WO2017071347A1 - 一种脆弱拟杆菌在预防和/或治疗炎症性肠病中的应用 - Google Patents

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WO2017071347A1
WO2017071347A1 PCT/CN2016/092386 CN2016092386W WO2017071347A1 WO 2017071347 A1 WO2017071347 A1 WO 2017071347A1 CN 2016092386 W CN2016092386 W CN 2016092386W WO 2017071347 A1 WO2017071347 A1 WO 2017071347A1
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bacteroides fragilis
group
inflammatory bowel
bowel disease
treatment
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智发朝
白杨
王晔
刘洋洋
王从峰
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to the field of microbial technology, in particular to the use of Bacteroides fragilis ZY-312 for the prevention and/or treatment of inflammatory bowel diseases, including the preparation of pharmaceuticals, pharmaceutical compositions, foods, health products and food additives. Background technique
  • IBD Inflammatory bowel disease
  • UC Ulcerative colitis
  • CD Crohn's disease
  • the former also known as non-specific ulcerative colitis, is an unexplained inflammation of the rectum and colon.
  • the lesions are mainly limited to the large intestine mucosa and submucosa.
  • the latter is a chronic granulomatous inflammation, which can affect all parts of the gastrointestinal tract, but mainly in the terminal ileum and adjacent colon, mostly in segmental and asymmetrical distribution (Jiang Weiru. Understanding of inflammatory bowel disease) And treatment progress [J]. Shanghai Medical, 2010, 05: 207-210.).
  • IBD has different incidence rates in different countries, regions, and ethnic groups, and has significant geographical and ethnic differences.
  • Molodecky et al (Molodecky NA, Soon IS, abi DM, et al. Increasing Based on systematic review [J] . Gastroenterology , 2012, 142 ( 1 ): 46-54. ) Searched the literature on IBD epidemiological studies from 1950 to 2010, and the results showed that the highest incidence rates of UC in Europe, Asia, and North America were respectively 2.43/100,000, 6.3/100,000, 19.2/100,000; the highest incidence of CD is
  • the age of onset of IBD in western countries is mostly bimodal.
  • the first age of onset of UC is 30-39 years old, CD is 20-29 years old, and the second age of onset of UC and CD is 60-70 years old.
  • the number of peak cases is large.
  • the second highest age of onset of IBD in Asian countries is rare, and the peak age of UC and CD is 10 years lower than in Western countries.
  • Inflammatory bowel disease currently lacks effective treatments, and its therapeutic drugs include the following categories:
  • SASP Sulfasalazine
  • GCS ulcerative colitis
  • azathioprine azathioprine
  • 6-MP 6-mercaptopurine
  • MTX methotrexate
  • CsA cyclosporine A
  • FK506 tacrolimus
  • MMF mycophenol
  • aminosalicylic acid preparations adrenal glucocorticoids and immunosuppressive agents have good curative effect in most cases, the efficacy and safety of these drugs have a certain degree of limitation.
  • monoclonal antibody therapy has become a new direction of research.
  • Infliximab (IFX)-human-mouse chimeric TNF- ⁇ monoclonal antibody was introduced in the 1990s. The clinical application of more than 10 years has confirmed that it improves the clinical symptoms and endoscopic lesions of CD in activity or remission. Excellent results in ulcers and fistula healing. Because IFX is not listed in China for a short time, its application indications are only CD and its complications, but it has been used abroad for patients with moderate or severe UC who are ineffective or intolerant to hormones and immunosuppressive agents.
  • Antibiotics should be used for IBD patients and critically ill patients with bacterial infections. Penicillins, tobramycin, new cephalosporins and cephalosporins can be used as appropriate.
  • metronidazole has also been widely used in the treatment of IBD. Metronidazole can inhibit intestinal anaerobic bacteria and has immunosuppressive effects, affecting leukocyte chemotaxis, and has good effects on UC and CD. It can promote fistula healing. And to prevent recurrence, adverse reactions such as nausea, vomiting, and paresthesia, can be considered as a second-line drug when GCS or SASP is ineffective.
  • microecological preparations have been applied to improve intestinal microenvironment, restore normal body flora, and down-regulate immune response to control intestinal Inflammation of the tract and maintenance of remission.
  • Microecological preparations include probiotics, prebiotics and synbiotics.
  • Probiotics are preparations containing a specific amount of live bacteria; prebiotics are functional oligosaccharides, which are not easily digested and absorbed by the human body, but can be absorbed and utilized in the intestinal tract by the beneficial bacteria of the intestinal tract, promoting The role of Bifidobacterium; Synbiotics is a mixed preparation of probiotics and prebiotics, or added vitamins, trace elements and so on.
  • VSL3 has a certain therapeutic effect on UC (Bibiloni R, Fedorak N, Tannock GW, et al. VSL#3 probiotic-mixture induces remission in patients with active ulcerative colitis. Am J Gastroenterol, 2005. 100: 1539-1546. ) .
  • Embacker et al embackers BJ. Non-pathogenic escherichia coli versus mesalazine for the treatment of ulcerative colitis: a randomized trial [J] . Lancet,
  • Non-pathogenic Escherichia coli is as effective as mesalamine in maintaining remission.
  • Bacteroides fragilis is a member of the genus Bacteroides in Gram-negative anaerobic bacteria, belonging to the genus Bacteroides, which is completely different from the Bifidobacteria and lactic acid bacteria of the thick-walled bacteria. There are 25 strains of Bacteroides, 10 strains from humans only, 10 strains from animals, and 5 strains from humans and animals.
  • Bacteroides fragilis is an obligate anaerobic bacterium.
  • the morphology of the cells is polymorphic depending on the medium and the growth stage. Under normal conditions, the cells are rod-shaped, the ends are obtuse, and the coloration is deep. Shallow and uneven, with capsules, no spores, no power, some with vacuoles, and different lengths of bacteria. According to whether it can synthesize and secrete Bacteroides fragilis enterotoxin (BFT), it can be divided into enterotoxin-producing Bacteroides fragilis (Enterotoxigenic Bacteroides fragilis, ETBF) and non-toxin-producing Bacteroides fragilis (NTBF).
  • BFT Bacteroides fragilis enterotoxin
  • ETBF enterotoxin-producing Bacteroides fragilis
  • NTBF non-toxin-producing Bacteroides fragilis
  • Bacteroides fragilis is part of the normal flora of human and animal gut, mainly in the colon. In addition, the respiratory tract, gastrointestinal tract and genitourinary mucosa can also colonize and grow. Bacteroides fragilis acts as a conditional pathogen. When the host mucosa is damaged, it can invade the submucosa, cause infection, and can also flow through the blood, causing other organs of the body, such as the intestines, abdominal cavity, liver, lungs, brain tissue, A purulent infection of soft tissue, bone marrow, etc. with an abscess.
  • Zhang Jijie isolated a Bacteroides strain BF839 from the well-developed infant or the intestine of a younger animal. It can be used as a live bacterial preparation to increase the growth and development of children. It can prevent acute and chronic enteritis, dysbacteriosis, upper respiratory tract infection and neurological function. Symptoms and other diseases have good curative effect (see Chinese invention patent application with the publication number CN1056314A; and: Zhang Jijie, et al. Clinical application research of Bacteroides fragilis (BF839) bacterial liquid. Chinese Journal of Biological Products, 1995, Vol. 8, No. 2, pp. 63-65). In 2012, Zhifa Chao et al.
  • Bd312 Bacteroides fragilis strain with a probiotic characteristic from the feces of the fetus (deposited as CGMCC NO.7280), which can be used to treat inflammatory bowel disease, diarrhea, etc.
  • CGMCC NO.7280 a Bacteroides fragilis strain with a probiotic characteristic from the feces of the fetus (deposited as CGMCC NO.7280), which can be used to treat inflammatory bowel disease, diarrhea, etc.
  • CGMCC NO.7280 Bacteroides fragilis strain
  • strain Bd312 further identified the strain Bd312 and found that the strain Bd312 is in bacterial morphology, culture characteristics, physiological and biochemical reaction results and fragile Similarly, BLASTN sequence alignment, the isolated strain Bd312 and the Bacteroides fragilis standard strain ATCC25285 homology of 99%, drug sensitivity experiments suggest that strain Bd312 on cefradine, amoxicillin, gentamicin, sulfamethoxazole , Trimethoprim sensitive, acute and chronic toxicity test suggests no toxicity (see Liu Yangyang, et al. Isolation and identification of non-toxic fragile Bacteroides in healthy infants. Chinese Journal of Medicine, 2014, Vol. 94, No. 30, No. 2372-2374 pages).
  • the technical problem to be solved by the present invention is to provide an application of Bacteroides fragilis ZY-312 for preventing and/or treating inflammatory bowel disease, and providing a pharmaceutical composition for preventing and/or treating inflammatory bowel disease, Food, health care products and food additives, all of which contain the Bacteroides fragilis ZY-312.
  • the present invention provides a use of Bacteroides fragilis for the preparation of a medicament for preventing and/or treating inflammatory bowel disease, wherein the Bacteroides fragilis is deposited as CGMCC
  • the medicament comprises a pharmaceutically effective amount of Bacteroides fragilis ZY-312 and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is milk powder, lactose, cyclodextrin, maltose, glucose, glycerin, sodium glutamate, vitamin C, mannose, galactose, mannitol or methyl fiber Prime.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing and/or treating inflammatory bowel disease, wherein the pharmaceutical composition contains a pharmaceutically effective dose of a deposit number of
  • composition wherein the pharmaceutically effective dose is 10 6 -10 1Q CFU.
  • the present invention also provides a food for preventing and/or treating inflammatory bowel disease, wherein the food contains Z. fragrans ZY-312 having a deposit number of CGMCC No. 10685.
  • the present invention also provides a health care product for preventing and/or treating inflammatory bowel disease, wherein the health care product contains Bacteroides fragilis ZY- with the accession number CGMCC No. 10685. 312.
  • the present invention also provides a food additive for preventing and/or treating inflammatory bowel disease, wherein the food additive contains Bacteroides fragilis ZY- with the accession number CGMCC No. 10685 312.
  • the present invention proves that the strain has good preventive and therapeutic effects on antibiotic-associated diarrhea, obesity, diabetes, meningitis, etc. through experiments in vivo and in vitro. It has excellent resistance to inflammatory bowel disease, including ulcerative colitis or Crohn's disease, and has no toxic side effects, and can be used persistently and effectively for the prevention and/or treatment of inflammatory bowel disease.
  • Bacteroides fragilis ZY-312 of the present invention it can be prepared into medicines, foods, health products or The form of food additives.
  • the drug, food, health supplement or food additive contains Bacteroides fragilis
  • 1 is a diagram showing changes in DAI scores of rats in each group according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a graph showing changes in colonic tissue damage scores of rats in each group according to an embodiment of the present invention.
  • Bacteroides fragilis ZY-312 was deposited with the China General Microorganisms Collection and Management Center (CGMCC) on April 2, 2015, and its deposit number is CGMCC No. 10685.
  • the deposit address is Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing. No. 3 on the 1st. detailed description
  • the number is more than 400, among which Bifidobacterium and Lactobacillus acidophilus are the main ones. It accounts for more than 98% of the total amount of microorganisms. Usually, under normal conditions, the microorganisms in the intestines are in a relatively balanced state. Once imbalanced, the flora imbalance can lead to related diseases. It is currently believed that intestinal flora imbalance may be a key factor in IBD induction and recurrence.
  • the present invention detects and identifies the action of Bacteroides fragilis in various disease models, and it is found for the first time that Bacteroides fragilis ZY-312 has excellent preventive and/or therapeutic effects on inflammatory bowel disease.
  • the Bacteroides fragilis ZY-312 of the present invention the accession number is CGMCC No. 10685, and the application in the prevention and/or treatment of inflammatory bowel diseases specifically includes:
  • Bacteroides fragilis in the preparation of a medicament for preventing and/or treating inflammatory bowel disease, wherein The medicament contains a pharmaceutically effective dose.
  • the pharmaceutically effective dose is 10 6 -10 1Q CFU, which is excellent.
  • Bacteroides fragilis ZY-312 10 9 CFU of Bacteroides fragilis ZY-312 and pharmaceutically acceptable carrier (milk powder, lactose, cyclodextrin, maltose, glucose, glycerol, sodium glutamate, vitamin C, mannose, galactose, mannitol , methyl cellulose, etc.).
  • pharmaceutically acceptable carrier milk powder, lactose, cyclodextrin, maltose, glucose, glycerol, sodium glutamate, vitamin C, mannose, galactose, mannitol , methyl cellulose, etc.
  • the inflammatory bowel disease is usually ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • Bacteroides fragilis ZY-312 can also be used for preparing a pharmaceutical composition for preventing and/or treating inflammatory bowel disease, wherein the pharmaceutical composition contains a pharmaceutically effective dose of Bacteroides fragilis ZY-312, the pharmaceutically effective dose It is 10 6 -10 1Q CFU.
  • Bacteroides fragilis ZY-312 can also be used to prepare foods, health products and food additives for preventing and/or treating inflammatory bowel diseases, etc., and the foods, health products and food additives can be added to a certain proportion of Bacteroides fragilis ZY- 312 ingredients.
  • Bacteroides fragilis ZY-312 of the present invention in the prevention and/or treatment of inflammatory bowel disease is further illustrated by the following specific examples:
  • the viable count is 10 times serial dilution:
  • Viable count sum of three spotted colonies /3 ⁇ 50 ⁇ dilution
  • Training method Step 1 Take a freeze-preserved strain (ZY-312, Bd-312, ATCC25285 the same method), add 20 ( ⁇ L TSB medium, reconstitute, absorb 2 ( ⁇ L blood plate, anaerobic tank) The gas control system is pumped in a biochemical incubator at 37 ° C, anaerobic culture for 48 h;
  • Step 2 Pick the monoclonal colonies into lOmL TSB medium, add 5% (v/v) peptide bovine serum, and incubate in a biochemical incubator at 37 ° C for 12 h.
  • Step 3 Take 1 bottle of 500mL TSB medium, add 5% (v/v) peptide bovine serum, and connect to 1% (v/v) strain, and incubate in biochemical incubator at 37 °C for 48 hours. ;
  • Step 4 Centrifuge the bacteria solution, centrifuge with a centrifuge, and centrifuge at 6000 rpm for 10 min. Wash twice with physiological saline, and finally reconstitute the bacterial sludge with physiological saline for use and count the viable bacteria.
  • Example 2
  • the rat model of chronic ulcerative colitis was induced by 5% DSS (dextran sulfate sodium, DSS, purchased from Sigma). 70 SD rats were randomly divided into the following 7 groups:
  • the normal control group, the model group, the mesalazine group, the ZY-312 group, the Bd-312 group, the ATCC25285 group, and the combined group (ZY-312+ mesalazine) were tested for the efficacy of each intervention group by DAI score and tissue damage score.
  • the animal group table is as follows:
  • C is the mesalazine group 10
  • D is the ZY-312 group 10
  • E is the Bd-312 group 10
  • F is the ATCC25285 group 10
  • G is the joint group 10 1.
  • Experimental animal model is the experimental animal model
  • Ten SD rats were used as normal control group, and the other 60 rats were randomly divided into 6 groups, 10 rats in each group, which were model group, mesalazine group, ZY-312 group, Bd- 312 groups, ATCC25285 group and combination group (ZY-312+ mesalazine), dose design: ZY-312, Bd-312, ATCC25285, both 5xl0 9 CFU/only; mesalazine, O ⁇ g/Kg ⁇ T 1 ; model group only modeled without administration; combined group ZY-312 containing 5xl0 9 CFU / mesalamine, O g / Kg - 1 ; after the successful modeling, began to administer, once a day, Continuous gavage for 1 week.
  • the large intestine was washed with pre-cooled saline, and 0.5 cm of the large intestine was cut at the end of the large intestine 1 cm from the anus, soaked in 4% paraformaldehyde, embedded in paraffin, sectioned, and stained with HE for pathological examination. The rest of the colon tissue was scored for histopathology. The degree of histological damage is expressed as the product of inflammation, depth of lesion, crypt destruction, and lesion range score, and the mean is taken as a colon histological damage score.
  • the rats in the model group had reduced food intake, dry hair, arched back and tailing, loose stools, and some blood in the anus;
  • Rats in the ATCC25285 group were less smooth, less active, and inflexible;
  • ZY-312 group was significantly better than Bd-312 group, ATCC25285 group and mesalazine group;
  • the combination group was significantly better than the Bd-312 group, the ATCC25285 group, and the mesalazine group, which was similar to the ZY-312 group.
  • FIG. 2 is a diagram showing changes in colonic tissue damage scores of rats in each group according to an embodiment of the present invention, specifically, colonic inflammatory infiltration score, lesion depth score, crypt destruction, and overall tissue injury score on day 7 of each group of rats. Histogram.
  • the histological injury score was 0 in the normal control group and 9.01 in the model group.
  • the histological injury scores of the mesalazine group, the ZY-312 group, the Bd-312 group, the ATCC25285 group, and the combined group were 7.12, 6.31, 8.87, 8.93, 5.69, respectively, and the ZY-312 group, the combined group and the model group were significantly different (PO). .01 ) , where the joint group works best.
  • the experimental results show that the Bd-312 and ATCC25285 groups are similar to the model group, and the effect is not obvious during the treatment.
  • the mesalazine group can significantly reduce the DAI score and colon tissue damage score in rats, but compared with the model group, the ZY-312 group and the combined group can significantly reduce the DAI score and colon tissue damage score in rats, and is superior to the US.
  • Salsalazine group When ZY-312 is combined with mesalazine, the effect is remarkable.
  • ZY-312 promotes the immune recovery of the body by up-regulating the intestinal immune function, thus effectively correcting the anti-inflammatory and anti-inflammatory dynamic imbalance and reducing the inflammatory response. Reduced release of inflammatory factors.
  • the results of the experiment fully demonstrate the advantages of the ZY-312 group and the combination group in the treatment of inflammatory bowel disease, and ZY-312 is significantly superior to other strains of Bacteroides fragilis (such as Bd-312 and ATCC25285).
  • the present invention proves that the strain has good preventive and therapeutic effects on antibiotic-associated diarrhea, obesity, diabetes, meningitis, etc. through experiments in vivo and in vitro. It has excellent resistance to inflammatory bowel disease, including ulcerative colitis or Crohn's disease, and has no toxic side effects, and can be used persistently and effectively for the prevention and/or treatment of inflammatory bowel disease.
  • the form of a drug, food, health supplement or food additive can be prepared using the Bacteroides fragilis ZY-312 of the present invention.
  • the drug, food, health supplement or food additive contains Bacteroides fragilis ZY-312. These drugs, foods, health supplements or food additives can be used for the prevention and treatment of inflammatory bowel disease and have great application value.

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Abstract

提供了一种脆弱拟杆菌ZY-312在预防和/或治疗炎症性肠病中的应用，包括脆弱拟杆菌ZY-312用于制备预防和/或治疗炎症性肠病的药物、药物组合物、食品、保健品及食品添加剂等的应用。

Description

一种脆弱拟杆菌在预防和 /或治疗炎症性肠病中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域， 特别是脆弱拟杆菌 ZY-312在预防和 /或治 疗炎症性肠病中的应用， 包括制备药物、 药物组合物、 食品、 保健品及食品 添加剂等的应用。 背景技术
炎症性肠病 （Inflammatory bowel disease, IBD) 是一组不明原因的慢性 肠道炎症性疾病， 包括溃疡性结肠炎 （Ulcerative colitis, UC ) 和克罗恩病 ( Crohn's disease, CD) 。 前者又称非特异性溃疡性结肠炎， 是一种原因不明 的直肠和结肠的炎症， 病变主要限于大肠黏膜与黏膜下层。 后者为一种慢性 肉芽肿性炎症， 病变可累及胃肠道各部位， 而以末段回肠及临近结肠为主， 多呈节段性、 非对称性分布（蒋蔚茹. 炎症性肠病的认识与治疗进展 [J]. 上海 医药, 2010,05:207-210. ) 。 炎症性肠病的发病机制尚未阐明， 目前认为是基因 上易感人群对肠道共生微生物产生过度的先天或后天免疫反应所致 （蒋蔚茹. 炎症性肠病的认识与治疗进展 [J]. 上海医药, 2010,05:207-210. ) 。 肠黏膜屏障 功能损伤参与了 IBD的发生 （毛靖伟,王英德. 肠黏膜屏障在炎症性肠病中作 用机制的研究进展 [J]. 世界华人消化杂志, 2010,07:695-698. ) 。
IBD在不同国家、 地区、 种族人群中的发病率不同， 有显著的地域和种族 异。 Molodecky等 (Molodecky NA, Soon IS, abi DM, et al. Increasing
Figure imgf000003_0001
based on systematic review [J] . Gastroenterology , 2012， 142 ( 1)： 46-54. ) 检索了 1950-2010年有关 IBD流行病学研究的文献， 结果显示欧洲、 亚洲、 北美洲 UC 最高发病率分别为 24.3/10万、 6.3/10万、 19.2/10万； CD最高发病率分别为
12.7/10万、 5.0/10万、 20.2/10万。 欧洲、 北美洲 UC最高患病率分别为 505 /10 万、 249 /10万； CD最高患病率分别为 322/10万、 319/10万。 可见 IBD在亚洲的 发病率低于欧美国家。据报道日本 UC、 CD 的发病率分别为每年 0.5人 /10万和 0.08人 /10万 （陆星华. 克罗恩病的诊断和治疗 [J] . 中华消化内镜， 2007， 1(6) ： 26-35. ) 。 近 20年来， IBD病例数在国内迅猛增加。 1989-2007年间我国 IBD文献报道 病例数逐渐增多（Hu RW， Ouyang Q, Chen X et al. Analysis of the articles of inflammatory bowel disease in the literature China in recent fifteen years
[J] . Chin J Gastroenterol, 2007， 12:74-77. )。 Jiang等（Jiang XL, Cui HF . An analysis of 10218 ulcerative colitis cases in China [ J] . World J Gastroenterol , 2002， 8 ( 1) : 158-161. )分析了 1981-2000年国内文献报道的 10218例 UC患者， 发现 10年间病例数上升了 3.08倍。 Wang等 （Wang Y, Ouyang Q; APDW 2004 Chinese IBD working grou . Ulcerative colitis in China: retrospective analysis of 3100 hospitalized patients [J] . J Gastroenterol Hepatol , 2007， 22 ( 9) :
1450-1455. ) 和中国 IBD工作组 （APDW 2004 Chinese IBD Working
Grou . Retrospective analysis of 515 cases of Crohn's disease hospitalization in China: nationwide study from 1990 to 2003 [J] . J Gastroenterol Hepatol, 2006， 21 ( 6) : 1009-1015. ) 对1990-2003年间 IBD住院患者进行回顾性研究， 共收集 3100例 UC和 515例 CD患者， 结果显示我国 IBD住院患者呈逐渐增加趋 势， 粗略推测 UC患病率约为 11.6/10万， CD约为 1.4/10万， 增长情况与日本、 韩国、 新加坡等国家相似。
西方国家 IBD 发病年龄多呈双峰状分布， UC 第一个发病年龄高峰为 30-39岁， CD 为 20-29岁， UC和 CD第二个发病年龄高峰为 60-70岁， 以第 一个高峰病例数为多。亚洲国家 IBD发病年龄第二高峰少见， UC和 CD发病 年龄高峰较西方国家延迟 10年。
两项我国多中心研究显示， 3100例 UC患者中 19例 （0.6%) 死亡， 515 例 CD 患者中 7例 （1.4%) 死亡， 死亡率明显低于西方国家。
炎症性肠病目前尚缺乏有效的治疗手段， 其治疗药物包括以下几类：
( 1 ) 氨基水杨酸类制剂
从 20世纪 30年代以来， 柳氮磺吡啶（Sulfasalazine, SASP)一直是治疗
IBD 的有效药物， 但其代谢产物磺胺吡啶会产生不良反应。 现已研究出新型 制剂如缓控释制剂、 局部治疗制剂提高其在结肠的浓度， 从而发挥最大效益， 并降低药物的毒副作用。
(2 ) 肾上腺糖皮质激素 （GCS )
GCS 是单一应用最为有效的抑制急性活动性炎症的药物， 近期疗效好， 有效率可达 90%， 它能够控制炎症、 抑制自身免疫反应、 减轻中毒症状。 常 用药物有氢化可的松、 地塞米松和泼尼松等， 但该类药物长期使用易产生不 良反应。 目前已有新一代 GCS制剂问世， 如布地奈德 （Budesonide) 、 二丙 酸倍氯松和巯氢可的松等， 此类药物抗炎作用强， 而全身副反应少。另外 IBD 的治疗还有多种局部治疗剂， 如灌肠剂、 泡沬剂及栓剂， 局部用药大大减轻 了全身的副反应。
(3 ) 免疫抑制剂
传统免疫抑制剂包括： 硫唑嘌呤 （AZA) 、 6 - 巯基嘌呤 （6 - MP)及氨 甲蝶呤 （MTX) 等。 这些免疫抑制剂也可用于 IBD 的治疗， 总体来说是有 效的， 但不是对所有 IBD患者均有效， 而且不良反应较多。 新型免疫抑制剂， 如环孢素 A (CsA) 、 他克莫司 （FK506 )和霉菌酚（MMF )等对 IBD有效， 但其疗效和安全性尚有待于进一步评价。
(4 ) 单克隆抗体
氨基水杨酸类制剂、 肾上腺糖皮质激素和免疫抑制剂虽然对大多数病例 有较好的疗效， 但上述药物的有效性和安全性均具有一定程度的局限性， 随 着对 IBD发病机制研究的深入， 单克隆抗体治疗成为研究的新方向。
20 世纪 90年代英夫利昔 （Infliximab, IFX) -人鼠嵌合型 TNF-α单抗问 世， 10 余年的临床应用证实其无论对活动性或缓解期 CD在临床症状、 内镜 下病变改善、 溃疡及瘘管愈合等方面均有卓越疗效。 由于 IFX在国内上市时 间尚短，其应用适应证仅为 CD及其并发症，但在国外已用于激素及免疫抑制 剂无效或不能耐受的中、 重度 UC 患者。 随着 IFX临床应用经验的不断积累 以及纯人源化抗 TNF-a的 IgG单抗阿达姆 （Adalimumab ) 、 人源化抗 α24整 联蛋白（Integrin)的 IgG4单抗 Natalizumab和聚乙二醇化人抗 TNF-α抗体 Fab 片段产品赛妥珠 （Certolizumab Pegol ) 等新一代药物的出现， 单克隆抗体的 疗效越来越被人们所认同。 许多大型临床对照研究均证实， 单克隆抗体不但 在诱导缓解方面疗效明显优于传统药物， 而且在维持治疗中也有巨大的优势 ( Colombel JF， KammMA, SchwartzD, et al. Sustainability of adalimumab in fistula healing and response ： 2 year data from CHARM and 12-month open-label extension follow-up study [ J] . Am J Gastroenterol, 2007， 102(11): 2541-2550. )。 目前普遍的做法是： 对于中、 重度 IBD和高危病人， 若传统药物无效， 则立 即采用单克隆抗体诱导缓解。
限制单克隆抗体应用的原因除价格昂贵， 潜在的危险性也是重要因素。 如使用 IFX的病人罹患结核或组织胞浆菌病等感染的可能性明显增加。此外， 神经系统脱髓鞘病变、 充血性心力衰竭以及淋巴瘤等疾病的患病率也有提高。
( 5 ) 抗生素
对有细菌感染的 IBD患者和重症患者应选用抗生素， 青霉素类、 妥布霉 素、 新型头霉素和头孢菌素均可酌情选用。 近年来， 甲硝唑也广泛用于 IBD 的治疗， 甲硝唑可抑制肠内厌氧菌并有免疫抑制、 影响白细胞趋化等作用， 对 UC和 CD均有良好效果，它能促进瘘管愈合和预防复发，不良反应有恶心、 呕吐、 肢端感觉异常等， 目前作为二线药物在 GCS或 SASP无效时可考虑使 用。
(6 ) 微生态制剂
由于肠道菌群失调和腔内抗原剌激是 IBD触发和复发的重要原因，近 10 年来开始应用微生态制剂以改善肠道微环境， 恢复机体正常菌群、 下调免疫 反应， 以达到控制肠道炎症及维持缓解的目的。 微生态制剂包括益生菌、 益 生元和合生元制剂。 益生菌为含有特定的充足数量活菌的制剂； 益生元为功 能性低聚糖， 它不易被人体消化吸收， 却可在肠道被肠道的有益菌双岐杆菌 吸收和利用， 起到促进双岐杆菌的作用； 合生元是益生菌与益生元的混合制 剂， 或加入维生素、 微量元素等。
人类应用益生菌虽有百余年历史， 但真正应用于临床还是最近几十年才 开始。 Kmis等 (Kruis W， Fric P,Pokrotnieks J,et al. Maintaining remission of ulcerative colitis with the probiotic Escherichia coli Nissle 1917 is as effective as with standard mwsalazine. Gut,2004.53: 1617-1623. )在 327例 UC患者维持治疗 中比较美沙拉嗪和益生菌的治疗效果。 两组患者分别口服美沙拉嗪 50mg (3 次 /d) 和大肠埃希菌 Nisslel917 ( 1 次 /d) 。 两组的复发率、 缓解天数及疾病 活动指数相接近， 说明益生菌治疗可取得与抗炎药物相似的疗效， 且无药物 副作用。 给予 18例活动期 UC患者长双歧杆菌和菊粉、 寡果糖治疗 1个疗程 后， 治疗组的乙状结肠镜评分降低， 而安慰剂组无改善， 治疗组临床症状改 善 (Furrie E， Macfarlane S, Kennedy A,et al. Synbiotic therapy(Bifidobacterium longum/Synergy l)initiates resolution of inflamation in patients with active ulcerative colitis: a randomised controlled pilot trial. Gut,2005. 54:242-249. ) 。 传 统药物治疗无反应的 34例轻、中度活动期 UC患者接受一种益生菌制剂 VSL3 治疗， 缓解率为 53%， 24%患者有反应。 说明 VSL3对 UC有一定的治疗作用 ( Bibiloni R， Fedorak N, Tannock GW, et al. VSL#3 probiotic-mixture induces remission in patients with active ulcerative colitis. Am J Gastroenterol,2005. 100: 1539-1546. ) 。
embacken 等 ( embackers BJ. Non-pathogenic escherichia coli versus mesalazine for the treatment of ulcerative colitis: a randomized trial [J] . Lancet,
1999， 354(9) ： 635-639. ) 在 116例活动性 UC患者中采用随机对照双模拟 法比较了美沙拉嗪和大肠埃希菌的疗效和维持缓解的效果。 结果美沙拉嗪组 的缓解率为 75%，大肠埃希菌组为 68%;达到缓解的天数美沙拉嗪组为 44天， 大肠埃希菌组为 42天； 复发率美沙拉嗪组为 73%， 大肠埃希菌组为 67%; 平 均缓解天数美沙拉嗪组为 206天 （中位数为 175天） ， 大肠埃希菌组为 221 天 （中位数为 185 天） ， 故提示在维持缓解方面， 非致病性大肠埃希菌与美 沙拉嗪同样有效。
综上， 说明一些临床研究证实益生菌治疗 IBD的疗效。 肠道菌群与 IBD 发病密切相关，随着对肠道黏膜免疫系统及 IBD遗传易感性研究的不断完善， 微生态制剂在用于治疗 IBD方面将非常有前景。
传统药物如氨基水杨酸类制剂、 糖皮质激素、 免疫抑制剂等不良反应较 多， 而单克隆抗体药物又价格昂贵； 微生态制剂因其对其他细菌具有明显的 调节作用和较少的毒副作用而逐渐成为 IBD治疗的新手段， 也成为目前研究 的热点。
脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis)是革兰氏阴性厌氧细菌中拟杆菌属的成 员， 属于拟杆菌门， 完全不同于厚壁菌门的双歧杆菌、 乳酸菌等。 拟杆菌属 有 25个菌种， 仅来自人类的有 10个菌种， 仅来自动物的有 10个菌种， 来自 人和动物的有 5个菌种。
脆弱拟杆菌是一种专性厌氧细菌， 依培养基的不同和生长阶段的不同， 菌体形态呈现多形性， 一般条件下菌体为杆状、 两端钝圆、 着色深， 中间色 浅且不均匀， 有荚膜、 无芽胞、 无动力， 有些有空泡， 菌体长短不一。 依据 能否合成、分泌脆弱拟杆菌肠毒素（BFT )可将其分为产肠毒素型脆弱拟杆菌 ( Enterotoxigenic Bacteroides fragilis, ETBF ) 和非产肠毒素型脆弱拟杆菌 (NontoxigenicBacteroides fragilis, NTBF )。脆弱拟杆菌作为人及动物肠道正 常菌群的一部分， 主要存在于结肠中。 此外， 呼吸道、 胃肠道及泌尿生殖道 粘膜也可定植生长。 脆弱拟杆菌作为一种条件致病菌， 当宿主粘膜受损时， 可侵犯粘膜下层， 引起感染， 也可经血液流动， 引起身体其它器官， 如肠道、 腹腔、 肝、 肺、 脑组织、 软组织、 骨髓等的化脓性感染并伴发脓肿。
本领域已经对脆弱拟杆菌进行了大量研究。 张季阶从发育良好的婴儿或 低龄动物肠道中分离出一种拟杆菌菌株 BF839, 将其制成活菌制剂后能够增 加儿童生长发育， 对防治急慢性肠炎、 菌群失调、 上呼吸道感染和神经官能 症等具有较好疗效 （参见公开号为 CN1056314A的中国发明专利申请； 及： 张季阶，等. 脆弱拟杆菌 (BF839) 菌液的临床应用研究. 中国生物制品学杂志， 1995年， 第 8卷， 第 2期， 第 63-65页） 。 智发朝等在 2012年从婴儿粪便中 分离出一种具有益生菌特性的脆弱拟杆菌菌株 （称为 Bd312 ) (保藏编号为 CGMCC NO.7280 ) ， 可用于治疗炎症性肠病、 腹泻等 （参见公开号为 CN103146620A, CN103142658A, CN103156888A 的中国发明专利申请） ； 此外， 智发朝等还对该菌株 Bd312进行了进一步鉴定， 发现该菌株 Bd312在 细菌形态、 培养特性、 生理生化反应结果与脆弱拟杆菌相似， 经 BLASTN序 列比对， 所分离菌株 Bd312与脆弱拟杆菌标准株 ATCC25285同源性达 99%， 药敏实验提示， 菌株 Bd312对头孢拉定、 阿莫西林、 庆大霉素、 磺胺甲嗯唑、 甲氧苄啶敏感， 急慢性毒性试验提示无毒性（参见刘洋洋， 等. 健康婴儿体内 的无毒脆弱拟杆菌的分离及鉴定. 中华医学杂志， 2014年， 第 94卷， 第 30 期， 第 2372-2374页） 。
早期筛选出的脆弱拟杆菌 ZY-312, 经由活体内及体外的相关实验证实， 此菌株除了对抗生素相关性腹泻、 肥胖及糖尿病、 脑膜炎等具有良好的预防 及治疗效果之外， 未见其对炎症性肠病， 特别是溃疡性结肠炎或克罗恩病， 具有优异的抵抗力的相关研究及报道。 发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种脆弱拟杆菌 ZY-312在预防和 /或 治疗炎症性肠病的应用，并提供用于预防和 /或治疗炎症性肠病的药物组合物、 食品、 保健品及食品添加剂， 其均包含所述脆弱拟杆菌 ZY-312。
为了解决上述问题， 本发明提供了一种脆弱拟杆菌在制备预防和 /或治疗 炎症性肠病的药物中的应用， 其中， 该脆弱拟杆菌为保藏号为 CGMCC
No .10685的脆弱拟杆菌 ZY-312。
上述的应用， 其中， 所述药物含有药学有效剂量的脆弱拟杆菌 ZY-312和 药学上可接受的载体。
上述的应用， 其中， 所述药学有效剂量为 106-101QCFU。
上述的应用， 其中， 所述药学上可接受的载体为奶粉、 乳糖、 环糊精、 麦芽糖、 葡萄糖、 甘油、 谷氨酸钠、 维生素 C、 甘露糖、 半乳糖、 甘露聚醇或 甲基纤维素。
上述的应用， 其中， 所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。
为了更好地实现上述目的， 本发明还提供了一种用于预防和 /或治疗炎症 性肠病的药物组合物， 其中， 所述药物组合物含有药学有效剂量的保藏号为
CGMCC No .10685的脆弱拟杆菌 ZY-312。
上述的药物组合物， 其中， 所述药学有效剂量为 106-101QCFU。
为了更好地实现上述目的， 本发明还提供了一种用于预防和 /或治疗炎症 性肠病的食品， 其中， 所述食品含有保藏号为 CGMCC No .10685的脆弱拟杆 菌 ZY-312。
为了更好地实现上述目的， 本发明还提供了一种用于预防和 /或治疗炎症 性肠病的保健品， 其中， 所述保健品含有保藏号为 CGMCC No .10685的脆弱 拟杆菌 ZY-312。
为了更好地实现上述目的， 本发明还提供了一种用于预防和 /或治疗炎症 性肠病的食品添加剂，其中，所述食品添加剂含有保藏号为 CGMCC No .10685 的脆弱拟杆菌 ZY-312。
本发明的技术效果在于：
本发明通过对脆弱拟杆菌 ZY-312, 经由活体内及体外的相关实验证实， 此菌株除了对抗生素相关性腹泻、 肥胖及糖尿病、 脑膜炎等具有良好的预防 及治疗效果之外， 还发现其对炎症性肠病， 包括溃疡性结肠炎或克罗恩病， 具有优异的抵抗力且无毒副作用， 可持久且有效地应用于预防和 /或治疗炎症 性肠病。 利用本发明的脆弱拟杆菌 ZY-312可以制备成药物、 食品、 保健品或 食品添加剂的形式。 所述药物、 食品、 保健品或食品添加剂含有脆弱拟杆菌
ZY-312。 这些药物、 食品、 保健品或食品添加剂可用于预防和治疗炎症性肠 病， 具有重大应用价值。
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述， 但不作为对本发明 的限定。 附图说明
图 1为本发明一实施例的各组大鼠 DAI 评分变化；
图 2为本发明一实施例的各组大鼠结肠组织损伤评分变化。
脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis) ZY-312于 2015年 4月 2日保藏于中国 普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC)，其保藏编号为 CGMCC No. 10685， 保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院 3号。 具体实施方式
下面结合附图对本发明的结构原理和工作原理作具体的描述：
近年来我国的炎症性肠病患病率逐年增加， 而目前该病的发病因素及致 病机制尚未明确， 是多种因素导致的病变， 一般主要考虑与外界环境、 基因 遗传、 免疫力以及感染等多方面综合因素相关。 该病的主要临床表现为腹痛、 腹泻、 黏性血便等， 如并发溃疡必须及时治疗， 否则极易引发肠穿孔， 威胁 患者的生命安全。近年来有相关研究报道， IBD 与肠道菌群失调有密切关系， 人体肠道有大量的微生物， 不完全统计， 数量高达 400 种以上， 其中就以双 歧杆菌与嗜酸乳杆菌为主， 大约占到微生物总量的 98% 以上， 通常人体在正 常情况下， 肠道内的微生物处于相对平衡状态， 可一旦失衡， 菌群失调可导 致相关疾病的发生。 目前认为肠道菌群失调可能是 IBD 诱发及复发的关键因 素。
本发明在多种疾病模型中对脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis)的作用进行 了检测和鉴定，第一次发现脆弱拟杆菌 ZY-312对炎症性肠病具有优异的预防 和 /或治疗效果。 本发明的脆弱拟杆菌 ZY-312, 保藏号为 CGMCC No. 10685， 在预防和 /或治疗炎症性肠病中的应用具体包括：
脆弱拟杆菌在制备预防和 /或治疗炎症性肠病的药物中的应用， 其中， 所 述药物含有药学有效剂量， 本实施例中， 该药学有效剂量为 106-101QCFU， 优
选 109CFU的脆弱拟杆菌 ZY-312和药学上可接受的载体 （奶粉、 乳糖、 环糊 精、 麦芽糖、 葡萄糖、 甘油、 谷氨酸钠、 维生素 C、 甘露糖、 半乳糖、 甘露聚 醇、 甲基纤维素等） 。 其中， 所述炎症性肠病通常为溃疡性结肠炎或克罗恩 病。
另外， 脆弱拟杆菌 ZY-312 还可用于制备预防和 /或治疗炎症性肠病的药 物组合物， 其中， ， 所述药物组合物含有药学有效剂量的脆弱拟杆菌 ZY-312, 该药学有效剂量为 106-101QCFU。
脆弱拟杆菌 ZY-312 还可用于制备预防和 /或治疗炎症性肠病的食品、 保 健品及食品添加剂等， 所述食品、 保健品及食品添加剂等均可加入一定比例 的脆弱拟杆菌 ZY-312成分。
下面以具体实施例进一步说明本发明的脆弱拟杆菌 ZY-312在预防和 /或 治疗炎症性肠病中的作用：
实施例 1
脆弱拟杆菌 ZY-312的培养
1、 所用试剂和仪器名称如下表：
试剂及仪器名称 试剂及仪器供应者 试剂及仪器型号或代码 胰蛋白胨大豆肉汤 （TSB ) OXOID ( Thermo Fisher Scientific Inc. ) CM0129B 胰蛋白胨大豆琼脂 （TSA) OXOID ( Thermo Fisher Scientific Inc. ) CM0131B
胎牛血清 MP Biomedicals Co Lid. 2916754 厌氧罐气体控制系统 Don whitLey scientific C Ud. WhitLey Jar Gassing system 生化培养箱 MIR-262 生物洁净安全柜 苏州净化仪器有限公司 BHC-1300 II A/B3
2、 活菌计数方法
活菌计数采用 10倍系列稀释法：
取 ΙΟΟμΙ^菌液加入 90(^L培养基中， 逐步梯度稀释至合适浓度。 每个平 板点 4个浓度梯度， 每个梯度重复点样 3次， 每次点样 2(^L。 37 °C、 厌氧培 养 48h， 数菌落数 （取菌落数为 3-30的浓度梯度计数） 。
活菌数 （CFU/mL ) =三个点样菌落总和 /3 χ50χ稀释度
3、 培养方法 步骤 1 :取一支冻干保存菌种（ZY-312、 Bd-312、 ATCC25285方法相同）， 加入 20(^L TSB培养基， 复溶， 吸取 2(^L血平皿划线， 厌氧罐气体控制系统 抽气后在生化培养箱中 37°C、 厌氧培养 48h;
步骤 2: 挑取单克隆菌落接入 lOmL TSB培养基， 加入 5% (v/v)肽牛血 清， ， 在生化培养箱中 37°C、 厌氧培养 12h;
步骤 3: 取 1瓶 500mL TSB培养基， 分别加入 5% (v/v) 肽牛血清， 接 入 1% (v/v) 菌种， ， 在生化培养箱中 37°C、 厌氧培养 48h;
步骤 4: 取菌液离心， 用离心机进行离心， 离心条件为 6000rpm、 10min。 用生理盐水洗涤 2次， 最后用生理盐水复溶菌泥备用并进行活菌计数。 实施例 2
脆弱拟杆菌 ZY-312治疗大鼠实验性结肠炎的效果
选健康成熟的 SD 大鼠 70只， 雌雄各半， 体质量 200±20g， 购自广东省 实验动物中心， 饲养于 SPF级动物房， 随机分成 7组， 每组 10只， 所有大鼠 实验前适应环境 1 周， 喂食普通大鼠饲料。
采用 5% DSS (dextran sulfate sodium, DSS， 购自美国西格玛公司）溶液 诱导大鼠慢性溃疡性结肠炎模型， 70只 SD 大鼠随机分为如下 7组：
正常对照组、 模型组、 美沙拉嗪组、 ZY-312组、 Bd-312组、 ATCC25285 组和联合组（ZY-312+ 美沙拉嗪） ， 采用 DAI积分及组织损伤学评分检测各 干预组疗效。 动物分组表如下： 编
造模 分组 动物只数
号
A 否 正常对照组 10
B 是 模型组 10
C 是 美沙拉嗪组 10
D 是 ZY-312组 10
E 是 Bd-312组 10
F 是 ATCC25285组 10
G 是 联合组 10 1、 实验动物模型：
50g DSS 加入 lOOOmL蒸馏水中， 充分溶解， 配制成 5% DSS 溶液， 每 日 新 鲜 配 制 。 依 据 Cooper 等 研 究 方 法 ( Cooper,H.S . ,Murthy, S.N., Shah, . S .,Sedergran,D.J. ,1993. ryInvestigation69,238-249. )，大鼠自由饮用 5% DSS溶液 7天，正常饮水 10 天， 以上为 1个循环， 反复 4个循环， 建立大鼠慢性溃疡性结肠炎模型。 10只 SD 大鼠为正常对照组， 其余 60只大鼠采用随机抽签的方法将大鼠分为 6组， 每 组 10只， 分别为模型组、 美沙拉嗪组、 ZY-312组、 Bd-312组、 ATCC25285 组和联合组（ZY-312+美沙拉嗪）， 剂量设计： ZY-312、 Bd-312, ATCC25285, 均为 5xl09CFU/只； 美沙拉嗪， O^g/Kg^T1; 模型组只造模不给药； 联合组为 ZY-312含 5xl09CFU/只且美沙拉嗪， O g/Kg— —1 ; 造模成功后开始给药， 每 天灌胃 1次， 连续灌胃 1周。
2、 大鼠疾病活动度积分的计算：
参照 Hamamoto等标准 ( Murano M, Maemura K, Hirata I, Toshina K, Nishikawa T, Hamamoto N, Sasaki S, Saitoh O, Katsu K. Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B (p65) antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis. Clin Exp Immunol 2000; 120: 51-58 ) ， 每日观察大鼠的体质量、 大便性状和隐血情况， 计算每只大鼠的疾病积分活动 （DAI) 积分， 评估结肠炎活动程度。
3、 病理学观察：
预冷生理盐水将大肠洗净，于大肠末端距离肛门 1cm 处剪取 0.5cm大肠， 4%多聚甲醛浸泡， 石蜡包埋， 切片， HE染色做病理检查。 其余部分结肠组织 进行组织病理学评分。 组织学损伤程度用炎症、 病变深度、 隐窝破坏及病变 范围评分的乘积表示， 取平均值作为结肠组织学损伤计分。
4、 实验观察指标：
体质量减轻, 造模成功后予以美沙拉嗪、 ZY-312、 Bd-312、 ATCC25285, 以及美沙拉 嗪与 ZY-312联合治疗 1 周， 整个实验过程中无大鼠死亡， 观察结果如下：
( 1 ) 模型组大鼠食量降低， 毛色干枯、 拱背和拖尾， 出现稀便， 部分肛 周可见血迹；
(2 ) 美沙拉嗪组大鼠毛色欠光滑、 精神欠活跃、 反应不灵活， 但好于模 型组；
(3 ) Bd-312组大鼠毛色欠光滑、 精神欠活跃、 反应不灵活；
(4 ) ATCC25285组大鼠毛色欠光滑、 精神欠活跃、 反应不灵活；
( 5 ) ZY-312组明显好于 Bd-312组、 ATCC25285组和美沙拉嗪组；
(6 )联合组明显好于 Bd-312组、 ATCC25285组和美沙拉嗪组，与 ZY-312 组相近。
以上结果显示： ZY-312组明显优于 Bd-312和 ATCC25285组， 也明显好 于美沙拉嗪组， ZY-312组与联合组效果相近。 表明 ZY-312明显改善了炎症 性肠病小鼠症状， 症状明显优于 Bd-312、 ATCC25285, 美沙拉嗪组。
大鼠疾病活动度的变化参考 Hamamoto 等的方法 ( Murano M ,Maemura K ,Hirata I ,
Toshina K ,Nishikawa T ,Hamamoto N , Sasaki S , Saitoh O ,Katsu K .Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor ka ppa B( p65 )antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium ( DSS ) -induced colitis .Clin Exp Immunol 2000； 120:51-58对每只大鼠的 体质量下降、 大便性状和粪便隐血情况进行综合评分。 结果如下：
( 1 ) 正常对照组 DAI 评分始终稳定在零水平；
(2 ) 模型组大鼠炎症逐渐加重；
(3 ) 美沙拉嗪组、 ZY-312组及联合组大鼠 DAI评分也逐渐升高， 但明 显低于模型组、 Bd-312组和 ATCC25285组， 差异有统计学意义 （参见图 1， 图 1为本发明一实施例的各组大鼠 DAI评分变化） 。
以上结果显示： ZY-312组综合评分明显优于 Bd-312和 ATCC25285组， 也明显好于美沙拉嗪组， ZY-312组与联合组效果相近。 表明 ZY-312治疗炎 症性肠病小鼠效果显著， 效果明显优于 Bd-312、 ATCC25285及美沙拉嗪组。
结肠黏膜损伤组织病理变化参照 Dieleman等的评分标准 （Dieleman L A, Palmen M J, Akol H, et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulfate sodium (DSS) is characterized by Thl and Th2 Cytokines[J]. Clinical & Experimental Immunology, 1999, 114(3):385-91. )对每只大鼠的结肠病理切片进 行组织损伤学评分。参见图 2， 图 2为本发明一实施例的各组大鼠结肠组织损 伤评分变化， 具体为各组大鼠第 7 天的结肠炎症浸润评分、 病变深度评分、 隐窝破坏及总体组织损伤评分直方图。 正常对照组大鼠组织学损伤评分为 0 分， 模型组评分 9.01分。 美沙拉嗪组、 ZY-312组、 Bd-312组、 ATCC25285 组、 联合组组织学损伤评分分别为 7.12、 6.31、 8.87、 8.93、 5.69， ZY-312 组、 联合组与模型组差异显著 （PO.01 ) ， 其中联合组效果最优。
以上结果显示： ZY-312组评分明显优于 Bd-312和 ATCC25285组， 也明 显优于美沙拉嗪组， 联合组效果极其显著。表明 ZY-312治疗炎症性肠病小鼠 效果显著， 效果明显优于 Bd-312、 ATCC25285及美沙拉嗪。
实验结果显示， Bd-312和 ATCC25285组与模型组结果相近，在治疗过程 中， 效果不明显。 美沙拉嗪组能够明显降低大鼠大鼠 DAI评分、 结肠组织损 伤评分， 但是与模型组相比， ZY-312组和联合组可显著降低大鼠 DAI 评分、 结肠组织损伤评分， 且优于美沙拉嗪组。 当 ZY-312与美沙拉嗪联合应用时， 效果显著， 源于 ZY-312通过上调肠道局部的免疫功能， 促进机体免疫恢复， 从而有效纠正了抑炎和抗炎动态失衡， 降低炎症反应， 减少了炎性因子的释 放。 实验结果充分表明 ZY-312 组和联合组在治疗炎症性肠病中的优势， ZY-312显著优于脆弱拟杆菌其他菌株 （例如 Bd-312和 ATCC25285 ) 。
本发明通过对脆弱拟杆菌 ZY-312, 经由活体内及体外的相关实验证实， 此菌株除了对抗生素相关性腹泻、 肥胖及糖尿病、 脑膜炎等具有良好的预防 及治疗效果之外， 还发现其对炎症性肠病， 包括溃疡性结肠炎或克罗恩病， 具有优异的抵抗力且无毒副作用， 可持久且有效地应用于预防和 /或治疗炎症 性肠病。 利用本发明的脆弱拟杆菌 ZY-312可以制备成药物、 食品、 保健品或 食品添加剂的形式。 所述药物、 食品、 保健品或食品添加剂含有脆弱拟杆菌 ZY-312。 这些药物、 食品、 保健品或食品添加剂可用于预防和治疗炎症性肠 病， 具有重大应用价值。
当然， 本发明还可有其它多种实施例， 在不背离本发明精神及其实质的 情况下， 熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形， 但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

权利要求书
1 .一种脆弱拟杆菌在制备预防和 /或治疗炎症性肠病的药物中的应用， 其 特征在于， 该脆弱拟杆菌为保藏号为 CGMCC No .10685 的脆弱拟杆菌 ZY-312 o
2 .如权利要求 1所述的应用， 其特征在于， 所述药物含有药学有效剂量 的脆弱拟杆菌 ZY-312和药学上可接受的载体。
3 .如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于， 所述药学有效剂量为 106-1010CFU。
4 .如权利要求 2或 3所述的应用， 其特征在于， 所述药学上可接受的载 体为奶粉、 乳糖、 环糊精、 麦芽糖、 葡萄糖、 甘油、 谷氨酸钠、 维生素 c、 甘 露糖、 半乳糖、 甘露聚醇或甲基纤维素。
5 .如权利要求 1、 2或 3所述的应用， 其特征在于， 所述炎症性肠病为溃 疡性结肠炎或克罗恩病。
6 .—种用于预防和 /或治疗炎症性肠病的药物组合物， 其特征在于， 所述 药物组合物含有药学有效剂量的保藏号为 CGMCC No .10685 的脆弱拟杆菌
ZY-312 o
7 .如权利要求 6所述的药物组合物， 其特征在于， 所述药学有效剂量为 106-1010CFU。
8 .—种用于预防和 /或治疗炎症性肠病的食品， 其特征在于， 所述食品含 有保藏号为 CGMCC No .10685的脆弱拟杆菌 ZY-312。
9 .一种用于预防和 /或治疗炎症性肠病的保健品， 其特征在于， 所述保健 品含有保藏号为 CGMCC No .10685的脆弱拟杆菌 ZY-312。
10 .一种用于预防和 /或治疗炎症性肠病的食品添加剂， 其特征在于， 所 述食品添加剂含有保藏号为 CGMCC No .10685的脆弱拟杆菌 ZY-312。
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