CN110573514A - 含有紫花前胡素衍生物作为有效成分的老化相关疾病的预防或治疗用药物组合物 - Google Patents

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CN110573514A CN201880027751.9A CN201880027751A CN110573514A CN 110573514 A CN110573514 A CN 110573514A CN 201880027751 A CN201880027751 A CN 201880027751A CN 110573514 A CN110573514 A CN 110573514A
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Abstract

本发明涉及新型紫花前胡素衍生物及含有其为有效成分的老化相关疾病的预防或治疗用组合物，所述新型紫花前胡素衍生物显示出优异的早老蛋白表达抑制效果及早老蛋白和核纤层蛋白A结合抑制效果，确认了能够延长诱导早老症的动物模型的生存期间，由此本发明的化合物能够有效地用于早老症等老化相关疾病的预防或治疗。

Description

含有紫花前胡素衍生物作为有效成分的老化相关疾病的预防 或治疗用药物组合物
技术领域
本发明涉及新型紫花前胡素衍生物及含有其作为有效成分的老化相关疾病的预防或治疗用组合物。
背景技术
随着人类的寿命增加，人们对老化进行过程的关注与日俱增，但有许多还不能明确的部分，最近研究主要集中于人类早老症为对象的遗传或分子老化机制等方面。
早老症或者哈钦森-吉尔福德早衰综合征(Hutchinson-Gilford Progeriasyndrome)是在儿童中出现早期老化现象的致命而又罕见的遗传疾病，患有早老症的小孩而言，初期幼儿期呈现出正常样貌，但经过9～24个月之后呈现出严重的生长迟缓，最终显示出身高矮、体重轻的症状。具有特征性的脸型，全身出现动脉粥样硬化、心血管系统疾病、脑卒中、髋高关节脱位等；皮下脂肪层损失；指甲缺陷；关节的轻质；骨骼损伤。这种早老症小儿患者由于心脏疾病而通常在8-21岁去世，平均寿命为13岁左右。
HGPS是非常罕见的常染色体显性遗传疾病，是由于核纤层蛋白A(Lamin A，LMN A)的G608G的沉默突变而发生。所述突变生成新的剪切供体位点，并产生早老蛋白(Progerin,Prg)。该早老蛋白是核纤层蛋白A的C末端结构域的50个氨基酸缺失的选择性的剪切部位产物。
早老蛋白的表达诱发如核膜不规则性或核-细胞质核纤层蛋白A减少等形态学上的变化，阻碍早老蛋白的表达会诱发核变形的减少，已确认为是HGPS的主要因素。
由此，作为治疗早老症的方法，有阻碍早老蛋白的法尼基化(Farnesylation)，或者利用细胞自噬(autophage)去除法尼基化的核纤层蛋白A来减轻早老蛋白，但是，这两种情况都有副作用的问题，目前为止能够根本上治疗早老症的方法还未见报道。
发明内容
所要解决的问题
本发明提供一种抑制早老蛋白的核纤层蛋白A的结合的新型化合物，还提供含有所述化合物作为有效成分的用于早老症等老化相关疾病预防或治疗用药物组合物。
用于解决问题的方案
本发明的一个方面提供由下列化学式1表示的化合物或其药学上可用的盐。
化学式1
本发明还提供含有由下列化学式1表示的化合物或其药学上可用的盐作为有效成分的老化相关疾病预防或治疗用药物组合物。
化学式1
此外，本发明的另一方面还提供含有由下列化学式1表示的化合物及其药学上可用的盐的皱纹预防或改善用化妆品组合物。
化学式1
发明效果
根据本发明的新型化合物，在诱导早老症的细胞及动物模型中显示出优异的早老蛋白表达及早老蛋白和核纤层蛋白A结合抑制效果，尤其是确认了在早老蛋白和核纤层蛋白A的结合抑制效果及延长诱导早老症的动物模型的生存期间上，在通过口服给药显示出与腹腔注射类似的水平，因此本发明的化合物能够有效用于哈钦森-吉尔福德早衰综合征(Hutchinson-Gilford Progeria syndrome，HGPS)及维尔纳综合征(werner syndrome)等老化相关疾病治疗。本发明的新型化合物还确认了能够增加皮肤细胞的胶原蛋白生成，因此能够用作皱纹预防或改善用化妆品组合物。
附图说明
图1是确认早老蛋白-核纤层蛋白A结合抑制效果的结果，图1A是JH4的体内PK分析结果，确认了JH4在腹腔内注射的早衰小鼠模型中衰表型得到抑制，但PO处理时很快消失。图1B是显示JH4衍生物形成的模拟图，为了抑制在体内快速分解，而将侧链替换为酰胺键(JH010)或醚键(SLC-D011)来合成的JH4衍生物化合物的确认结果。图1C是确认JH4衍生物抑制核纤层蛋白A(Lamin A；Lmna)及早老蛋白相互作用的效果的结果，是通过将结合有磁珠(bead)的Lmna与用GFP-早老蛋白转化的293细胞裂解物以及各个化合物一同孵化，进行抑制结合分析的结果。图1D是通过早老蛋白表达分析确认SLC-D011(D011)的早老蛋白表达抑制效果的确认结果，对于利用早老蛋白转化的293细胞使用化合物处理24小时而表达早老蛋白的结果，确认D011与JH4或JH010相比显示出明显的早老蛋白表达抑制效果。图1E是D011改善核形态、抑制早老蛋白表达的效果的确认结果，HGPS细胞(AG03198，10岁女性；AG03198，10岁女性)与化合物孵化48小时后，对早老蛋白进行染色(红色)的结果，化合物改善了异常的核形态，尤其是确认了D011的改善效果优异，DAPI表示DNA。图1F是确认JH010和D011诱导H3K9me3表达的效果的免疫染色结果，H3K9me3抑制是在早老症细胞中已熟知的标记物，且免疫染色结果显示所有化合物在HGPS细胞中都有效诱导了H3K9me3的表达。
图2是确认SLC-D011体内显著性效果的结果，图2A是JH010及SLC-D011体内PK分析结果，两种化合物均显示出适当的药代动力学特性，B.A是表示生物可用性(bioavailability)。图2B是确认SLC-D011的人类ERG(hERG)抑制效果的结果，由于在JH010中确认了hERG的抑制效果，因此确认SLC-D011对hERG产生的影响，结果SLC-D011并未显示hERG抑制效果。图2C是确认SLC-D011对早衰(progeria)模型组小鼠LmnaG609G/G609G的寿命延长效果的结果，与平均寿命为14.8周(最大寿命为15周)的组相比，每周两次腹腔注射SLC-D01120mg/kg的组的寿命延长至19.5周(最大寿命为21周)，SLC-D011注射给5周龄的LmnaG609G/G609G小鼠。图2D是确认注射的10周龄LmnaG609G/G609G小鼠整体形态的结果，在相同年龄的小鼠中注射SLC-D011的小鼠相比对照组的小鼠体型更大。图2E是确认SLC-D011对Lmnawt/G609G小鼠的寿命产生的效果的结果，与对照组(vehicle)(ave＝44.6及max＝46)及JH4(ave＝54及max＝56)相比，注射SLC-D011的组平均寿命可延长至65周，注射从43周龄开始进行。图2F是注射D011的Lmnawt/G609G小鼠的整体形态，虽然与对照组小鼠是同龄，但是在45周龄的Lmnawt/G609G小鼠并未见病弱瘦小的情况。
图3是确认SLC-D011经口给药对早老化(premature aging)的效果的结果，图3A是溶解度确认结果，SLC-D011显示很大的疏水性而无法溶解于水溶液中(左侧)，为了解决上述问题，在已经作为医药剂型使用的溶液中确认了其溶解度，结果选择了基于油酸甘油酯(monoolein)的溶液(右侧)。图3B是确认SLC-D011稳定性的结果，为了完全溶解需要进行80℃加热及超声波处理步骤，但是SLC-D011的LC-MS分析结果显示经过加热及超声波处理之后也与原化合物显示相同的图谱，由此确认并没有分解。图3C是确认SLC-D011经口给药对Lmnawt/G609G小鼠的寿命延长效果的结果，油酸甘油酯溶液中溶解的SLC-D011对5周龄小鼠每天经口给药50mg/kg的结果，相比对照组(ave＝14.9及max＝15.5)，经口给药组的寿命得到延长(ave＝19.3及max＝19.5)。图3D是确认随着SLC-D011经口给药的LmnaG609G/G609G小鼠体重变化增加结果，相比对照组，处理组的小鼠体重增加了35％。图3E是确认SLC-D011处理的8周龄小鼠整体形态结果，处理组小鼠的身材大小相比对照组小鼠大。
图4是确认维尔纳综合征(wener syndorme)细胞中SLC-D011的早老化(prematureaging)改善效果的结果，图4A是确认使用各个载体将转化48小时的HGPS细胞固定后进行H3K9me3抗体染色的H3K9me3表达水平结果，在用人类WRN(hWRN)转化的HGPS细胞中确认H3K9me3的表达，相反用小鼠WRN(mWRN)转化的HGPS细胞中没有出现H3K9me3的表达。图4B是确认早老蛋白-WRN结合相关的人类特异性双重区域的结果，将结合有微珠(bead)的GSTWRN-R1(非重复肽)及WRN-R2(重复肽)与GFP-LmnA或早老蛋白转染的293细胞裂解物进行孵化并离心分离，接着进行免疫沉淀分析(pull down assay)，然后确认结合的GFP蛋白而进行的蛋白免疫印迹(western blot)的分析结果。图4C是确认WRN-R2抑制核纤层蛋白A与早老蛋白相互作用的效果的结果，将结合有微珠的GST-早老蛋白与用GFP-核纤层蛋白A转化的293细胞裂解物，在WRN-R1或R2存在或不存在的条件下进行孵化，结果确认了重组WRN-R2添加组中明确减少了核纤层蛋白A-早老蛋白相互作用。图4D是确认利用蛋白搬运试剂将WRN-R1及R2肽插于HGPS细胞中24小时后，重组WRN-R2肽诱导H3K9me3且改善核畸形效果的结果，在搬运WRN-R2的细胞中H3K9me3的表达增加，确认了核形状改善。图4E是确认维尔纳综合征(WS)患者细胞中通过去除早老蛋白的H3K9me3表达诱导与否的结果，将WS细胞用si-对照组(non-target sequence)或si-早老蛋白转化48小时，用H3K9me3抗体及DAPI(核染色)进行染色，结果在利用siRNA抑制早老蛋白表达的WS细胞中诱导了H3K9me3的表达，核的大小减小。图4F是确认SLC-D011对WS细胞的核畸形改善效果的结果，将WS细胞和SLC-D011孵化48小时，用核纤层蛋白A/C抗体及DAPI染色的结果。图4G是确认将WS细胞和SLC-D011孵化48小时后进行IF染色，在WS细胞中通过SLC-D011诱导H3K9me3表达的效果，确认出通过SLC-D011处理而H3K9me3表达非常低的WS细胞中，明确诱导了H3K9me3的表达。
图5是确认在人体皮肤角蛋白细胞HaCaT细胞及成纤维细胞中SLC-D01的效果的结果，图5A是HaCaT细胞用SLC-D011处理并孵化24小时之后，在HaCaT细胞中确认胶原蛋白1A的表达量的免疫蛋白印迹分析结果，图5B是正常成纤维细胞9N(GM 00038，9岁女性)及N46(AG13299，46岁男性)用SLC-D011处理并孵化24小时后，确认胶原蛋白1A表达量的免疫印迹分析结果。
具体实施方式
本发明可以提供有下列化学式1表示的化合物或其药学上可用的盐。
化学式1
本发明还提供含有由下列化学式1表示的化合物或其药学上可用的盐作为有效成分的老化相关疾病预防或治疗用药物组合物。
化学式1
更具体地，所述化学式1表示的化合物或及药学上可用的盐可以是(7S)-(+)-8,8-二甲基-7-(3-苯基-烯丙氧基)-7,8-二氢-6H-吡喃并[3,2-g]色烯-2-酮((7S)-(+)-8,8-dimethyl-7-(3-phenyl-allyoxy)-7,8-dihydro-6H-pyrano[3,2-g]chromen-2-one(SLC-D011))。
所述老化相关疾病可以是早老症。
更具体地，所述早老症可以是选自维尔纳综合征及哈钦森-吉尔福德早衰综合征组成的组中。
所述化学式1表示的化合物及其药学上可用的盐可以抑制早老蛋白与核纤层蛋白A的结合。
根据本发明以具体例，所述药物组合物根据通常的方法可以使用选自注射剂、颗粒剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、栓剂、凝胶剂、混悬剂、乳剂、点滴剂或液剂组成的组中的任意一种。
根据本发明的另一具体例，药物组合物可以进一步包含通常适用于药物组合物制备中的选自载体、赋形剂、崩解剂、甜味剂、包覆剂、膨胀剂、润滑剂、流动改性剂、香味剂、抗氧化剂、缓冲剂、杀菌剂、稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂及润滑剂组成的组的一种以上的添加剂。
具体地，载体、赋形剂及稀释剂可以使用乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻蛋白酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁、及矿物油；用于经口给药的固体制剂可以包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂可以通过在上述组合物中混合一种以上的赋形剂，例如混合淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖或明胶等制造。此外，除了单纯的赋形剂之外还可以使用硬脂酸镁、滑石等润滑剂。用于经口给药的液体制剂包括混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除了常用的单纯稀释剂水、液体石蜡之外，可以包含各种赋形剂，例如可以包含湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。用于非经口给药的制剂包括灭菌水溶液、非水溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂、栓剂等。作为非水溶剂、混悬剂可以使用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等可注射的酯。栓剂的基材可以使用合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂酯、甘油明胶等。
根据本发明的一实施例，所述药物组合物可以是通过静脉内、动脉内、腹腔内、肌肉内、动脉内、腹腔内、胸骨内、经皮、鼻侧内、吸入、局部、直肠、经口、眼球内或皮内途径，按照通常方式向对象给药。
所述化学式1表示的化合物的优选给药量为根据对象的状态及体重、疾病的种类及程度、药物形态、给药途径及时间而不同，本领域技术人员可以适当的进行选择。根据本发明的一实施例，一日给药量为0.01～200mg/kg，优选为0.1～200mg/kg，更优选为0.1～100mg/kg，但不限于此。给药可以是一天给药一次或分数次给药，但本发明的范围不限于此。
本发明中，所述“对象”可以是包括人的哺乳动物，但不限于此。
此外，本发明的另一方面还提供含有由下列化学式1表示的化合物及其药学上可用的盐的皱纹预防或改善用化妆品组合物。
化学式1
所述化学式1表示的化合物及其药学上可用的盐可以提高角质细胞和成纤维细胞的胶原蛋白生成。
所述化妆品组合物除了作为有效成分的由化学式1表示的化合物之外，还可以包含稳定化剂、增溶剂、维生素、颜料及香料等通常的辅助剂，还包括载体。
所述化妆品组合物可以制造为本领域通常制造的任何剂型，例如，可以剂型化为溶液、混悬液、乳浊液、糊剂、凝胶剂、霜、乳液、粉、油、粉状粉底、乳浊液粉底、蜡状粉底及喷雾等，但不限于此。更具体而言，可以制造为防晒霜、柔润化妆水、收敛化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华、眼霜、面膜、喷雾或粉末剂型。
所述剂型为膏、霜或凝胶剂的情况时，载体成分可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。
所述剂型为粉或喷雾的情况时，所述载体成分可以使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末等；尤其为喷雾的情况时可以进一步包含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚等推进剂。
所述剂型为溶液或乳浊液的情况时，所述载体成分可以使用溶剂、增溶剂或乳化剂，例如有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇或脂肪酸失水山梨醇脂。
所述剂型为混悬液的情况时，所述载体成分可以使用水、乙醇或丙二醇等液状稀释剂；乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯、聚氧乙烯山梨醇酐酯等混悬剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂、黄蓍胶等。
具体实施例
下面，为了帮助理解通过下列实施例详细说明。但是以下实施例仅是为了示例性说明本发明的内容，本发明范围并不由这些实施例限定。本发明的实施例是为了使本领域技术人员能够更完整地理解本发明而提供。
参考例：物质及装备
1H及13C NMR谱图利用JNM-AL 400分光计(400MHz，JEOL，日本)测定，熔点(Meltingpoint)利用电热熔点仪(Electrotheramal melting point apparatus)(Yamaco.MD-S3)，质量分析仪器使用API 2000LC/MS/MS分光计(PE Sciex，加拿大)测定。
此外，旋光度(Optical rotations)利用JASCO DIP-360自动数字旋光仪测定，手性物质的纯度测定使用HPLC(Shinadzu LC-6AD，日本)、色谱柱(CHIRACEL OD-H 0.46cmф×25cm，戴赛尔化学工业公司，日本大阪)。
用于物质分离的硅胶(Silica gel)使用P60(SILICYCLE,230～400目(mesh))，薄膜TCL板使用了TCL硅胶60F254(MERCK)产品。
物质的合成使用的溶剂与试剂从Sigma-Aldrich、Fluka、TCI、Junsei、德山纯化学公司、SK化学公司及SAMCHUN化学公司购买了化学纯(Reagent)等级使用。
实施例1：醚型(Ether-form)的(+)-紫花前胡素(decursin)衍生物合成(SLC-D011)
按照下列反应式1和2相同的过程合成了(7S)-(+)-8,8-二甲基-7-(3-苯基-烯丙氧基)-7,8-二氢-6H-吡喃并[3,2-g]色烯-2-酮((7S)-(+)-8,8-dimethyl-7-(3-phenyl-allyoxy)-7,8-dihydro-6H-pyrano[3,2-g]chromen-2-one(SLC-D011))。
1.合成过程I
反应式1
步骤I：在100ml圆底烧瓶中加入反式桂皮酸(trans-cinnamic acid，D011a，5g，33.7mmol)用甲醇(50ml)溶解后，滴入5滴浓H2SO4，在80℃加热24小时回流，将反应混合液冷却至室温后减压浓缩。
之后，用二氯甲烷(300ml)和蒸馏水(300ml)进行分液，收集有机层后用硫酸钠(sodium sulfate)脱水后过滤。
过滤获得的滤液减压浓缩获得纯的产物3-苯基-丙烯酸,甲酯(3-phenyl-acrylicacid,methyl ester，D011b，5.39g，收率＝98.5％)，然后将此用于下面的步骤。
步骤II：填充氮气的500ml圆底烧瓶中加入3-苯基-丙烯酸,甲酯(3-phenyl-acrylic acid,methyl ester，D011b，4g，24.7ml，1eq)，用无水二氯甲烷(dichloromethane)溶解后，装在温度设定为-78℃的低温反应器中。
反应液中经过30分钟缓慢滴加二异丁基氢化铝(Diisobutylaluminium hydride)1M溶液(DIBAL-H；己烷中的1M溶液，74ml，74.0mmol，3eq)后，将反应温度提升至0℃搅拌1小时，缓慢滴加甲醇(22ml)。
将反应液移至室温搅拌30分钟后，加入饱和罗谢尔盐(Rochelle's salt)88ml。
将反应混合液在室温下剧烈搅拌2小时，使用二氯甲烷300ml和蒸馏水300ml进行2次分液。收集有机层用硫酸钠(sodium sulfate)脱水，过滤后将滤液进行减压浓缩。
浓缩液用硅胶柱分离(乙酸乙酯:正己烷＝3:1)，获得纯的产物3-苯基丙-2-烯-1-醇(3-phenyl-pro-2-pen-1-ol，D011c，3.1g，收率＝93.9％，Rf＝0.37(2:1正己烷-乙酸乙酯)，并将所述化合物用于下面步骤。
步骤III：在100ml圆底烧瓶中加入3-苯基丙-2-烯-1-醇(3-phenyl-pro-2-pen-1-ol，D011c，1g，7.45mmol，1eq)，用无水二氯甲烷(dichloromethane)溶解后，在蒸汽浴上(steam bath)添加三溴化磷(PBr3，phosphorous tribromide，253.6μl，2.608mmol，0.35eq)后，搅拌1小时。
将反应混合液浓缩后，进行硅胶柱分离(乙酸乙酯:正己烷＝1:8)获得纯的产物肉桂酸溴((3-bromo-propenyl)-benzene，D005d，1.42g，收率＝96.2％，Rf＝0.34(5:1正己烷-乙酸乙酯))，所述化合物用于下面步骤。
步骤IV：在氮气氛围下，100ml的圆底烧瓶中加入(S)-(+)紫花前胡醇(decursinol)(SLC-B001，2.33g，9.47mmol，1eq)用无水N,N-二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide，DMF；10ml)溶解，将其装入预设温度为-20℃的低温反应器。
反应混合液中加入肉桂酸溴((3-bromo-propenyl)-benzene，D005d，2.8g，14.2mmol，1.5eq)和硫酸钠(NaH 60％，757mg，18.9mmol，2eq)搅拌4小时后，加入蒸馏水3ml，10分钟后从低温反应器中取出，接着使用二氯甲烷200ml和蒸馏水200ml分液2次，收集有机层并用硫酸钠脱水，过滤后滤液减压浓缩。
浓缩液经硅胶柱分离(乙酸乙酯:正己烷＝从1:10梯度洗脱至1:3)，获得了化合物(7S)-(+)-8,8-二甲基-7-(3-苯基-烯丙氧基)-7,8-二氢-6H-吡喃并[3,2-g]色烯-2-酮((7S)-(+)-8,8-dimethyl-7-(3-phenyl-allyoxy)-7,8-dihydro-6H-pyrano[3,2-g]chromen-2-one(SLC-D011))1.21g(35.3％)。收率35.3％，白色固体，mp:143℃，Rf＝0.39(2:1正己烷-乙酸乙酯)；[α]25 D+117.6(c＝1,CHCl3)；1H NMR(400MHz,CDCl3):δH 7.56(1H,d,J＝9.6Hz,H-4),7.38-7.23(5H,m,H-5’,H-6’,H-7’,H-8’,H-9’),7.15(1H,s,H-5),6.76(1H,s,H-10),6.59(1H,d,J＝16.0Hz,H-3’),6.30-6.23(1H,m,H-2’),6.20(1H,d,J＝9.6Hz,H-3),4.34(1H,dd,J＝6.0,12.8Hz,H-1a’),4.21(1H,dd,J＝6.0,12.4Hz,H-1b’),3.59(1H,dd,J＝5.2,7.6Hz,H-7),3.07(1H,dd,J＝4.8,16.0Hz,H-6a),2.85(1H,dd,J＝7.2,16.4Hz,H-6b),1.41(3H,s CH3-8),1.36(3H,s,CH3-8)；13C NMR(100MHz,丙酮-d6)δC161.2(C-2),157.8(C-9a),155.3(C-10a),144.5(C-4),137.9(C-4’),132.9(C-3'),130.4(C-5),129.6(C-6’,C-8'),128.6(C-7’),127.5(C-2’),127.4(C-5',C-9’),118.3(C-5a),113.7(C-3),113.6(C-4a),104.5(C-10),78.8(C-7),76.4(C-8),70.8(C-1’),27.8(C-6),26.1(CH3-8),22.2(CH3-8)；ESI-MS:m/z＝363[M+H]+.Anal.Calc.for C23H22O4:C,76.22；H,6.12；Found:C,76.20；H,6.10.
2.合成过程II
反应式2
步骤I：在100ml圆底烧瓶中加入反式桂皮酸(trans-cinnamic acid，D011a，5g，33.7mmol)用甲醇(50ml)溶解后，滴入5滴浓H2SO4，在80℃加热24小时回流，将反应混合液冷却至室温后减压浓缩。之后，用二氯甲烷(300ml)和蒸馏水(300ml)进行分液，收集有机层后用硫酸钠(sodium sulfate)脱水后过滤。
过滤获得的滤液减压浓缩获得纯的产物3-苯基-丙烯酸,甲酯(3-phenyl-acrylicacid,methyl ester，D011b，5.39g，收率＝98.5％)，然后将此用于下面的步骤。
步骤II：填充氮气的500ml圆底烧瓶中加入3-苯基-丙烯酸,甲酯(3-phenyl-acrylic acid,methyl ester，D011b，4g，24.7ml，1eq)，用无水二氯甲烷(dichloromethane)溶解后，装在温度设定为-78℃的低温反应器中。
反应液中经过30分钟缓慢滴加二异丁基氢化铝1M溶液(DIBAL-H；己烷中的1M溶液，74ml，74.0mmol，3eq)后，将反应温度提升至0℃搅拌1小时，缓慢滴加甲醇(22ml)。
将反应液移至室温搅拌30分钟后，加入饱和罗谢尔盐88ml。将反应混合液在室温下剧烈搅拌2小时，使用二氯甲烷300ml和蒸馏水300ml进行2次分液。
收集有机层用硫酸钠脱水，过滤后将滤液进行减压浓缩。
浓缩液用硅胶柱分离(乙酸乙酯:正己烷＝3:1)，获得纯的产物3-苯基丙-2-烯1-醇(3-phenyl-pro-2-pen-1-ol，D011c，3.1g，收率＝93.9％，Rf＝0.37(2:1正己烷-乙酸乙酯)，并将所述化合物用于下面步骤。
步骤III：在填充氮气的100ml圆底烧瓶中加入3-苯基丙-2-烯-1-醇(D011c，1g，7.45mmol，1eq)，用无水二氯甲烷溶解后，依次添加三甲胺(Et3N，1.04ml，7.45mmol，1eq)、4-二甲基氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine，4-DMAP，92mg，0.75mmol，0.1eq)、二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl-dicarbonate，Boc2O，2.57ml，11.18mmol，1.5eq)后，将反应液在室温下搅拌2小时。
将反应混合液浓缩后，进行硅胶柱分离(乙酸乙酯:正己烷＝1:30)获得纯的产物肉桂基碳酸叔丁酯(tert-butyl cinnamyl carbonate，D011d，1.30g，收率＝74.7％，Rf＝0.32(20:1正己烷-乙酸乙酯))，所述化合物用于下面步骤。
步骤IV：在100ml的圆底烧瓶中加入肉桂基碳酸叔丁酯(D011，1.43g，6.09mmol，1.5eq)、(S)-(+)紫花前胡醇(decursinol)(SLC-B001，1g，4.06mmol，1eq)，在真空状态下干燥1小时。
将干燥的混合物在氮气氛围下溶解于无水四氢呋喃(tetrahydrofuran)，利用氮气对溶解液吹泡(bubbling)1小时后，反应混合液中加入四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)，188mg，0.162mmol，0.04eq)后，回流一夜。将混合溶液在减压条件下浓缩后，进行硅胶柱分离(乙酸乙酯:正己烷＝从1:8梯度洗脱至1:4)，获得了化合物(7S)-(+)-8,8-二甲基-7-(3-苯基-烯丙氧基)-7,8-二氢-6H-吡喃并[3,2-g]色烯-2-酮((7S)-(+)-8,8-dimethyl-7-(3-phenyl-allyoxy)-7,8-dihydro-6H-pyrano[3,2-g]chromen-2-one(SLC-D011))1.20g(81.3％)。
收率81.3％，白色固体，mp:143℃,Rf＝0.39(2:1正己烷-乙酸乙酯)；[α]25 D+117.6(c＝1,CHCl3)；1H NMR(400MHz,CDCl3):δH 7.56(1H,d,J＝9.6Hz,H-4),7.38-7.23(5H,m,H-5’,H-6’,H-7’,H-8’,H-9’),7.15(1H,s,H-5),6.76(1H,s,H-10),6.59(1H,d,J＝16.0Hz,H-3’),6.30-6.23(1H,m,H-2’),6.20(1H,d,J＝9.6Hz,H-3),4.34(1H,dd,J＝6.0,12.8Hz,H-1a’),4.21(1H,dd,J＝6.0,12.4Hz,H-1b’),3.59(1H,dd,J＝5.2,7.6Hz,H-7),3.07(1H,dd,J＝4.8,16.0Hz,H-6a),2.85(1H,dd,J＝7.2,16.4Hz,H-6b),1.41(3H,s CH3-8),1.36(3H,s,CH3-8)；13C NMR(100MHz,丙酮-d6)δC 161.2(C-2),157.8(C-9a),155.3(C-10a),144.5(C-4),137.9(C-4’),132.9(C-3'),130.4(C-5),129.6(C-6’,C-8'),128.6(C-7’),127.5(C-2’),127.4(C-5',C-9’),118.3(C-5a),113.7(C-3),113.6(C-4a),104.5(C-10),78.8(C-7),76.4(C-8),70.8(C-1’),27.8(C-6),26.1(CH3-8),22.2(CH3-8)；ESI-MS:m/z＝363[M+H]+.Anal.Calc.for C23H22O4:C,76.22；H,6.12；Found:C,76.20；H,6.10。
实施例2：作为核纤层蛋白A(LMN A)-早老蛋白结合抑制剂的SLC-D011的效果确认
1.动物实验
动物实验按照釜山国立大学承认的动物政策、在认证评价协会及实验动物管理认证机关中进行。
通过Carlos Lopez-Otin(奥维耶多大学，西班牙奥维耶多阿斯图里亚斯)提供的杂合子Lmna+/G609G的适当交配获得了Lmna G609G/609G。
将混合了DMOS及PBS的SLC-D011 20mg/kg一周两次腹腔注射于5周龄小鼠。此外，将基于油酸甘油酯的溶液(olein-based solution)中以10mg/ml浓度溶解的SLC-D011一周五次经口给药于小鼠，对照组小鼠以与上述相同条件仅给药基于油酸甘油酯的溶液。
Lmna G609G/609G小鼠从5周龄起开始给药，生存期间一直使用新鲜化合物溶液进行处理。Lmna+/G609G小鼠从32周龄开始进行腹腔内处理。
2.细胞培养及试剂
从卡瑞尔细胞库(美国新泽西卡姆登)获得了HGPS患者(AG03198，10岁女性；AG03199，10岁女性)、WS患者(AG06300，37岁男性；AG03141，30岁女性；AG00780，60岁男性)及对照组(GM 00038，9岁女性)人类成纤维细胞，在含有15％FBS、2mM谷氨酰胺的EMEM培养基或不含抗生素含有26mM HEPES的HEMEM培养基中培养。
从ATCC获得HEK293细胞系，利用含10％FBS及1％抗生素的DMEM液体培养基，在37℃培养。
3.抗体及试剂
实验中使用了如下的抗体：GFP(全称；1:1000；sc-9996；圣克鲁斯生物技术公司)；谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase；GST；1:5000；sc-138；圣克鲁斯生物技术公司)；肌动蛋白(Actin；1:10000；sc-47778；圣克鲁斯生物技术公司)；核纤层蛋白A/C(Lamin A/C；1:10000；sc-376248；圣克鲁斯生物技术公司)；早老蛋白(Progerin；1:300；sc-81611；圣克鲁斯生物技术公司)；早老蛋白(1:300；ab66587；艾博抗公司)；H3K9me3(1；2000；Ab8898；艾博抗公司)。
4.重组蛋白
为了生产重组蛋白，通过PCR从终止密码子的上游序列中克隆100AA，生产了重组核纤层蛋白AC-末端区域(Lamin A-C)及早老蛋白C-末端区域(Progerin C)。
通过类似方法生产了WRN-R1区域(hWRN424-450)及WRN-R2区域(hWRN424-476)。各片段上样至GSH-琼脂糖，大范围洗涤，利用含有2mM还原谷胱甘肽的缓冲液进行溶出。
溶出片段利用阴离子交换色谱柱(HitrapQ)进一步纯化，获得了如下WRN-R1及WRN-R2氨基酸序列。
WRN-R1：HLSPNDNENDTSYVIESDEDELEMEMLK
WRN-R2：HLSPNDNENDTSYVIESDEDELEMEMLKHLSPNDNENDTSYVIESDEDELEMEMLK
5.蛋白免疫印迹分析
利用RIPA准备了全细胞裂解物。
从SDS-PAGE中分离15μg细胞提取物移到PVDF膜上。
将膜与抗体一起在4℃下孵化1小时至一晚，利用二次抗体在室温下反应1小时。
使用ECL试剂盒(韩国首尔仁川)，按照生产商的说明书，通过化学发光确认了过氧化物酶的活性。
6.蛋白质-蛋白质相互作用分析
为了分析蛋白质-蛋白质相互作用，进行了谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase，GST)免疫沉淀(pull-down)分析。
为了检测相互作用，GST-基础融合核纤层蛋白A-C-末端区域、早老蛋白-C-末端区域、WRN-R1区域或WRN-R2区域与GFP标记的早老蛋白(GFP-Progerin)及核纤层蛋白A(GFP-Lamin A)转染的HEK293细胞裂解物，在室温下孵化30分钟。
之后，用PBS洗涤1次，收集沉淀物质从SDS-PAGE中分离，之后用抗-GFP及GST进行了蛋白免疫印迹分析。
为了确认对早老蛋白及核纤层蛋白A的WRN-R1及R2的竞争反应，在存在或不存在WRN-R1及R2的重组蛋白的条件下，将结合有GST-早老蛋白的微珠与GFP-核纤层蛋白A过量表达的293溶解物一同进行孵化。
7.免疫荧光染色及老化特异性酸性β-半乳糖苷酶活性染色
将细胞接种于载玻片上，转染了适当的载体。
利用100％甲醇或1％多聚甲醛(PFA)在4℃固定1小时，之后细胞用封闭液(PBS+anti-human-Ab；1:400)进行孵化。
利用PBS进行2次洗涤后，抗核纤层蛋白A/C、早老蛋白或H3K9Me3在封闭液中以1:200稀释，与细胞一同孵化一晚，接着使用含有抗-羊Ab-FITC或抗-兔Ab-核纤层蛋白(rhodamin)的封闭液(1:500)孵化7小时，细胞核使用DAPI染色。之后，利用荧光显微镜法(fluorescence microscopy)(蔡司和Logos)检测出免疫荧光信号。
为了老化特异性酸性β-半乳糖苷酶活性染色，细胞使用PBS(pH7.2)洗涤一次，使用包含0.5％戊二醛的PBS固定。
之后，使用PBS洗涤，在37℃使用X-gal溶液染色细胞一晚。
8.等离子转染及蛋白搬运
从T.Misteli(国家癌症研究所，美国马里兰州贝塞斯达)获得了GFP-早老蛋白及GFP-融合核纤层蛋白A表达载体，从Addgene购得Myc-人WRN载体及Myc-鼠WRN载体。
利用jetPEI(Polyplus Transfection)及PULSin(Polyplus Transfection，美国纽约)，按照生产商的说明书进行了转染。
为了将WRN-R1及R2蛋白转达到HGPS细胞被，按照生产商的的说明书使用了PULSin(Polyplus Transfection，美国纽约)。
用20mM Hepes 200μl稀释重组蛋白(2μg)后，添加了PULSin试剂(8μl).所述混合物在室温下孵化15分钟后，添加了细胞。3小时后无血清培养基替换为含10％FBS的培养基，孵化4小时。之后，从培养孔(well)去除包含培养基的混合物，填充包含血清的新鲜培养基。
9.细胞计数
为了计数具有畸形核的细胞，使用了所获得的免疫荧光照片。在随机选择区域对依赖于核纤层蛋白A染色的显示畸形的核膜进行计数，并以百分比显示了细胞。
为了测定细胞增殖，在免疫荧光照片中对DAPI染色的细胞进行计数。
10.化合物药代动力学(pharmacokinetic；PK)分析及体外(in vitro)ADME确认
为了药代动力学分析，将溶解有JH4 5mg/kg的10％DMSO、5％吐温90及95％生理盐水溶液进行腹腔注射，将溶解有JH4 10mg/kg的10％NMPHE90％PEG400溶液进行经口给药。每规定时间使用LC-MS/MS分析JH4的血液浓度，其他化合物也以同样过程分析PK。
体外ADME研究(等离子蛋白结合、CYP抑制、微粒体稳定性、等离子稳定性及hERG抑制)以标准方法在新药开发中心进行。
11.作为早老蛋白-核纤层蛋白A结合抑制剂的SLC-D011效果确认
哈钦森-吉尔福德早衰综合征是广泛已知的非常罕见的早老综合征的一种。遗传性原因来说是核纤层蛋白A内发生单点突变，出现异常的供体连接，由此生成了从内部去除了C末端50氨基酸的早老蛋白。
以往报告中本发明的发明人已确认HGPS细胞的核畸形是由于核纤层蛋白A与早老蛋白之间非常强有力的结合引起的，早老蛋白抑制剂(JH4)通过核纤层蛋白A结合改善了HGPS细胞的核变形，恢复了p16/INK4A、DNA-PK和H3K9me3表达等老化相关的标记。此外，通过腹腔内注射(i.p)的JH4的处理延长了早老蛋白模型小鼠的寿命约4周。
但是考虑患者的条件时，HGPS患者具有非常薄的血管壁，静脉内注射并不是最适当的给药方式，因此确认了JH4经口给药的可能性。
结果，如图1A和表1及表2所示，静脉内注射及经口给药JH4在体内显示非常短暂的半衰期，因此无法确认体内利用可能性(B.A)。
表1
5mg/kg(n＝3)剂量腹腔注射后等离子浓度
时间(小时) 实验对象1 实验对象2 实验对象3 平均(ng/ml) SD
0.08 3.3 4.6 6.3 4.7 1.5
0.25 1.7 1.1 1.8 1.5 0.4
0.5 0.5 0.7 0.5 0.6 0.1
1 BQL BQL BQL BQL BQL
2 BQL BQL BQL BQL BQL
4 BQL BQL BQL BQL BQL
8 BQL BQL BQL BQL BQL
24 BQL BQL BQL BQL BQL
BQL：低于可量化限制(＜1ng/ml)
表2
10mg/kg(n＝3)剂量腹腔注射后等离子浓度
BQL：低于可量化限制(＜1ng/ml)
由此，为了获得体内稳定的化合物而从JH4变型获得多种化合物，进行GST-免疫沉淀分析(pull down assay)及早老蛋白表达分析而确认41种不同JH4衍生物，结果如图1C所示，化合物JH010及SLC-D011显示出与JH4类似的活性，如图1D所示，显示出抑制早老蛋白表达的效果。
此外，参考图1E和1F，化合物JH010及SLC-D011化合物诱导了H3K9me3的表达，改善了HGPS细胞的核畸形。
如图2A所示，在PK分析结果中也可知道化合物JH010及SLC-D011(早老蛋白)分别改善了体内利用性(B.A)达70％、66％。
但是在体外ADME分析结果显示，JH010化合物显示hERG离子通道抑制效果，从而确认SLC-D011对hERG离子通道的影响，如图2b所示，与JH010比较，SLC-D011中并没有出现严重的hERG抑制，如表3至表6所示，SLC-D011化合物显示出良好的等离子稳定性和适当的CYP抑制范围。
表3
血浆蛋白结合
化合物 人类(结合％) 鼠(结合％)
SLC-D-011 99.9 99.8
地塞米松(对照) 62.1 78.8
华法林(对照) 98.9 98.2
表4
血浆稳定性(残留％)
表5
肝微粒体稳定性(30分钟期间残留％)
化合物 人类(％) 大鼠(％) 小鼠(％)
SLC-D011 21.5 17.4 59.7
维拉帕米(对照) 16.2
表6
CYP抑制剂
CYP1A2 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP3A4
SLC-D011 81.6 78.4 28.8 91.7 92.5
酮康唑(对照) 97.3 95.4 >100 98.4 29.9
如上述结果所示，为了确认稳定已经得到确认的SLC-D011的体内效果,注射i.p，结果如图2C所示，Lamn G609G/G609G小鼠的寿命延长至20周，如图2D所示通过SLC-D011处理，身体尺寸增加且整体形态(Gross morphology)得到改善。
特别有趣的是，Lamnwt/G609G模型中通过SLC-D011处理小鼠寿命延长至45周至64周，参考图2E，与延长约10周寿命的JH4相比是非常增强的效果。此外，如图2F所示，SLC-D011处理的小鼠的毛状态及身体尺寸等形态得到很大改善。
从上述结果可知，SLC-D011可以作为HGPS的优秀的候补。
12.SLC-D011经口给药效果确认
不仅JH4，SLC-D011也显示出非常低的水溶性，这种低水溶性对于经过口给药的化合物的传递会成为问题，因此筛选了能够增加SLC-D011溶解率的适当溶液。
结果如图3A所示，确认了基于油酸甘油酯(monoolein)的溶液能够有效溶解SLC-D011，在溶液内的SLC-D011如图3B所示在加热和超声波处理时也不分解而维持稳定。
此外，基于油酸甘油酯的溶液没有毒性，从而可以增加肠内吸收，非常适合作为SLC-D011的运送载体。
溶解于基于油酸甘油酯的溶液制备成经口给药剂型的SLC-D011，向Lamn G609G/G609G小鼠经口给药而确认体内效果，结果如图3C及图3D所示，LamnG609G/G609G小鼠的寿命延长至4.5周，体重增加。
从上述结果可知，基于油酸甘油酯的SLC-D011溶液对HGPS治疗非常有用。
实施例3：作为维尔纳综合征治疗剂的SLC-D011的效果确认
由于老化，早老蛋白表达增加，因此在早老症疾病维尔纳综合征(WS)和正常模型中确认了SLC-D011的效果。
首先，确认了维尔纳基因(WRN)缺乏和早衰之间的关联性。根据以前报告，WRN表达受抑制的小鼠体重及寿命与野生型小鼠没有明显的差别，在本发明中mWRN-/-小鼠的寿命及体重与Lamnwt/G609G小鼠也未产生差异。
此外，比较了小鼠和人WRN的氨基酸序列，结果确认，人WRN中特异性反复的序列(WRN-R2)，实际上hWRN的重复是由于cDNA而发生。
为了调查hWRN和早老蛋白的关联性，向HGPS细胞内转染人类及小鼠WRN，确认了核形态及H3K9me3的表达。
结果发现，有趣的是如图4A所示，仅在hWRN中核变形得到改善，诱导H3K9me3的表达。此外，制备单一及双重复的氨基酸重组的肽确认了相互作用。
与WRN-R1比较的结果，如图4B所示，双重肽与早老蛋白发生强烈地结合，如图4C所示，WRN-R2阻断早老蛋白和核纤层蛋白A的相互作用。
从上述结果中可以确认WRN-R2为天然早老蛋白抑制剂，HGPS细胞和WS细胞用重组WRN-R2处理，结果如图4D所示，向HGPS细胞内运送重组WRN-R2的细胞中核形态变得正常，H3K9me3表达得到提高。
但是去除早老蛋白的WS细胞中也出现上述效果，因此为了确认SLC-D011是否能作为适于WS细胞治疗的治疗剂而使用，WS细胞用SLC-D011处理后确认了核形态及细胞增殖。
结果，如图4F所示，SLC-D011在WS患者细胞中也与HGPS类似地改善了核形态及细胞增殖，如图4G所示诱导了H3K9me3的表达。
从上述结果可知，SLC-D011可以用于成人早老症维尔纳综合征的治疗。
实施例4：化合物SLC-D011的皮肤老化改善效果
随着上述实验中SLC-D011化合物显示出对老化相关疾病的治疗效果，确认了该化合物对人类皮肤角质细胞HaCaT细胞及成纤维细胞中的影响。
将人类皮肤角质细胞HaCaT细胞及正常成纤维细胞9N(GM 00038，9岁女性)及N46(AG13299，46岁男性)用2μM或5μM的SLC-D011进行处理，孵化24小时后，确认HaCaT细胞及成纤维细胞中的胶原蛋白1A的表达量。
结果如图5A及5B显示，SLC-D011在人类成纤维细胞及角质细胞中具有增加胶原蛋白表达的效果。
从上述结果可以确认化合物SLC-D011适合作为早老蛋白-核纤层蛋白A结合抑制剂，所述化合物SLC-D011可以制备成经口给药用剂型，从而有效用作早老症治疗剂或皱纹改善用组合物。
以上对本发明内容的特定部分进行了详细描述，对于本领域技术人员而言应当理解的是，这种具体说明仅是优选的实施形态，本发明的范围并不由此限定。本发明实际范围应当有随附的权利要求书及其等同物来定义。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种由下列化学式1或化学式2表示的化合物或其药学上可用的盐，
化学式1
化学式2
2.一种老化相关疾病预防或治疗用药物组合物，其含有由下列化学式1或化学式2表示的化合物或其药学上可用的盐作为有效成分，
化学式1
化学式2
3.根据权利要求2所述的老化相关疾病预防或治疗用药物组合物，其中，所述化学式1表示的化合物或及药学上可用的盐是(7S)-(+)-8,8-二甲基-7-(3-苯基-烯丙氧基)-7,8-二氢-6H-吡喃并[3,2-g]色烯-2-酮，所述化学式2表示的化合物或及药学上可用的盐是(7S)-(+)-(E)-2-(吡啶-3-基)乙烯基氨基甲酸、8,8-二甲基-2-氧-6,7-二氢-2H、8H-吡喃并-[3,2-g]色烯-7-基-酯。
4.根据权利要求2所述的老化相关疾病预防或治疗用药物组合物，其中，所述老化相关疾病是早老症。
5.根据权利要求4所述的老化相关疾病预防或治疗用药物组合物，其中，所述早老症选自维尔纳综合征及哈钦森-吉尔福德早衰综合征组成的组。
6.根据权利要求2所述的老化相关疾病预防或治疗用药物组合物，其中，所述化学式1或化学式2表示的化合物及其药学上可用的盐抑制早老蛋白与核层蛋白A之间的结合。
7.一种皱纹预防或改善用化妆品组合物，其含有由下列化学式1或化学式2表示的化合物及其药学上可用的盐，
化学式1
化学式2
8.根据权利要求2所述的皱纹预防或改善用化妆品组合物，其中，所述化学式1或化学式2表示的化合物及其药学上可用的盐提高角质细胞和成纤维细胞产生胶原蛋白。

Claims (8)

1.一种由下列化学式1表示的化合物或其药学上可用的盐，
化学式1
2.一种老化相关疾病预防或治疗用药物组合物，其含有由下列化学式1表示的化合物或其药学上可用的盐作为有效成分，
化学式1
3.根据权利要求2所述的老化相关疾病预防或治疗用药物组合物，其中，所述化学式1表示的化合物或其药学上可用的盐是(7S)-(+)-8,8-二甲基-7-(3-苯基-烯丙氧基)-7,8-二氢-6H-吡喃并[3,2-g]色烯-2-酮。
4.根据权利要求2所述的老化相关疾病预防或治疗用药物组合物，其中，所述老化相关疾病是早老症。
5.根据权利要求4所述的老化相关疾病预防或治疗用药物组合物，其中，所述早老症选自维尔纳综合征及哈钦森-吉尔福德早衰综合征组成的组。
6.根据权利要求2所述的老化相关疾病预防或治疗用药物组合物，其中，所述化学式1表示的化合物及其药学上可用的盐抑制早老蛋白与核纤层蛋白A之间的结合。
7.一种皱纹预防或改善用化妆品组合物，其含有由下列化学式1表示的化合物及其药学上可用的盐，
化学式1
8.根据权利要求7所述的皱纹预防或改善用化妆品组合物，其中，所述化学式1表示的化合物及其药学上可用的盐提高角质细胞和成纤维细胞产生胶原蛋白。
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