肠球菌(Enterococcus hirae)13144)，以及Akk+EH 13144的组合，每组小鼠(每组n＝5-6只小鼠)保存在分离的隔离器中(图14)。
最佳应答组是口服灌胃Akkermansia municiphila+希氏肠球菌 (Enterococcushirae)13144，显著降低了用小鼠微生物群自发重建的化身小鼠的最终肿瘤大小(停止ATB后，图15)或接受FMT患者B (图16)或F。图17显示了该实验中所有小鼠的结果，其中Akk+EH的组合比单独的每个共生更有效。
【实施例7：PD1和CTLA4共阻断物的功效取决于肠道微生物群，并且在益生菌小鼠中，通过脆弱拟杆菌(B.fragilis)和洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cepacia)或Barnesiellaintestinihominis的组合可以恢复组合的受损杀肿瘤活性】
在施用14天广谱ATB后，用MCA205肉瘤接种C57BL/6小鼠。然后，在MCA205植入的第6天，用静脉内注射抗-CTLA4 Ab(每4 天注射4次)以及抗-PD1 Ab(每6天注射6次注射6次)处理小鼠。在不同笼子中分离的独立组中，小鼠接受具有不同"oncobax"的口服gavages，例如短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)与长双歧杆菌或脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)组合或与洋葱伯克霍尔德氏菌 (Burkholderia cepacia)或Barnesiellaintestinihominis组合。在6只小鼠/组中监测肿瘤生长动力学，每周两次。
用脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)+洋葱伯克霍尔德氏菌 (Burkholderiacepacia)或Barnesiella intestinihominis的组合获得了两个独立实验的最佳结果。在该组中，排斥肿瘤的无肿瘤小鼠的百分比为3/6(50％)(图18)。
【对实施例1-7的结论性评论】
我们的目的是更好地定义癌症患者在其疾病的不同阶段的肠道微生物组：诊断时的乳腺癌，PD1阻断后6个月响应的顺铂抗性膀胱癌，对酪氨酸激酶具有抗性的二线或三线转移性肾癌抑制剂和mTOR抑制剂，顺铂耐药的晚期肺癌。除了一名患者外，没有人在收集粪便前的最后一个月服用过抗生素。
尽管疾病组织学和阶段具有广泛的异质性，但我们根据读数和高映射％发现了非常均一的测序样品。
无论是队列还是结果，都发现了类似的癌症样本丰度(GC和MGS 计数)。
根据基因和MGS计数，癌症患者往往具有较低的丰度，但差异不显著。然而，样本的层次聚类给出了由微生物群丰度驱动的2个大群集，高丰度样本包含大多数(90％)健康样本和仅一半的癌症样本，这表明半数癌症相关微生物群的丰度不足。
与癌症相关的微生物物种与健康受试者的物种形成对比。发现138 个MGS在至少一个癌症队列中显著对比，其中40％看起来是高或低丰度MGS，其具有丰度MGS和表型之间的非常强的关联：高丰度 MGS/健康受试者与低丰度MGS/癌症群组。因此，我们根据基因丰度聚类对所有样本进行分层，并使用完整队列和高丰度样本对MGS进行显著对比。发现147个MGS在至少一个癌症队列中显著对比，27个在至少2个不同队列中进行对比。30％的对照MGS似乎仍然是高丰度或低丰度的MGS，但丰度/表型关联不太清楚。在"健康的MGS"中，发现了许多潜在的SCFA产生细菌(如粪杆菌属(Faecalibacterium) 和罗斯氏菌属(Roseburia)物种)以及青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，其似乎在癌症患者中高度耗尽。
特别地，我们基于19种标记提出了典型的癌症相关的肠内容物微生物指纹，其定义如下：
下列的过表现：齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)，隐杆菌属(Cryptobacterium sp.)CAG:338，未分类的Eggerthella， Phascolarctobacteriumsp.CAG:266，梭菌属(Clostridium sp.)CAG:169，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，Faecalitalea cylindroides，罕见小球菌属(Subdoligranulum sp.)4_3_54A2FAA，扭链瘤胃球菌 (Ruminococcus torques)，Hungatella hathewayi，梭菌属(Clostridium sp.)CAG:242，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)。
下列的低表现：青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，未分类的梭菌目(Clostridiales)，罗斯氏菌属(Roseburia sp.)CAG:182，未分类的布劳特氏菌属(Blautia)，布劳特氏菌属(Blautia sp.) CAG:237，未分类的粪杆菌属(Faecalibacterium)。
因此，肺癌和膀胱癌患者长期接受PD1阻断至少6个月(并对该疗法做出反应)表现出类似于健康志愿者的微生物移位，柔嫩梭菌 (Clostridium leptum)的丰度降低(仅考虑肺病人)和双歧杆菌的富集青春期(高度富集健康对照组与所有癌症组)。
与PD1阻断反应相关的肠内容物的微生物指纹基于16MGS，富含硬壁菌门(Firmicutes)细菌，梭菌目(Clostridiales)，瘤胃球菌科 (Ruminococcaceae)，Alistipes和真杆菌属(Eubacterium)以及感兴趣的物种如史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibactersmithii)和Akkermansia muciniphila，但在Oscillibacter中较差。已发现Akkermansiamuciniphila在厌食症中，以及在治疗中的个体中，改善糖尿病和胰岛素依赖性。这种属于疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)的Akkermansia muciniphila在响应PD1阻断的癌症患者中也被过多地表达，并且在我们的FMT实验中将无反应的化身小鼠转化为响应者。感兴趣的是，在环磷酰胺的情况下，具有高免疫原性的希氏肠球菌 (Enterococcus hirae)也非常有效地将进展者转化为化身小鼠的响应者。此外，文化组学分析显示，在NSCLC患者诊断时，粪便中可检测到的肠球菌菌落数量较多，而且与使用抗PD1/PDL1抗体治疗失败的患者的粪便相比。
总之，癌症患者表现出生理异常的粪便微生物组成，具有低基因多样性，"健康相关MGS"的低表现，例如产生SCFA的细菌，其降低其免疫调节及其对免疫调节作出反应的倾向和可能性，例如PD1阻断。它们可以受益于健康个体粪便的异体粪便微生物移植或适当的益生菌组合物，例如混合下列的组合物：青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，未分类的梭菌目(Clostridiales)，罗斯氏菌属(Roseburia) CAG:182，未分类的布劳特氏菌属(Blautia)，布劳特氏菌属(Blautia sp.)CAG:237，和未分类的粪杆菌属(Faecalibacterium)，或下列免疫原性细菌的益生菌组合物，例如希氏肠球菌(Enterococcus hirae) 或Akkermansia muciniphila或Barnesiella intestinihominis或脆弱拟杆菌 (Bacteroides fragilis)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)。
【实施例8：在2-4次第1次施用抗PD1抗体后，对肠球菌或洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)或最佳Akkermansia muciniphila产生TH1免疫应答的IV期NSCLC患者对PD1阻断具有长期益处】
如Vetizou等人，Science，2015所述，在第1次或第2次或第3 次注射后，对用抗PD1抗体(纳武单抗)治疗的14名NSCLC患者(下表14)随后记录针对各种不同共有物的记忆TH1和TC1或Tr1免疫应答。
表14
简言之，将自体单核细胞与活细菌以1:10的比例温育，然后在加入自体CD4+或CD8+T细胞(使用磁珠从患者血液中分选)之前，通过适当的ATB使细菌失活。在ELISA中测试这些共培养物的48小时上清液中IFNγ或IL-10的浓度。使用IFNγ或IL-10产生的中位数或其在整个群组中的每个错误的比例来分离患者并计算PD1阻断期间的进展时间。针对希氏肠球菌(Enterococcus hirae)13144(MH13144) 的记忆TH1/Tr1CD4+T细胞应答与用抗PD1 Ab治疗的这14名患者的长期进展时间(TTP)相关，而针对粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(EF)或TCR的那些患者交联(珠子)未能预测TTP(图19A，B， C)。
为了证实这组NSCLC患者对于PD1阻断反应的肠球菌的免疫原性的相关性，我们还举例说明了对其他分离株的希氏肠球菌 (Enterococcus hirae)(EH17/13344)的CD8+Tc1免疫应答对于预测 TTP也是至关重要的(图19D-E)。对希氏肠球菌(Enterococcus hirae)的高Tc1免疫应答是在基于抗PD1 Ab的疗法下预测TTP的有利免疫动力学参数。在图37中，我们还证明了对疣微菌科 (Verrucomicrobiaceae)A.muciniphila的CD4+TH1(图37)和CD8+Tc1免疫应答(Routy等，Science 2017)对预测TTP也是至关重要的。
在其他8个共生体中，只有TH1对洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)(B)的反应也与预测该队列患者的TTP相关，高TH1或TH1/Tr1比率与延长的TTP相关(图19F和19H)。
【实施例9：非小细胞肺癌患者口服抗生素显著降低PD1阻断的功效】
我们已经扩展了抗生素(ATB)对PD1阻断对非小细胞肺癌患者的反应的有害作用。在参加使用抗PD1抗体(ICB)治疗的第2或第 3线治疗中的66名NSCLC患者(表15中详述的特征)随访18个月。 20名患者在ICB(V1)开始前2个月或在第1次接种ICB(V2)后的第1个月内接受了抗生素(详见表16)。ATB(+)组：V1(ICB第 1次注射前)+V2(ICB第1个月内)。
表15：用纳武单抗作为第2至第3线治疗的66名NSCLC患者的基线特征。ATB(+)/(-)组被定义为在Nivolumb之前(2个月期间) 或第1个月内接受或不接受ATB治疗的患者。除突变状态外，ATB(+) 和ATB(-)组的临床特征无显著差异。ATB(+)组：V1(ICB第1 次注射前)+V2(ICB第1个月内)。*由于数量较少而未计算
表16：ATB特异性。对V2患者图进行了审查，并对V2 ATB开出了尿路感染，咳嗽或发烧(基于CTCAE v4)。没有人在ICU或死于败血症。
ATB列表 ATB(+)组(N＝20) ATB(V2)组(N＝7)
大环内酯类 2 1
β内酰胺酶 9 4
氟喹诺酮类 4 2
磺胺类药物 2 -
四环素 2 -
未报道 1 -
显示了Kaplan Meier存活曲线的无进展存活(在用ATB处理或未处理的组之间没有显著差异，图20左图)或总存活(显著差异，图 20，右图)。Cox回归多变量分析显示，ATB给药仍然是NSCLC患者对ICB耐药的独立预测因子(表17)。
表17：NSCLC中总体存活的多变量分析。多变量分析确定风险比，计算调整已知预后风险因素：ATB，年龄，性别，组织学(非鳞状与鳞状)，吸烟史(非吸烟者与吸烟者)，既往治疗次数，转移部位数，ECOG表现状态的规模(0＝完全活跃，1受限于身体剧烈活动， 2＝限于床或椅子＜50％，3＝仅限于床或椅子＞50％，4＝完全禁用)。 *p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，ns＝不显著。
我们收集了患有肺癌(N＝66，表15中描述的队列)，膀胱癌(N＝42，表5中描述的队列)和肾癌(N＝67，如下表18中所述)的癌症患者。在总共N＝175名患者中，在第2或第3线治疗中接受基于ICB的治疗，我们显示ATB诱导对PD-1阻断的抗性(PFS和OS，图21)。
表18：使用PD1治疗的mRCC的患者基线特征的更新包括在ATB 在PFS和OS中的影响的分析中。
【实施例10：与癌症相关的肠道指纹(有或没有ATB)】
【材料】
292个健康对照
癌症患者：
乳腺癌：表9中描述的批次1和表19中描述的批次2。肺癌：表 3中描述的批次1和表20中描述的批次2。肾癌：表4中描述的批次 1和表21中描述的批次2。
30个样本来自使用抗生素(AB)治疗的患者。
●3：Augmentin(β-内酰胺+青霉素)
●1：氧氟喹诺酮(氟喹诺酮)
●1：头孢曲松(β-内酰胺)
●25：NA
仅使用来自AB处方的部分信息，AB样本作为整体处理。
进行了2次分析：
●所有样品
●配对样本+/-AB(12个肺+5个肾配对样本)
AB处理的样品具有较低浓度(不显著)的趋势。
表19：乳腺癌患者特征包括第2批。
表20：批次2中包括的肺癌患者特征。
表21：批次2中包括的转移性肾细胞癌患者特征。
【结果】
发现18个宏基因组物种(MGS)与至少2个癌症队列中的2个批次形成对比。其中，15个属于最初确定的27个物种的清单(图6和7)。
如果我们取出ATB治疗的患者，则维持11种宏基因组物种。
因此，我们提出了在有或没有(*)ATB的2批中验证的癌症患者的肠道指纹，其包含19个MGS。
与健康志愿者相比，8位MGS在癌症中表达不足：
粪杆菌属(Faecalibacterium)CAG297*
布劳特氏菌属(Blautia)CAG179
罗斯氏菌属(Roseburia)CAG55*
副流感嗜血杆菌(Haemophila parainfluenzae)CAG 1056
梭菌目(Clostridiales)CAG1132
青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)(CAG702)
硬壁菌门(Firmicutes)CAG1308*
硬壁菌门(Firmicutes)细菌CAG713*
11MGS在癌症和HV中过度表达：
齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)(CAG456)*
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(CAG257)
罕见小球菌属(Subdoligranulum)CAG140*
毛螺菌科(Lachnospiricaeae)细菌CAG14
无害梭菌(Clostridium innocuum)CAG36
扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)1(CAG243)*
Hungatella hathewayi 1CAG25*
2种大肠埃希氏菌(E.coli)(CAG11*et 371*)
梭菌目(Clostridiales)CAG533*
Tyzzerella nexilis CAG311
其中18个在至少2个(3个)癌症队列中对比(图22，数据未显示)。
如果仅考虑那些不服用抗生素(无ATB)的患者，则至少有2个 (三分之一)癌症队列中只有11个MGS形成对比(图23)。
在MGS分析中，ATB对癌症队列的直接影响是显而易见的：ATB 后富含9个MGS，而6个被消除。ATB倾向于富集钝化PD1阻断或其他免疫原性化学疗法的功效的有害细菌，如单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)，解纤维拟杆菌(Bacteroides cellulosilyticus)，Coprobacter fastidiosus，毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌。此外，ATB倾向于从重要的保护性抗癌细菌如罗斯氏菌属(Roseburia)CAG100，布劳特氏菌属(Blautia)CAG01214，真杆菌属(Eubacterium)CAG38和CAG115 中消耗宿主菌群。
【实施例11：肠道指纹预测阻断抗PD1/PD-L1-PD-L2轴的抗体的临床益处】
对患有肾癌或肺癌的患者(N＝100名患者)进行与上述实施例4 中公开的相同的实验。
结果证实了几个物种的有利作用，例如：
1.诊断时的签名：Akkermansia muciniphila，瘤胃球菌科 (Ruminococcaceae)(CAG210双环瘤胃球菌(Ruminococcus bicirculans)，CAG854，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)2 CAG1262，250，细菌D16CAG949)的有利和主导作用
2.诊断时的签名：产丁酸肠单胞菌(Intestinimonas butyriciproducens)，Oscillibacter，Collinsella物种(Collinsella tanakaei 和Collinsellaintestinihominis)的有利作用(数据未显示+表27)
3.诊断时的签名：青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，长双岐杆菌(Bifidobacterium longum)，以及Parabacteroides distasonis 和Parabacteroidesgoldsteinii，沃氏嗜胆菌(Bilophila wadsworthia)，丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)，单形拟杆菌(Bacteroides uniformis) 的有害作用。
【实施例12：与肺癌中的PD1阻断反应相关的肠道指纹(有或没有ATB)】
鉴定了与对抗PD1抗体的应答或抗性相关的末期肺癌特异性的肠指纹在3个月时的进展时间。
表22：肺癌患者中过表现的细菌物种在抗PD1或PD-L1或抗PD-L2抗体3个月时可能是良好响应者，并且在3个月时可能具有抗性的肺癌患者中低表现抗-PD1或PD-L1或抗-PD-L2抗体，以及相应的参考物种(对于已经鉴定的物种)和其中包含的序列。
表23：在3个月时可能对抗PD1或PD-L1或抗PD-L2抗体具有抗性的肺癌患者中过表现的细菌物种，并且在3个月时可能是良好响应者的肺癌患者中低表现抗-PD1或PD-L1或抗-PD-L2抗体，以及相应的参考物种(对于已经鉴定的物种)和其中包含的序列。
因此，除了搜索通常确定患者是否可能对抗PD1或PD-L1或抗 PD-L2抗体治疗有反应的MGS之外，可以在肺癌患者中测量以下MGS 的相对丰度：
●在3个月时对抗PD1或PD-L1或抗PD-L2抗体可能有良好反应肺癌患者中的其他细菌物种：CAG00278，CAG00676(硬壁菌门 (Firmicutes))，CAG01188，CAG0994(硬壁菌门(Firmicutes))， CAG1205，CAG1220，CAG1399(梭菌目(Clostridiales)，颤螺菌科(Oscillospiricaeae))，CAG00112，CAG1386，CAG00674，CAG00328 (Alistipes)，CAG00731(Parasutterella)，CAG0903，CAG001342 (瘤胃球菌科(Ruminococcaceae))，CAG01262(瘤胃球菌科 (Ruminococcaceae))。
●肺癌患者中可能在抗PD1或PD-L1或抗PD-L2抗体3个月时具有抗性的其他细菌物种：CAG01629(硬壁菌门(Firmicutes))，CAG430， CAG00389，CAG00005_4(梭菌目(Clostridiales))。
【实施例13：与肾癌中的PD1阻断反应相关的肠指纹(有或没有 ATB)】
除了肺癌和肾癌常见的表1和2中概述的MGS之外，还有一些额外的MGS可参与肾癌患者的早期复发或对PD1阻断的反应(表 24-25)。
表24：在PD1阻断3个月时可能是响应者的肾癌患者中过表现的细菌物种(前2种细菌梭菌属物种在2个独立的晚期肾癌队列中可重现地发现，以响应PD1封锁的二线)
细菌物种 共变体基因数 对应参考的物种 序列(SEQ ID Nos)
CAG452 1942 梭菌属(Clostridium sp.)CAG:167
CAG00317 2130 梭菌属(Clostridium sp.)CAG:230
CAG00062 3614 Bacteroides salyersiae
CAG00510 1860 Alistipes timonensis
CAG00816 1464 Candidatus stoquefichus massilensis
CAG00215 2381 Anaerotruncus
CAG001401 522 毛螺菌科(Lachnospiricaeae)
CAG00774 1519 硬壁菌门(Firmicutes) 2076-2100
表25：在PD1阻断3个月时可能是进展者(不良响应者)的肾癌患者中过表现的细菌物种。
【实施例14：与非小细胞肺癌和肾癌(无ATB)的验证组中的 PD1阻断反应相关的肠指纹】
下表26显示了与验证群组相关的临床数据。表27中列出了该验证群组中存在的细菌(没有ATB的组)。
表26：验证群组的基线特征
表27：基于RECIST标准具有最佳临床结果的非小细胞肺癌和肾癌患者中过表现的细菌物种：PR＞SD>通过MG评估PD并通过 Cochran-Armitage测试分析。
【实施例15：GS和MGS诊断时的多样性决定了肾脏+肺癌(有或没有ATB)在6个月时对PD1阻断的反应】
预测患者在抗PD1抗体治疗6个月时易于反应的另一个指标是分析基因计数(GC)和宏基因组物种(MGS)的多样性指数(图24)。
当GS＞6×106或MGS＞250时，癌症患者将容易做出反应。
【实施例16：基于MGS的动态参数，用于预测肾病+肺癌(有或没有ATB)6个月时对PD1阻断的长期反应】
上述所有参数均与在诊断时，治疗开始前在基线时计算的值相关。
在这里，我们概述了一些MGS，其中治疗过程中的显著变化将表明患者的反应或复发倾向。
V1(治疗前)和V2(2次注射mAb，间隔15天)之间没有显著变化。
在V3(第1次计算机断层摄影扫描的时间)观察到的修改是预测临床益处的最关键的(MGS数据未显示)。与临床受益相关的修改是：
(i)损失：
●溶木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanosolvens)CAG945
●单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)CAG159(常见于2种癌症)
●卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)CAG1165
●普雷沃氏菌属(Prevotella)CAG:255，CAG163
●布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)CAG611
●肠罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)CAG291
●真杆菌属(Eubacterium)CAG:38，CAG629；和
(ii)获得：
●瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)CAG:1003
●Flavonifractor plautii CAG:439
●硬壁菌门(Firmicutes)细菌CAG:124，CAG:629。
【实施例17：在临床前模型中，oncobax在几种肿瘤模型和组织学类型中的功效】
使用以下细菌菌株：
●希氏肠球菌(Enterococcus hirae)：菌株于2013年11月7日以编号CNCM I-4815保藏在国家微生物保藏中心(CNCM)，
●Akkermansia muciniphila：菌株以参考号CSUR P2261保藏在立克次氏体联合会保藏机构(CSUR)，
●Alistipes indistinctus：菌株以参考号CSUR P723保藏在立克次氏体联合会保藏机构(CSUR)。
将Akkermansia muciniphila在5％绵羊血液富集的Columbia琼脂 (bioMerieux，Marcy I'Etoile，France)上在厌氧气氛中生长，使用3 个厌氧发生器(bioMerieux)在37℃下产生72小时。Alistipes indistinctus 也在5％绵羊富血的哥伦比亚琼脂(bioMerieux，Marcy I'Etoile，France) 上生长，在厌氧气氛中使用单个厌氧发生器在37℃下产生48小时。将希氏肠球菌(Enterococcus hirae)在富含5％羊血的哥伦比亚琼脂 (bioMerieux，Marcy I'Etoile，France)中在37℃的有氧气氛中培养 48小时。
对于细菌管饲：使用荧光分光光度计(Eppendorf)在PBS中以600nm的波长获得109cfu/mL的悬浮液。然后小鼠口服接受100μL每种细菌悬浮液。
A.模型MCA205肉瘤：能够补偿菌群失调的oncobax(图25-26) 是希氏肠球菌(Enterococcus hirae)，Akkermansia muciniphila单独或同时或顺序混合在一起，以及Alistipes indistinctus。Akkermansia muciniphila+希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和Alistipes indistinctus 增强效应子和中枢记忆CD8+T细胞在肿瘤微环境中(在处死的第12 天肿瘤引流淋巴结)(图27)。
B.模型RET黑色素瘤：如图28-29所示，组合了希氏肠球菌 (Enterococcus hirae)+Akkermansia muciniphila在这个模型中非常有效。
C.Lewis肺原位癌模型：图30-31。该模型显示：(i)我们的结论在PD1阻断与放射治疗相结合的情况下成立，(ii)在没有菌群失调的情况下，oncobax仍然可以改善ICB组合的抗肿瘤作用。
D.RENCA-荧光素酶肿瘤模型，其中ICB的组合是抗-CTLA4+ 抗-PD1Ab：使用来自2个生育障碍患者的粪便进行FMT。在宏基因组学中的粪便组合物中未检测到Akkermansiamuciniphila/瘤胃球菌属 (Ruminococcus)细菌D16CAG949。FMT没有提高ICB联合治疗的疗效(图32-33)。
我们得出结论，抗生素益生菌或"oncobax"的施用可以改善抗PD1 或抗PDL1或抗PDL2抗体在益生菌患者中的功效，菌群失调基于MG 分析，侧重于Akkermansiamuciniphila，瘤胃球菌属(Ruminococcus) 的不同CAG，Alistipes，真杆菌属(Eubacterium)，Intestinihominas butyriciproducens，双岐杆菌属(Bifidobacterium)(青春双岐杆菌 (Bifidobacterium adolescentis)，长双岐杆菌(Bifidobacteriumlongum)) 和拟杆菌属(Bacteroides)(诺氏拟杆菌(Bacteroides nordii)，Bacteroidesgoldsteinii)，沃氏嗜胆菌(Bilophila wadsworthia)……
重要的是，这些抗癌益生菌还可能改善eubiotic患者的反应，并且它们不仅可以提高单独的抗PD1抗体的效力，还可以与抗-CTLA4 Ab或放射疗法相结合。
【实施例18：在PD-1阻断期间与"有利粪便组合物或肥胖症"的生物活性相关的血液标记物】
有效粪便(良好MG组成)的oncobax或FMT的功效或生物活性的最佳替代标志之一是CD4+或CD8+循环(或脾)T细胞上PD-L1表达的上调(图34-37)或CCR9在循环T细胞上的上调。
【实施例19：来自应答患者的粪便的FMT可以补偿无应答患者的菌群失调并恢复对免疫关卡抑制剂的响应性】
在原位肾癌模型(RENCA)中，我们已经显示来自生殖器无应答的RCC癌症患者(逃避PD1阻断)的FMT能够消除化身小鼠中的抗 PD1功效。来自响应的RCC患者(其接受抗PD1或PD-L1 Ab并且根据RECIST标准表现出临床反应)的粪便的口服管饲能够挽救在生理不良的化身受体中丧失的抗PD1的抗肿瘤功效。因此，可以想象用来自应答患者(诊断时或治疗6个月后的粪便)的FMT治疗患有生殖器官的NSCLC/RCC或乳腺癌患者，作为来自正常志愿者的FMT的替代物(图38)。
【实施例20：来自健康志愿者的粪便的FMT可以补偿无应答患者的体重并恢复对节律性环磷酰胺(CTX)的反应】
使用小鼠乳腺肿瘤模型(AT3)，我们已经显示来自生殖器乳腺癌患者的FMT(对化疗无反应，三阴性，Ki67高，MG分析中α和β多样性降低)降低了化身AT3携瘤小鼠中CTX的疗效(图39)。来自健康志愿者HV(通过口服强饲或配合)的粪便补偿通过恢复某种类型的肥胖症(HV衍生的微生物群)来补偿CTX功效的丧失。
【实施例21：来自患有不同癌症的患者的菌群失调可以用确定的菌株和细菌聚生体补偿】
在原位肾癌模型(RENCA)中，我们已经显示来自生殖器无应答的RCC癌症患者(逃避PD1阻断)的FMT能够消除化身小鼠中的抗 PD1功效。用Akkermansia muciniphila，Bacteroides salyersiae或 Akkermansia muciniphila和希氏肠球菌(Enterococcushirae)口服灌胃能够挽救抗PD1的抗肿瘤功效。
同时，在不同的肿瘤模型中，化身小鼠的肉瘤(如图40至43所示)，我们能够改善抗-PD1功效，这种功效在单独注射抗-PD1的FMT 治疗的带MCA205肉瘤的小鼠中受到损害。实际上，用Akkermansia muciniphila，Bacteroides salyersiae或Akkermansiamuciniphila和希氏肠球菌(Enterococcus hirae)进行口服管饲能够挽救抗PD1的抗肿瘤功效。此外，希氏肠球菌(Enterococcus hirae)(克隆13144＝CNCM I-4815，IGR7＝CNCM I-5224和IGR4＝CNCM I-5260)和Barnesiella intestinihominis的组合，或希氏肠球菌(Enterococcus hirae)(克隆 IGR7，IGR4，13144)和Christensenella minuta的组合，或希氏肠球菌(Enterococcus hirae)(克隆IGR7，IGR4，13144)和Actinotignum schaalii的组合，或希氏肠球菌(Enterococcus hirae)(克隆IGR7，IGR4， 13144)和Akkermansiamuciniphila(p2261和p3415)和粘液真杆菌 (Eubacterium limosum)的组合也是有效的。
这里描述的这些共生联合体可以在任何适合PD1阻断的肿瘤类型的情况下有效，最特别是NSCLC，RCC和乳腺癌。
【实施例22：Barnesiella intestinihominis与抗PD1功效相关】
通过对用抗PD1与同种型对照Ab处理的MCA205荷瘤小鼠的粪便进行宏基因组分析，我们能够证明在用抗PD1治疗的小鼠中存在 Barnesiella intestinihominis与治疗功效相关(图44)。实际上，用 Barnesiella intestinihominis的口服强饲剂能够单独改善抗PD1功效或与抗CTLA4 Ab组合(图43)。
我们得出结论，单独或在包含希氏肠球菌(Enterococcus hirae) 分离株+/-Akkermansia muciniphila的聚集体中对oncobax Barnesiella intestinihominis(源自患者或小鼠的菌株)的补偿可以恢复对肾癌或肺癌患者或任何适用于免疫关卡抑制剂治疗的癌症患者(特别是那些接受抗生素治疗的患者或那些被诊断患有肠道菌群失调症的患者)的 PD1阻断或PD1/CTLA4共阻断物的功效。
【实施例23：保护oncobax降低抗PD1治疗的毒性(用combo 抗-CTLA4+抗PD1 Ab产生的自身免疫疾病)】
在与实施例21中使用的相同的肿瘤模型中，发明人证明可以解除免疫关卡阻断剂的功效和毒性。实际上，如图45所示，粪便从响应者的转移降低了粪便从非响应者获得的毒性。FMT补偿了oncobax降低结肠炎评分。
【实施例24：免疫关卡阻断剂诱导参与治疗功效(肿瘤大小减小) 的肠道微生物组组成的显著变化。】
我们对位于皮肤中的2种不同小鼠肿瘤模型(MCA205肉瘤和RET 黑色素瘤)的微生物组随时间的变化进行了系列分析，通过之前单独注射抗PD1 Ab 2次或5次，或组合至抗-CTLA4抗体之后在6只小鼠 /组中使用小鼠粪便基因扩增子的16S rRNA测序分析对细菌组成的显著调节(图46)。β多样性的主成分分析显示出超时的显著差异，这意味着ICB的组合诱导微生物组组成的变化与肿瘤大小显著相关(图 47，图48)。
在响应者的2种肿瘤模型中共同发现的78种细菌物种(但不在非响应者中)属于产生SCFA的细菌(健康相关的细菌，如梭菌目 (Clostridiales)，布劳特氏菌属(Blautia)，普氏粪杆菌 (Faecalibacterium prausnitzii))(图49)。我们证实了拟杆菌门(Bacteroidetes)属(Finegoldii拟杆菌(Bacteroides finegoldii)，肠拟杆菌(Bacteroides Intestinalis)，地中海拟杆菌(Bacteroides mediterraneensis))的某些成员的优势，以及在响应PD1阻断的人肺 /肾癌患者中发现的Alistipes onderdonkii，双岐杆菌属(Bifidobacteria) 和真杆菌属(Eubacterium)。基于先前专利申请EP17306509.5(结肠癌和奥沙利铂，其中发现丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)的Erysipelatoclostridium ramosum的免疫原性)的其他数据，我们推断了 Dielmafastidiosa(硬壁菌门(Firmicutes)/丹毒丝菌纲 (Erysipelotrichia))在免疫关卡阻断剂(ICB)功效中的潜在有益作用(图49)。
感兴趣的是，抗-PD1+抗-CTLA4组合的响应者共有的常见细菌包括Akkermansiamuciniphila，Alistipes indistinctus，几种拟杆菌属， Barnesiellaintestinihominis，Erysipelatoclostridium ramosum和 Flavonifractor plautii，均在人类中发现(NSCLC/肾癌)对PD1阻断和我们的免疫原性益生菌"oncobax"列表(图50)。这些细菌的结合提供了与ICB组合的临床反应相关的生态系统。
【参考文献】
Arrieta,M.-C,Stiemsma,L.T.,Dimitriu,P.A.,Thorson,L,Russell, S.,Yurist-Doutsch,S.,Kuzeljevic,B.,Gold,M.J.,Britton,H.M.,Lefebvre, D.L.,et al.(2015).Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk ofchildhood asthma.Sci.Transl.Med.7,307ra152.
Berman,D.,Parker,S.M.,Siegel,J.,Chasalow,S.D.,Weber,J., Galbraith,S.,Targan,S.R.,and Wang,H.L.(2010).Blockade of cytotoxic T-lymphocyte antigen-4by ipilimumab results in dysregulation of gastrointestinal immunity inpatients with advanced melanoma.Cancer Immun.10,11.
Blaser,M.J.(2016).Antibiotic use and its consequences for the normalmicrobiome.Science 352,544-545.
Champiat,S.,Lambotte,O.,Barreau,E.,Belkhir,R.,Berdelou,A., Carbonnel,F.,Cauquil,C,Chanson,P.,Collins,M.,Durrbach,A.,et al. (2016).Management ofimmune checkpoint blockade dysimmune toxicities:a collaborative positionpaper.Ann.Oncol.Off.J.Eur.Soc. Med.Oncol.27,559-574.
Clarke,J.,Wu,H.-C,Jayasinghe,L,Patel,A.,Reid,S.,and Bayley, H.(2009).Continuous base identification for single-molecule nanopore DNAsequencing.Nat.Nanotechnol.4,265-270.
Eid,J.,Fehr,A.,Gray,J.,Luong,K.,Lyle,J.,Otto,G.,Peluso,P., Rank,D.,Baybayan,P.,Bettman,B.,et al.(2009).Real-time DNA sequencing from singlepolymerase molecules.Science 323,133-138.
Fidler,M.M.,Soerjomataram,I.,and Bray,F.(2016).A global view oncancer incidence and national levels of the human development index.Int.J.Cancer 139,2436-2446.
Garon,E.B.(2015).Current Perspectives in Immunotherapy for Non-SmallCell Lung Cancer.Semin.Oncol.42 Suppl 2,S11-18.
Gensollen,T.,Iyer,S.S.,Kasper,D.L.,and Blumberg,R.S.(2016). Howcolonization by microbiota in early life shapes the immune system. Science352,539-544.
Goodrich,J.K.,Davenport,E.R.,Waters,J.L.,Clark,A.G.,and Ley, R.E.(2016).Cross-species comparisons of host genetic associations with themicrobiome.Science 352,532-535.
Hugon,P.,Lagier,J.-C,Colson,P.,Bittar,F.,and Raoult,D.(2016).Repertoire of human gut microbes.Microb.Pathog.
Li,J.,Jia,H.,Cai,X.,Zhong,H.,Feng,Q.,Sunagawa,S.,Arumugam, M.,Kultima,J.R.,Prifti,E.,Nielsen,T.,et al.(2014).An integrated catalog ofreference genes in the human gut microbiome.Nat.Biotechnol. 32,834-841.
Nielsen,H.B.,Almeida,M.,Juncker,A.S.,Rasmussen,S.,Li,J., Sunagawa,S.,Plichta,D.R.,Gautier,L.,Pedersen,A.G.,Le Chatelier,E., et al.(2014).Identification and assembly of genomes and genetic elements in complexmetagenomic samples without using reference genomes.Nat. Biotechnol.32,822-828.
Pigneur,B.,and Sokol,H.(2016).Fecal microbiota transplantation ininflammatory bowel disease:the quest for the holy grail.Mucosal Immunol.9,1360-1365.
Pitt,J.M.,Vetizou,M.,Daillere,R.,Roberti,M.P.,Yamazaki,T., Routy,B.,Lepage,P.,Boneca,I.G.,Chamaillard,M.,Kroemer,G.,et al. (2016).ResistanceMechanisms to Immune-Checkpoint Blockade in Cancer:Tumor-Intrinsic and-Extrinsic Factors.Immunity 44,1255-1269.
Plovier,H.,Everard,A.,Druart,C,Depommier,C,Van Hul,M., Geurts,L.,Chilloux,J.,Ottman,N.,Duparc,T.,Lichtenstein,L.,et al. (2016).A purifiedmembrane protein from Akkermansia muciniphila or the pasteurized bacteriumimproves metabolism in obese and diabetic mice. Nat.Med.
Raoult,D.(2016).Microbiota,obesity and malnutrition.Microb. Pathog.
Rizvi,N.A.,Mazieres,J.,Planchard,D.,Stinchcombe,T.E.,Dy, G.K.,Antonia,S.J.,Horn,L.,Lena,H.,Minenza,E.,Mennecier,B.,et al. (2015).Activityand safety of nivolumab,an anti-PD-1 immune checkpoint inhibitor,for patientswith advanced,refractory squamous non-small-cell lung cancer(CheckMate 063):aphase 2,single-arm trial. Lancet Oncol.16,257-265.
Rooks,M.G.,and Garrett,W.S.(2016).Gut microbiota,metabolites and hostimmunity.Nat.Rev.Immunol.16,341-352.
Shono,Y.,Docampo,M.D.,Peled,J.U.,Perobelli,S.M.,Velardi,E., Tsai,J.J.,Slingerland,A.E.,Smith,O.M.,Young,L.F.,Gupta,J.,et al. (2016).IncreasedGVHD-related mortality with broad-spectrum antibiotic use after allogeneichematopoietic stem cell transplantation in human patients andmice.Sci.Transl.Med.8,339ra71.
Sivan,A.,Corrales,L.,Hubert,N.,Williams,J.B.,Aquino-Michaels, K.,Earley,Z.M.,Benyamin,F.W.,Lei,Y.M.,Jabri,B.,Alegre,M.-L.,et al.(2015).Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti-PD-L1 efficacy.Science 350,1084-1089.
Taur,Y.,Jenq,R.R.,Ubeda,C,van den Brink,M.,and Pamer,E.G. (2015).Roleof intestinal microbiota in transplantation outcomes.BestPract.Res.Clin.Haematol.28,155-161.
Vetizou,M.,Pitt,J.M.,Daillere,R.,Lepage,P.,Waldschmitt,N., Flament,C,Rusakiewicz,S.,Routy,B.,Roberti,M.P.,Duong,C.P.M.,et al.(2015).Anticancerimmunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota.Science 350,1079-1084.
Viaud,S.,Saccheri,F.,Mignot,G.,Yamazaki,T.,Daillere,R., Hannani,D.,Enot,D.P.,Pfirschke,C,Engblom,C,Pittet,M.J.,et al. (2013).The intestinalmicrobiota modulates the anticancer immune effects ofcyclophosphamide.Science 342,971-976.
【PCT/RO/134表】
PCT
打印(原文为电子格式)
(此表不是国际申请的一部分，且不被计作国际申请的表)
本栏由受理局填写
本栏由国际局填写
PCT/RO/134表

Claims (36)

1.组合物，其包含选自下组的细菌：希氏肠球菌(Enterococcus hirae)，Akkermansiamuciniphila，Alistipes shahii，其他Alistipes物种及其混合物，用于与基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法组合而治疗癌症，其中所述组合物在癌症患者中诱导免疫刺激。
2.权利要求1的组合物，其用于权利要求1的用途，包含至少2种选自下组的细菌：希氏肠球菌(Enterococcus hirae)，Akkermansia muciniphila，Alistipes物种，真杆菌属(Eubacterium)物种，瘤胃球菌科(Ruminococcacae)，梭菌目(Clostridiales)物种，拟杆菌目(Bacteroidales)物种，放线菌门(Actinobacteria)，红蝽杆菌目(Coriobacteriales)物种和史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)。
3.权利要求1或2的组合物，其用于权利要求1的用途，其包含下列细菌物种：希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和Akkermansia muciniphila。
4.权利要求1～3之任一项的组合物，其用于权利要求1的用途，其中所述组合物还包含下列细菌：洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)和/或脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)和/或Actinotignum schaalii和/或Alistipes indistinctus和/或Alistipesonderdonkii。
5.权利要求1～4之任一项的组合物，其用于权利要求1的用途，其中所述组合物包含：
·梭菌目(Clostridiales)细菌物种，其为Christensenella minuta；和/或
·丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)物种，其为Dielma fastidiosa或Erysipelatoclostridium ramosum；和/或
·Alistipes细菌物种，其选自：Alistipes shahii，Alistipes indistinctus，Alistipes onderdonkii和Alistipes finegoldii；和/或
·真杆菌属(Eubacterium)细菌物种，其为粘液真杆菌(Eubacterium limosum)；和/或
·拟杆菌目(Bacteroidales)细菌，其为Bacteroides salyersiae和/或Barnesiellaintestinihominis；和/或
·放线菌门(Actinobacteria)物种，其为Actinotignum schaalii；和/或
·红蝽杆菌目(Coriobacteriales)细菌物种，其为Collinsella intestinalis和/或Collinsella tanakaei；和/或
·硬壁菌门(Firmicutes)细菌，其为Flavonifractor plautii。
6.权利要求1～5之任一项的组合物，其用于权利要求1的用途，其中所述组合物包含：
(i)选自下列的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)及其混合物：
于2013年11月7日以编号CNCM I-4815保藏在国立微生物保藏中心(CNCM)的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)菌株13144，
于2017年8月31日以编号CNCM I-5224保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcushirae)菌株IGR7，
于2017年11月27日以编号CNCM I-5260保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcushirae)菌株IGR4，
于2017年11月27日以编号CNCM I-5261保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcushirae)菌株IGR11；
(ii)Akkermansia muciniphila，其选自均保藏在立克次氏体联合会保藏机构(CSUR)的Akkermansia muciniphila菌株p2261和p3415及其混合物；和
(iii)粘液真杆菌(Eubacterium limosum)。
7.权利要求1～5之任一项的组合物，其用于权利要求1的用途，其中所述组合物包含：
(i)选自下列的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)及其混合物：
于2013年11月7日以编号CNCMI-4815保藏在国立微生物保藏中心(CNCM)的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)菌株13144，
于2017年8月31日以编号CNCM I-5224保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcushirae)菌株IGR7，
于2017年11月27日以编号CNCM I-5260保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcushirae)菌株IGR4，
于2017年11月27日以编号CNCM I-5261保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcushirae)菌株IGR11；和
(ii)Barnesiella intestinihominis。
8.权利要求1～5之任一项的组合物，其用于权利要求1的用途，其中所述组合物包含：
(i)选自下列的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)及其混合物：
于2013年11月7日以编号CNCMI-4815保藏在国立微生物保藏中心(CNCM)的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)菌株13144，
于2017年8月31日以编号CNCM I-5224保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcushirae)菌株IGR7，
于2017年11月27日以编号CNCM I-5260保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcushirae)菌株IGR4，
于2017年11月27日以编号CNCM I-5261保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcushirae)菌株IGR11；和
(ii)Christensenella minuta。
9.权利要求1～5之任一项的组合物，其用于权利要求1的用途，其中所述组合物包含：
(i)选自下列的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)及其混合物：
于2013年11月7日以编号CNCMI-4815保藏在国立微生物保藏中心(CNCM)的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)菌株13144，
于2017年8月31日以编号CNCMI-5224保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)菌株IGR7，
于2017年11月27日以编号CNCM I-5260保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcushirae)菌株IGR4，
于2017年11月27日以编号CNCM I-5261保藏在CNCM的希氏肠球菌(Enterococcushirae)菌株IGR11；和
(ii)Actinotignum schaalii。
10.权利要求1～9之任一项的组合物，其用作补偿癌症患者的菌群失调的药物。
11.权利要求1～9之任一项的组合物，其用于权利要求1或10的用途，其中所述细菌组合物在所述个体中诱导免疫刺激。
12.权利要求1～9之任一项的组合物，其用于权利要求1、10和11之任一项的用途，其中所述个体用抗PD1和抗CTLA4共阻断物或用抗PD-L2和抗CTLA4共阻断物治疗。
13.权利要求1～9之任一项的组合物，其用作免疫刺激疗法以预防癌症复发。
14.权利要求1～9之任一项的组合物，其用作降低或预防基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法和/或基于抗CTLA-4 Ab的疗法的肠毒性的药物。
15.用于与基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法组合而治疗癌症的粪便微生物群组合物。
16.权利要求15的粪便微生物群组合物，其用于权利要求15的用途，其中所述组合物包含至少10种选自下组的细菌：硬壁菌门(Firmicutes)物种，梭菌目(Clostridiales)物种，Alistipes物种，真杆菌属(Eubacterium)物种，拟杆菌目(Bacteroidales)物种，史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，Akkermansia muciniphila和希氏肠球菌(Enterococcus hirae)。
17.权利要求15或16的粪便微生物群组合物，其用于权利要求15的用途，其中所述组合物富含权利要求1～9之任一项的组合物。
18.用于确定癌症患者在施用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法之前是否需要细菌补偿的治疗诊断方法，包括在来自所述患者的粪便样品中评估来自选自下列的一种或几种的细菌的存在：Akkermansia muciniphila，希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和Dielmafastidiosa，其中如果在所述粪便样品中不存在Akkermansia muciniphila希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和Dielma fastidiosa中的任何一种，则患者需要用权利要求1～9之任一项的组合物或权利要求15～17之任一项的粪便微生物群组合物进行细菌补偿。
19.用于确定癌症患者在施用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法之前是否需要细菌补偿的治疗诊断方法，包括在来自所述患者的粪便样品中评估下列的存在：瘤胃球菌属(Ruminococcus sp.)CAG:353，瘤胃球菌属(Ruminococcus)细菌LM158，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)2和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)细菌D16，其中如果没有瘤胃球菌属(Ruminococcus sp.)CAG:353、瘤胃球菌属(Ruminococcus)细菌LM158、扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)2和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)细菌D16存在于所述粪便样品中，患者需要用权利要求1～9之任一项的组合物或权利要求15～17之任一项的粪便微生物群组合物进行细菌补偿。
20.用于确定癌症患者在施用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法之前是否需要细菌补偿的治疗诊断方法，包括在来自所述患者的粪便样品中评估下列的存在：Alistipessp.CAG:435、Alistipes sp.CAG:514、Alistipes indistinctus CAG328和Alistipessp.CAG/268，其中如果没有Alistipes sp.CAG:435、Alistipes sp.CAG:514、Alistipesindistinctus CAG328和Alistipes sp.CAG/268存在于所述粪便样品中，患者需要使用权利要求1～9之任一项的组合物或权利要求15～17之任一项的粪便微生物群组合物进行细菌补偿。
21.用于确定癌症患者在施用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法之前是否需要细菌补偿的治疗诊断方法，包括在来自所述患者的粪便样品中评估下列的存在：溶木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanosolvens)CAG945，单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)CAG159，卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)CAG1165，普雷沃氏菌属(Prevotella)CAG:255，CAG163，布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)CAG611，肠罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)CAG291和真杆菌属(Eubacterium)CAG:38，CAG:629，其中如果溶木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanosolvens)CAG945，单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)CAG:159，卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)CAG1165，普雷沃氏菌属(Prevotella)CAG:255，CAG:163，布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)CAG611，肠罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)CAG291或真杆菌属(Eubacterium)CAG:38，CAG:629存在于所述粪便样品中，患者需要使用权利要求1～9之任一项的组合物或权利要求15～17之任一项的粪便微生物群组合物进行细菌补偿。
22.用于确定癌症患者在施用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法之前是否需要细菌补偿的治疗诊断方法，包括在来自所述患者的粪便样品中评估选自下列的产生短链脂肪酸的梭菌科(Clostridiaceae)的存在：硬壁菌门(Firmicutes)细菌，真杆菌属(Eubacterium)，布劳特氏菌属(Blautia)和罗斯氏菌属(Roseburia)，其中所述粪便样品中不存在硬壁菌门(Firmicutes)细菌细菌，真杆菌属(Eubacterium)，布劳特氏菌属(Blautia)和罗斯氏菌属(Roseburia)，表明患者需要用希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和/或Akkermansiamuciniphila或权利要求1～9之任一项的组合物或权利要求15～17之任一项的粪便微生物群组合物进行细菌补偿。
23.体外治疗诊断方法，用于确定癌症患者是否可能是对基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的良好响应者，包括在来自所述患者的粪便样品中评估选自表1和表2中公开的微生物物种的至少10种微生物物种的存在，
其中表1中公开的微生物物种的存在和表2中公开的微生物物种的缺乏表明患者可能是对基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的良好响应者，并且
其中表1中公开的微生物物种的缺乏和表2中公开的微生物物种的存在表明患者可能对基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法有抗性。
24.权利要求23的方法，其中评估下列的存在：至少5种硬壁菌门(Firmicutes)物种，5种梭菌目(Clostridiales)物种(其中至少3种瘤胃球菌科(Ruminococcaceae))，1种Alistipes物种，1种真杆菌属(Eubacterium)物种，1种拟杆菌目(Bacteroidales)物种，史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)和/或Akkermansia muciniphila。
25.权利要求23或24的方法，其中评估了Anaerotruncus colihominis和至少一种Oscillibacter物种的存在。
26.权利要求23～25之任一项的方法，其中所述基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法单独施用或与抗-CTLA4 Ab或IDO抑制剂或其他免疫调节剂组合施用。
27.权利要求23～26之任一项的方法，其中所述患者已经接受抗PD1/PD-L1/PD-L2抗体。
28.设计用于实施权利要求23～27之任一项的方法的核酸微阵列，其特征在于其包含对于在所述方法中待检测的每种微生物物种特异的核酸探针。
29.用于实施权利要求23～28之任一项的方法的一组引物，其特征在于它包含用于扩增对所述方法中待检测的每种微生物物种特异的序列的引物对。
30.用于评估癌症患者是否患有与癌症相关的菌群失调的体外方法，包括在来自所述患者的粪便样品中评估至少10、11、12、13、14、15、16、17、18或19种选自下组的微生物物种的存在：粪杆菌属(Faecalibacterium)CAG297，布劳特氏菌属(Blautia)CAG179，罗斯氏菌属(Roseburia)CAG55，副流感嗜血杆菌(Haemophila parainfluenzae)CAG1056，梭菌目(Clostridiales)CAG1132，青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，硬壁菌门(Firmicutes)CAG1308，硬壁菌门(Firmicutes)细菌CAG713，齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，罕见小球菌属(Subdoligranulum)CAG140，毛螺菌科(Lachnospiricaeae)细菌CAG14，无害梭菌(Clostridium innocuum)CAG36，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)1，Hungatella hathewayi 1 CAG25，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG11，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG371，梭菌目(Clostridiales)CAG533和Tyzzerella nexilis CAG311，其中：
·存在选自下组的微生物物种：齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，罕见小球菌属(Subdoligranulum)CAG140，毛螺菌科(Lachnospiricaeae)细菌CAG14，无害梭菌(Clostridium innocuum)CAG36，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)1，Hungatella hathewayi1 CAG25，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG11，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG371，梭菌目(Clostridiales)CAG533和Tyzzerellanexilis CAG311，及
·不存在选自下组的微生物物种：粪杆菌属(Faecalibacterium)CAG297，布劳特氏菌属(Blautia)CAG179，罗斯氏菌属(Roseburia)CAG55，副流感嗜血杆菌(Haemophilaparainfluenzae)CAG1056，梭菌目(Clostridiales)CAG1132，青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，硬壁菌门(Firmicutes)CAG1308和硬壁菌门(Firmicutes)细菌CAG713
表明患者患有与癌症相关的菌群失调。
31.预测接受治疗或已接受癌症治疗的患者的复发的方法，包括评估在不同时间点从所述患者获得的粪便样品中至少5、6、7、8，9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19种选自下组的微生物物种的存在：粪杆菌属(Faecalibacterium)CAG297，布劳特氏菌属(Blautia)CAG179，罗斯氏菌属(Roseburia)CAG55，副流感嗜血杆菌(Haemophila parainfluenzae)CAG1056，梭菌目(Clostridiales)CAG1132，青春双岐杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)，硬壁菌门(Firmicutes)CAG1308，硬壁菌门(Firmicutes)细菌CAG713，齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，罕见小球菌属(Subdoligranulum)CAG140，毛螺菌科(Lachnospiricaeae)细菌CAG14，无害梭菌(Clostridium innocuum)CAG36，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)1，Hungatellahathewayi1 CAG25，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG11，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG371，梭菌目(Clostridiales)CAG533和Tyzzerella nexilis CAG311，其中：
·选自下组的微生物物种的增加：齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，罕见小球菌属(Subdoligranulum)CAG140，毛螺菌科(Lachnospiricaeae)细菌CAG14，无害梭菌(Clostridium innocuum)CAG36，扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)1，Hungatella hathewayi1 CAG25，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG11，大肠埃希氏菌(E.coli)CAG371，梭菌目(Clostridiales)CAG533和Tyzzerellanexilis CAG311，和
·选自下组的微生物物种减少：粪杆菌属(Faecalibacterium)CAG297，布劳特氏菌属(Blautia)CAG179，罗斯氏菌属(Roseburia)CAG55，副流感嗜血杆菌(Haemophilaparainfluenzae)CAG1056，梭菌目(Clostridiales)CAG1132，青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，硬壁菌门(Firmicutes)CAG1308和硬壁菌门(Firmicutes)细菌CAG713
表明患者可能复发。
32.用于离体确定癌症患者是否可能受益于基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的治疗的方法，包括评估在来自所述患者的血液样品中针对下列的记忆Th1或Tc1细胞的存在：洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、希氏肠球菌(Enterococcus hirae)和/或脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，其中
存在针对洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)和希氏肠球菌(Enterococcushirae)的记忆Th1或Tc1细胞表明患者可能是对所述治疗的良好响应者，并且
存在针对脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的记忆Th1细胞表明患者可能是不良响应者。
33.用于离体确定癌症患者是否可能受益于基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的治疗的方法，包括评估来自所述患者的血液样品中存在针对Akkermansia muciniphila的记忆Th1或Tr1细胞，其中存在针对Akkermansia muciniphila的记忆CD4+Th1或CD8+Tc1(产生IFNg)或CD4+Tr1细胞(产生IL-10)表明患者可能是所述治疗的良好响应者。
34.用于评估用基于抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法治疗的癌症患者是否是对所述治疗的良好响应者的方法，包括以下步骤：
(i)评估在治疗开始时从所述患者获得的粪便样品中至少3、4、5、6、7、8、9或10种选自下组的微生物物种的存在或相对丰度：溶木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanosolvens)CAG945，单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)CAG159，卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)CAG1165，普雷沃氏菌属(Prevotella)CAG:255，CAG163，布氏瘤胃球菌(Ruminococcusbromii)CAG611，肠罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)CAG291，真杆菌属(Eubacterium)CAG:38，CAG:629，瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)CAG1003，Flavonifractor plautiiCAG439和硬壁菌门(Firmicutes)细菌CAG:124，CAG:629；
(ii)在抗PD1/PD-L1/PD-L2 Ab施用三次或四次后获得的所述患者的粪便样品中评估与步骤(i)中相同物种的存在或相对丰度，
其中：
·溶木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanosolvens)CAG945，单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis)CAG159，卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)CAG1165，普雷沃氏菌属(Prevotella)CAG:255，CAG:163，布氏瘤胃球菌(Ruminococcus bromii)CAG611，肠罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)CAG291和真杆菌属(Eubacterium)CAG:38，CAG:629的减少或完全丧失，和/或
·瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)CAG1003，Flavonifractor plautii CAG439和硬壁菌门(Firmicutes)细菌CAG:124，CAG:629的增加或获得
表明患者是治疗的良好响应者。
35.免疫原性组合物，其包含选自下组的细菌片段：硬壁菌门(Firmicutes)物种，梭菌目(Clostridiales)物种，Alistipes物种，真杆菌属(Eubacterium)物种，拟杆菌目(Bacteroidales)物种，史密斯甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，Akkermansiamuciniphila和希氏肠球菌(Enterococcus hirae)及其混合物，所述组合物用作施用癌症患者的基于抗-PD1/PD-L1/PD-L2 Ab的疗法的辅佐物。
36.权利要求35的免疫原性组合物，其还包含下列的片段：脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)和/或洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)。
CN201780079668.1A 2016-12-22 2017-12-22 抗pd1/pd-l1/pd-l2抗体的反应性标志物和功效改善用调节剂 Pending CN110582291A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16306779 2016-12-22
EP16306779.6 2016-12-22
EP17305206 2017-02-24
EP17305206.9 2017-02-24
PCT/EP2017/084552 WO2018115519A1 (en) 2016-12-22 2017-12-22 Microbiota composition, as a marker of responsiveness to anti-pd1/pd-l1/pd-l2 antibodies and use of microbial modulators for improving the efficacy of an anti-pd1/pd-l1/pd-l2 ab-based treatment

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110582291A true CN110582291A (zh) 2019-12-17

Family

ID=61005784

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780079668.1A Pending CN110582291A (zh) 2016-12-22 2017-12-22 抗pd1/pd-l1/pd-l2抗体的反应性标志物和功效改善用调节剂

Country Status (9)

Country Link
US (2) US11684640B2 (zh)
EP (1) EP3559257A1 (zh)
JP (2) JP7366744B2 (zh)
KR (1) KR102644935B1 (zh)
CN (1) CN110582291A (zh)
AU (1) AU2017380257B2 (zh)
CA (1) CA3047029A1 (zh)
IL (1) IL267564A (zh)
WO (1) WO2018115519A1 (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111249314A (zh) * 2020-03-03 2020-06-09 深圳未知君生物科技有限公司 人体共生菌群在提高肿瘤免疫治疗应答中的作用
CN114432439A (zh) * 2021-12-07 2022-05-06 苏州普瑞森生物科技有限公司 一种抗肿瘤组合物及其应用
CN114452382A (zh) * 2022-01-12 2022-05-10 广州知易生物科技有限公司 脆弱拟杆菌荚膜多糖a与pd-1及pd-l1抗体联合治疗呼吸系统肿瘤的应用
CN114469987A (zh) * 2022-01-12 2022-05-13 广州知易生物科技有限公司 脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖与免疫检查点抑制剂联合用药治疗生殖泌尿系统肿瘤的应用
CN114469986A (zh) * 2022-01-12 2022-05-13 广州知易生物科技有限公司 脆弱拟杆菌荚膜多糖a与免疫检查点抑制剂联用在制备治疗消化系统肿瘤药物中的应用
WO2023284069A1 (zh) * 2021-07-16 2023-01-19 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种细菌在制备免疫检查点抑制剂的增效剂中的应用
WO2023284758A1 (zh) 2021-07-16 2023-01-19 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种细菌在制备免疫检查点抑制剂的增效剂中的应用
CN117462690A (zh) * 2023-11-03 2024-01-30 中南林业科技大学 一种药物组合物及其应用
WO2024140860A1 (zh) * 2022-12-27 2024-07-04 慕恩（广州）生物科技有限公司 克里斯滕森菌或包含其的组合物在预防或治疗肿瘤中的用途以及包含其的药物

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4169383A1 (en) 2015-05-06 2023-04-26 SNIPR Technologies Limited Altering microbial populations & modifying microbiota
GB201609811D0 (en) 2016-06-05 2016-07-20 Snipr Technologies Ltd Methods, cells, systems, arrays, RNA and kits
EP3518946A4 (en) 2016-09-27 2020-09-09 Board of Regents, The University of Texas System METHODS TO IMPROVE IMMUNE CHECKPOINT BLOCKING TREATMENT BY MODULATING THE MICROBIOME
AU2017380257B2 (en) 2016-12-22 2024-06-06 Institut Gustave Roussy Microbiota composition, as a marker of responsiveness to anti-PD1/PD-L1/PD-L2 antibodies and use of microbial modulators for improving the efficacy of an anti-PD1/PD-L1/PD-L2 ab-based treatment
WO2018145082A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 New York University Methods and compositions for treating and diagnosing pancreatic cancers
US11638728B2 (en) * 2017-06-05 2023-05-02 The University Of Chicago Microbiome biomarkers immunotherapy responsiveness: diagnostic, prognostic and therapeutic uses thereof
CN111295394B (zh) 2017-08-11 2024-06-11 豪夫迈·罗氏有限公司 抗cd8抗体及其用途
EP3476396A1 (en) * 2017-10-31 2019-05-01 Institut Gustave Roussy Bacterial and cell compositions for the treatment of colorectal cancer and methods for assessing a prognosis for patients having the same
EP3505177A1 (en) 2017-12-29 2019-07-03 Institut Gustave Roussy Immunogenic sequences from a phage tail length tape measure protein, bacteria expressing the same and their use in treating a cancer
US10760075B2 (en) 2018-04-30 2020-09-01 Snipr Biome Aps Treating and preventing microbial infections
CN110496140B (zh) * 2018-05-18 2022-05-31 瑞微（深圳）生物科技有限公司 脆弱拟杆菌或阿克曼粘细菌在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用
EP3629023A1 (en) 2018-09-28 2020-04-01 Institut Gustave Roussy Microbiota composition, as a marker of responsiveness to anti-pd1/pd-l1/pd-l2 antibodies in renal cell cancer
EP3864414A4 (en) * 2018-10-13 2023-03-29 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE IDENTIFICATION AND TREATMENT OF SUBJECTS AT RISK OF A POOR RESPONSE TO CAR T CELL THERAPY
WO2020079021A1 (en) * 2018-10-15 2020-04-23 Pharmabiome Ag Consortia of living bacteria useful for treatment of cancer related diseases, particularly graft versus host disease
CN109336857A (zh) * 2018-11-13 2019-02-15 南方医科大学 一种含取代联苯的黄酮及其应用
JP7295547B2 (ja) * 2018-11-13 2023-06-21 株式会社サイキンソー 腸内ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ判定システム
US20220016188A1 (en) * 2018-11-21 2022-01-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treating cancer
US20220023359A1 (en) * 2018-12-07 2022-01-27 President and Fellows of Flarvard College Identification of gut bacteria that promote an anti-tumor response to immunotherapy
EP3666905A1 (en) * 2018-12-11 2020-06-17 Sanofi E. coli positive for pks island as marker of positive response to anti-pd1 therapy in colorectal cancer
IT201800011030A1 (it) * 2018-12-12 2020-06-12 Artemisia Lab Srl Metodo per la determinazione quali-quantitativa del microbiota intestinale
CN113226370A (zh) * 2019-01-04 2021-08-06 国立大学法人京都大学 利用含有pd-1信号抑制剂的药剂的治疗有效性的预测和/或判定标记
CN111450124B (zh) * 2019-01-18 2022-03-15 瑞微（深圳）生物科技有限公司 阿克曼粘菌或普氏菌在增加肿瘤微环境γδT细胞积累并增强抗肿瘤免疫功能药物中的应用
CN109680085B (zh) * 2019-01-22 2021-01-29 深圳未知君生物科技有限公司 基于肠道微生物信息预测治疗响应性的模型
CN111920793A (zh) * 2019-04-25 2020-11-13 瑞微（深圳）生物科技有限公司 泛酸在制备用于治疗和/或预防肿瘤的组合物中的应用
CN110063970B (zh) * 2019-04-30 2024-09-03 上海心脉途医疗科技有限公司 与irAE相关的肠道菌群及irAE的治疗和预防方法
CN111991427A (zh) * 2019-05-07 2020-11-27 瑞微（深圳）生物科技有限公司 肠道细菌在制备用于促进TCR γδ+T细胞增殖的药物中的应用
JP2022546117A (ja) 2019-08-28 2022-11-02 アッセンブリー バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド 細菌種を含む組成物及びそれに関連する方法
JP7417321B2 (ja) * 2019-09-25 2024-01-18 ヘルスバイオミー 癌治療のための絶対嫌気性人体腸内微生物及びその用途
WO2021063948A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Institut Gustave Roussy Microbial compositions for improving the efficacy of anticancer treatments based on immune checkpoint inhibitors and/or tyrosine kinase inhibitors and markers of responsiveness to such treatments
EP4048778A4 (en) * 2019-11-01 2024-02-21 UTI Limited Partnership Harnessing the power of microbiota and metabolites for the treatment of cancer
WO2021102510A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 South Australian Health And Medical Research Institute Limited Methods and products for reducing side effects associated with use of immune agonist antibodies
US20230042960A1 (en) * 2019-12-10 2023-02-09 Northeastern University Microbial compositions and methods for treatment and detection of disease
WO2021216618A1 (en) * 2020-04-21 2021-10-28 City Of Hope Compositions and methods comprising clostridium butyricum for the treatment of cancer
GB202007452D0 (en) * 2020-05-19 2020-07-01 Microbiotica Ltd Threrapeutic bacterial composition
KR102351601B1 (ko) * 2020-07-06 2022-01-13 연세대학교 산학협력단 장내 미생물 기반 면역 항암 요법의 치료 반응 예측과 향상 방법 및 후보 프리바이오틱스 스크리닝 방법
KR102468351B1 (ko) * 2020-09-23 2022-11-18 주식회사 리비옴 항암 활성을 갖는 엔테로코커스 패칼리스 미생물, 그를 포함하는 조성물 및 그를 이용한 암 예방 또는 치료 방법
CN116322721A (zh) * 2020-09-30 2023-06-23 国立研究开发法人国立癌症研究中心 通过给予肠道瘤胃球菌实现的免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效果的增强
WO2022092783A1 (ko) * 2020-10-27 2022-05-05 재단법인 아산사회복지재단 프레보텔라 스터코리아 균주의 암의 예방 또는 치료를 위한 응용
JP2024503710A (ja) 2021-01-19 2024-01-26 アンスティテュ ギュスタブ ルシ 抗ｐｄ１薬に対するがん患者の応答の予測に役立つ、腸内ディスバイオシスの生物学的マーカー
KR102475860B1 (ko) * 2021-01-20 2022-12-07 전남대학교산학협력단 니볼루맙 치료 예후 예측을 위한 정보제공방법
JP7398714B2 (ja) * 2021-06-28 2023-12-15 東栄新薬株式会社 医療・美容に応用可能なアッカーマンシア・ムシニフィラ増殖促進用組成物およびこれを含む医薬、飲食品、飼料
KR20230056619A (ko) * 2021-10-20 2023-04-27 주식회사 고바이오랩 항암 활성을 갖는 베일로넬라 파르불라 균주를 이용한 암의 완화, 예방 또는 치료용 조성물
WO2023080501A1 (ko) * 2021-11-03 2023-05-11 고려대학교 산학협력단 장내 미생물군집 및 기능적 바이오마커 프로파일을 통해 sars-cov-2 백신의 면역반응을 예측하기 위한 정보제공방법 및 대상체 맞춤형 백신정보제공방법
GB202209518D0 (en) 2022-06-29 2022-08-10 Snipr Biome Aps Treating & preventing E coli infections
CN116356026B (zh) * 2023-03-06 2024-10-01 臻傲生物科技检测(深圳)有限公司 预测结直肠癌或结直肠腺瘤风险的新型微生物标志物
CN116287355A (zh) * 2023-05-12 2023-06-23 中国医学科学院北京协和医院 上消化道肿瘤化疗疗效及不良反应的肠道菌群预测模型
WO2024248549A1 (ko) * 2023-06-01 2024-12-05 재단법인 아산사회복지재단 락토바실러스 살리바리우스 또는 박테로이데스 플레비우스를 포함하는 면역항암제 치료 반응성 및 예후 예측용 바이오마커 및 이를 이용한 면역항암제 치료 반응성 및 예후 예측 방법
CN116949165B (zh) * 2023-06-25 2024-04-02 大连医科大学 用于评估焦虑/抑郁-乳腺癌共患病的粪便标志物组及其应用
WO2025141323A1 (en) * 2023-12-29 2025-07-03 Maat Pharma Compositions used in combination with immune modulatory treatments for treating cancers
CN119552781B (zh) * 2025-01-24 2025-07-08 中山大学 一种嗜粘蛋白阿克曼氏菌及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016063263A2 (en) * 2014-10-23 2016-04-28 Institut Gustave Roussy Methods and products for modulating microbiota composition for improving the efficacy of a cancer treatment with an immune checkpoint blocker
WO2016086208A1 (en) * 2014-11-25 2016-06-02 Epiva Biosciences, Inc. Probiotic and prebiotic compositions, and methods of use thereof for treatment and prevention of graft versus host disease
CN106170557A (zh) * 2013-11-21 2016-11-30 古斯达威罗斯研究所 作为化疗应答标志物的微生物群组合物，以及微生物调节剂(益生元、益生菌或合生元)用于提高癌症治疗效力的用途
WO2016196605A1 (en) * 2015-06-01 2016-12-08 The University Of Chicago Treatment of cancer by manipulation of commensal microflora

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102203282B (zh) 2008-06-25 2014-04-30 生命技术公司 使用大规模fet阵列测量分析物的方法和装置
AU2017380257B2 (en) 2016-12-22 2024-06-06 Institut Gustave Roussy Microbiota composition, as a marker of responsiveness to anti-PD1/PD-L1/PD-L2 antibodies and use of microbial modulators for improving the efficacy of an anti-PD1/PD-L1/PD-L2 ab-based treatment

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106170557A (zh) * 2013-11-21 2016-11-30 古斯达威罗斯研究所 作为化疗应答标志物的微生物群组合物，以及微生物调节剂(益生元、益生菌或合生元)用于提高癌症治疗效力的用途
WO2016063263A2 (en) * 2014-10-23 2016-04-28 Institut Gustave Roussy Methods and products for modulating microbiota composition for improving the efficacy of a cancer treatment with an immune checkpoint blocker
WO2016086208A1 (en) * 2014-11-25 2016-06-02 Epiva Biosciences, Inc. Probiotic and prebiotic compositions, and methods of use thereof for treatment and prevention of graft versus host disease
WO2016196605A1 (en) * 2015-06-01 2016-12-08 The University Of Chicago Treatment of cancer by manipulation of commensal microflora

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CETIZOU等: "Anticancer immunotherapy by CTLA-4 blockade relies on the gut microbiota", 《SCIENCE》 *
SIVAN等: "Commensal Bifidobacterium promotes antitumor immunity and facilitates anti–PD-L1 efficacy", 《SCIENCE》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021175339A1 (zh) * 2020-03-03 2021-09-10 深圳未知君生物科技有限公司 人体共生菌群在提高肿瘤免疫治疗应答中的作用
CN111249314A (zh) * 2020-03-03 2020-06-09 深圳未知君生物科技有限公司 人体共生菌群在提高肿瘤免疫治疗应答中的作用
WO2023284069A1 (zh) * 2021-07-16 2023-01-19 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种细菌在制备免疫检查点抑制剂的增效剂中的应用
CN115998771A (zh) * 2021-07-16 2023-04-25 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种细菌在制备免疫检查点抑制剂的增效剂中的应用
WO2023284758A1 (zh) 2021-07-16 2023-01-19 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种细菌在制备免疫检查点抑制剂的增效剂中的应用
CN114432439A (zh) * 2021-12-07 2022-05-06 苏州普瑞森生物科技有限公司 一种抗肿瘤组合物及其应用
CN114452382A (zh) * 2022-01-12 2022-05-10 广州知易生物科技有限公司 脆弱拟杆菌荚膜多糖a与pd-1及pd-l1抗体联合治疗呼吸系统肿瘤的应用
CN114469986A (zh) * 2022-01-12 2022-05-13 广州知易生物科技有限公司 脆弱拟杆菌荚膜多糖a与免疫检查点抑制剂联用在制备治疗消化系统肿瘤药物中的应用
CN114469987A (zh) * 2022-01-12 2022-05-13 广州知易生物科技有限公司 脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖与免疫检查点抑制剂联合用药治疗生殖泌尿系统肿瘤的应用
WO2023134204A1 (zh) * 2022-01-12 2023-07-20 广州知易生物科技有限公司 脆弱拟杆菌荚膜多糖a与pd-1及pd-l1抗体联合治疗呼吸系统肿瘤的应用
WO2024140860A1 (zh) * 2022-12-27 2024-07-04 慕恩（广州）生物科技有限公司 克里斯滕森菌或包含其的组合物在预防或治疗肿瘤中的用途以及包含其的药物
CN117462690A (zh) * 2023-11-03 2024-01-30 中南林业科技大学 一种药物组合物及其应用
CN117462690B (zh) * 2023-11-03 2025-03-21 中南林业科技大学 一种药物组合物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3559257A1 (en) 2019-10-30
US20230263843A1 (en) 2023-08-24
KR102644935B1 (ko) 2024-03-07
US11684640B2 (en) 2023-06-27
JP2020512294A (ja) 2020-04-23
AU2017380257B2 (en) 2024-06-06
US20210346438A1 (en) 2021-11-11
US12144839B2 (en) 2024-11-19
AU2017380257A1 (en) 2019-07-04
JP2023133291A (ja) 2023-09-22
CA3047029A1 (en) 2018-06-28
KR20190118151A (ko) 2019-10-17
WO2018115519A1 (en) 2018-06-28
JP7366744B2 (ja) 2023-10-23
IL267564A (en) 2019-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12144839B2 (en) Microbiota composition, as a marker of responsiveness to anti-PD1/PD-L1/PD-L2 antibodies and use of microbial modulators for improving the efficacy of an anti-PD1/PD-L1/PD-L2 AB-based treatment
Derosa et al. Intestinal Akkermansia muciniphila predicts clinical response to PD-1 blockade in patients with advanced non-small-cell lung cancer
US11344586B2 (en) Microbiota composition, as a marker of responsiveness to chemotherapy, and use of microbial modulators (pre-, pro- or synbiotics) for improving the efficacy of a cancer treatment
Roberti et al. Chemotherapy-induced ileal crypt apoptosis and the ileal microbiome shape immunosurveillance and prognosis of proximal colon cancer
EP3209692B1 (en) Methods and products for modulating microbiota composition for improving the efficacy of a cancer treatment with an immune checkpoint blocker
CN113645981A (zh) 用于治疗癌症的方法和组合物
US20240398876A1 (en) Biological marker of intestinal dysbiosis, useful for predicting the response of a cancer patient to an anti-pdi drug
JP2021501167A (ja) 結腸直腸癌の治療のための細菌及び細胞組成物並びにそれを有する患者の予後を評価するための方法
Bonvalet et al. The impact of the intestinal microbiota in therapeutic responses against cancer
CN116997798A (zh) 可用于预测癌症患者对抗pd1药物的反应的肠道生态失调的生物标志物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination