CN110577247B - 负载有纳米单质铁的复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种负载有纳米单质铁的复合材料及其制备方法和应用，所述复合材料是一种产脲酶真菌菌丝体经矿化而成的生物碳表面负载纳米级单质铁所得到的复合材料。本发明的负载纳米单质铁的复合材料分散性能佳，对单质铁的负载能力强，具有良好的降解效果。

Description

负载有纳米单质铁的复合材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种负载有纳米单质铁的复合材料及其制备方法和应用。

背景技术

自1994年以来，零价铁粉已被有效地应用于降解卤化有机化合物，比较广泛地用于了例如排放污水的净化。为提高降解效果，对于零价铁粉的研究已转向纳米级尺寸。纳米零价铁(nano zero-valent iron，NZVI)是由纳米级(1-100nm)的零价铁粒子组成，由于其较高的比表面积与高活性，应用于降解污水中的卤代烃等污染物的净化具有更理想的效果。然而，纳米零价铁自身的高活性会使得在水溶液中易团聚失活，从而导致降解效率降低；且纳米零价铁粉接触到空气中的氧气也会迅速氧化而放热，热量较快累积，易造成自燃现象，相对危险，因此，通常纳米零价铁对存放条件要求较为苛刻。

解决纳米零价铁的自身团聚等问题，也是这类材料的研究热点之一。已经有报道和公开的一些方案中使用了特定的负载材料(或称载体)，如活性碳、海泡石等，为纳米零价铁提供负载及分散作用，该类负载型纳米零价铁材料的制备方式主要有热还原法和化学还原法等，通常是离子态的铁源成分负载在载体上，然后经过高温煅烧(热还原)或投加化学试剂(化学还原)等方式将铁成分还原为零价铁，得到最终的负载型纳米零价铁材料。

目前较为广泛使用的是一种活性碳负载纳米零价铁材料，其主要是通过将活性碳混合于富含亚铁离子(Fe²⁺)的溶液内、再投入还原性化学药剂将Fe²⁺还原为零价铁、使零价铁吸附于活性碳空隙等过程而得到，即实施化学还原法制备得到。然而，这类活性碳或同类多孔载体负载纳米零价铁材料，利用活性碳的物理吸附性质实现负载纳米零价铁，负载效率相对较低，仅能使零价铁吸附至活性碳表面，并且依赖于活性碳自身的形状、结构、生产工艺等，负载能力受限；此外，采用化学还原法制备，需要投加特定的化学药剂(如硼氢化钠、硼氢化钾、水合联氨等)，不仅增加了额外的成本，且通常需要严格地控制反应条件及环境，使制备流程复杂化，同时，将Fe²⁺还原为零价铁的关键步骤在水溶液(液相)中进行，作为溶剂的水中不可避免会溶解一定程度的氧气，使得反应体系中还原得到的零价铁易发生氧化反应，变为氧化铁等沉淀，造成原料损失，不能被充分利用，进一步提高成本。

诚如上述，现有技术中活性碳负载纳米零价铁材料及其制备过程存在一定的缺陷，工业化应用受限；此外，用于污水净化，降解污染物时的负载分散性能主要取决于活性碳在水中的分散性能，活性碳负载纳米零价铁材料往往不能充分与污染物溶液体系较为均匀的混合。这也是目前大部分负载型纳米零价铁材料存在的问题，即制备工艺复杂，成本较高，材料负载及分散能力不佳，导致降解效率不理想。

发明内容

针对上述现有技术的缺陷，本发明提供一种负载有纳米单质铁的复合材料，采用真菌生物碳负载纳米零价铁，解决了纳米零价铁在实际应用中易团聚失活、存放条件苛刻等问题，且具有良好的负载能力及分散性能，能够提高降解效率。

本发明还提供一种上述负载有纳米单质铁的复合材料的制备方法，通过选择利于提供铁源负载的真菌生物材料，以及生物矿化和铁源还原的工艺，制备出生物碳负载有纳米单质铁的复合材料，且制备过程简单，成本较低。

本发明还提供一种上述负载有纳米单质铁的复合材料的应用，可应用于有机污染物的降解处理中，降解效果显著。

本发明还提供一种有机污染物的降解处理方法，成本低，并具有较高的降解效率。

本发明的一方面，提供一种负载有纳米单质铁的复合材料，是一种产脲酶真菌菌丝体经矿化而成的生物碳表面负载纳米级单质铁所得到的复合材料。

本发明的复合材料利用产脲酶真菌的生物矿化作用形成的生物碳作为载体负载纳米级单质铁(或称零价铁)，提供了一种新的负载型纳米零价铁材料，对该材料的分析和降解应用结果可以证明，产脲酶真菌经矿化得到的生物碳对纳米单质铁表现出良好的负载能力及分散效果，而得到的复合材料也表现出了良好的分散性，从而解决传统纳米零价铁因易团聚失活而导致降解效率降低的缺陷，更利于产业应用。

本发明提供了一种负载型的纳米单质铁复合材料，单质铁以纳米级形态实现在生物碳表面均匀负载，且得到的复合材料具有良好分散性，因此不会大量累积热量，更利于运输和保存，通常置于玻璃样品瓶等容器内干燥密封保存即可。

生物矿化作用的原理一般是生物体通过生长、代谢等生理活动有效地改变局部环境的酸碱度(pH)、电化学势(Eh)和矿化离子浓度等物理化学条件，影响矿化离子的聚集和成团，从而诱导和控制矿物的成核和生长，最终形成具有特定组成、结构和形貌的生物矿物的过程。由于生物矿化作用是生物体从分子层面富集环境中的矿物元素(矿化离子)，所以得到的生物体表面的矿物成分往往趋向于形成纳米级尺度的结构。

本发明的研究发现，产脲酶真菌在生长繁衍的过程中，会富集所处环境中的铁矿物成分，将铁离子通过物理化学反应聚集于真菌细胞表面(或细胞内)，以达到有利于自身生长的作用，从而实现对纳米级铁成分的负载。基于此，本发明选择产脲酶真菌作为生物矿化微生物原料，亚铁离子作为铁源成分。在本发明的具体实施过程中，上述复合材料的制备过程包括了使菌丝体在含有亚铁离子的培养基中培养并负载铁成分、以及通过煅烧使菌丝体碳化和铁元素被还原为单质的过程。在该制备过程中，产脲酶真菌通过生物矿化作用，使其菌丝体作为载体负载铁成分，并且铁成分可呈纳米级结构，在对负载有铁成分的菌丝体的煅烧过程中，菌丝体碳化产生生物碳，同时铁成分的化学价态通过高温还原转变为零价，得到零价铁，即可得到目标材料-真菌生物碳负载纳米单质铁复合材料，经过该过程得到的复合材料的组成主要为碳、铁的混合物，有效避免了零价铁的氧化，确保原料中的铁源绝大部分以零价铁的形态负载于生物碳上。

此外，产脲酶的良好生长也是影响最终复合材料产物性能的重要因素之一。发明人研究发现，上述含有亚铁离子的培养基中，亚铁离子的浓度对复合材料产物影响较大，过低则产物中纳米单质铁的负载量过少，影响降解性能；过高则生物毒性较大，会对真菌生长造成不利影响，同样会影响到最终所得到的复合材料的性能。因此，基于发明人的研究，上述含有亚铁离子的培养基中，亚铁离子的浓度一般可以为5-50mMol/L。

尽管大部分微生物都具有一定的生物矿化作用，然而，不同微生物对不同矿物成分的富集能力或负载能力具有一定的差异，考虑到最终所获得的复合材料的性能，所以本发明采用产脲酶真菌，在具体实施过程中，可以使用产脲酶脉孢菌。

进一步地，在本发明的一实施方式中，使用了上述产脲酶脉孢菌中的粗糙脉孢菌(Neurospora crassa，简称N.crassa)，该菌在生长过程中会分解尿素作为自身氮源，由于尿素的分解，使得培养基的溶液环境偏碱性，溶液内含有较多的羟基，配合培养基中亚铁离子(Fe²⁺)的存在，通过生物矿化作用，其菌丝体表面会富集大量铁成分，可进一步提高负载效率，并提高最终所得复合材料的降解性能。本发明的具体实施例中使用的粗糙脉孢菌，保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号：ACCC 32256。

本发明的另一方面，提供一种上述负载有纳米单质铁的复合材料的制备方法，包括以下过程：

培养得到产脲酶真菌菌丝体；

将菌丝体置于含有亚铁离子的培养基中，摇床培养，收取负载有铁成分的菌丝体，含有亚铁离子的培养基中，亚铁离子的浓度为5-50mMol/L；

将所得到的负载有铁成分的菌丝体实施真空冷冻干燥后研磨；

将研磨后的粉末料于880-950℃煅烧1小时以上，冷却得到复合材料。

在本发明的制备工艺条件下，通过定向诱导产脲酶真菌的生物矿化作用，使其主动富集铁成分，富集过程在分子层面进行，实现对纳米级铁成分的负载，并结合使用热还原法(在上述条件下煅烧)及干燥、研磨等前处理，纳米铁成分被还原为零价铁，从而制备出真菌生物碳负载纳米零价铁的复合材料，该制备过程简单，条件较为温和。此外，本发明制备方法通过生物矿化作用(或生物矿化法)主动捕集铁成分，相比于其他载体(如活性碳)的物理吸附(被动吸附)作用，甚或是其他菌种的被动吸附作用，负载能力更好，负载力更强，铁成分分散更为均匀，减少结块现象，可显著提升最终复合材料的降解性能。此外，本发明制备方法采用固液相结合，通过生物矿化作用负载纳米级铁成分的过程处于液相环境(含有亚铁离子的培养基)中，产脲酶真菌能够良好生长，其菌丝体负载纳米级铁成分更为充分、均匀；而后热还原过程在固相的煅烧环境中进行，铁成分转化为零价铁更为充分，损耗小，且能够保证最终所得到的复合材料中的铁成分大部分是单质铁，被氧化程度低。

可以理解，虽然上述培养基中加入的是亚铁离子，然而，在具体的培养过程中，亚铁离子可能不可避免的会产生部分三价铁离子，上述菌丝体所负载的铁成分一般包括了二价铁离子与三价铁离子(通常可能大部分为三价铁离子)，其在煅烧过程中均可被还原为零价铁。在一具体实施过程中，通过上述生物矿化作用，产脲酶真菌主动从环境中富集铁成分至自身，通常可观察到其菌丝体表面呈红褐色，即是菌丝体表面富集了铁成分(大部分为三价铁)。

诚如上述，本发明制备方法可先对产脲酶真菌的菌株进行培养，使其生长繁殖到一定规模后(即得到产脲酶真菌菌丝体，通常可以菌丝长满培养器皿为参考)，再将其置于含有亚铁离子的培养基中进行培养矿化。本发明对用于培养产脲酶真菌的菌株的培养基不做特别限定，一般可以是麦芽汁琼脂培养基(malt extract agar medium，MEA培养基)、麦芽汁培养基(malt extract medium，ME培养基)等，或上述二者联用。在一实施方式中，可先将得到的菌株接种至MEA培养基进行放大培养，一段时间后再将长成的菌丝接种至ME培养基，最后将长成的菌丝体移至含有亚铁离子的培养基进行培养矿化。

具体地，一般可先将得到的比如保藏状态下的菌株接种到装有MEA培养基的培养板的中心，置于恒温培养箱内于20-25℃左右进行放大培养，待菌丝布满培养板的表面后，再将长成的菌丝接种至装有ME培养基的培养瓶中，放入摇床培养箱进行摇床培养，观察到菌丝长满培养瓶，即可视为菌丝体长成；然后将菌丝体过滤滤出，转移至装有含有亚铁离子的培养基的培养瓶中，继续置于摇床培养箱进行摇床培养。其中，通过对摇床培养箱的参数进行设置，可以使上述摇床培养在更适于菌丝成长的环境中进行，一般温度为20-25℃左右、转速为80-125r/min左右。

上述培养过程中可使用常规的培养板、培养瓶等对微生物进行培养的器皿。进一步考虑到对产脲酶真菌的培养效果及得到更为适宜的菌丝体，在本发明的一实施方式中，培养板为平板培养皿，培养瓶为三角培养瓶(简称三角瓶)，一般情况下，菌株在装有MEA培养基的平板培养皿中培养2-3天，长成的菌丝在装有ME培养基的三角瓶中培养3-5天，即可得到产脲酶真菌菌丝体。

本发明中，上述涉及产脲酶真菌培养的过程最好在无菌环境下进行，具体操作时，整个制备复合材料的工艺流程最好在高清洁度的环境中进行，如可在超净台(或超净工作台)内进行。

对菌种的选择也是本发明的关键所在，在本发明的一实施方式中，上述产脲酶真菌可进一步选自产脲酶脉孢菌。在本发明的制备工艺条件下，产脲酶脉孢菌可使其生物矿化作用伴随着物理吸附作用，并将被动吸附转化为主动捕集，同时培养基中特定浓度的亚铁离子的加入，使得产脲酶脉孢菌能够利用自身生长环境内的铁元素，通过物理化学反应，吸附、捕集铁元素于自身表面/内部，从而出现其菌丝体负载铁成分的现象。其中，亚铁离子的加入量(即浓度)决定了最终复合材料的单质铁的负载量，过多或过少都会对最终复合材料的性能造成不利影响。

在本发明的一具体实施方式中，上述产脲酶脉孢菌为粗糙脉孢菌。

培养基通常是由适于微生物生长繁殖的多种营养物质配制而成的营养基质，本发明中，除含亚铁离子的组分外，上述含有亚铁离子的培养基的组分还包括碳源、氮源、其他无机盐类等营养成分，以提供更适于上述产脲酶真菌生长的环境，一般情况下，糖类物质可作为主要的碳源，如一些单糖、双糖、多糖或淀粉等，含氮化合物可作为主要的氮源，如蛋白胨、尿素等，在本发明的具体实施过程中，一般以葡萄糖、尿素等作为碳源和氮源。

在本发明的一实施方式中，上述含有亚铁离子的培养基的氮源包括尿素，上述制备方法还包括制备含有亚铁离子的培养基的过程：将除尿素和亚铁离子外的组分于超纯水中混合溶解，高压蒸汽灭菌；无菌状态下加入尿素溶液和含亚铁离子溶液，制成含有亚铁离子的培养基，该培养基可进一步提高菌丝体对铁成分的富集及负载效果。

在配制上述含有亚铁离子的培养基时，可通过加入亚铁盐(即含亚铁离子的组分)的形式在培养基中引入亚铁离子，一般可采用本领域常用可溶性亚铁盐，如FeSO₄·7H₂O、FeCl₂、硫酸亚铁等。

此外，其他无机盐类一般可包括主要元素和微量元素，微量元素相对主要元素而言，真菌所需量比较微小，但通常又不可缺少，其中，主要元素例如可以是钾、钠、镁、钙、磷、硫等，微量元素例如可以是锌、锰、铜、钼、钴、镍、钒等，通常也可以包含相应元素的可溶性盐的形式加入培养基中，例如可在培养基中加入K₂HPO₄、KH₂PO₄、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜等以引入相应的所需元素。

根据发明人的进一步研究，在一具体实施方式中，上述含有亚铁离子的培养基的组分主要包括葡萄糖5～40g/L、尿素2～30g/L、亚铁离子5-50mMol/L、主要元素和微量元素，其中，主要元素包括钾离子4mMol/L、镁离子0.8mMol/L、钙离子0.2mMol/L、钠离子2mMol/L，偏差范围均为±1％～3％；微量元素包括锌离子1.4×10^-2mMol/L、锰离子1.8×10^-2mMol/L、铜离子1.6×10^-2mMol/L，偏差范围均为±1％～3％。包含该些组分的培养基适于对产脲酶真菌、尤其是产脲酶脉孢菌的培养，并能够使真菌菌丝体表面富集大量的铁成分，进一步提高负载效率，有利于最终复合材料产物的性能。需说明的是，上述偏差范围是指，在上述所给出的某一元素的具体浓度数值的基础上，其浓度数值可适量浮动的程度。

上述含有亚铁离子的培养基最好现配现用，以避免铁离子形成沉淀从培养基溶液中析出。

本发明对上述高压蒸汽灭菌方式不做严格限制，可采用本领域常规处理方式，如可采用高压蒸汽灭菌锅或高压蒸汽灭菌器等常规仪器进行相应处理。一般高压蒸汽灭菌条件为：温度约121℃，压力约103kPa，时间约20-30分钟。

此外，上述无菌状态加入尿素溶液和含亚铁离子溶液可以是通过无菌注射剂、无菌滤膜等加入尿素溶液和含亚铁离子溶液，然本发明并不以此为限，也可以采用其他适用的方式。其中，尿素溶液、含亚铁离子溶液可采用例如超纯水等配制成适宜浓度的溶液。

上述制备过程中，采用含亚铁离子的培养基对产脲酶真菌的菌丝体进行培养矿化，一般培养2-3天即可完成。通常菌丝体在含有亚铁离子的培养基中培养完成后，可对培养产物进行过滤，得到负载有铁成分的菌丝体(通常可能为红褐色)。

为尽可能的除去菌丝体中的水分，得到负载有铁成分的干燥菌丝体，在本发明的一实施方式中，将所得到的负载有铁成分的菌丝体抽滤除水后先实施冷冻，再经过真空冷冻干燥机进一步干燥处理，真空表压力不高于80Pa，干燥温度为-55～-50℃，干燥时间5-6小时。

一般情况下，在进行真空冷冻干燥处理时，较低的压力条件能带来更好的干燥效果，然而，温度和压力通常也会根据所使用的冷冻干燥机不同而有所调整，如在一具体实施例中，采用真空冷冻干燥机对菌丝体进行真空冷冻干燥处理时，真空表压力为70Pa，干燥温度为-55℃，能达到良好的干燥效率。

本发明对上述实施冷冻的方式不做严格限制，可采用常规冷冻方式，如可将抽滤除水后的菌丝体置于冰箱、冷柜中实施冷冻。一般冷冻温度约为-10℃～-18℃，进一步为-15℃～-18℃，冷冻时间一般不低于8小时，如可为8-10小时，具体操作时可过夜冷冻。

上述制备过程中，对负载有铁成分的菌丝体采用了抽滤、冷冻及进一步真空冷冻干燥处理，总体来讲是采用了冷冻干燥的处理方式，干燥效率高、速度快，并且能够最大程度保证被干燥的菌丝体的物理形貌和化学组成不被破坏。当然，除上述冷冻干燥处理方式外，本发明也可采用其他干燥手段，如烘干干燥、自然风干干燥等，然而，该些干燥手段对菌丝体的干燥效果较差于上述冷冻干燥的处理方式。

通过对负载有铁成分的菌丝体进行上述干燥处理，除去菌丝体中的水分，更利于其经后续煅烧处理后得到负载有零价铁的复合材料，避免零价铁被氧化，有助于提高原料利用率及整个工艺流程的效率，并有助于提高最终复合材料的性能。

为进一步提高煅烧还原效果，在本发明的一实施方式中，研磨后的粉末料在惰性环境中按照如下程序实施煅烧：控制升温速率2℃/分钟～7℃/分钟，升温至880-950℃，煅烧1-3小时；煅烧完成后，自然冷却。

上述煅烧过程在惰性环境中进行，更利于负载于菌丝体的铁成分还原为零价铁，进一步提高生产效率及最终产物的性能。一般在煅烧过程中可通入惰性气体为载气以保持惰性环境，其中，可选用较常用的惰性气体，如氮气、氩气等，在具体实施时，通常是通入高纯氩气和/或高纯氮气等。

上述煅烧过程中，一般是从室温(20～25℃)按照上述升温速率升温至目标温度，煅烧完成后，使产物自然冷却至室温，即得到目标产品。

本发明中，如无特别说明，可按照本领域常规方式进行操作以完成各步骤，各步骤所需用到的仪器、药剂等均可商购或通过常规方法配制得到。

本发明的再一方面，还提供一种上述负载有纳米单质铁的复合材料在降解有机污染物处理中的应用。

本发明复合材料可应用于多种有机污染物的降解处理中，上述有机污染物一般可以是常见的有机污染成分，或含有有机污染成分的工业废弃物等，例如可以是四氯化碳等卤代烃类物质或其他有害物质，或含有该些物质的工业废弃物等。

本发明的再一方面，提供一种有机污染物的降解处理方法，使用上述负载有纳米单质铁的复合材料作为处理剂。

本发明中，一般是在含有有机污染物的溶液中对有机污染物进行降解处理，如在一实施方式中，可向每升含有机污染物的溶液中投加适量本发明复合材料产品，适当搅拌一段时间即可观察到该复合材料快速混合于含污染物的溶液中(一般可通过溶液的颜色变化进行观察)，一般4小时左右即可大致完成对有机污染物的降解。当然，采用本发明的复合材料对有机污染物或含有其的工业废弃物进行处理，所需复合材料的用量、处理时间等条件可根据实际需求(如有机污染物的种类、浓度/含量等)进行相应调整。如在一具体实施例中，可用约1克的本发明复合材料处理1升左右的含四氯化碳10～20mg/L的污水溶液，相对于现有的活性炭负载纳米零价铁材料或其他负载型纳米零价铁材料能够达到相当或更优的降解效果/效率。

与现有技术相比，本发明至少存在如下有益效果：

1)本发明提供的负载纳米单质铁的复合材料，首次利用产脲酶真菌的生物矿化作用，通过其产生的生物碳作为载体负载纳米单质铁，提供了一种新的负载型纳米零价铁材料，能够解决传统纳米零价铁在实际应用中易团聚失活、存放条件苛刻等问题；且本发明复合材料相对于现有技术常用的活性碳负载型纳米零价铁材料，其分散性能更佳，对单质铁的负载能力更强，具有更好的降解效果。

2)本发明提供的负载纳米单质铁复合材料的制备方法，首次采用产脲酶真菌的生物矿化作用来负载铁成分，相比于其他载体(如活性碳)的物理吸附(被动吸附)作用，负载及分散效果更好；同时本发明首次采用了生物矿化作用与热还原法相结合的方式，两者联用，制备出真菌生物碳负载纳米零价铁的复合材料，整个制备过程简单、方便、高效，条件不苛刻，周期短，且成本较低，适于工业化生产。

3)本发明的负载有纳米单质铁的复合材料能够应用于对有机污染物的降解处理中，且应用范围广泛，为有机污染物及含有其的工业废弃物的降解处理提供了更加高效的处理方式。

4)采用本发明的复合材料作为处理剂对有机污染物进行降解处理，相对于采用现有的处理剂，如纳米零价铁粉(或还原铁粉)、活性炭负载纳米零价铁材料或其他负载型纳米零价铁材料等，本发明处理剂使用量少、降解处理成本低，能够达到更为优异的降解效果/效率。

附图说明

图1为本发明一实施例的负载有纳米单质铁的复合材料的示意图；

图2为本发明一实施例的负载有纳米单质铁的复合材料在扫描电子显微镜下观察的示意图；

图3为本发明一实施例的负载有纳米单质铁的复合材料的EDAX能谱图；

图4为本发明一实施例的负载有纳米单质铁的复合材料与活性碳负载纳米零价铁材料在扫描电子显微镜下观察的对比图；

图5为本发明一实施例的负载有纳米单质铁的复合材料、还原铁粉、活性碳在水中的状态图；

图6为本发明一实施例的负载有纳米单质铁的复合材料、还原铁粉、真菌生物碳、空白对照组降解四氯化碳的浓度变化曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

以下实施例中，如无特别说明，可按照本领域常规方式进行操作以完成各步骤，各步骤所需用到的仪器、药剂等均可商购或通过常规方法配制得到。

实施例一、负载有纳米单质铁的复合材料(以下简称复合材料)的制备及分析

本实施例中，粗糙脉孢菌(N.crassa)来自于中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号：ACCC 32256；MEA培养基、ME培养基浓缩液为北京奥博星生物技术有限责任公司商品；葡萄糖、尿素、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰为天津市光复科技发展有限公司商品；氯化钾为北京市通广精细化工公司商品；氯化钙、氯化钠、硫酸铜为北京化工厂商品；所用超纯水通过超纯水仪制得；所用超纯水仪、无菌滤膜来自于赛多利斯(上海)贸易有限公司；所用无菌注射器来自于常州市康福莱医疗用品有限公司；所用平板培养皿直径为90mm，三角瓶规格为250mL。

1、培养基的制备

1)制备MEA培养基

取MEA培养基粉末20g，溶于1L超纯水中，混合摇匀后，经高压蒸汽灭菌锅(121℃、103kPa保持20分钟)灭菌，于超净工作台内在培养基凝固前将其倒入平板培养皿中冷却备用。

2)制备ME培养基

取ME培养基浓缩液16g，溶于1L超纯水中，混合摇匀后，经高压蒸汽灭菌锅(121℃，103kPa保持20分钟)灭菌，于超净工作台内将灭菌后的混合液倒入适宜数量的三角瓶中备用，每个三角瓶中混合液的加入量为100mL。

3)制备含有亚铁离子的培养基(以下简称AP1培养基)

(1)原料组成

采用如下组分配制AP1培养基：葡萄糖、尿素、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜。

其中，上述各组分的加入量满足如下各成分的浓度要求：葡萄糖20g/L，尿素20g/L，钾离子4mMol/L，镁离子0.8mMol/L，钙离子0.2mMol/L，钠离子2mMol/L，亚铁离子20mMol/L，锌离子1.4×10^-2mMol/L，锰离子1.8×10^-2mMol/L，铜离子1.6×10^-2mMol/L。

(2)配制过程

将除尿素和亚铁离子外的其他组分置于盛有适量超纯水的培养基药品瓶(1L)内进行混合溶解，向该药品瓶内补加超纯水至溶液体积为880mL，经高压蒸汽灭菌锅(121℃，103kPa保持20分钟)灭菌，然后于超净工作台内通过无菌注射器和无菌滤膜分别将尿素溶液(共100mL，用超纯水配制而成的适宜浓度的尿素溶液)和含亚铁离子溶液(共20mL，用超纯水配制而成的适宜浓度的含亚铁离子溶液)，进行过滤除菌注射入上述灭菌处理后的药品瓶内，混合摇匀后，将药品瓶内的混合物倒入适宜数量的三角瓶中备用，每个三角瓶中混合物的加入量为100mL。

2、复合材料的制备(以下步骤在超净工作台内进行)

1)使用接种环将N.crassa菌株接种于上述平板培养皿的中心，然后于恒温培养箱内于约20℃放大培养2-3天，菌丝长成，布满平板培养皿的表面；

2)之后，使用打孔器将平板培养皿表面菌丝边缘部分打孔，将打孔部分的菌丝(以下称打孔菌落)接种至上述装有ME培养基的三角瓶中，每个三角瓶中置入10个打孔菌落，然后将该些三角瓶放入摇床培养箱，在温度约25℃、转速约125r/min条件下继续培养3-5天，观察到菌丝长满三角瓶溶液内，即可视为菌丝体长成；

3)之后，将上述三角瓶内长成的菌丝体过滤滤出，转移至盛有AP1培养基的三角瓶内，然后将该些盛有AP1培养基的三角瓶放入摇床培养箱，在温度约25℃、转速约125r/min条件下培养2-3天，观察到三角瓶内菌丝体呈红褐色；

4)将上述盛有AP1培养基的三角瓶内的培养产物进行过滤，得到红褐色菌丝体(即负载有铁成分的菌丝体)，使用真空抽滤机对其进行抽滤，初步除去菌丝体内部水分，然后将其置于冰箱，于约-15℃～-18℃过夜冷冻；

5)将上述冷冻后的菌丝体再经过真空冷冻干燥机，在真空表压力70Pa、温度-55℃条件下进一步干燥5-6小时，然后使用玛瑙研钵将其研磨充分，得到粉末料；

6)将研磨后的粉末料放入管式炉中进行高温煅烧，煅烧全程通入高纯氩气以保持煅烧的惰性环境，煅烧程序为：以5℃/min的升温速率，从室温(约20℃)升温至900℃，在900℃保持煅烧1小时后，停止加热，煅烧完成，使煅烧产物自然冷却至室温，即得到复合材料。

3、产物分析

本实施例利用真菌生物矿化作用，在上述工艺条件下诱导N.crassa菌种矿化并负载了纳米级的铁成分，再经过在惰性环境中进行高温煅烧还原，得到上述复合材料。

1)该复合材料外貌如图1所示，图1示出的为将上述煅烧后得到的复合材料进行研磨得到的复合材料粉末，呈黑色，表面无光泽，质轻。

2)使用扫描电子显微镜(SEM)观察上述复合材料，结果见图2，左图为放大5K倍后的示意图，图正中管状结构及其周围条状结构皆为真菌菌丝，可以看到，经过高温煅烧后，真菌仍能够保持其条状菌丝结构。右图为放大50K倍后的示意图，在该放大倍数下，可观察到菌丝体表面均匀且密集地负载了细微颗粒成分，可以得出该放大倍数下这些细微颗粒为纳米级颗粒，即为纳米单质铁。

3)使用EDAX能谱仪对上述复合材料进行分析，其EDAX能谱图如图3所示，可以看到，该复合材料组成大部分为C、Fe，含极少部分的O，说明该复合材料的组成主要为碳、铁的混合物，并且大部分铁以零价铁形态存在，受氧化程度低，说明该复合材料对铁的负载及防氧化能力强。

4)对照分析

(1)按照如下方法制备活性碳负载纳米零价铁材料：

称取8g活性碳，将其置于200mL浓度为1mol/L的FeSO₄·7H₂O溶液中，然后置于摇床(25℃，150r/min)，经24h吸附后，将产物过滤分离、烘干，得到固体物；

称取4g上述固体物，将其置于适宜容量的三角烧瓶中，向三角烧瓶中缓慢滴入100mL浓度为1mol/L的NaBH₄溶液，得到混合液；将上述混合液置于摇床(120rpm，25℃)中震荡1h左右，使其充分反应；对反应后的产物进行抽滤分离，将分离得到的固体产物用无水乙醇清洗以去除其表面残留物，即得到活性碳负载纳米零价铁材料，将该材料保存在氮气氛围下待用。

(2)SEM观察分析

使用扫描电子显微镜(SEM)分别观察上述活性碳负载纳米零价铁材料与本实施例的复合材料，结果如图4所示，左图为观察活性碳负载纳米零价铁材料的示意图，图中放大倍数为20K，右图为观察本实施例复合材料的示意图，图中放大倍数为10K。可以看到，活性碳负载纳米零价铁材料中，纳米零价铁是附着在活性碳颗粒的表面，其比表面积受活性碳颗粒的物理形貌决定。而本实施例的复合材料，由于菌丝体成管状结构，其可负载纳米零价铁的比表面积远远大于活性碳颗粒，负载能力更高，即相比活性碳物理吸附而言，本实施经生物矿化作用得到的复合材料对单质铁的负载能力更强。

(3)水中分散性分析

各取0.1g复合材料、还原铁粉、活性碳，分别置于装有100mL超纯水的三角摇瓶内，密封，并置于摇床中以125r/min摇动10min，观察其分散性。

结果如图5所示，可以看到，上述复合材料可以与水较为均匀的混合(左边锥形瓶)，而还原铁粉(中间锥形瓶)、活性碳(右边锥形瓶)均不能与水充分混合，表明本实施例复合材料分散性更佳。

试验例、负载有纳米单质铁的复合材料的应用

本试验例中，如无特别说明，所用真菌生物碳负载纳米单质铁的复合材料(以下简称复合材料)均按照实施例一的方法制备。

本试验例所用真菌生物碳与实施例一复合材料的制备方法的区别仅在于：本实施例真菌生物碳的制备过程中，没有使用AP1培养基对菌丝体进行培养矿化的步骤，其余步骤及各步骤条件均与实施例1复合材料的制备过程相同。

本试验例中，四氯化碳、正己烷为上海阿拉丁生化科技股份有限公司商品；气相色谱质谱联用仪(GCMS)来自于安捷伦科技有限公司，GCMS检测所用吸附柱型号为DB-35；GCMS检测条件：萃取剂及清洗剂选用正己烷(色谱纯)，载气为高纯氮气，进样方式为分流进样，分流比5：1，进样量1μL，柱流量为1mL/min，升温程序为30℃保持运行3.6分钟，溶剂延迟3.18，四氯化碳出峰时间约为3.44左右。

本试验例中，如无特别说明，涉及待测样品中四氯化碳的浓度均按如下方法测定：

1)取适量四氯化碳(CCL4)与正己烷配制7组标准样(编号1-7)，各标准样中四氯化碳的体积浓度分别如表1所示；采用GCMS对上述7组标准样进行检测，分别记录四氯化碳的色谱峰面积，结果如表1所示；

2)根据上述检测结果，拟合四氯化碳的体积浓度与峰面积的关系曲线，得到四氯化碳的体积浓度与峰面积呈线性关系：y＝3×10^-5x+0.5688，相关系数R²＝0.9966；

3)采用GCMS对待测样品进行检测，记录四氯化碳的色谱峰面积，通过上述线性关系计算待测样品中四氯化碳的浓度。

表1

为了进一步测试复合材料降解污染物的效果，设计了以下试验：

1)试验方法(以复合材料为例说明)

取0.1g复合材料，将其加入含有100mL浓度为16mg/L的四氯化碳水溶液的锥形瓶中，将锥形瓶封口，置于摇床(25℃，125r/min)中反应，每隔30分钟取样，反应时间持续150分钟；

分别对各取样样品及原始样品(浓度为16mg/L的四氯化碳水溶液)进行如下处理：

(1)萃取：将上述取样样品与正己烷各5mL加入适宜大小的分液漏斗，室温下震荡1分钟，静置分层，取上层有机相置于小烧杯中，加入适量无水硫酸钠进行干燥，移取1mL干燥后的有机相至样品瓶中作为待测样品；

(2)对上述待测样品进行GCMS检测，记录四氯化碳的色谱峰面积，并计算取样样品中四氯化碳的浓度占原始样品中四氯化碳的浓度的比例(即浓度百分比)。

2)测定分析

(1)复合材料试验组：按照上述试验方法进行3组平行试验，编号：本材料组1、本材料组2、本材料组3，测定复合材料的降解性能；

(2)还原铁粉试验组：以还原铁粉替换复合材料，其余步骤按照上述试验方法进行；

(3)真菌生物碳试验组：以真菌生物碳替换复合材料，其余步骤按照上述试验方法进行；

(4)空白对照试验组：不添加复合材料，其余步骤按照上述试验方法进行。

试验结果见表2与图6。

表2

可以看出，三组平行试验中，四氯化碳的浓度变化趋势相近，反应历时150分钟，从原始浓度(16mg/L)逐渐降低到原始浓度的22％-27％左右，从不同时间的峰面积也可以明显看出该趋势，说明复合材料对四氯化碳具有高效的降解作用。

此外，在不同的时间段，还原铁粉试验组与真菌生物碳试验组中，四氯化碳的含量均要较复合材料试验组高出很多，反应150分钟后，其四氯化碳的浓度百分比分别为86.80％与71.70％，更高于复合材料试验组，说明了复合材料具有优异的降解效果。

Claims (9)

1.一种负载有纳米单质铁的复合材料，其特征在于，所述复合材料是一种产脲酶真菌菌丝体经矿化而成的生物碳表面负载纳米级单质铁所得到的复合材料；

所述复合材料的制备过程包括了使菌丝体在含有亚铁离子的培养基中培养并负载铁成分、以及通过煅烧使菌丝体碳化和铁元素被还原为单质的过程；其中，所述含有亚铁离子的培养基中，所述亚铁离子的浓度为5-50mMol/L。

2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于，

所述产脲酶真菌选自产脲酶脉孢菌。

3.根据权利要求2所述的复合材料，其特征在于，所述产脲酶脉孢菌为粗糙脉孢菌。

4.权利要求1-3任一项所述的负载有纳米单质铁的复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下过程：

培养得到产脲酶真菌菌丝体；

将所述菌丝体置于含有亚铁离子的培养基中，摇床培养，收取负载有铁成分的菌丝体，所述含有亚铁离子的培养基中，所述亚铁离子的浓度为5-50mMol/L；

将所得到的负载有铁成分的菌丝体实施真空冷冻干燥后研磨；

将研磨后的粉末料于880-950℃煅烧1小时以上，以使菌丝体碳化和铁元素被还原为单质，冷却得到所述复合材料。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述含有亚铁离子的培养基的氮源包括尿素，该制备方法还包括制备含有亚铁离子的培养基的过程：

将除尿素和亚铁离子外的组分于超纯水中混合溶解，高压蒸汽灭菌；

无菌状态下加入尿素溶液和含亚铁离子溶液，制成所述含有亚铁离子的培养基。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将所得到的负载有铁成分的菌丝体抽滤除水后先实施冷冻，再经过真空冷冻干燥机进一步干燥处理，真空表压力不高于80Pa，干燥温度为-55～-50℃，干燥时间5-6小时。

7.根据权利要求4或6所述的制备方法，其特征在于，研磨后的粉末料在惰性环境中按照如下程序实施煅烧：

控制升温速率2℃/分钟～7℃/分钟，升温至880-950℃，煅烧1-3小时；

煅烧完成后，自然冷却。

8.根据权利要求1-3任一项所述的负载有纳米单质铁的复合材料在降解有机污染物处理中的应用。

9.一种有机污染物的降解处理方法，其特征在于，使用权利要求1-3任一项所述的负载有纳米单质铁的复合材料作为处理剂。

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