WO2023134195A1 - 脆弱拟杆菌联合免疫检查点抑制剂在治疗皮肤肿瘤中的应用 - Google Patents

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Definitions

  • mice were stripped of the mouse tumors under aseptic operation, weighed the stripped tumors of each group, and ground them into cell suspensions respectively. After filtering the tissue residues with a 700-mesh filter, they were washed twice with PBS and counted by centrifugation. Two specimens were taken from each group. Tube cell samples were used to detect the levels of CD8+ effector T cells, Treg cells and cytokines.

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Abstract

公开了脆弱拟杆菌联合免疫检查点抑制剂在治疗皮肤肿瘤中的应用，特别是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312，与PD-1抑制剂联用，能够显著提高治疗皮肤肿瘤的综合疗效；脆弱拟杆菌可通过降低促炎因子IL-1、IL-6、IL-8、VEGF的水平，增加CD8+效应T细胞的迁移，减少Treg细胞的募集，降低原位肿瘤的重量，增加抑癌率，有效防治黑色素瘤的发生发展及其复发转移，减轻放化疗对机体的伤害，提高患者的生活质量。

Description

脆弱拟杆菌联合免疫检查点抑制剂在治疗皮肤肿瘤中的应用
本发明要求2022年01月12日向中国国家知识产权局提交的专利申请号为202210034074.1，发明名称为“脆弱拟杆菌联合免疫检查点抑制剂在治疗皮肤肿瘤中的应用”的在先申请的优先权。该件在先申请的全文通过引用的方式结合于本发明中。
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一种脆弱拟杆菌联合免疫检查点抑制剂在治疗皮肤肿瘤中的应用。
背景技术
黑色素瘤(melanoma)是黑色素瘤是一类起源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤，可发生于皮肤、黏膜(消化道、呼吸道和泌尿生殖道等)、眼葡萄膜、软脑膜等不同部位或组织，是一种死亡率高、转移率高、治疗难度大的恶性肿瘤。中国每年黑色素瘤新发病例近2万人，发病率呈逐年上升趋势，每年死亡患者多达3800例，占所有亚洲患者的1/3，居亚洲首位。其中皮肤黑色素瘤的恶性程度高，生长迅速，预后大多很差，因此早期诊断和及时正确治疗十分重要。治疗上强调早期发现和局部扩大切除。但皮肤黑色素瘤临床表现复杂，容易误诊，尤其是无色素型黑色素瘤。若未能早期诊断，病变呈侵袭性发展，早期可出现淋巴转移，晚期发生血行转移。病变位于肢端者，必要时需行截指(趾)或截肢术。
皮肤黑色素瘤目前指南推荐疗法中，除了手术治疗、化疗、干扰素治疗这些传统的疗法，新兴的免疫治疗获得了不错疗效，如：BRAF+MEK抑制剂、PD-1抑制剂、纳武利尤单抗、伊匹木单抗、纳武利尤+伊匹木单抗、伊匹木单抗+溶瘤病毒局部注射等已获批临床应用。在新兴的疗法中值得注意的是，程序性死亡受体1(programmed death-1，PD-1)是T细胞表面一类重要的共抑制分子，对免疫反应起负性调节作用。PD-L1/PD-L2是PD-1的配体。PD-L1主要在抗原呈递细胞(APC)的膜上表达，也在淋巴和非淋巴组织中广泛表达。 在肿瘤微环境中，受到IFN-γ或致癌驱动事件的刺激，PD-L1过表达。PD-1与PD-L1结合并随后抑制PI3K-AKT和Ras-Raf-MEK-ERK信号传导途径。PD-1/PD-L1的细胞内下游信号制动效应T细胞的活化，抑制效应T细胞的增殖和分化，并阻止肿瘤抗原呈递从而导致免疫逃逸。越来越多的证据证明PD-1/PD-L1抑制剂在多种肿瘤治疗方面有巨大潜力。对于不可切除的晚期黑色素瘤或者晚期黑色素瘤，PD-1单抗+阿昔替尼方案在I/II期研究中取得良好疗效，并被FDA批准为孤儿药。Nivolumab
Figure PCTCN2022119441-appb-000001
Pembrolizumab
Figure PCTCN2022119441-appb-000002
Atezolizumab
Figure PCTCN2022119441-appb-000003
Avelumab
Figure PCTCN2022119441-appb-000004
Durvalumab
Figure PCTCN2022119441-appb-000005
均为PD-1/L1单抗剂，适用于晚期黑色素瘤、非小细胞型肺癌、经典型霍奇金皮肤黑色素瘤、尿路上皮癌等肿瘤治疗。
虽然免疫检查点阻断治疗在临床应用中带来持久的肿瘤抑制作用，但仅对部分患者有效，如何提高免疫检查点抗体药物应答率是目前面临的主要难题。目前医学研究认为，免疫检查点阻断治疗的持续治疗能带来更好的治疗效果，然而在有限的免疫检查点应答患者中，强烈的副反应(如严重的消化道不良反应、皮肤剧烈瘙痒、肝损伤、肺炎、肾功能损害等)使得这些患者不得不中止免疫治疗，从而无法获得预期的临床受益。
越来越多的实验和临床数据表明肠道微生物与免疫检查点抑制剂的抗肿瘤作用及其诱导的消化道不良反应密切相关。肠道微生物可通过其表面分子(如荚膜多糖、鞭毛和表面蛋白等)以及代谢物(如短链脂肪、吲哚和肌苷等)影响宿主的免疫系统甚至影响免疫检查点抑制剂的疗效。已有报道显示，在PD-1/PD-L1抗体的疗效中，双歧杆菌起到了促进作用。联用短双歧杆菌-长双歧杆菌-PD-1抗体可使得黑色素瘤生长几乎完全停止。此外，肠道中高含量的A.mucinophilia和F.prausnitzii与对PD-1治疗的良好反应相关。
脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis，B.fragilis)为革兰氏染色阴性、杆状、两端钝圆而浓染、有荚膜、无芽胞、无动力的专性厌氧细菌，分为产肠毒素型(ETBF)和非产肠毒素型(NTBF)，是人及动物肠道正常菌群的一部分，正常寄居于人体呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜等。申请人研究团队从2012年开始探索并从健康婴儿粪便中分离脆弱拟杆菌B.fragilis(菌株ZY-312)。已有研究证实，双歧杆菌通过上调树突状细胞(dendritic cells，DCs)多种基因 的表达，诱导其成熟及细胞因子分泌，从而增强其抗原呈递能力增强。但是目前没有关于利用脆弱拟杆菌联合免疫检查点抑制剂治疗皮肤黑色素瘤的文献记载。
发明内容
为克服现有技术中所存在的上述缺陷，本发明的目的是提供一种脆弱拟杆菌联合免疫检查点抑制剂治疗皮肤肿瘤的应用。本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌特别是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312及其灭活菌，可降低促炎因子IL-1、IL-6、IL-8、VEGF的水平，增加CD8+效应T细胞的迁移，减少CD4+CD25+T cell(Treg)细胞的募集，以改善肿瘤微环境，从而降低原位肿瘤的重量，增加抑癌率，可有效地防治皮肤黑色素瘤。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种产品组合，包括：
(i)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有(a)第一活性成分，所述第一活性成分为脆弱拟杆菌，以及药学上可接受的载体；和
(ii)第二药物组合物，所述第二药物组合物含有(b)第二活性成分，所述第二活性成分为免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点选自下组：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA、A2aR或其组合；
以及药学上可接受的载体；
其中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物为不同的药物组合物，或同一药物组合物。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是活菌、形态结构完整的灭活菌或形态结构不完整的灭活菌中的一种及以上。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
在其中一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、或其组合。
在另一优选例中，所述抗体选自如下中的一种或多种：纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)。
在其中一些实施例中，所述含有脆弱拟杆菌的第一药物组合物与含有所述免疫检查点抑制剂的第二药物组合物同时或分别给药。
在其中一些实施例中，所述的药物组合物的剂型包括注射剂型、外用药物剂型和口服剂型。
在另一优选例中，所述药物组合物可以通过皮下注射、静脉注射、肌内注射的方式给药。
在另一优选例中，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、和颗粒剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型包括缓释型剂型、和非缓释型剂型。
第二方面，本发明提供了一种药物组合物，包括：
(i)药学有效剂量的脆弱拟杆菌；
(ii)免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点选自下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA和A2aR；和
(iii)药学上可接受的载体。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是活菌、形态结构完整的灭活菌或形态结构不完整的灭活菌中的一种及以上。
在其中一些实施例中，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。
在另一优选例中，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
在另一优选例中，所述药学效剂量为10 5-10 10CFU。
在其中一些实施例中，所述免疫检查点的抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、或其组合。
在另一优选例中，所述抗体选自如下中的一种或任意组：纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)。
在其中一些实施例中，所述药物组合物的剂型包括丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、散剂、混悬剂或口服液。
在其中一些实施例中，所述药物组合物中还包含以下药物可接受的辅料中的一种或多种：稀释剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、助悬剂、矫味剂、包衣剂和/或增溶剂。
在其中一些实施例中，所述药物可接受的辅料包括水、盐溶液、醇、硅酮、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、麦芽糊精、微晶纤维素、硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、单脂肪酸甘油酯、二脂肪酸甘油酯、石化脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
第三方面，本发明提供第一方面所述的产品组合、第二方面所述的药物组合物在制备治疗皮肤肿瘤的药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述皮肤肿瘤包括黑色素瘤、鳞状细胞癌和基底细胞癌。
本发明的有益效果：
本发明通过大量实验证明，脆弱拟杆菌特别是保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312及其灭活菌在体内可降低促炎因子IL-1、IL-6、IL-8、VEGF的水平，增加CD8+效应T细胞的迁移，减少CD4+CD25+T cell(Treg)细胞的募集，降低原位肿瘤的重量，增加抑癌率，可有效地防治皮肤黑色素瘤。与PD-1抑制剂联用，能够显著提高综合疗效，更有效抑制皮肤黑色素瘤的发生发展及其复发转移，提高患者的生活质量。
本发明采用的脆弱拟杆菌ZY-312不含BFT基因，是非产毒菌株，急性毒性证实，该菌株对正常小鼠和裸鼠均无致病性(Wang Y，Deng H，Li Z，Tan Y，Han Y，Wang X，Du Z，Liu Y，Yang R，Bai Y，Bi Y，Zhi F. Safety Evaluation of a Novel Strain of Bacteroides fragilis.Front Microbiol.2017 Mar 17；8:435.)。根据专利ZL201510459408.X和科技文献Xu W，Su P，Zheng L，Fan H，Wang Y，Liu Y，Lin Y，Zhi F.In vivo Imaging of a Novel Strain of Bacteroides fragilis via Metabolic Labeling.Front Microbiol.2018 Oct 1；9:2298.的报道，该菌株对胃酸、胆盐有着较好的耐性，能够保证其在胃中的存活和有效定植。
附图说明
图1为本发明实施例1的脆弱拟杆菌ZY-312的菌落特征图；
图2为本发明实施例4中各组对小鼠瘤体中CD8+效应T细胞数量的影响；
图3为本发明实施例4中各组对小鼠瘤体中CD4+CD25+Treg细胞数量的影响；
图4为本发明实施例4中各组对小鼠瘤体中IL-1的影响；
图5为本发明实施例4中各组对小鼠瘤体中IL-6的影响；
图6为本发明实施例4中各组对小鼠瘤体中IL-8的影响；
图7为本发明实施例4中各组对小鼠瘤体中VEGF的影响。
菌种相关信息：
本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已于2015年4月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏。分类命名：脆弱拟杆菌ZY-312(bacteroides fragilis ZY-312)，保藏编号CGMCC No.10685。脆弱拟杆菌ZY-312由本发明申请单位自行分离获得，并且已经在授权专利保护(专利号201510459408.X)，按照专利审查指南的规定，公众能够从商业渠道买到或已经授权，不用保藏，即不用提供保藏证明。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保 护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，所有细胞购自ATCC；所有细胞培养材料及胰酶购自Gibco；所有实验动物购自浙江维通利华实验动物技术有限公司；或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1：脆弱拟杆菌的发酵培养
将脆弱拟杆菌ZY-312菌种划线接种于血平皿，厌氧培养48h。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。
菌落特征：脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm之间，参见图1。
显微镜下形态：脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡。
选取单个菌落接种于植物源蛋白胨液体培养基中进行发酵培养8小时(温度为37℃)，所得菌液离心沉淀，转速3000r/min，离心15min，去上清，收集沉淀物，即得脆弱拟杆菌ZY-312菌泥。
实施例2：脆弱拟杆菌活菌液的制备
1)将菌种划线接种于血平皿，37℃、厌氧培养48h。
菌落特征：脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm。
2)增菌：从步骤1)中选取单个菌落接种于TSB(胰蛋白胨大豆肉汤，含5％胎牛血清)中进行增菌培养，所得菌液保存备用。
3)脆弱拟杆菌活菌液：将步骤1)制备的菌液，用麦氏比浊管做菌数测定，用生理盐水稀释至10 7CFU/ml和10 9CFU/ml，保存备用。用于以下实施例。
实施例3：脆弱拟杆菌的灭活菌粉的制备
(1)取实施例1制得的脆弱拟杆菌发酵液对发酵液进行离心处理，收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:(10～30)(m:v)比例加入生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心收集洗涤后的菌体；
(2)对步骤(1)所得菌体加入5％麦芽糊精+0.9％氯化钠混合成的赋形剂，按菌体：赋形剂＝1:(5～15)(m:m)比例进行添加，搅拌分散后在(70～100)±5℃热灭活(20～40)±5分钟，得灭活菌液；
(3)将步骤(2)所得的灭活菌液离心收集灭活菌泥。
(4)在步骤(3)收集的灭活菌泥中加入赋形剂使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；
(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经1次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉，菌粉的菌数达到1×10 11Cell/g以上。用于以下实施例。
实施例4：脆弱拟杆菌联合PD-1抑制剂治疗小鼠B16F10皮肤黑色素瘤模型的药效实验
肿瘤局部微环境中浸润淋巴细胞对肿瘤的演进起着不容小觑的作用。肿瘤程序性细胞死亡受体-1(PD-1)可通过与其配体的结合抑制T细胞活化，从而实现肿瘤的免疫逃逸。肿瘤免疫反应中CD8+效应T细胞承担主要的肿瘤杀伤活性，而微环境中聚集的调节性T细胞起着肿瘤免疫抑制的作用。大量研究显示，不同类型的肿瘤患者外周血中的调节性T细胞数量远高于正常人群，CD4+CD25+Treg细胞被认为是抗肿瘤免疫治疗中的主要阻碍。本实验观察了脆弱拟杆菌联合PD-1抑制剂(商品编号BE0146，购自BioXcell)治疗B16F10黑色素瘤小鼠模型中CD8+效应T细胞、调节性T细胞(Treg细胞)、肿瘤重量、抑瘤率、小鼠生存率及相关细胞因子的变化情况。
一、B16F10细胞培养
B16F10细胞生长于RPMI 1640完全培养基中(含有10％FBS和1％双抗)在37℃、5％CO 2的培养箱中培养。镜下观察，当细胞密度达80％左右时，加入2-3ml胰蛋白酶消化，将细胞悬液转移到50mL离心管中1000rpm离 心5min，弃上清液，加入5mL无抗生素的含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞。吸取10μL细胞悬液于1.5mL离心管中，加入10μL苔盼蓝染液混匀，取10μL混匀后的液体加入到细胞计数板中，上机进行计数。根据计数结果，调整细胞浓度为5×10 5cells/mL。置于冰上备用。
二、小鼠肿瘤模型建立
(1)瘤体接种
实验用7周雄性C57B6/L小鼠，待小鼠自然生长1周后，进行瘤体接种。分别给除正常对照组外全部小鼠接种肿瘤细胞，用鼠源性B16F10细胞进行下腹部皮下注射造模，注射细胞量为5×10 5cells/mL×0.2mL/只。观察小鼠肿瘤生长情况。
(2)建模成功标志
小鼠出现消瘦、弓背、精神萎靡等衰竭体征，小鼠接种部位可触及肿块。
三、小鼠体内实验
(1)实验分组：肿瘤体积达到约100mm 3时，选择肿瘤生长大小均匀的动物，按表1开始分组给药：
表1实验分组及给药方案
Figure PCTCN2022119441-appb-000006
Figure PCTCN2022119441-appb-000007
(2)给药方法：给药时间点为给药日的上午10点，联合用药组先给药PD-1抗体，再给药活菌/灭活菌。
(3)于瘤体接种后7、14、21天分别测量长径及短径长度以计算和记录瘤体体积，瘤体接种7天后开始给药，并于2周给药时间结束后，处死全部小鼠，无菌操作下剥离小鼠肿块，剥离的每组肿块称重，分别研磨为细胞悬液，700目过滤网过滤组织残渣后，PBS洗涤2遍，离心计数，每组标本取两管细胞样本分别上机检测CD8+效应T细胞、Treg细胞水平及细胞因子的水平。
(4)观察指标
CD8+效应T细胞、CD4+CD25+Treg细胞(Treg细胞)、肿瘤体积及重量、抑瘤率及细胞因子IL-1、IL-6、IL-8、VEGF。
四、实验结果
(1)肿瘤体积：瘤体接种后7、14、21天瘤体体积如表2所示。
表2.各组小鼠肿瘤体积表(
Figure PCTCN2022119441-appb-000008
n＝8)
Figure PCTCN2022119441-appb-000009
由表2可以看出，脆弱拟杆菌和PD-1抗体联合使用可以明显抑制肿瘤的 生长。
(2)肿瘤重量及抑瘤率
表3.各组小鼠肿瘤重量及抑瘤率(
Figure PCTCN2022119441-appb-000010
n＝8)
Figure PCTCN2022119441-appb-000011
注：与模型组组相比，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01
抑瘤率＝100％(模型组肿瘤平均重量-给药组肿瘤平均重量)/模型组肿瘤平均重量。
如表3所示，模型组的肿瘤平均重量显著高于其他组，其中PD-1组低于模型组(P＜0.05)，ZY-312组低于模型组(P＜0.05)；低、中、高剂量脆弱拟杆菌ZY-312联合PD-1抑制剂组均低于PD-1抑制剂组(P＜0.05)，其中高剂量脆弱拟杆菌ZY-312联合PD-1抑制剂组瘤体重量最低；高剂量脆弱拟杆菌ZY-312灭活菌联合PD-1抑制剂组低于PD-1抑制剂组(P＜0.05)；低、中剂量脆弱拟杆菌ZY-312灭活菌联合PD-1抑制剂组与PD-1抑制剂组均无统计学差异。
(3)CD8+效应T细胞
使用流式细胞计数分别分析各组处理给药结束后瘤体中CD8+效应T细胞占比。瘤体中CD8+效应T细胞，模型组高于生理盐水空白对照组(P＜0.001)，PD-1抑制剂组高于模型组(P＜0.001)，ZY-312组高于模型组(P＜0.01)；低、中、高剂量脆弱拟杆菌ZY-312联合PD-1抑制剂组均高于PD-1抑制剂组(P＜0.05)，其中高剂量脆弱拟杆菌ZY-312联合PD-1抑制剂组CD8+效应T细胞占比最高；高剂量脆弱拟杆菌ZY-312灭活菌联合PD-1抑制剂组高于PD-1抑制剂组(P＜0.05)；低、中剂量脆弱拟杆菌ZY-312灭活菌联合PD-1抑制剂组与PD-1抑制剂组无统计学差异。如图2所示。
(4)CD4+CD25+Treg细胞(Treg细胞)
使用流式细胞计数检测脾脏和瘤体中Treg细胞占比。如图3所示，瘤体Treg细胞，模型组显著高于生理盐水空白对照组(P＜0.001)，PD-1抑制剂组低于模型组(P＜0.01)，但高于生理盐水空白对照组(P＜0.001)，ZY-312组低于模型组(P＜0.05)；低、中、高剂量脆弱拟杆菌ZY-312联合PD-1抑制剂组均低于PD-1抑制剂组(P＜0.05)，其低中剂量脆弱拟杆菌ZY-312联合PD-1抑制剂组Treg细胞占比最低，但高于生理盐水空白对照组(P＜0.001)；低、中、高剂量脆弱拟杆菌ZY-312灭活菌联合PD-1抑制剂组均低于PD-1抑制剂组(P＜0.05)，其中高剂量脆弱拟杆菌ZY-312灭活菌联合PD-1抑制剂组Treg细胞占比最低，但高于生理盐水空白对照组(P＜0.001)。
(5)细胞因子
采用luminex技术检测皮肤黑色素瘤小鼠模型中IL-1、IL-6、IL-8、VEGF等细胞因子的水平。
图4-7分别为IL-1、IL-6、IL-8、VEGF的变化情况。相较于正常对照组，模型组中IL-1、IL-6、IL-8、VEGF等促炎因子显著升高(p＜0.001)。PD-1抑制剂能够有效调节上述细胞因子，下调IL-1、IL-6、IL-8、VEGF等促炎因子水平，说明脆弱拟杆菌ZY-312活菌及灭活菌均能够加强PD-1抑制剂效果。
以上结果说明了脆弱拟杆菌ZY-312及其灭活菌联合PD-1抑制剂可以显著改善小鼠B16F10黑色素瘤肿瘤微环境。

Claims (10)

  1. 一种产品组合，其特征在于，包括：
    (i)第一药物组合物，所述第一药物组合物含有(a)第一活性成分，所述第一活性成分为脆弱拟杆菌，以及药学上可接受的载体；和
    (ii)第二药物组合物，所述第二药物组合物含有(b)第二活性成分，所述第二活性成分为免疫检查点的抑制剂，所述免疫检查点选自以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA、A2aR；
    以及药学上可接受的载体；
    其中，所述的第一药物组合物和第二药物组合物为不同的药物组合物，或同一药物组合物。
  2. 根据权利要求1所述的产品组合，其特征在于，所述脆弱拟杆菌是活菌、形态结构完整的灭活菌或形态结构不完整的灭活菌中的一种及以上；
    优选地，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。
  3. 根据权利要求1或2所述的产品组合，其特征在于，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。
  4. 根据权利要求1-3任一项所述的产品组合，其特征在于，所述免疫检查点的抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、或其组合；
    优选地，所述抗体选自以下中的一种或多种：纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)。
  5. 根据权利要求1-4任一项所述的产品组合，其特征在于，所述含有脆弱拟杆菌的第一药物组合物与含有所述免疫检查点抑制剂的第二药物组合物同时或分别给药；
    优选地，所述的药物组合物的剂型包括注射剂型、外用药物剂型和口服剂 型。
    进一步优选地，所述药物组合物可以通过皮下注射、静脉注射、肌内注射的方式给药；
    进一步优选地，所述口服剂型包括片剂、胶囊剂、膜剂、和颗粒剂；
    优选地，所述的药物组合物的剂型包括缓释型剂型、和非缓释型剂型。
  6. 一种药物组合物，其特征在于，包括：
    (i)药学有效剂量的脆弱拟杆菌；
    (ii)免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点选自以下中一种或多种：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、VISTA、A2aR；和
    (iii)药学上可接受的载体。
  7. 根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述脆弱拟杆菌是活菌、形态结构完整的灭活菌或形态结构不完整的灭活菌中的一种及以上；
    优选地，所述脆弱拟杆菌是脆弱拟杆菌活菌体，经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理或灭活的脆弱拟杆菌，脆弱拟杆菌裂解物，脆弱拟杆菌液体培养上清液中的一种或多种。
  8. 根据权利要求6或7所述的组合物，其特征在于，所述脆弱拟杆菌为保藏编号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312；
    优选地，所述(i)药学效剂量为10 5-10 10CFU。
  9. 根据权利要求6-8任一项所述的组合物，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、或其组合；
    优选地，所述抗体选自以下中的一种或多种：纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、西米普利单抗(Cemiplimab)、特瑞普利单抗(Toripalimab)、信迪利单抗(Cindilimab)、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)阿特朱单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)。
  10. 权利要求1-5任一项所述的产品组合、权利要求6-9任一项所述的药物组合物在制备治疗皮肤肿瘤的药物中的应用；
    优选地，所述皮肤肿瘤包括黑色素瘤、鳞状细胞癌和基底细胞癌。
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