CN114452382A - 脆弱拟杆菌荚膜多糖a与pd-1及pd-l1抗体联合治疗呼吸系统肿瘤的应用 - Google Patents
脆弱拟杆菌荚膜多糖a与pd-1及pd-l1抗体联合治疗呼吸系统肿瘤的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖与PD‑1抗体和/或PD‑L1抗体联合用药在防治呼吸系统肿瘤中的应用。本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖，特别是提取自保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY‑312的两性离子荚膜多糖与PD‑1抗体/PD‑L1抗体联用能够调节免疫细胞比例和免疫因子水平，增强机体抗肿瘤免疫反应，有效防治呼吸系统肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及一种脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖与PD-1抗体/PD-L1抗体联合用药治疗呼吸系统肿瘤中的应用。
背景技术
呼吸系统肿瘤是指任何特征为在呼吸系统中解剖学定位为恶性细胞的疾病，包括肺癌、鼻咽癌、喉癌等。临床上常见类型包括非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)、小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)、头颈部鳞癌(head and necksquamous cell carcinoma,HNSCC)中的鼻咽癌与喉癌等。
头颈部鳞癌(HNSCC)是头颈部恶性肿瘤的主要病理类型，发病率居于常见恶性肿瘤的第6位，约占所有头颈部肿瘤的90％，起源于上呼吸消化道的黏膜上皮细胞，包括口腔、口咽部、喉咽部和喉部。HNSCC是一种具有高度免疫缺陷的肿瘤，全球每年死亡人数约31.5万，5年生存率不足40％。HNSCC发生病变的部位较为隐蔽，且缺乏特异性临床表现，早期常难以发现，并易发生颈部淋巴结转移，七成以上患者确诊时已经处于中晚期阶段，对于晚期转移或复发的患者，目前多采用包括手术、化疗和放疗在内的综合性治疗。
肺癌是所有癌症中发病率与病死率最高的恶性肿瘤，约占总癌症死亡的18.4％，肺癌的发生与环境因素和遗传因素都有关系，吸烟是导致肺癌发生的主要危险因素，但空气污染、职业原因造成的暴露和遗传等因素也有影响。2020年世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的最新癌症负担数据显示全球新发癌症病例约2000万例。
肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。其中，SCLC约占支气管源性肺癌的15％-20％，其特点为确诊时多已转移，治疗后易复发，预后差，约67％的小细胞肺癌患者确诊时有明显的肺外转移病灶，而仅有33％的局限期患者病变局限于胸腔的单一放射野内。而NSCLC是世界上死亡率最高的恶性肿瘤，约占总体肺癌的85％。NSCLC发现时多为中晚期，传统治疗手段效果不佳，5年总体生存率约为16％。NSCLC以化疗、免疫治疗、抗血管生成治疗为主要治疗手段，无论是一线治疗还是维持治疗，临床试验均证实在化疗、抗血管生成治疗的基础上联合免疫治疗可使患者受益，免疫检查点抑制剂(Immune checkpointinhibitor,ICI)，是主要针对机体免疫检查点的单抗，其能够有效阻断T淋巴细胞负性共刺激信号途径，进而恢复机体的抗肿瘤作用，促使T淋巴细胞清除肿瘤细胞，以延长患者的生存期，是SCLC和NSCLC的热门治疗方向。
近年来，肿瘤免疫治疗特别是免疫检查点抑制剂在临床试验中取得巨大成功，尤其是PD-1/PD-L1抗体(PD-1，Programmed Death 1,程序性死亡受体，PD-L1，ProgrammedCell Death-Ligand 1,程序性死亡受体-配体1)和CTLA-4(Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Antigen 4，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)抗体在黑色素瘤、肺癌、膀胱癌、CRC、霍奇金淋巴瘤等的治疗中取得革命性突破，被FDA(Food and Drug Administration，美国食品药品监督管理局)批准用于临床治疗，如Opdivo、Keytruda和Tecentriq通过阻断细胞表面的PD-L1发挥作用。
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)在多种淋巴细胞上表达，尤其在肿瘤特异性T细胞上高表达。在肿瘤微环境中，它通过干扰保护性免疫应答而导致恶性肿瘤细胞的扩张。它具有两个配体，即程序性细胞死亡配体1和2(PD-L1、PD-L2)，其中，PD-L1被肿瘤细胞表达，以逃逸免疫系统对它进行的抗肿瘤反应。阻断PD-1和PD-L1间的作用可以在T细胞进入肿瘤微环境后保持T细胞的应答，保证T细胞的抗肿瘤作用。针对PD-1/PD-L1的抗体已有纳武单抗(Nivolumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、JQ1、阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)和西米普利单抗(Cemiplimab)。这些单抗被批准用于治疗乳腺癌、肺癌、大肠癌、癌症、膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
虽然免疫检查点阻断治疗在临床应用中带来持久的肿瘤抑制作用，但仅对部分患者有效，如何提高免疫检查点抗体药物应答率是目前面临的主要难题。目前医学研究认为，免疫检查点阻断治疗的持续治疗能带来更好的治疗效果，然而在有限的免疫检查点应答患者中，强烈的副反应(如严重的消化道不良反应、皮肤剧烈瘙痒、肝损伤、肺炎、肾功能损害等)使得这些患者不得不中止免疫治疗，从而无法获得预期的临床受益。
越来越多的实验和临床数据表明肠道微生物与免疫检查点抑制剂的抗肿瘤作用及其诱导的消化道不良反应密切相关。肠道微生物可通过其表面分子(如荚膜多糖、鞭毛和表面蛋白等)以及代谢物(如短链脂肪、吲哚和肌苷等)影响宿主的免疫系统甚至影响免疫检查点抑制剂的疗效。已有报道显示，在PD-1/PD-L1抗体的疗效中，双歧杆菌起到了促进作用。联用短双歧杆菌-长双歧杆菌-PD-1抗体可使得黑色素瘤生长几乎完全停止。此外，肠道中高含量的A.mucinophilia和F.prausnitzii与对PD-1治疗的良好反应相关。
脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，B.fragilis)为革兰氏染色阴性、杆状、两端钝圆而浓染、有荚膜、无芽胞、无动力的专性厌氧细菌，分为产肠毒素型(ETBF)和非产肠毒素型(NTBF)，是人及动物肠道正常菌群的一部分，主要存在于结肠中，呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜也可定植生长。研究发现非产肠毒型脆弱拟杆菌(NTBF)具有重要的益生作用。脆弱拟杆菌与宿主的关系在很大程度上取决于其高度复杂和动态的荚膜结构，B.fragilis两性离子荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)是首个公认的调节宿主免疫系统的发育，逆转无菌动物的形态、细胞和功能缺陷的共生因子。众多研究表明，非产肠毒型脆弱拟杆菌及其两性离子荚膜多糖在调节宿主免疫系统的发育等多种方面具有较好疗效。
目前没有关于利用脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖与免疫检查点抑制剂联合治疗呼吸系统肿瘤的文献记载。
发明内容
为克服现有技术中所存在的上述缺陷，本发明的目的是提供一种脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖与PD-1抗体和/或PD-L1抗体联合用药在防治呼吸系统肿瘤中的应用。本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖，特别是提取自保藏编号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312的两性离子荚膜多糖与PD-1抗体/PD-L1抗体联用能够调节免疫细胞比例和免疫因子水平，增强机体抗肿瘤免疫反应，有效防治呼吸系统肿瘤。
为此，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖与免疫检查点抑制剂联合预防和/或治疗呼吸系统肿瘤的应用。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖提取自保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
在其中一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂包括PD-1抗体、PD-L1抗体、PD-L2抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、VISTA抗体、A2aR抗体中的一种或多种，优选为PD-1抗体和/或PD-L1抗体。
在其中一些实施例中，所述两性离子荚膜多糖含有荚膜多糖A。其中，所述荚膜多糖A的结构如下所示：
根据本发明，所述荚膜多糖A的重均分子量为80-90kD，Mw分布于70-100KD的部分占总量的70-80％，重均分子量/数均分子量(Mw/Mn)的比值为1.0-1.3。
在其中一些实施例中，其中，所述荚膜多糖A的含量超过95wt％。
在其中一些实施例中，所述两性离子荚膜多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)将发酵培养后的脆弱拟杆菌菌液离心收集沉淀物，即得脆弱拟杆菌菌泥；取菌泥，加入菌泥质量3～10倍的纯化水使菌体重悬，用酸溶液调节其pH至2.0～4.5，50～120℃提取0.5～3.0h，冷却至室温，常温离心，取上清，得到粗糖溶液；
(2)粗糖溶液经超滤膜超滤浓缩、除小分子杂质，至电导率稳定，收集回流液；
(3)回流液中加入等体积40mmol/L Tris-HCl转盐；离子交换柱层析，梯度洗脱，分段收集，SEC-HPLC跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，超滤膜超滤，加入纯化水反复超滤，至电导率稳定，收集回流液，冻干，得到脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述离心为11000-13000g离心8～12min。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述酸溶液可以是有机酸、无机酸和酸性缓冲液中的一种或多种。其中，无机酸可以是盐酸、硫酸、磷酸等；有机酸可以是乙酸、柠檬酸等。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述超滤膜可以为100、50、30、10、5、3KD或者任意两个分子量值之间的范围。
在其中一些实施例中，步骤(3)中所述离子交换柱优选为DEAE Sepharose FastFlow的16mm×200mm，层析时的流速15～25mL/min，pH5.0～9.0含0.2mol/L NaCl 20mmol/LTris-HCl梯度洗脱25个柱体积，分段收集，100mL/瓶(组分)；所述超滤膜为10KD。
在其中一些实施例中，所述呼吸系统肿瘤包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈部鳞癌。
根据本发明，所述头颈部鳞癌选自鼻咽癌、喉癌。
在其中一些实施例中，所述PD-1抗体包括纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)及其他能够与PD-1结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路，上调T细胞活化，激活内源性抗肿瘤免疫反应的物质。
在其中一些实施例中，所述PD-L1抗体包括阿特朱单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、度伐鲁单抗(Durvalumab)及其他能够与PD-L1结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路，上调T细胞活化，激活内源性抗肿瘤免疫反应的物质。
在其中一些实施例中，脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖与PD-1抗体和/或PD-L1抗体同时给药。
在其中一些实施例中，脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖与PD-1抗体和/或PD-L1抗体分别给药。
在其中一些实施例中，脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖采用口服或灌肠方式给药。
第二方面，提供一种药物，其中，所述药物同时包括脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖及PD-1和/或PD-L1抗体。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖提取自保藏号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
在其中一些实施例中，所述两性离子荚膜多糖含有荚膜多糖A。其中，所述荚膜多糖A的结构如下所示：
根据本发明，所述荚膜多糖A的重均分子量为80-90kD，Mw分布于70-100KD的部分占总量的70-80％，重均分子量/数均分子量(Mw/Mn)的比值为1.0-1.3。
在其中一些实施例中，其中，所述荚膜多糖A的含量超过95wt％。
在其中一些实施例中，所述两性离子荚膜多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)将发酵培养后的脆弱拟杆菌菌液离心收集沉淀物，即得脆弱拟杆菌菌泥；取菌泥，加入菌泥质量3-10倍的纯化水使菌体重悬，用酸溶液调节其pH至2.0-4.5，50-120℃提取0.5-3.0h，冷却至室温，常温离心，取上清，得到粗糖溶液；
(2)粗糖溶液经超滤膜超滤浓缩、除小分子杂质，至电导率稳定，收集回流液；
(3)回流液中加入等体积40mmol/L Tris-HCl转盐；离子交换柱层析，梯度洗脱，分段收集，SEC-HPLC跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，超滤膜超滤，加入纯化水反复超滤，至电导率稳定，收集回流液，冻干，得到脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述离心为11000～13000g离心8～12min。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述酸溶液可以是有机酸、无机酸和酸性缓冲液中的一种或多种。其中，无机酸可以是盐酸、硫酸、磷酸等；有机酸可以是乙酸、柠檬酸等。
在其中一些实施例中，步骤(2)中所述超滤膜可以为100、50、30、10、5、3KD或者任意两个分子量值之间的范围。
在其中一些实施例中，步骤(3)中所述离子交换柱优选为DEAE Sepharose FastFlow的16mm×200mm，层析时的流速15-25mL/min，pH5.0-9.0含0.2mol/L NaCl 20mmol/LTris-HCl梯度洗脱25个柱体积，分段收集，100mL/瓶(组分)；所述超滤膜为10KD。
在其中一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂包括PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体及其他能够与免疫检查点结合，激活或增强内源性抗肿瘤免疫反应的物质。
在其中一些实施例中，所述PD-1抗体包括纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)及其他能够与PD-1结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路，上调T细胞活化，激活内源性抗肿瘤免疫反应的物质。
在其中一些实施例中，所述PD-L1抗体包括阿特朱单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、度伐鲁单抗(Durvalumab)及其他能够与PD-L1结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路，上调T细胞活化，激活内源性抗肿瘤免疫反应的物质。
在其中一些实施例中，脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖与PD-1抗体和/或PD-L1抗体同时给药。
在其中一些实施例中，脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖与PD-1抗体和/或PD-L1抗体分别给药。
在其中一些实施例中，脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖采用口服或灌肠方式给药。
根据本发明，所述药物用于预防和/或治疗呼吸系统肿瘤。其中，所述呼吸系统肿瘤包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈部鳞癌。
根据本发明，所述头颈部鳞癌选自鼻咽癌、喉癌。
本发明的有益效果：
本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌特别是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312及其两性离子荚膜多糖，尤其是荚膜多糖A(PSA)，与PD-1抗体/PD-L1抗体联用能够调节免疫细胞比例和免疫因子水平，增强机体抗肿瘤免疫反应，有效预防呼吸系统肿瘤的发生发展及其复发转移，提高患者的生活质量。
本发明采用的脆弱拟杆菌ZY-312不含BFT基因，是非产毒菌株，急性毒性证实，该菌株对正常小鼠和裸鼠均无致病性(Wang Y，Deng H，Li Z，Tan Y，Han Y，Wang X，Du Z，LiuY，Yang R，Bai Y，Bi Y，Zhi F.Safety Evaluation of a Novel Strain of Bacteroidesfragilis.Front Microbiol.2017Mar 17；8:435.)。根据专利ZL201510459408.X和科技文献Xu W，Su P，Zheng L，Fan H，Wang Y，Liu Y，Lin Y，Zhi F.In vivo Imaging of a NovelStrain of Bacteroides fragilis via Metabolic Labeling.Front Microbiol.2018Oct1；9:2298.的报道，该菌株对胃酸、胆盐有着较好的耐性，能够保证其在胃中的存活和有效定植。
附图说明
图1为本发明实施例1的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析图；
A-E分别为本发明实施例1的荚膜多糖A核磁共振波谱仪分析的1H谱、13C谱、COSY谱、HSQC谱、HMBC谱图；
图2为本发明实施例1制备得到的脆弱拟杆菌荚膜多糖A的结构单元的化学结构式。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。下文中，仅仅是为说明，只在实施例中描述了其中一少部分，然而不应将其理解为对本发明的限制。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，所有细胞购自ATCC；所有细胞培养材料及胰酶购自Gibco；所有实验动物购自浙江维通利华实验动物技术有限公司；或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1脆弱拟杆菌ZY-312两性离子荚膜多糖的制备
(1)将脆弱拟杆菌ZY-312菌种划线接种于血平皿，厌氧培养48h，选取单个菌落接种于植物源蛋白胨液体培养基中进行发酵培养8小时(温度为37℃)，所得菌液离心沉淀，转速3000r/min，离心15min，去上清，收集沉淀物，即得脆弱拟杆菌ZY-312菌泥。
(2)取步骤(1)中所制菌泥50g，加入300g纯化水使菌体重悬，用1mol/L盐酸溶液调节其pH至3.5，100℃提取1.5h，冷却至室温，12000g常温离心10min，取上清，得到粗糖溶液；
(3)粗糖溶液经10KD超滤膜超滤浓缩、除小分子杂质，至电导率稳定，收集回流液；
(4)回流液中加入等体积40mmol/L Tris-HCl(pH8.5)转盐；DEAE Sepharose FastFlow离子交换柱层析(16mm×200mm)，流速20mL/min，20mmol/L Tris-HCl(pH8.5，含0.2mol/L NaCl)梯度洗脱25个柱体积，分段收集，100mL/瓶(组分)，SEC-HPLC跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，10KD超滤膜超滤，加入纯化水反复超滤，至电导率稳定，收集回流液，冻干，得到脆弱拟杆菌提取物；
(5)称量30mg步骤(4)所述的脆弱拟杆菌提取物，溶于0.5mL D2O，加入1μL丙酮(1H，2.22；13C，30.89)定标。采用500MHz Bruker核磁共振波谱仪分析1H、13C、COSY、HSQC、HMBC谱(参见图1A-E)，确证步骤(3)收集的脆弱拟杆菌提取物为荚膜多糖A(PSA)，结合脂质含量低于0.02％，蛋白残留低于1％，核酸残留低于0.05％。通过GPC(凝胶渗透色谱)分析，制得的荚膜多糖A重均分子量为80-90kDa，Mw/Mn为1.0-1.3，化学结构参见图2。
制得的PSA命名为PSA-ZY-312。
实施例2脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖联合PD-1抗体在治疗小鼠Lewis肺癌中的应用
一.实验设计及流程
为了验证实施例1提供的脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖联合PD-1抗体对非小细胞肺癌的治疗作用，本实施例选用C57BL/6小鼠进行实验，并采用移植瘤模型的方法建立小鼠非小细胞肺癌模型。取传代Lewis肺癌荷瘤小鼠的肿瘤细胞，以生理盐水稀释成瘤细胞浓度1×107个/mL的细胞悬液，取0.2mL接种于小鼠右侧腋窝皮下，建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型。建模成功后将模型小鼠随机分为模型组、PD-1抗体组、PSA-ZY-312组、低剂量PSA-ZY-312+PD-1抗体组、中剂量PSA-ZY-312+PD-1抗体组和高剂量PSA-ZY-312+PD-1抗体组，每组10只。另以10只未接瘤同种小鼠作为空白组。以分组当日作为Day0(D0)，按表1进行给药，共给药21天。D21，所有小鼠安乐死，采集小鼠血清、肿瘤、粪便、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。所有肿瘤称重和拍照。肿瘤分为三份，一份冻存用于细胞因子检测，一份于福尔马林中固定，一份送于体外用于流式分析。
表1实验动物分组及给药方案
二.肿瘤测量和实验指标
肿瘤体积与肿瘤生长抑制率：每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。
肿瘤内T细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤内CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例。
三.统计分析
基于实验结束时获得的数据进行统计学分析评估组间差异。两组间比较用T-test(one tailed)进行统计分析。使用SPSS统计软件25.0进行统计学分析，p<0.05认为有显著性差异。
四.实验结果
1.肿瘤体积与肿瘤生长抑制率
表2.受试物对小鼠Lewis肺癌模型的抑瘤药效评价
(基于分组给药后第21天肿瘤体积计算得出)
注：
a.平均值±SEM；
b.TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100％；
c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(one-tailed)方法计算。
给药期间各组荷瘤小鼠的瘤块体积如表2所示，与空白组相比，模型组出现明显瘤块，造模成功；与模型组相比，各给药组均可降低肿瘤体积，而PD-1抗体与PSA-ZY-312联合给药可显著降低瘤块体积(p＜0.05或0.01)。在PSA组内，存在一定的剂量依赖性。这说明脆弱拟杆菌荚膜多糖A与PD-1抗体联用能够有效抑制小鼠Lewis肺癌的生长。
2.T细胞亚群
表3.各组小鼠T细胞亚群比例(mean±SD)
注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。
CD8+T细胞(TC或CTL细胞)能杀伤表达抗原的靶细胞，它在抗毒感染、急性同种异型移植物排斥和对肿瘤细胞的杀伤作用是重要的效应细胞。CD4+T细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞，主要由辅助T(Th)细胞分化而来，可与MHCⅡ类分子的非多肽区结合，参与T细胞抗原受体(TCR)识别抗原的信号转导。研究发现，在肿瘤免疫中，CD4+T细胞启动后可以通过多种机制激活CD8+T细胞，使其分化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，同时维持并加强CTL的抗肿瘤反应。
如上表所示，与模型组相比，各给药组均不同程度地上调了肿瘤内CD3+CD4+T细胞占CD3+T细胞的比例。脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A联用PD-1抗体组的上调幅度大于单独给药组；PSA组内具有一定的剂量差异性，中、高剂量PSA联用PD-1抗体组与模型组具有显著性差异。
与模型组相比，各给药组均上调了肿瘤内CD3+CD8+T细胞占CD3+T细胞的比例。脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A联用PD-1抗体组的上调幅度大于单独给药组；PSA组内具有一定的剂量依赖性，高剂量PSA联用PD-1抗体组与模型组具有显著性差异。
可见，脆弱拟杆菌ZY-312的荚膜多糖A联用PD-1抗体能够上调肿瘤内CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞的比例。
由以上实施例的结果可见，脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A联用PD-1抗体能够调节肿瘤浸润T细胞的比例，增强机体抗肿瘤免疫反应，有效防治小鼠Lewis肺癌。这种防治作用与荚膜多糖A具有一定的剂量依赖关系。
实施例3荚膜多糖A联合PD-L1抗体在治疗小细胞肺癌中的应用
一.实验设计
为了验证实施例1提供的脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖联合PD-1抗体对小细胞肺癌的治疗作用，本实施例选用Trp53loxP/loxP；Rb1loxP/loxP；Rb12loxP/loxP小鼠进行实验，并采用移植瘤模型的方法建立小鼠小细胞肺癌模型。以Ad-CreCaPi(Ad-CreCaPi：滴度为107PfU的Ad-Cre 2μL加入到246.8μL的MEM中，再加入1.2μL的2mol/L CaCl2，购自VECTOR B IOLABS)的共沉淀物诱导Trp53loxP/loxP；Rb1loxP/loxP；Rb12loxP/loxP小鼠得到的小细胞肺癌细胞(SCLC细胞)，以Matrigel胶(基质胶：无血清培养基＝1:1，基质胶购自Solarbio)调整SCLC细胞浓度为1×107个/mL，取50μL接种于Trp53loxP/loxP；Rb1loxP/loxP；Rb12loxP/loxP小鼠右侧肋部皮下，建立小细胞肺癌荷瘤小鼠模型。建模成功后将模型小鼠随机分为模型组、PD-L1抗体组、PSA-ZY-312组、低剂量PSA-ZY-312+PD-L1抗体组、中剂量PSA-ZY-312+PD-L1抗体组和高剂量PSA-ZY-312+PD-L1抗体组，每组10只。另以10只未接瘤同种小鼠作为空白组。以分组当日作为Day0(D0)，按表4进行给药，共给药21天。D21，所有小鼠安乐死，采集小鼠血清、肿瘤、粪便、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。所有肿瘤称重和拍照。肿瘤分为三份，一份冻存用于细胞因子检测，一份于福尔马林中固定，一份送于体外用于流式分析。
表4实验动物分组及给药方案
二.肿瘤测量和实验指标
肿瘤体积与肿瘤生长抑制率：每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100％。
T细胞亚群：流式细胞术分析肿瘤内CD3+T细胞、CD8+T细胞的比例。
三.统计分析
基于实验结束时获得的数据进行统计学分析评估组间差异。两组间比较用T-test(two-tailed)进行统计分析。使用SPSS 25.0软件进行所有数据分析，p<0.05认为有显著性差异。
四.实验结果
1.肿瘤体积与肿瘤生长抑制率
表5.受试物对小鼠SCLC模型的抑瘤药效评价
(基于分组给药后第21天肿瘤体积计算得出)
注：
a.平均值±SEM；
b.TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100％；
c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(one-tailed)方法计算。
给药期间各组荷瘤小鼠的瘤块体积如表5所示，与空白组相比，模型组显著成瘤，造模成功。与模型组相比，各给药组均可降低肿瘤体积，而PD-L1抗体与PSA-ZY-312联合给药可显著降低瘤块体积(p＜0.05或0.01)。在PSA组内，存在一定的剂量依赖性。这说明脆弱拟杆菌荚膜多糖A与PD-L1抗体联用能够有效抑制小鼠SCLC肺癌的生长。这种抑制作用与荚膜多糖A具有一定的剂量依赖关系。
2.T细胞亚群
表6各组小鼠CD3+T细胞、CD8+T细胞比例(mean±SD)
注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。
如上表所示，与模型组相比，PD-L1抗体、脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A单用均未能明显提升小鼠肿瘤内浸润CD3+T细胞、CD8+T细胞的比例；PD-L1抗体与脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A联用时，CD3+T细胞、CD8+T细胞比例显著上升。PSA组内具有一定剂量依赖性。这说明脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A与PD-L1抗体联用能够调节T细胞水平，增强机体抗肿瘤免疫反应。这种调节作用与荚膜多糖A具有一定的剂量依赖关系。
由以上实施例的结果可见，脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A与PD-L1抗体联用能够调节肿瘤内T细胞水平，增强机体抗肿瘤免疫反应，有效防治小鼠SCLC肺癌。这种防治作用与荚膜多糖A具有一定的剂量依赖关系。
实施例4脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖联合PD-1抗体在治疗小鼠Hep-2喉癌移植瘤中的应用
一.实验设计
为了验证实施例1提供的脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖联合PD-1抗体对喉癌的治疗作用，本实施例选用6周龄雄性BALB/c纯系裸鼠进行实验，并采用Hep-2异种移植裸鼠模型的方法建立小鼠喉癌移植瘤模型。将对数生长期Hep-2喉癌细胞制成无血清细胞悬液，接种于裸鼠背部，每只接种100μL，含有2×106个细胞，待瘤体直径约50mm3时，选择肿瘤生长大小均匀的动物，随机分为空白组、模型组、PD-1抗体组、PSA-ZY-312组、低剂量PSA-ZY-312+PD-1抗体组、中剂量PSA-ZY-312+PD-1抗体组和高剂量PSA-ZY-312+PD-1抗体组，每组10只。另设置10只未接瘤同种小鼠作为空白组。以分组当日作为Day0(D0)，按表7进行给药，共给药27天。D27，所有小鼠安乐死，采集小鼠血清、肿瘤、粪便、右侧颈部淋巴以及右侧腋窝淋巴。所有肿瘤称重和拍照。肿瘤分为三份，一份冻存用于细胞因子检测，一份于福尔马林中固定，一份送于体外用于流式分析。
表7实验动物分组及给药方案
二.肿瘤测量和实验指标
肿瘤体积与肿瘤生长抑制率：每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径。肿瘤体积的计算公式为：V＝0.5a×b2，a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
化合物的抑瘤疗效用TGI(％)评价。TGI(％)，反映肿瘤生长抑制率。TGI(％)的计算：TGI(％)＝[1-(某处理组给药结束时平均瘤体积－该处理组开始给药时平均瘤体积)/(同型对照组治疗结束时平均瘤体积－同型对照组开始治疗时平均瘤体积)]×100。
细胞因子检测：Luminex技术检测小鼠肿瘤中IL-2和IL-10的含量。
三.统计分析
基于实验结束时获得的数据进行统计学分析评估组间差异。两组间比较用T-test(two-tailed)进行统计分析。使用SPSS 25.0软件进行所有数据分析，p<0.05认为有显著性差异。
四.实验结果
1.肿瘤体积与肿瘤生长抑制率
表8.受试物对小鼠喉癌移植瘤模型的抑瘤药效评价
(基于分组给药后第27天肿瘤体积计算得出)
注：
a.平均值±SEM；
b.TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100％；
c.根据肿瘤体积计算，两组间p值按照unpaired t-test(one-tailed)方法计算。
给药期间各组荷瘤小鼠的瘤块体积如表8所示，与空白组相比，模型组显著成瘤，造模成功；与模型组相比，各给药组均下调了肿瘤体积，PSA-ZY-312联用PD-1抗体各组具有显著性差异(p＜0.05或0.01)。可见脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A与PD-1抗体联用可抑制Hep-2喉癌细胞在小鼠体内的生长，这种抑制作用与荚膜多糖A有一定的剂量依赖关系。
2.细胞因子水平
表9.各组小鼠肿瘤内细胞因子水平(mean±SD)
注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。
IL-2是已知的抗肿瘤免疫细胞因子。IL-10作为一种免疫抑制细胞因子被广泛接受，被认为通过降低肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫反应来促进肿瘤免疫逃逸。
如表9所示，与模型组相比，各给药组均显著下调了肿瘤内IL-10的水平，中、高剂量脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A与PD-1抗体联用时具有极显著差异。
与模型组相比，各给药组均显著上调了肿瘤内IL-2的水平，脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A高剂量与PD-1抗体联用时具有极显著差异。
上述结果说明脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A与PD-1抗体联用能够调节肿瘤内免疫因子，增强机体抗肿瘤免疫反应。这种调节作用与荚膜多糖A有一定的剂量依赖关系。
由以上实施例的结果可见，脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A与PD-1抗体联用能够调节小鼠喉癌Hep-2移植瘤内的免疫因子水平，抑制肿瘤生长，有效防治小鼠喉癌。这种防治作用与荚膜多糖A具有一定的剂量依赖关系。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
Claims (10)
1.一种脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖与免疫检查点抑制剂协同预防和/或治疗呼吸系统肿瘤的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂包括PD-1抗体、PD-L1抗体、PD-L2抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体、TIM-3抗体、VISTA抗体、A2aR抗体中的一种或多种，优选为PD-1抗体和/或PD-L1抗体。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述呼吸系统肿瘤包括头颈部癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌。优选地，所述头颈部癌还包括鼻咽癌、喉癌。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于，所述两性离子荚膜多糖含夹膜多糖A。优选地，所述荚膜多糖A的结构如下所示：
更优选地，所述夹膜多糖A的重均分子量为80-90kD；所述两性离子荚膜多糖中夹膜多糖A的含量超过95wt％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述两性离子荚膜多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)将发酵培养后的脆弱拟杆菌菌液离心收集沉淀物，即得脆弱拟杆菌菌泥；取菌泥，加入菌泥质量3～10倍的纯化水使菌体重悬，用酸溶液调节其pH至2.0～4.5，50～120℃提取0.5～3.0h，冷却至室温，常温离心，取上清，得到粗糖溶液；
(2)粗糖溶液经超滤膜超滤浓缩、除小分子杂质，至电导率稳定，收集回流液；
(3)回流液中加入等体积40mmol/L Tris-HCl转盐；离子交换柱层析，梯度洗脱，分段收集，SEC-HPLC跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，超滤膜超滤，加入纯化水反复超滤，至电导率稳定，收集回流液，冻干，得到脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖。
优选地，步骤(1)中所述离心为11000～13000g离心8～12min；
优选地，步骤(1)中所述酸溶液可以是有机酸、无机酸和酸性缓冲液中的一种或多种；其中，无机酸可以是盐酸、硫酸、磷酸等；有机酸可以是乙酸、柠檬酸等；
优选地，步骤(2)中所述超滤膜可以为100、50、30、10、5、3KD或者任意两个分子量值之间的范围；
优选地，步骤(3)中所述离子交换柱为DEAE Sepharose Fast Flow的16mm×200mm，层析时的流速15～25mL/min，pH5.0～9.0含0.2mol/L NaCl 20mmol/L Tris-HCl梯度洗脱25个柱体积，分段收集，100mL/瓶(组分)；所述超滤膜为10KD。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PD-1抗体包括纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)及其他能够与PD-1结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路，上调T细胞活化，激活内源性抗肿瘤免疫反应的物质。
优选地，所述PD-L1抗体包括阿特朱单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、度伐鲁单抗(Durvalumab)及其他能够与PD-L1结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路，上调T细胞活化，激活内源性抗肿瘤免疫反应的物质。
7.一种药物，其特征在于，所述药物同时包括脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖及PD-1和/或PD-L1抗体。优选地，所述所述脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖提取自保藏号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述两性离子荚膜多糖含夹膜多糖A。优选地，所述荚膜多糖A的结构如下所示：
更优选地，所述夹膜多糖A的重均分子量为80-90kD；所述两性离子荚膜多糖中夹膜多糖A的含量超过95wt％。
所述两性离子荚膜多糖的制备方法包括以下步骤：
(1)将发酵培养后的脆弱拟杆菌菌液离心收集沉淀物，即得脆弱拟杆菌菌泥；取菌泥，加入菌泥质量3～10倍的纯化水使菌体重悬，用酸溶液调节其pH至2.0～4.5，50～120℃提取0.5～3.0h，冷却至室温，常温离心，取上清，得到粗糖溶液；
(2)粗糖溶液经超滤膜超滤浓缩、除小分子杂质，至电导率稳定，收集回流液；
(3)回流液中加入等体积40mmol/L Tris-HCl转盐；离子交换柱层析，梯度洗脱，分段收集，SEC-HPLC跟踪监测，合并206nm吸收峰为单一、对称峰的组分，超滤膜超滤，加入纯化水反复超滤，至电导率稳定，收集回流液，冻干，得到脆弱拟杆菌两性离子荚膜多糖。
优选地，步骤(1)中所述离心为11000～13000g离心8～12min；
优选地，步骤(1)中所述酸溶液可以是有机酸、无机酸和酸性缓冲液中的一种或多种；其中，无机酸可以是盐酸、硫酸、磷酸等；有机酸可以是乙酸、柠檬酸等；
优选地，步骤(2)中所述超滤膜可以为100、50、30、10、5、3KD或者任意两个分子量值之间的范围；
优选地，步骤(3)中所述离子交换柱为DEAE Sepharose Fast Flow的16mm×200mm，层析时的流速15～25mL/min，pH5.0～9.0含0.2mol/L NaCl 20mmol/L Tris-HCl梯度洗脱25个柱体积，分段收集，100mL/瓶(组分)；所述超滤膜为10KD。
9.根据权利要求7或8所述的药物，其特征在于，所述PD-1抗体包括纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)及其他能够与PD-1结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路，上调T细胞活化，激活内源性抗肿瘤免疫反应的物质。
优选地，所述PD-L1抗体包括阿特朱单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、度伐鲁单抗(Durvalumab)及其他能够与PD-L1结合，阻断PD-1/PD-L1信号通路，上调T细胞活化，激活内源性抗肿瘤免疫反应的物质。
10.根据权利要求7-9中任一所述的药物，其特征在于，所述呼吸系统肿瘤包括非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈部鳞癌。优选地，所述头颈部鳞癌选自鼻咽癌、喉癌。
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