CN110577559B - α-L-艾杜糖醛酸酶测定用荧光糖苷酶底物的合成方法 - Google Patents

α-L-艾杜糖醛酸酶测定用荧光糖苷酶底物的合成方法 Download PDF

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Abstract

一种α‑L‑艾杜糖醛酸酶测定用荧光糖苷酶底物的合成方法，是以香豆素‑β‑D‑葡萄糖醛酸苷为原料，运用Wohl‑Ziegler自由基反应于光照条件下加入N‑溴代琥珀酰亚胺、氯代有机溶剂回流搅拌，之后，减压旋干有机溶剂，使用有机溶剂溶解萃取，收集有机相，旋干溶剂后经硅胶柱层析分离得到溴代化合物，再通过自由基还原在有机溶剂中还原，溶剂旋干经硅胶柱层析分离得到香豆素‑α‑L‑艾杜糖醛酸苷，最后脱去保护基得到香豆素‑α‑L‑艾杜糖醛酸苷。本发明首次通过自由基取代、还原香豆素‑β‑D‑葡醛酸苷的方法实现了香豆素‑α‑L‑艾杜糖醛酸苷的合成，反应具有操作简便，原料简单易得，产物易分离、反应收率高等特点。

Description

α-L-艾杜糖醛酸酶测定用荧光糖苷酶底物的合成方法
技术领域
本发明属于有机合成技术领域，涉及一种α-L-艾杜糖醛酸酶检测用荧光底物的合成方法。
背景技术
粘多糖贮积症I（MPS I）是一种遗传性疾病，由身体无法合成α-L-艾杜糖醛酸酶（IDUA）引起，这是一种参与降解糖胺聚糖的酶。IDUA不能水解硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素可导致溶酶体中部分降解的产物积累，这可导致细胞、组织和器官功能障碍。一般来说，这种疾病可以表现为较温和的病症，但有一些严重的病例可能在生命的第一个十年内导致死亡。目前，造血干细胞移植和酶替代疗法均可用于治疗MPS I，但早期检测对于避免疾病的严重进展至关重要。
用于诊断所有临床类型的MPS I的一种众所周知的技术是IDUA活性的测量，其中香豆素-α-L-艾杜糖醛酸苷广泛用作荧光底物。但是这种特殊的底物非常昂贵（> 100美元/mg），主要是因为L-艾杜糖部分的不能从自然界中获得和合成相对困难。此外，4-甲基香豆素组的水溶性差，IDUA活性测定需要广泛的底物浓度。虽然已经报道了L-艾杜糖及其香豆素衍生物的合成的几种合成方法，但该策略仍然涉及繁琐的步骤，并在糖基化阶段产率较低。
1986年，法国科学院院士皮埃尔·席奈报道了有关合成α-L-艾杜糖醛酸甲酯的方法，利用NBS进行自由基反应，然后通过自由基还原得到α-L-艾杜糖醛酸甲酯，该方法还原步骤中得到α-L-艾杜糖醛酸甲酯的产率仅有27%。（Chiba T , Pierre Sinaÿ.Carbohydrate Research, 1986, 151(14):379–389.），
Figure 388963DEST_PATH_IMAGE001
。
2013年，中国台湾洪上程等人探索和开发了从不同的D-葡萄糖衍生物制备L-艾杜糖，并通过Mitsunobu反应与7-羟基-4-甲基香豆素通过Mitsunobu反应得到相应的糖苷酶底物，该方法合成收率相对较低，大多数反应难以进行，并且每个步骤都需要繁琐的纯化。（Arkivoc, 2012, 2013(2):13-21.），
Figure 664086DEST_PATH_IMAGE002
。
综上所述，目前报道的α-L-艾杜糖醛酸酶的荧光底物合成方法主要是首先合成L-艾杜糖醛酸糖给体，然后构建糖苷键的方法，合成步骤长，操作繁琐，总产率很低。
发明内容
本发明的目的就是提供一种反应产率高、操作简便、原料易得、产物易分离的α-L-艾杜糖醛酸酶测定用荧光糖苷酶底物的合成方法。
本发明的α-L-艾杜糖醛酸酶测定用荧光糖苷酶底物的合成方法，以香豆素-β-D-葡萄糖醛酸苷（活泼氢被R2保护，优选乙酰基）（Ⅰ）为原料，运用Wohl-Ziegler自由基反应于光照条件下加入N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、氯代有机溶剂（优选CCl4）回流搅拌1-4 h（优选2h），待反应完全后，减压旋干有机溶剂，使用有机溶剂（优选二氯甲烷DCM）溶解萃取，收集有机相，旋干溶剂后经硅胶柱层析分离得到溴代化合物（Ⅱ），而后通过自由基还原在有机溶剂（优选DCM）中还原，反应结束后，溶剂旋干经硅胶柱层析分离得到香豆素-α-L-艾杜糖醛酸甲酯（活泼氢被R2保护，优选乙酰基）（Ⅲ），最后通过脱保护得到香豆素-α-L-艾杜糖醛酸苷（Ⅳ）；
Figure 369874DEST_PATH_IMAGE003
，
其中式（I）、（II）、（III）和（Ⅳ）中的X为F、Cl、Br、I中的任意一种； R1为H、CH3、(CH2)nCH3、C(CH3)3、Ar、X（F、Cl、Br、I）、O(CH2)nCH3、COOR中的任意一种；R2为Ac、Bz中的任意一种。
所述反应的反应式如下：
Figure 705041DEST_PATH_IMAGE004
。
本发明与现有技术相比，是利用容易合成得到的香豆素-D-葡醛酸苷作为起始原料，利用自由基反应溴代以及利用自由基还原合成α-L-艾杜糖醛酸酶的荧光底物，该策略是对传统α-L-艾杜糖醛酸酶的荧光底物的合成方法的补充和突破。其有益效果体现在：（1）提供一种新的合成策略；（2）首次实现由香豆素-β-D-葡萄糖醛酸苷通过自由基反应合成香豆素-α-L-艾杜糖醛酸苷；（3）本方法不仅产率高，而且操作简便，解决了产物难以分离的问题；（4）本方法原料简单易得，反应适用范围广泛。
具体实施方式
1、4-甲基香豆素-2,3,4-三-O-乙酰基-5-C-溴-β-D-葡萄糖醛酸甲酯(2)和4-溴甲基香豆素-2,3,4-三-O-乙酰基-5-C-溴-β-D-葡萄糖醛酸甲酯(3)的合成：
Figure 433962DEST_PATH_IMAGE005
，
将4-甲基香豆素-7-基-2,3,4-三-O-乙酰基-β-D-葡醛酸甲酯1（1.00 g，2.03mmol）溶于20 ml CCl4中，然后加入NBS（542 mg， 3.05 mmol）搅拌，使用光照回流2 h，经过TLC监测，原料反应完全。减压旋干CCl4，而后使用DCM溶解，依次使用水、饱和NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液萃取，无水MgSO4干燥有机相，滤液减压浓缩。粗产物通过硅胶柱层析分离得到白色固体2和3。
化合物2:m.p.180-183℃；
Figure RE-GDA0002264183170000033
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.80(d,J＝8.7Hz,1H),7.05(m,J＝13.1Hz,2H),6.32(s,1H),5.96 (d,J＝8.1Hz,1H),5.67(d,J＝9.1Hz,1H),5.54(t,J＝8.8Hz,1H),5.46(t,J＝9.5Hz,1H),3.76(s,3H),2.41 (s,3H),2.06(s,6H),2.01(s,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:169.79,169.33,168.78,164.43,160.13, 158.61,154.60,153.46,127.61,116.11,113.40,113.16,103.98,97.74,90.32,70.41,69.53,69.22,54.54,20.78, 20.70,20.58,18.53；MS(ESI)m/z：588.0[M+NH4]+。
化合物3:m.p.89-92℃；
Figure RE-GDA0002264183170000041
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.90(d,J＝8.9Hz,1H),7.10(d,J＝8.8Hz,1H),7.06(s,1H),6.64(s, 1H),6.00(d,J＝8.1Hz,1H),5.70(t,1H),5.56(t,J＝8.9Hz,1H),5.48(t,J＝9.5Hz,1H),4.85(s,2H),3.77(s, 3H),2.07(s,6H),2.02(s,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:169.84,169.38,168.85,164.48,160.05, 158.84,155.23,151.31,127.66,114.57,113.50,113.42,104.30,97.65,90.28,70.46,69.57,69.22,60.21,54.57, 28.32,21.16,20.71,20.60；MS(ESI)m/z：665.8[M+NH4]+。
2、4-甲基香豆素-7-基-2,3,4-三-O-乙酰基-α-L-艾杜糖醛酸甲酯(5)的合成：
Figure 490911DEST_PATH_IMAGE007
，
Figure 843395DEST_PATH_IMAGE008
，
在Ar气氛下，化合物2或化合物3（1.00 g，1.75 mmol）、Bu3SnH（2.35 ml，8.75mmol）加入20 ml DCM中，于-78 ℃下缓慢滴加Et3B（0.35 ml，0.35 mmol，1M的己烷溶液），滴加完后继续搅拌5 h，经过TLC监测，原料反应完全。反应液减压浓缩，粗产物通过硅胶柱层析分离得到白色固体4和5。
化合物5:m.p.89-91℃；
Figure RE-GDA0002264183170000043
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.75(d,J＝8.8Hz,1H),7.16(s,1H),7.11(d,J＝8.9Hz,1H),6.28(s, 1H),6.02(s,1H),5.16(s,1H),5.04(s,2H),4.99(s,1H),3.66(s,3H),2.41(s,3H),2.16(s,3H),2.10(s,3H), 2.05(s,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:169.62,169.45,167.83,160.31,158.55,154.72,153.60, 127.18,115.27,113.84,112.64,104.25,95.73,67.95,67.25,66.86,66.50,52.77,20.96,20.76,18.53；MS(ESI) m/z：515.4[M+Na]+。
3、4-甲基香豆素-7-基-α-L-艾杜糖醛酸甲酯（6）的合成：
Figure 956079DEST_PATH_IMAGE009
，
将化合物5（100 mg，0.203 mmol）悬浮于超干2 ml CH3OH中，加入CH3ONa溶液（5 mgNa溶于20 ml CH3OH中）3.6 ml，先冰浴半个小时后恢复室温搅拌4 h，经TLC监测反应完全。低温旋干CH3OH，少量CH3OH溶解粗产物，加入冰醋酸（34 mg，0.57 mmol）超声混合均匀，减压浓缩得到粗产物，将其通过硅胶柱层析分离得到白色固体6（70 mg，94.1%）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ: 7.73 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.06 (m, J =9.1 Hz, 2H), 6.26 (s, 1H), 5.70 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 5.57 (d, J = 5.8 Hz,1H), 5.38 (d, J = 4.4 Hz, 2H), 4.65 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 3.80 (m, J = 5.6 Hz,1H), 3.67 (m, 4H), 3.55 (m, J = 5.7 Hz, 1H), 2.40 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz,DMSO-d 6) δ: 170.47, 160.45, 160.07, 154.81, 153.69, 127.07, 114.70, 113.79,112.28, 103.82, 99.46, 72.30, 71.86, 71.15, 70.50, 52.15, 18.54; MS（ESI）m/z：389.0 [M+Na]+。
4、4-甲基香豆素-7-基-α-L-艾杜糖醛酸（7）的合成：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
，
将4-甲基香豆素-7-基-α-L-艾杜糖醛酸甲酯6（20 mg，54.60 μmol）溶于溶剂THF/H2O=10/1（1.1 ml）于-10 ℃加入NaOH溶液（2.62 mg，65.52 μmol NaOH溶于65.52 μl H2O中），后于冰浴搅拌2 h，经TLC监测反应完全后，加入阳离子树脂调节PH=6-7，低温旋蒸除去THF，冻干除水得到白色固体7（16 mg，83.2%）。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ: 7.93 – 7.83 (m, 1H), 7.65 (d, J = 8.8 Hz,1H), 7.34 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.21 (s, 1H), 5.51 (d, J = 7.0 Hz, 1H),5.19 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 4.96 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 3.99 (d, J = 6.2 Hz, 1H),3.21 (d, J = 10.4 Hz, 2H), 2.40 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6) δ: 172.38,161.22, 160.71, 155.00, 153.77, 126.38, 113.94, 113.94, 111.12, 103.97,97.62, 74.93, 73.54, 72.93, 71.56, 18.52; MS（ESI）m/z：353.2 [M+H]+。

Claims (4)

1.一种α-L-艾杜糖醛酸酶测定用荧光糖苷酶底物的合成方法，其特征在于：所述的方法以香豆素-β-D-葡萄糖醛酸苷为原料，活泼氢被R2保护，运用Wohl-Ziegler自由基反应于光照条件下加入N-溴代琥珀酰亚胺、氯代有机溶剂回流搅拌1-4 h，待反应完全后，减压旋干氯代有机溶剂，使用有机溶剂溶解萃取，收集有机相，旋干溶剂后经硅胶柱层析分离得到溴代化合物Ⅱ，而后通过自由基还原在有机溶剂中还原，反应结束后，溶剂旋干经硅胶柱层析分离得到香豆素-α-L-艾杜糖醛酸甲酯Ⅲ，活泼氢被R2保护，最后脱保护得到香豆素-α-L-艾杜糖醛酸苷Ⅳ；
Figure 681500DEST_PATH_IMAGE001
，
其中式（I）、（II）、（III）和（Ⅳ）中的X为F、Cl、Br、I中的任意一种； R1为H、CH3、C(CH3)3、Ar、X、COOR中的任意一种；R2为Ac、Bz中的任意一种。
2.根据权利要求1 所述的α-L-艾杜糖醛酸酶测定用荧光糖苷酶底物的合成方法，其特征在于：所述的氯代有机溶剂为CCl4。
3.根据权利要求1 所述的α-L-艾杜糖醛酸酶测定用荧光糖苷酶底物的合成方法，其特征在于：所述的有机溶剂为二氯甲烷。
4.根据权利要求1 所述的α-L-艾杜糖醛酸酶测定用荧光糖苷酶底物的合成方法，其特征在于：合成中所用的还原方法为使用自由基Et3B和Bu3SnH组合在低温0到-78 ℃下反应。
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